Test do ilościowego określania wiązania białka-RNA u bakterii
12 czerwca 2019
W tej metodzie, określamy ilościowo powinowactwo wiązania białek wiążących RNA (RBP) do pokrewnych i niepokrewnych miejsc wiązania za pomocą prostego, żywego, reporterowego testu w komórkach bakteryjnych. Test opiera się na represji genu reporterowego.
Charakterystyka wiązania białek z RNA in vivo pozostaje dużym wyzwaniem ze względu na złożony charakter RNA i wiele czynników wpływających na jego interakcję z białkami. Białko wiążące RNA lub powinowactwo RBP-RNA mierzy się w żywych komórkach bakteryjnych. Ponieważ środowisko komórkowe wpływa zarówno na strukturę RNA, jak i wynikowe wiązanie RBP-RNA, pomiar powinowactwa in vivo ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia takich interakcji w systemach naturalnych.
Sekret sukcesu tkwi w konstrukcji plazmidów. W projekcie należy wykorzystać kilka fal delta i unikać wstawiania kodonów stop i mutacji przesunięcia ramki odczytu. Rozpocznij ten protokół od zaprojektowania kasety miejsca wiązania.
Każdy mini gen zawiera miejsce restrykcyjne EagI, 40 zasad z pięciu głównych końców genu oporności na kanamycynę, promotor pLac / Ara, miejsce wiązania rybosomów, AUG genu mCherry, dystans, miejsce wiązania RBP, 80 zasad z pięciu głównych końców genu mCherry i miejsce restrykcyjne ApaLI. Aby zwiększyć wskaźnik powodzenia testu, należy zaprojektować trzy kasety w miejscu wiązania dla każdego miejsca wiązania z przekładkami składającymi się z co najmniej jednej, dwóch i trzech podstaw. Podwójne trawienie zarówno mini genów, jak i wektora docelowego za pomocą EagI, HF i ApaLI przed wykonaniem oczyszczania kolumnowego składników trawiennych.
Zwiąż strawione mini geny ze szkieletem miejsca wiązania zawierającym resztę genu reporterowego mCherry, terminatora i genu oporności na kanamycynę. Następnie przekształć roztwór ligacji w 10 najlepszych komórek Escherichia coli. Po zidentyfikowaniu dodatnich transformantów za pomocą sekwencjonowania Sangera, oczyszczone plazmidy należy przechowywać w formacie 96 dołków w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.
Szczepy bakterii należy również przechowywać w postaci zapasów glicerolu w formacie 96 dołków w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Zamówienie niestandardowe wymaganej sekwencji RBP bez kodonu stop jako dwuniciowego mini genu DNA z miejscami restrykcyjnymi na końcach. Przekształć przygotowane plazmidy w chemicznie kompetentne komórki bakteryjne zawierające już plazmid RBP mCerulean.
Aby zaoszczędzić czas, należy poszczepić komórki za pomocą pipetera ośmiokanałowego na ośmiopasmowych płytkach zawierających agar Luria-Bertani z odpowiednimi antybiotykami. Kolonie powinny pojawić się w ciągu 16 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wybierz pojedynczą kolonię dla każdego podwójnego transformantu i przenieś do 48 płytek dołkowych zawierających 1,5 mililitra LB z odpowiednimi antybiotykami.
Hoduj komórki przez okres 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 250 obr./min. Przechowuj nocki jako zapas glicerolu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w 96-dołkowych płytkach. Rano zaprogramuj robota tak, aby podgrzał 180 mikrolitrów podłoża półporowego lub SPM w 96-dołkowych płytkach.
Zaprogramuj robota tak, aby przygotował płytkę induktora. Na czystej 96-dołkowej płytce przygotuj dołki z SPM składającym się z 95% BA i 5% LB. Liczba studzienek odpowiada pożądanej liczbie stężeń induktora.
Dodaj C4-HSL do studzienek w płytce induktora, które będą zawierały najwyższe stężenie induktora. Następnie zaprogramuj robota tak, aby seryjnie rozcieńczał pożywkę z każdej z dołków o najwyższym stężeniu do 23 niższych stężeń w zakresie od zera do 218 nanomolów. Objętość każdego rozcieńczenia induktora powinna być wystarczająca dla wszystkich szczepów.
