Test migracji zadrapań i komora grzbietowego fałdu skórnego do analizy gojenia się ran in vitro i in vivo

Tutaj prezentujemy protokół dla testu in vitro z użyciem pierwotnych fibroblastów oraz dla testu in vivo gojenia ran skóry na myszach. Oba testy są prostymi metodami oceny gojenia się ran in vitro i in vivo.

Powstańcza potrzeba leczenia ran skóry. Aby zidentyfikować cząsteczki docelowe do leczenia farmakologicznego, wymagane są systemy testowe in vitro i in vivo. Odpowiednimi systemami są test zarysowania in vitro oraz komora grzbietowego fałdu skórnego in vivo.

Obie są prostymi procedurami monitorowania migracji komórek i gojenia się ran skóry, przy braku i obecności związków farmakologicznie czynnych. Chociaż obie techniki są proste, badacze powinni ćwiczyć aplikację zadrapań. Oraz implantacja i zranienie w komorze fałdu skórnego grzbietowego w celu uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wyników.

Demonstrację procedur przeprowadzi dr Matthias Laschke, chirurg i profesor z Instytutu Chirurgii Klinicznej i Doświadczalnej. Przed rozpoczęciem procedury użyj bardzo cienkiego markera permanentnego, aby oznaczyć jedną sześciodołkową płytkę na typ komórki, z poziomą linią na dole każdej studzienki, aby wyznaczyć obszar zadrapania dla każdej kultury. Następnie wybuchy włókien pierwotnych na płytce wyizolowane od myszy z niedoborem typu dzikiego i beta 3, na płytce sześciodołkowej w stężeniu 5 razy 10 do piątego włókna na studzienkę.

W 2 ml DMEM uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą. Oznacz płytki typem komórki, genotypem i datą. I umieść płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny.

Następnego ranka dodać 9 mikrolitrów każdego interesującego nas odczynnika do transfekcji na bazie lipidów do pojedynczych mikroprobówek wirówkowych zawierających 150 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy na probówkę. Dodać 1,5 mikrolitra siRNA do drugiej mikroprobówki wirówkowej na odczynnik do transfekcji zawierający 150 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy na probówkę. I wymieszaj każdy roztwór siRNA z pojedynczą probówką roztworu odczynnika do transfekcji.

Po krótkim wirowaniu umieść mieszaniny w temperaturze 21 stopni Celsjusza na 5 minut. Podczas inkubacji ostrożnie zastąp supernat w każdym dołku. Z 2,25 ml świeżej pożywki hodowlanej z boku studzienek.

Pod koniec inkubacji dodać 250 mikrolitrów odpowiedniej mieszaniny odczynników do transfekcji siRNA, wsypać do każdej odpowiedniej studzienki komórek. I włóż płytki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych na 72 godziny. Gdy komórki osiągną 100% zbieżność, wyrzuć supernatant kultury z każdej studzienki.

I użyj końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby utworzyć rysę w monowarstwie zlewających się komórek. Pionowo do zaznaczonej linii poziomej na dnie każdej studzienki. Następnie ostrożnie spłucz każdą zranioną studnię 2 razy 2 ml PPS na pranie.

Aby usunąć wszelkie uwolnione czynniki z uszkodzonych komórek, luźne komórki lub zanieczyszczenia z porysowanego obszaru. Po drugim płukaniu dodaj 2 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych uzupełnionej 1 lub 10 procentami surowicy do każdego dołka. I uchwyć obrazy ran na każdej płytce na stoliku mikroskopu świetlnego.

Natychmiast po zadrapaniu przy 10-krotnym powiększeniu. Następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych. Kontynuowanie przechwytywania obrazów w odpowiednich eksperymentalnych punktach czasowych przez następne 30 godzin.

Pod koniec eksperymentu należy określić ilościowo początkową powierzchnię wolną od komórek i pozostałą powierzchnię po 6, 10 i 30 godzinach hodowli. Określa procent obszaru szkicu ponownie zapełnionego przez migrujące komórki w stosunku do początkowego obszaru szkicowania. Po potwierdzeniu braku reakcji na szczypanie palców, w myszy typu dzikiego lub beta three knockout C57 black six, ostrożnie ogol grzbiet.

I nałóż maść na oczy zwierzęcia. Nałóż krem do depilacji, aby usunąć pozostałe włosy. Usunięcie kremu po 10 minutach.

Aby przygotować tytanową komorę, przymocuj jedną część symetrycznej ramy tytanowej komory za pomocą łączących z nakrętkami. Aby zachować od 400 do 500 mikrometrów między dwiema symetrycznymi częściami komory. Aby uniknąć ucisku pęcherzyków krwionośnych w skórze.

