Name: Ruch w kierunku strzału smugi CFDA załadowanej do tkanek dennego zlewu Arabidopsis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Poznaj metodę ładowania CFDA do korzeni i hipokotylu Arabidopsis w celu badania transportu międzykomórkowego. Technika fluorescencyjna pozwala wizualizować ruch sondy od podstawy do wierzchołka rośliny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31671257) oraz Hubei Collaborative Innovation Center for Grain Industry (LXT-16-18).

1. Pionowy wzrost rzodkiewnika w pożywce dla SM
<ol>
	<li>Wnętrze komory z przepływem laminarnym należy przed użyciem poddać działaniu 30-minutowego światła UV i 15-minutowego przepływu powietrza. Pamiętaj, aby zamknąć szklane drzwi, gdy włączone jest światło UV. Spryskaj wszystkie narzędzia i talerze 70% etanolem przed umieszczeniem ich w szafce.</li>
	<li>Przygotować pożywkę Murashige i Skoog (MS) na standardowej szalce Petriego o średnicy 90 mm w komorze laminarnej. 
	UWAGA: Pożywka MS zawiera następujące składniki: 20,6 mM NH4NO3, 18,8 mM KNO3, 1,25 mM KH2PO4, 1,5 mM MgSO4·7H2O, 3 mM CaCl2·2H2O, 0,1 mM MnSO4·H2O, 1,03 μM Na2MoO4·2H2O, 0,1 mM H3BO3, 30 μM ZnSO4·7H2O, 0,1 μM CuSO4·5H2O, 0,1 μM CoCl2·6H2O, 1,39 μM KI, 97 μM FeSO4·7H2O, 114,5 μM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 4,07 μM kwas nikotynowy, 2,44 μM chlorowodorek pirydoksyny, 0,15 μM chlorowodorek tiaminy, 2,68 mM glicyny, 555 μM mio-inozytol, 87,7 mM sacharozy i 10 g/L agaru.</li>
	<li>Nawilż wysterylizowane końcówki lub wykałaczki, dotykając końcówki lub wykałaczek pożywką MS, a następnie zanurz wysterylizowane nasiona jeden po drugim w ustalonej pozycji każdej szalki Petriego wskazanej w karcie wysiewu.</li>
	<li>Uszczelnij szalkę Petriego folią parafinową i taśmą klejącą i umieść ją pionowo na przezroczystym stojaku w pomieszczeniu do wzrostu (22 °C, 70% wilgotności) z cyklem dziennym 16 godzin światła i 8 godzin ciemności (oświetlenie od 6 rano do 22 wieczorem). Roślina Arabidopsis jest gotowa do załadunku CFDA w dniach 9-13 po siewie. 
	UWAGA: Poniższa procedura jest wykonywana w godzinach popołudniowych od 14 do 17</li>.
</ol>
2. Ładowanie CFDA z procedurą wycinania korzeni
<ol>
	<li>Przygotować świeży roztwór roboczy CFDA bezpośrednio przed użyciem. Rozcieńczyć 1 mM roztwór podstawowy CFDA przechowywany w zamrażarce o temperaturze -20 °C sterylną wodą ultraczystą do stężenia roboczego 5 μM.</li>
	<li>Pokrój mikroporowatą folię membrany parafinowej (patrz tabela materiałów) na małe kawałki o wymiarach 3 mm x 3 mm.</li>
	<li>Odsłoń rosnące rośliny w pomieszczeniu w temperaturze 22 °C i usuń nadmiar wilgoci ręcznikiem papierowym. Umieść małe kawałki folii poniżej każdego korzenia. 
	UWAGA: Od tego do kroku 2.6 cały proces powinien zostać zakończony w ciągu 15 minut.</li>
	<li>Podnieś rośliny na pokrywę szalki Petriego. Odetnij korzenie w pozycji około 5-10 mm poniżej połączenia korzeń-hipokotyl. Umieść część zdjęciową z powrotem na filmie na podłożu.</li>
	<li>Ostrożnie nałóż 0,25 μl CFDA na odcięty koniec każdego korzenia pod mikroskopem preparacyjnym. Unikaj rozpryskiwania się na inne części rośliny.</li>
	<li>Przykryj płytkę i pozostaw rośliny pod światłem na 2-3 godziny (22 °C) w pomieszczeniu do wzrostu.</li>
	<li>Wybarwione rośliny opłucz trzy razy sekwencyjnie w trzech oddzielnych zlewkach wypełnionych wodą destylowaną, a następnie obserwuj rośliny pod mikroskopem stereofluorescencyjnym z zoomem od 1,4x do 3,3x (patrz Tabela materiałów). Do detekcji fluorescencji należy użyć kostki filtrującej o wysokiej wydajności (wzbudzenie 470/20 nm, podział 495 nm i emisja 525/50 nm) zamontowanej do przesyłania sygnału fluorescencji.</li>
</ol>
3. Ładowanie CFDA z procedurą szczypania hipokotylu
<ol>
	<li>Przygotować świeży roztwór roboczy CFDA bezpośrednio przed użyciem. Rozcieńczyć 1 mM roztwór podstawowy CFDA przechowywany w zamrażarce o temperaturze -20 °C sterylną ultraczystą wodą (patrz tabela materiałów) do stężenia roboczego 5 μM.</li>
	<li>Pokrój mikroporowatą folię membrany parafinowej (patrz tabela materiałów) na małe kawałki o wymiarach 3 mm x 3 mm.</li>
	<li>Odsłoń rosnące rośliny w pomieszczeniu w temperaturze 22 °C i usuń nadmiar wilgoci ręcznikiem papierowym. 
	UWAGA: Od tego do kroku 3.7 cały proces powinien zostać zakończony w ciągu 15 minut.</li>
	<li>Połóż mały kawałek folii pod połączeniem korzeń-hipokotyl każdej rośliny.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby delikatnie uszczypnąć hipokotyl w pobliżu połączenia korzeń-hipokotyl pod mikroskopem preparacyjnym</li>.
	<li>Ostrożnie nanieść 0,1 μl CFDA na miejsce rany pod mikroskopem preparacyjnym. Unikaj rozpryskiwania się na inne części rośliny.</li>
	<li>Przykryj talerz i pozostaw rośliny pod światłem (22 °C) na 2-3 godziny.</li>
	<li>Wybarwione rośliny opłucz trzy razy sekwencyjnie w trzech oddzielnych zlewkach wypełnionych wodą destylowaną, a następnie obserwuj rośliny pod mikroskopem stereofluorescencyjnym z zoomem od 1,4x do 3,3x (patrz Tabela materiałów). W celu detekcji fluorescencji zamontuj kostkę filtrującą o wysokiej wydajności (wzbudzenie 470/20 nm, podział 495 nm i emisja 525/50 nm) w celu przesyłania sygnału fluorescencji.</li>
</ol>