Aby rozcieńczyć szczepy na noc, zaprogramuj robota tak, aby rozcieńczał 10-krotnie, mieszając 20 mikrolitrów bakterii ze 180 mikrolitrami SPM w 48-dołkowych płytkach. Następnie ponownie rozcieńczyć 10-krotnie, pobierając 20 mikrolitrów z rozcieńczonego roztworu na wstępnie przygotowaną płytkę naprężającą odpowiednią do pomiaru fluorescencyjnego. Teraz zaprogramuj robota tak, aby dodał rozcieńczony induktor z płytki induktora do 96-dołkowych płytek z rozcieńczonymi szczepami zgodnie z końcowymi stężeniami.
Potrząsaj 96-dołkowymi płytkami w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin. W tym czasie co 30 minut należy wykonywać pomiary gęstości optycznej lub średnicy zewnętrznej przy 595 nanometrach, a także fluorescencji mCherry i mCerulean za pomocą czytnika płytek. W celu normalizacji zmierz wzrost SPM bez dodawania komórek.
Pokazano tutaj trójwymiarowe wykresy dla dodatniego szczepu. Wykresy przedstawiają surowe poziomy OD, fluorescencję mCerulean i fluorescencję mCherry w funkcji czasu i stężenia induktora. Poziomy ekspresji w stanie ustalonym mCerulean obliczono dla każdego stężenia induktora zarówno dla szczepów dodatnich, jak i ujemnych.
Szybkość produkcji mCherry została również obliczona dla każdego stężenia induktora zarówno dla szczepów dodatnich, jak i ujemnych. Szybkość produkcji mCherry wykreślono jako funkcję średniej fluorescencji mCerulean uśrednionej dla dwóch duplikatów biologicznych dla dwóch szczepów. Pasowanie KRBP przy użyciu wzoru dopasowania jest pokazane dla dodatniego szczepu wykazującego specyficzną odpowiedź wiązania.
Dla szczepu ujemnego nie wyodrębniono wartości KRBP. Znormalizowane krzywe odpowiedzi na dawkę określono dla 30 różnych szczepów w oparciu o dwa RBP jako 10 miejsc wiązania w różnych lokalizacjach. Obserwuje się trzy typy reakcji: wysokie powinowactwo, niskie powinowactwo i brak powinowactwa.
Poniżej przedstawiono ilościowe wyniki KRBP dla dwóch RBP, białka płaszcza MS2 i białka płaszcza PP7 z 10 różnymi kasetami miejsc wiązania. Przedstawiono tutaj krzywe odpowiedzi na dawkę dla białka płaszcza MS2 z miejscem wiązania mutanta w czterech różnych miejscach, aby pokazać wpływ odstępów między mutantami na produkcję mCherry. Pokazana jest sekwencja badanego zmutowanego miejsca wiązania.
Ważne jest, aby zastosować technikę strukturalną, taką jak shape seek, aby chemicznie zbadać strukturę kompleksu białko-RNA i zwizualizować, na które regiony mRNA wpływa wiązanie RNA. Ostatnio zastosowaliśmy tę technikę w sposób wysokoprzepustowy, aby jednocześnie zmierzyć powinowactwo RBP do 10 000 miejsc wiązania.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Metoda ta pozwala na ilościowe określenie powinowactwa wiązania białek wiążących RNA (RBP) do cognatywnych i niecognatywnych miejsc wiązania z wykorzystaniem testu z reporterem w żywych komórkach bakteryjnych. Test opiera się na represji genu reporterowego, co dostarcza informacji na temat oddziaływań RBP-RNA in vivo.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Białka wiążące RNA
- Interakcje białko-RNA
- Analizy na żywych komórkach
Wstęp
- Charakterystyka wiązania białek z RNA in vivo jest trudna ze względu na złożoność RNA.
- Środowisko komórkowe wpływa na strukturę RNA oraz wiązanie RBP-RNA.
- Pomiar powinowactwa in vivo jest niezbędny do zrozumienia naturalnych oddziaływań.
- Projekt plazmidu jest kluczowy dla powodzenia analiz.
Cel badania
- W celu zmierzenia powinowactwa RBP-RNA w żywych komórkach bakteryjnych.
- W celu zrozumienia wpływu środowiska komórkowego na oddziaływania RNA-białko.
- W celu udoskonalenia projektowania plazmidów dla kaset miejsc wiązania.
Zastosowane metody
- Projektowanie kaset miejsc wiązania dla plazmidów.
- Wykorzystanie żywych komórek bakteryjnych do pomiarów powinowactwa.
- Unikanie kodonów stop oraz mutacji przesunięcia ramki odczytu w projekcie plazmidu.
- Zastosowanie testu represji genu reporterowego.