Zdezynfekuj odsłoniętą skórę 70% etanolem. I chwyć fałd skóry przed źródłem światła. Umieść środkową linię podwójnej warstwy skóry w miejscu, w którym zostanie wszczepiona tytanowa komora.

I czaszkowo i doogonowo przymocuj fałd skórny za pomocą szwu polipropylenowego. Zaciśnij drugą stronę szwu na metalowym stojaku, aby podnieść złożoną skórę. I dostosuj wysokość stojaka, aby mysz mogła wygodnie siedzieć.

Zszyj pierwszą ramę komory tytanowej za pomocą polipropylenu, zszyj na niej górną krawędź do tylnej części grzbietowego fałdu skórnego. Po ponownym potwierdzeniu sedacji użyj cienkich nożyczek, aby wykonać małe nacięcia w skórze. I przełóż dwie łączące przymocowane do pierwszej połowy tytanowej komory przez podstawę fałdu skórnego.

Wyjmij mysz ze stojaka i umieść zwierzę w pozycji bocznej. Umieść drugą bezpłatną połowę tytanowej komory na 3 łączących. I ręcznie lekko dociśnij, aby przeciągnąć te przez drugą połowę tytanowej ramy.

Złożona warstwa skóry jest teraz umieszczona między dwiema symetrycznymi połówkami tytanowej ramy. Następnie przymocuj obie symetryczne części za pomocą nakrętek ze stali nierdzewnej. Za pomocą standaryzowanego stempla biopsyjnego o średnicy 2 ml zaznacz obszar rany na środku skóry, w okienku obserwacyjnym komory fałdu skórnego.

I użyj cienkich kleszczyków i nożyczek, aby usunąć cały naskórek i skórę właściwą w obrębie znaku. Aby stworzyć okrągłą ranę. Oczyść ranę o powierzchni od 3 i pół do 4 i pół milimetra kwadratowego za pomocą 0,5 ml sterylnego soli fizjologicznej.

I przykryj ranę szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Użyj szczypiec do pierścieni osadczych na tytanowej komorze, aby zamocować szkiełko nakrywkowe na miejscu. I natychmiast przenieś mysz do etapu obrazowania mikroskopu stereoskopowego.

Następnie zobrazuj ranę w 40-krotnym powiększeniu. Przed umieszczeniem myszy w klatce z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia. Po utworzeniu zadrapania za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, jak pokazano, w tym reprezentatywnym eksperymencie komórki z obu genotypów migrowały do obszaru zarysowania i zamknęły lukę.

Migrację komórek określono następnie ilościowo jako procent obszaru zarysowania ponownie zaludnionego przez migrujące komórki 6 godzin po wykonaniu zadrapania. Na przykład w tym eksperymencie migrujące wybuchy z niedoborem włókien Cav beta 3 zamknęły obszar zadrapania znacznie wcześniej niż wybuchy włókien od myszy typu dzikiego. Aby potwierdzić efekt zależny od Cav beta 3 obserwowany w blastach z niedoborem błonnika Cav beta 3, blasty włókien typu dzikiego zostały transfekowane siRNA w celu obniżenia regulacji białka Cav beta 3.

Blasty włókien potraktowane specyficznymi dla Cav beta 3 siRNA zachowywały się jak blasty z niedoborem błonnika beta 3. Aby porównać gojenie się ran skórnych między oboma genotypami, obszar rany w komorze fałdu skórnego został sfotografowany bezpośrednio po zranieniu. Rana była obrazowana przez następne 2 tygodnie.

Rozmiary ran mierzono na obrazach, a powierzchnia rany, w danym dniu, była wyrażona jako procent początkowej powierzchni rany. Zgodnie z oczekiwaniami szybkość zamykania ran była zwiększona u myszy z niedoborem Cav beta 3 w porównaniu z grupą kontrolną typu dzikiego. Upewnij się, że wywierasz równy nacisk na końcówkę pipety, przy każdym zadrapaniu i jak najdokładniej dopasuj rysy do zaznaczonych linii na dnie płytki.

Okienko obserwacyjne komory grzbietowego fałdu skórnego można otworzyć w dowolnym momencie procesu gojenia. Pozwala na miejscowe stosowanie różnych związków farmakologicznie czynnych. Możliwe jest również wycięcie zranionego obszaru na różnych etapach procesu gojenia.

Do analizy biochemicznej lub histologicznej białek molekularnych.