<ol><li>Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((6%285%29Carboxyfluorescein+as+a+tracer+of+phloem+sap+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation.</a> American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).</li>
<li>Wright, K. M., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+probe+HPTS+as+a+phloem-mobile%2C+symplastic+tracer%3A+an+evaluation+using+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy.</a> Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).</li>
<li>Oparka, K. J., Prior, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+Lucifer+Yellow+CH+in+potato+tuber+storage+tissues%3A+A+comparison+of+symplastic+and+apoplastic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport.</a> Planta. 176 (4), 533-540 (1988).</li>
<li>Knoblauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+Phloem-Mobile+Probes%3A+Properties+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications.</a> Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).</li>
<li>Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+phloem+unloading+in+the+root+tip+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).</li>
<li>Viola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberization+in+Potato+Involves+a+Switch+from+Apoplastic+to+Symplastic+Phloem+Unloading%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading.</a> The Plant Cell. 13 (2), 385-398 (2001).</li>
<li>Roberts, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+Unloading+in+Sink+Leaves+of+Nicotiana+benthamiana%3A+Comparison+of+a+Fluorescent+Solute+with+a+Fluorescent+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus.</a> The Plant Cell. 9 (8), 1381-1396 (1997).</li>
<li>Péron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+into+Phloem+Unloading+and+Expression+of+Sucrose+Transporters+in+Vegetative+Sinks+of+the+Parasitic+Plant+Phelipanche+ramosa+L+%28Pomel%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel).</a> Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).</li>
<li>Spallek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+hormonal+control+of+host+root+morphology+by+parasitic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Interspecies hormonal control of host root morphology by parasitic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (20), 5283-5288 (2017).</li>
<li>Complainville, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodule+initiation+involves+the+creation+of+a+new+symplasmic+field+in+specific+root+cells+of+medicago+species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species.</a> The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).</li>
<li>Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+fluorescent+dyes+Lucifer+Yellow+%28LYCH%29+and+carboxyfluorescein+%28CF%29+in+Medicago+truncatula+Gaertn.+roots+and+root+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Symbiosis%22%5BJournal%5D)">Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules.</a> Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).</li>
<li>Robards, A. W., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Physiology+and+Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).</li>
<li>Roberts, A. G., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+and+the+control+of+symplastic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata and the control of symplastic transport.</a> Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).</li>
<li>Duckett, C. M., Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Dolan, L., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-coupling+in+the+root+epidermis+of+Arabidopsis+is+progressively+reduced+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development.</a> Development. 120 (11), 3247-3255 (1994).</li>
<li>Palevitz, B. A., Hepler, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+dye+coupling+of+stomatal+cells+of+Allium+and+Commelina+demonstrated+by+microinjection+of+Lucifer+yellow%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microinjection of Lucifer yellow.</a> Planta. 164 (4), 473-479 (1985).</li>
<li>van Bel, A. J. E., Kempers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplastic+isolation+of+the+sieve+element-companion+cell+complex+in+the+phloem+of+Ricinus+communis+and+Salix+alba+stems%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems.</a> Planta. 183 (1), 69-76 (1991).</li>
<li>Erwee, M. G., Goodwin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplast+domains+in+extrastelar+tissues+of+Egeria+densa+Planch%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch.</a> Planta. 163 (1), 9-19 (1985).</li>
<li>Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplastic+communication+between+primary+and+developing+lateral+roots+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).</li>
<li>Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Unidirectional+Flow+through+Plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata.</a> Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).</li>
<li>Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+symplasmic+domains+in+the+embryo+and+seed+of+Sedum+acre+L.+%28Crassulaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae).</a> Planta. 245 (3), 491-505 (2017).</li>
<li>Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+Arabidopsis+spreads+from+the+root+to+the+shoot%2C+through+a+gating+barrier%2C+by+template-dependent%2C+non-vascular%2C+cell+to+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement.</a> Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).</li>
<li>Radford, J. E., White, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tissue-preparation-induced+callose+synthesis+on+estimates+of+plasmodesma+size+exclusion+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits.</a> Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).</li>
<li>Kollist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Responses+to+Abiotic+Stress%3A+Priming+the+Landscape+for+the+Signal+Transduction+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network.</a> Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).</li>
<li>Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Symplastic+Phloem+Unloading+in+Sink+Leaves+of+Barley%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley.</a> Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).</li>
<li>Botha, C. E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+xylem+sap+retrieval+pathway+in+rice+leaf+blades%3A+evidence+of+a+role+for+endocytosis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis?</a> Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nowe badania wykazały, że rośliny mogą szybko reagować na bodźce zewnętrzne23, w tym manipulacje wprowadzone do procedur eksperymentalnych22. W naszym początkowym eksperymencie nasze przeoczenie tej wiedzy często prowadzi do niepowodzenia barwienia. Dzięki tym lekcjom sugerujemy, że podczas wykonywania tego eksperymentu należy pamiętać o następujących środkach ostrożności: (1) nasiona po zbiorach powinny być przechowywane w szafce do przechowywania ustawionej na niską tempe...