Główne wyniki
- Skuteczne określenie ilościowe powinowactw wiązania RBP.
- Wgląd w wpływ warunków komórkowych na oddziaływania RBP-RNA.
- Efektywne projekty plazmidów zwiększają niezawodność testu.
- Wykazano użyteczność testów w żywych komórkach do badania wiązania RNA.
Wnioski
- Pomiary in vivo dostarczają kluczowych informacji na temat dynamiki RBP-RNA.
- Projekt plazmidu jest kluczowy dla pomyślnego przeprowadzenia testów wiązania RNA.
- Metoda ta może przyczynić się do lepszego zrozumienia oddziaływań RNA-białko.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe określanie powinowactwa wiązania białek do RNA w żywych komórkach bakteryjnych rozwiązuje kluczowy problem na etapie wczesnego odkrywania leków, umożliwiając bezpośredni pomiar oddziaływań molekularnych w warunkach fizjologicznych. Analiza ta zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu i dostarcza informacji niezbędnych do minimalizacji ryzyka mechanistycznego w portfelach projektów poszukiwania leków oddziałujących na białka wiążące RNA (RBP). Kontekst in vivo oraz ilościowe wyniki pozycjonują tę metodę jako wartościowe narzędzie do selekcji celów i optymalizacji wyboru związków wiodących w programach terapeutycznych skoncentrowanych na RNA.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne Etapy Odkrywania i Walidacja Celów
- Umożliwia bezpośrednią analizę specyficzności i powinowactwa wiązania RBP-RNA w żywych komórkach.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez rozróżnienie oddziaływań o wysokim, niskim i zerowym powinowactwie.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ujawnianie zależnych od kontekstu efektów wiązania.
- Dostarcza danych ilościowych niezbędnych do podejmowania decyzji go/no-go podczas selekcji celów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowany, skalowalny test reporterowy do oceny wiązania RBP w wielu miejscach.
- Umożliwia generowanie powtarzalnych, ilościowych krzywych dawka-odpowiedź w celu porównania powinowactwa.
- Umożliwia wysokoprzepustowy screening wariantów RBP oraz mutantów miejsc wiązania.
- Wspiera przygotowanie testu do późniejszej oceny związków ukierunkowanych na oddziaływania RNA-białko.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje dane o wiązaniu in vivo z systemami bakteryjnymi istotnymi dla przebiegu choroby, gdy jest to możliwe.
- Zapewnia ciągłość od oceny wiązania na etapie odkrywania do wyboru modelu przedklinicznego.
- Umożliwia dostosowanie dalszych działań do poziomu ryzyka poprzez ilościowe określenie zaangażowania funkcjonalnego w kontekście komórkowym.
- Wspiera rozwój biomarkerów translacyjnych dla terapii celowanych w RBP.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy test integruje się z procesem badawczym, od wczesnej walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, wspierając zarówno badania mechanistyczne, jak i procesy przesiewowe w zakresie oddziaływań RNA-białko.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe pomiary wiązania wyjaśniają specyficzność i znaczenie funkcjonalne oddziaływań między RBP a RNA.
- Przesiewanie: Ustandaryzowane wyniki z reporterów umożliwiają powtarzalne porównanie różnych miejsc wiązania i wariantów RBP.
- Analityka: Krzywe dawka-odpowiedź oraz wartości KRBP dostarczają praktycznych mierników do porównywania warunków i selekcji portfolio.
- Badania translacyjne: Dane in vivo wspierają dopasowanie do modeli bakteryjnych istotnych dla danej choroby, gdy jest to właściwe.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Format testu jest adaptowalny dla różnych kombinacji RBP i miejsc wiązania, co wspiera skalowalność platformy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów RBP.
- Wartość operacyjna: Oferuje zestandaryzowane, skalowalne i powtarzalne ilościowe określanie powinowactwa in vivo.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczenie solidnych danych o wiązaniu na wczesnym etapie procesu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów nakierowanych na RNA.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy w zakresie projektowania plazmidów i genetycznej manipulacji bakteriami.
- Wymaga dostępu do fluorometrycznych czytników płytek oraz podstawowej infrastruktury biologii molekularnej.
- Wymaga standaryzacji warunków testowych i potoków analizy danych pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji w przypadku miejsc wiązania o wysokiej złożoności strukturalnej ze względu na potencjalną represję tła.
- Ograniczone do systemów bakteryjnych; rozszerzenie na inne organizmy może wymagać modyfikacji protokołu.
