Ruch w kierunku strzału smugi CFDA załadowanej do tkanek dennego zlewu Arabidopsis

Szeroko stosowana sonda CFDA, czyli skrót od dioctanu karboksyfluoresceiny, jest niefluorescencyjna. Dwie grupy H3 i pozycja 3'6' na tym związku sprawiają, że jest on przepuszczalny dla błony. Tam, gdzie po wejściu do komórek, wewnętrzne octany komórkowe usuną grupy octanowe i uwolnią nową formę CFDA.

To karboksyfluoresceina lub CF, która jest fluorescencyjna. A ponieważ ta nowa forma jest mniej przepuszczalna przez błonę, waga, wszystkie komórki muszą przemieszczać się przez pory międzykomórkowe lub plazmodesmaty u roślin, co sprawia, że ten dioctan jest idealną sondą do badania transportu międzykomórkowego w aktywności łyka. W dzisiejszym filmie zademonstrujemy ładowanie CFD odpowiednio do korzenia i hipokotylu roślin Arabidopsis, a także pokażemy, jak te dwie nieco różne procedury wpłyną na ruch od dołu do góry tej sondy fluorescencyjnej.

Aby osiągnąć konsekwentne wyniki barwienia, przechowujemy zebrane nasiona Arabidopsis w komorze o temperaturze 40% stopni Celsjusza. Nowo zebrane nasiona przechowywane w tym stanie przez ponad siedem dni są chętnie wykorzystywane do siewu. Aby upewnić się, że każda roślina jest uprawiana w stosunkowo podobnej przestrzeni na szalce Petriego, używamy karty oceny strefy nasiennej.

Teraz, zwilżając wysterylizowaną końcówkę, zanurz wysterylizowane nasiona i wysiewaj nasiona pojedynczo w wyznaczonej pozycji. Po zakończeniu siewu uszczelnij szalkę Petriego parafilmem i taśmą klejącą, połóż je na stojaku na szalkę Petriego, aby mogła rosnąć pionowo. Oto narzędzia, których użyjemy w tym eksperymencie.

Pamiętaj, że lepiej załadować barwnik tak szybko, jak to możliwe. Zwykle cały proces kończy się w ciągu 10 do 15 minut. Zanim przeprowadzimy eksperyment z ładowaniem CFDA, zawsze przygotowujemy świeże rozwiązanie CFDA.

Tutaj przed natychmiastowym użyciem rozcieńczyć jeden milimolowy CFDA do pięciu mikromolowych stężeń z wodą. Pokrój parafilm na małe kawałki o wymiarach trzy na trzy milimetry. Ponieważ na pokrywie i dnie szalki Petriego występuje kondensacja, musimy je usunąć ręcznikiem papierowym, aby uniknąć przepływu barwnika.

Pod korzeń umieszcza się mały kawałek parafilmu. Podnieś rośliny i połóż je na pokrywie. Odetnij korzenie około pięciu do 10 milimetrów poniżej hipokotylu.

Zabierz pędy z powrotem na małe kawałki parafilmu. Teraz ostrożnie nałóż jeden mikrolitr CFDA na ścinający koniec korzenia. Staraj się unikać skażenia wszystkich proto-roślin.

Następnie przykryj pokrywkę, a następnie pozostaw je w pomieszczeniu do wzrostu na dwie godziny. Metoda szczypania hipokotylu. Mały kawałek parafilmu, tak jak wcześniej przygotowany, umieszcza się pod połączeniem korzeń-hipokotyl

Używamy forecep, aby delikatnie uszczypnąć hipokotyl blisko tkanki korzeniowej i ostrożnie nakładamy 0,1 mikrolitra CFDA na ściśniętą stronę i pozostawiamy roślinę na dwie godziny. Zdjęcia od 9 do 12 dnia po strefowym barwieniu roślin. Wszystkie pokazują wzór barwienia naczyń krwionośnych zarówno w liścieniach, jak i prawdziwych liściach.

Tylko w bardzo rzadkim przypadku liść liścienia wykazywał wzór barwienia połowy liścia. Zasadniczo więc te dwie metody nie miały wpływu na wzór barwienia CF, jednak jeśli przeprowadzimy ładowanie barwnikiem do coraz większej liczby roślin, okaże się, że te dwie procedury dają znaczną różnicę w wydajności. W przypadku metody wycinania korzeni około 70% roślin wykazuje sygnał fluorescencyjny w pędzie.

Ale wydajność można zwiększyć do 91% za pomocą metody szczypania hipokotylu. Próbowaliśmy również metody szczypania korzeni, ale ta metoda skutkuje jeszcze niższą wydajnością, wynosi około 30%Dlatego wydaje się, że sposób ładowania barwnika nie uwzględnia różnicy w barwieniu. Różnica najprawdopodobniej polega na miejscach załadunku, które mogą być oddzielone barierą symplastyczną.

Pokazaliśmy, jak ładujemy CFDA do korzeni rzodkiewnika i hipokotylu. Zastosowaliśmy dwie nieco różne procedury, a te dwie nieco różne procedury skutkują znaczącą różnicą w tym ruchu sondy od dołu do góry. Sugerujemy, że ta metoda może pomóc nam zidentyfikować potencjalną barierę symplastyczną dla sygnałów pędzliwych pochodzących z korzeni.