Wiele znaczników fluorescencyjnych o różnych właściwościach spektralnych, takich jak 5(6)-karboksyfluoresceina (CF)1, kwas 8-hydroksypyreno-1,3,6-trisulfonowy2, Lucyfer żółty CH (LYCH)3, eskulina i CTER4, zostały opracowane i zastosowane w roślinach do monitorowania ruchu symplastycznego i aktywności łyka. Ogólnie rzecz biorąc, barwnik symplastyczny jest ładowany do nacięcia w tkance docelowej, a sekwencyjne rozproszenie reportera na inne części rośliny wykaże komunikację międzykomórkową. Chociaż mechanizm wchłaniania barwnika nie jest w pełni poznany, zasada leżąca u podstaw ruchu mukowiscydozy w żywych komórkach została powszechnie uznana. Forma estrowa CF (CF dioctane, CFDA) jest niefluorescencyjna, ale przepuszczalna przez błonę. Ta właściwość umożliwia szybką dyfuzję barwnika przez błonę do komórek. Po dostaniu się do żywych komórek esterazy wewnątrzkomórkowe usuwają grupy octanowe w pozycji 3' i 6' CFDA, uwalniając fluorescencyjny i nieprzepuszczalny dla błony CF (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1, alternatywnie patrz Wright i wsp.<klasa sup = "xref">2); CF może następnie przemieszczać się przez plazmodesmaty do innych części roślin.
Dobrze znaną procedurą z CFDA jest to, że może być ładowany do liści źródłowych i używany do monitorowania strumienia łyka i rozładunku łyka w tkankach zlewu wielu gatunków, np. jako rozładunek łyka w korzeniu Arabidopsis 5, rozładunek łyka podczas tuberyzacji ziemniaka6, rozładunek łyka w liściach zlewu Nicotiana class7i tak dalej. Stosując podobne podejścia do ładowania, inne badania przyjęły ten barwnik, aby zademonstrować symplastyczne połączenie między gospodarzem a pasożytem8,9, lub aby ujawnić symbiotyczne relacje10,11.
Innym sposobem na wykorzystanie tego barwnika jest załadowanie go do określonych komórek lub pojedynczej komórki za pomocą mikroiniekcji, aby określić jego wzór dystrybucji. Tak wyrafinowane techniki znacznie ułatwiły nam głębsze zrozumienie komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem plazmodesmatów, szczególnie w rozwoju koncepcji domeny symplastycznej12,13. Na przykład mikrowstrzyknięcie CFDA do komórek liścienia Arabidopsis spowodowało powstanie wzorca sprzężenia barwnika w naskórku hipokotylowym, ale braku sprzężenia w komórkach leżących poniżej lub w naskórku korzenia, dlatego naskórek hipokotylowy tworzy domenę symplastyczną14. Podobne domeny, takie jak komórki ochrony aparatów szparkowych15, komórki towarzyszące elementowi sitowemu16, komórki włosaka korzeniowego14 i root cap17,18 zostały zidentyfikowane za pomocą techniki mikroiniekcji. Najbardziej zaskakujące jest to, że niektóre domeny pozwalają cząsteczkom znacznikowym poruszać się w określonym kierunku. Weźmy na przykład domenę trichomów, mikroiniekcja sondy fluorescencyjnej do podtrzymującej komórki naskórka prowadzi do przepływu znacznika do domeny trichomów, jednak odwrotne wstrzyknięcie nie jest prawdziwe19. Niedawny raport wykazał również podobne sytuacje w domenach symplastycznych Sedum embryo20. Tak więc wszystkie powyższe przypadki sugerują, że zamiana miejsc ładowania może prowadzić do nowego wglądu w komunikację symplastyczną. Nasz poprzedni eksperyment mający na celu przeanalizowanie trasy mobilnego wyciszania od korzenia do pędu zidentyfikował nową domenę symplastyczną lub strefę HEJ (połączenie hipokotylowo-epikotylowe), która została następnie zweryfikowana w eksperymencie CFDA z obciążeniem korzeniowym (niekanonicznym obciążeniem zlewu21. W tym miejscu dalej rozwijamy ruch CF od korzenia do pędu za pomocą prostej metody i odzyskujemy potencjalną domenę symplastyczną poprzez przesunięcie miejsc ładowania. Co więcej, procedura ta może być dostosowana do różnicowania tła genetycznego, które ma zmieniony transport na duże odległości od korzenia do pędu.

<table><tbody><tr><td>KNO3&nbsp; &nbsp;</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10017218</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4&nbsp;</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10017608</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4&middot; H2O&nbsp;</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10013418</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4&middot; 2H2O</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10019818</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10004818</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&middot; 7H2O</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10024018</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&middot; 5H2O</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10008218</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2&middot; 6H2O</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10007216</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10017160</td><td></td></tr><tr><td>FeSO4&middot; 7H2O</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10012118</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10009717</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik</td><td>chemiczny NaOH Sinopharm</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik</td><td>chemiczny KOH Sinopharm</td><td>10017018</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10021418</td><td></td></tr><tr><td>Myo-inozytol&nbsp; &nbsp;</td><td>MACKLIN</td><td>I811835</td><td></td></tr><tr><td>Kwas nikotynowy&nbsp;</td><td>MACKLIN</td><td>N814565</td><td></td></tr><tr><td>Pirydoksyna HCl</td><td>MACKLIN</td><td>V820447</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina HCl</td><td>MACKLIN</td><td>T818865</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>MACKLIN</td><td>G800880</td><td></td></tr><tr><td>Agar w proszku</td><td>Novon</td><td>ZZ14022</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom V16</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SDPTOP</td><td>SRE-1030</td><td></td></tr><tr><td>200&mu; l pipeta</td><td>Instrumenty laboratoryjne Dragon</td><td>713111110000-20-200ul</td><td></td></tr><tr><td>2,5 i mu; l pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3120000011</td><td></td></tr><tr><td>Drobne kleszczyki&nbsp;</td><td>PĘSETA</td><td>ST-15</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze dwustronne ze stali nierdzewnej</td><td>Gillette</td><td>Platinum-Plus Ostrze</td><td></td> Dwustronne</tr></tbody></table>

ruch w kierunku strzału smugi cfda załadowanej do tkanek dennego zlewu arabidopsis

Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis

Symplastic tracer 5(6)-dioctan karboksyfluoresceiny (CFDA) jest szeroko stosowany w żywych roślinach, aby zademonstrować połączenie międzykomórkowe, transport łyka i wzór naczyniowy. Protokół ten pokazuje ruch karboksyfluoresceiny (CF) od dołu do góry u Arabidopsis przy użyciu odpowiednio procedury cięcia korzeni i szczypania hipokotylu. Te dwie różne procedury skutkują różną skutecznością ruchu mukowiscydozy: około 91% pojawienia się mukowiscydozy w pędach w przypadku procedury szczypania hipokotylu, podczas gdy tylko około 70% pojawienia się mukowiscydozy w przypadku procedury przycinania korzeni. Prosta zmiana miejsc ładowania, skutkująca znaczącymi zmianami w mobilności tego barwnika symplastycznego, sugeruje, że ruch mukowiscydozy może podlegać regulacji symplastycznej, najprawdopodobniej przez połączenie korzeń-hipokotyl.

Transport symplastyczny często podlega wahaniom środowiskowym. Zaburzenie stanu wzrostu rośliny, a nawet proces przygotowania tkanek, wpływa na granicę wykluczania wielkości plasmodesmat, a tym samym na transport symplastyczny22. Aby zwiększyć wydajność barwienia, wszystkie czynności przeprowadzamy w pomieszczeniu wzrostowym, w którym temperatura i wilgotność są ściśle kontrolowane, a całą procedurę wykonujemy tak szybko, jak to możliwe (idealnie w ciągu 10-15 min ...

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak załadować CFDA do różnych miejsc w dolnych częściach Arabidopsis. Następnie przedstawiamy wynikowy wzór rozmieszczenia mukowiscydozy w pędach.

Ruch w kierunku strzału smugi CFDA załadowanej do tkanek dennego zlewu Arabidopsis

The symplastic tracer 5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) has been widely applied in living plants to demonstrate the intercellular connection, ...

Szeroko stosowana sonda CFDA, czyli skrót od dioctanu karboksyfluoresceiny, jest niefluorescencyjna. Dwie grupy H3 i pozycja 3'6' na tym związku sprawiają, że jest on przepuszczalny dla błony. Tam, gdzie po wejściu do komórek, wewnętrzne octany komórkowe usuną grupy octanowe i uwolnią nową formę CFDA.To karboksyfluoresceina lub CF, która jest fluorescencyjna. A ponieważ ta nowa forma jest mniej przepuszczalna przez błonę, waga, wszystkie komórki muszą przemieszczać się przez pory międzykomórkowe lub plazmodesmaty u roślin, co sprawia, że ten dioctan jest idealną sondą do badania transportu międzykomórkowego w aktywności łyka. W dzisiejszym filmie zademonstrujemy ładowanie CFD odpowiednio do korzenia i hipokotylu roślin Arabidopsis, a także pokażemy, jak te dwie nieco różne procedury wpłyną na ruch od dołu do góry tej sondy fluorescencyjnej.Aby osiągnąć konsekwentne wyniki barwienia, przechowujemy zebrane nasiona Arabidopsis w komorze o temperaturze 40% stopni Celsjusza. Nowo zebrane nasiona przechowywane w tym stanie przez ponad siedem dni są chętnie wykorzystywane do siewu. Aby upewnić się, że każda roślina jest uprawiana w stosunkowo podobnej przestrzeni na szalce Petriego, używamy karty oceny strefy nasiennej.Teraz, zwilżając wysterylizowaną końcówkę, zanurz wysterylizowane nasiona i wysiewaj nasiona pojedynczo w wyznaczonej pozycji. Po zakończeniu siewu uszczelnij szalkę Petriego parafilmem i taśmą klejącą, połóż je na stojaku na szalkę Petriego, aby mogła rosnąć pionowo. Oto narzędzia, których użyjemy w tym eksperymencie.Pamiętaj, że lepiej załadować barwnik tak szybko, jak to możliwe. Zwykle cały proces kończy się w ciągu 10 do 15 minut. Zanim przeprowadzimy eksperyment z ładowaniem CFDA, zawsze przygotowujemy świeże rozwiązanie CFDA.Tutaj przed natychmiastowym użyciem rozcieńczyć jeden milimolowy CFDA do pięciu mikromolowych stężeń z wodą. Pokrój parafilm na małe kawałki o wymiarach trzy na trzy milimetry. Ponieważ na pokrywie i dnie szalki Petriego występuje kondensacja, musimy je usunąć ręcznikiem papierowym, aby uniknąć przepływu barwnika.Pod korzeń umieszcza się mały kawałek parafilmu. Podnieś rośliny i połóż je na pokrywie. Odetnij korzenie około pięciu do 10 milimetrów poniżej hipokotylu.Zabierz pędy z powrotem na małe kawałki parafilmu. Teraz ostrożnie nałóż jeden mikrolitr CFDA na ścinający koniec korzenia. Staraj się unikać skażenia wszystkich proto-roślin.Następnie przykryj pokrywkę, a następnie pozostaw je w pomieszczeniu do wzrostu na dwie godziny. Metoda szczypania hipokotylu. Mały kawałek parafilmu, tak jak wcześniej przygotowany, umieszcza się pod połączeniem korzeń-hipokotyl.Używamy forecep, aby delikatnie uszczypnąć hipokotyl blisko tkanki korzeniowej i ostrożnie nakładamy 0,1 mikrolitra CFDA na ściśniętą stronę i pozostawiamy roślinę na dwie godziny. Zdjęcia od 9 do 12 dnia po strefowym barwieniu roślin. Wszystkie pokazują wzór barwienia naczyń krwionośnych zarówno w liścieniach, jak i prawdziwych liściach.Tylko w bardzo rzadkim przypadku liść liścienia wykazywał wzór barwienia połowy liścia. Zasadniczo więc te dwie metody nie miały wpływu na wzór barwienia CF, jednak jeśli przeprowadzimy ładowanie barwnikiem do coraz większej liczby roślin, okaże się, że te dwie procedury dają znaczną różnicę w wydajności. W przypadku metody wycinania korzeni około 70% roślin wykazuje sygnał fluorescencyjny w pędzie.Ale wydajność można zwiększyć do 91% za pomocą metody szczypania hipokotylu. Próbowaliśmy również metody szczypania korzeni, ale ta metoda skutkuje jeszcze niższą wydajnością, wynosi około 30%Dlatego wydaje się, że sposób ładowania barwnika nie uwzględnia różnicy w barwieniu. Różnica najprawdopodobniej polega na miejscach załadunku, które mogą być oddzielone barierą symplastyczną.Pokazaliśmy, jak ładujemy CFDA do korzeni rzodkiewnika i hipokotylu. Zastosowaliśmy dwie nieco różne procedury, a te dwie nieco różne procedury skutkują znaczącą różnicą w tym ruchu sondy od dołu do góry. Sugerujemy, że ta metoda może pomóc nam zidentyfikować potencjalną barierę symplastyczną dla sygnałów pędzliwych pochodzących z korzeni.

shootward-movement-cfda-tracer-loaded-bottom-sink-tissues

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Molekularne podstawy przestrzennie specyficznych odpowiedzi fitochromów są badane z wykorzystaniem roślin transgenicznych wykazujących deficyty fitochromów specyficzne dla tkanek i organów. W celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w przestrzennie specyficzne odpowiedzi fitochromów stosuje się izolację konkretnych komórek wykazujących indukowane wyczerpanie chromoforu fitochromu za pomocą sortowania komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a następnie analizy mikromacierzy.

Badanie odpowiedzi fitochromów specyficznych dla tkanek i organów z wykorzystaniem profilowania ekspresji specyficznej dla typów komórek wspomaganego przez FACS u Arabidopsis thaliana

Transport makromolekularny między komórkami roślinnymi można oceniać poprzez przejściową ekspresję białka docelowego znakowanego fluorescencyjnie oraz analizę jego rozkładu wewnątrz- i międzykomórkowego za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Analiza makromolekularnego transportu międzykomórkowego in planta z wykorzystaniem bombardowania biolistycznego

Opisujemy zastosowanie perfluorodekaliny jako infiltracyjnego medium montażowego. Jest to prosta metoda poprawiająca głębokość obrazowania w tkance liścia Arabidopsis thaliana przy minimalnym wpływie fizjologicznym.

Prosta metoda obrazowania liści Arabidopsis z wykorzystaniem perfluorodekaliny jako infiltrującego medium obrazującego

Metoda otrzymywania protoplastów z liści Arabidopsis kompatybilna z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS), umożliwiająca badania specyficznych populacji komórkowych. Metoda ta jest zgodna z każdą linią Arabidopsis wykazującą ekspresję GFP w podzbiorze komórek.

Analiza specyficzna dla komórek liści Arabidopsis z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Niniejszy artykuł przedstawia protokół hodowli siewek Arabidopsis w RootChip, mikrofluidycznej platformie obrazowania, która łączy zautomatyzowaną kontrolę warunków wzrostu z mikroskopijnym monitorowaniem korzeni oraz pomiarem wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w oparciu o technikę FRET.

Obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym wzrostu korzeni Arabidopsis z szybką manipulacją środowiskiem korzenia przy użyciu urządzenia RootChip

Ca2+ reguluje różnorodne procesy biologiczne w roślinach. W tym miejscu przedstawiamy podejścia do monitorowania przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2 + wywołanych stresem abiotycznym w komórkach i tkankach rzodkiewnika przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 + Aequorin lub Case12.

Pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2+ u rzodkiewnika

Przedstawiamy prostą i wszechstronną metodę wykonywania fluorescencyjnego obrazowania na żywo liści Arabidopsis thaliana przez dłuższy okres czasu. Używamy transgenicznej rośliny Arabidopsis wykazującej ekspresję fluorescencyjnego genu reporterowego pod kontrolą promotora związanego z odpornością jako przykładu uzyskania czasoprzestrzennego zrozumienia odpowiedzi immunologicznych roślin.

Uniwersalna metoda montażu liści Arabidopsis do przyżyciowego obrazowania poklatkowego

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) oferuje możliwość analizowania programów rozwojowych przy minimalnym przetwarzaniu narządów i tkanek. Protokół zapewnia wysokiej jakości RNA z komórek ukierunkowanych na podjednostkę rybosomalną znakowaną zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Narzędzia do dalszej analizy, takie jak qRT-PCR lub sekwencja RNA, ujawniają profile ekspresji specyficzne dla typu tkanki i komórki.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki

Zewnątrzkomórkowa systemowa sygnalizacja wapniowa wywołana glutaminianem jest kluczowa dla indukcji reakcji obronnych roślin na mechaniczne zranienia i ataki roślinożerców u roślin. W artykule opisano metodę wizualizacji przestrzennej i czasowej dynamiki obu tych czynników przy użyciu roślin Arabidopsis thaliana wykazujących ekspresję wrażliwych na wapń i glutaminian biosensorów fluorescencyjnych.

Szerokokątne obrazowanie w czasie rzeczywistym lokalnych i układowych sygnałów rany u rzodkiewnika

Kilka powszechnie stosowanych metod jest tutaj wprowadzanych do badania zdarzeń transportu błonowego kinazy receptora błony komórkowej. Manuskrypt ten opisuje szczegółowe protokoły, w tym przygotowanie materiału roślinnego, leczenie farmakologiczne i konfokalną.

Oparte na obrazie metody badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii szparkowej

Poznaj metodę ładowania CFDA do korzeni i hipokotylu Arabidopsis w celu badania transportu międzykomórkowego. Technika fluorescencyjna pozwala wizualizować ruch sondy od podstawy do wierzchołka rośliny.

Ruch w kierunku strzału smugi CFDA załadowanej do tkanek dennego zlewu Arabidopsis

Przeglądaj więcej filmów