Name: Test do ilościowego określania wiązania białka-RNA u bakterii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Poznaj metodę ilościowego określania wiązania białek RNA z RNA w żywych komórkach bakteryjnych. Technika ta wykorzystuje test z genem reporterowym do badania interakcji białko-RNA in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt otrzymał finansowanie z programu I-CORE Komitetu Planowania i Budżetu oraz Izraelskiej Fundacji Naukowej (Grant nr 152/11), Marie Curie Reintegration Grant No. PCIG11-GA- 2012-321675, oraz z Programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 na podstawie umowy o dofinansowanie nr 664918 - MRG-Grammar.

1. Przygotowanie systemu
<ol>
	<li>Projektowanie plazmidów w miejscu wiązania 
	<ol>
		<li>Zaprojektuj kasetę z miejscem wiązania, jak pokazano na rysunku Rysunek 1. Każdy minigen zawiera następujące części (od 5' do 3'): miejsce restrykcji Eagl, ∼40 zasad końca 5' genu oporności na kanamycynę (Kan), promotor pLac-Ara, miejsce wiązania rybosomów (RBS), AUG genu mCherry, dystans (δ), miejsce wiązania RBP, 80 zasad końca 5' genu mCherry, oraz strona z ograniczeniami ApaLI. 
		nuta: Aby zwiększyć wskaźnik powodzenia testu, zaprojektuj trzy kasety z miejscem wiązania dla każdego miejsca wiązania, z przekładkami składającymi się z co najmniej jednej, dwóch i trzech podstaw. Więcej informacji na temat wyników można znaleźć w sekcji Reprezentatywne wyniki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Klonowanie plazmidów w miejscu wiązania
	<ol>
		<li>Uporządkuj kasety miejsca wiązania jako minigeny dwuniciowego DNA (dsDNA). Każdy minigen ma długość ∼500 pz i zawiera miejsce restrykcji Eagl i miejsce restrykcyjne ApaLI odpowiednio na końcach 5' i 3' (patrz krok 1.1.1). 
		nuta: W tym eksperymencie mini-geny z połową genu kanamycyny zostały uporządkowane, aby ułatwić badania przesiewowe w kierunku dodatnich kolonii. Jednak Gibson assembly17 jest również odpowiedni tutaj, w którym to przypadku miejsce wiązania można uporządkować jako dwa krótsze komplementarne jednoniciowe oligonukleotydy DNA.</li>
		<li>Podwójnie trawij zarówno mini-geny, jak i wektor docelowy za pomocą Eagl-HF i ApaLI za pomocą protokołu restrykcji18 i kolumny purify19.</li>
		<li>Zwiąż strawione minigeny ze szkieletem miejsca wiązania zawierającym resztę genu reporterowego mCherry, terminatora i genu oporności na kanamycynę20.</li>
		<li>Przekształć roztwór do ligacji w komórki Escherichia coli TOP1021.</li>
		<li>Identyfikacja dodatnich transformantów za pomocą sekwencjonowania Sangera.
		<ol>
			<li>Zaprojektuj starter 100 zasad przed obszarem zainteresowania (patrz Tabela 1, aby zapoznać się z sekwencjami starterów).</li>
			<li>Miniprzygotuj kilka kolonii bakterii22.</li>
			<li>Przygotować 5 μl 5 mM roztworu startera i 10 μl DNA o stężeniu 80 ng/μl.</li>
			<li>Wyślij dwa roztwory do wygodnego obiektu do sekwencjonowania Sanger23.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Oczyszczone plazmidy należy przechowywać w temperaturze -20 °C, a szczepy bakteryjne jako zapasy glicerolu24, oba w formacie 96-dołkowym. DNA zostanie następnie wykorzystane do transformacji w komórki TOP10 E. coli zawierające jeden z czterech plazmidów fuzyjnych RBP (patrz krok 1.3.5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Projektowanie i budowa plazmidu RBP 
	nuta: Sekwencje aminokwasowe i nukleotydowe białek płaszcza użytych w tym badaniu wymieniono w tabeli 2.
	<ol>
		<li>Uporządkuj wymaganą sekwencję RBP bez kodonu stop jako niestandardowo uporządkowany minigen dsDNA bez kodonu stop z miejscami restrykcyjnymi na końcach (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</silna></li>
		<li>Sklonuj badany RBP pozbawiony kodonu stop bezpośrednio za indukowalnym promotorem i przed białkiem fluorescencyjnym pozbawionym kodonu start (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), podobnie jak w krokach 1.2.2-1.2.4. Upewnij się, że plazmid RBP zawiera inny gen oporności na antybiotyki niż plazmid miejsca wiązania.</silna></li>
		<li>Zidentyfikuj transformanty dodatnie za pomocą sekwencjonowania Sangera, podobnie jak w kroku 1.2.5 (patrz Tabela 1 dla sekwencji starterów).</li>
		<li>Wybierz jeden dodatni transformant i spraw, aby był kompetentny chemicznie25. Przechowywać w temperaturze -20 °C jako oczyszczone plazmidy z glicerolem i zapasy glicerolu szczepów bakteryjnych24 w temperaturze -80 °C na płytkach 96-dołkowych.</li>
		<li>Przekształć plazmidy w miejscu wiązania (z kroku 1.2.6) przechowywane w 96-dołkowych płytkach w chemicznie kompetentne komórki bakteryjne już zawierające plazmid RBP-mCerulean 21. Aby zaoszczędzić czas, zamiast posiewać komórki na szalkach Petriego, posmaruj je za pomocą 8-kanałowego pipetora na 8-pasmowych płytkach zawierających agar Luria-Bertani (LB)26 z odpowiednimi antybiotykami (Kan i Amp). Rodziny powinny pojawić się w ciągu 16 godzin.</li>
		<li>Wybierz pojedynczą kolonię dla każdego podwójnego transformantu i hoduj przez noc w pożywce LB z odpowiednimi antybiotykami (Kan i Amp) i przechowuj jako zapasy glicerolu24 w temperaturze -80 °C na 96-dołkowych płytkach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Konfiguracja eksperymentu
UWAGA: Przedstawiony tutaj protokół został wykonany przy użyciu robotycznego systemu obsługi płynów w połączeniu z inkubatorem i czytnikiem płytek. Każdy pomiar przeprowadzono dla 24 stężeń induktora, z dwoma duplikatami dla każdej kombinacji szczep + induktor. Za pomocą tego zrobotyzowanego systemu zebrano dane dla 16 szczepów dziennie o 24 stężeniach induktorów. Jeśli jednak takie urządzenie jest niedostępne lub jeśli potrzeba mniej eksperymentów, można je łatwo wykonać ręcznie za pomocą 8-kanałowej pipety wielokanałowej i odpowiednio dostosowując protokół. W ten sposób uzyskano na przykład wstępne wyniki dla czterech szczepów dziennie o 12 stężeniach induktora i czterech punktach czasowych.
<ol>
	<li>Przygotuj wcześniej 1 l buforu do testu biologicznego (BA), mieszając 0,5 g tryptonu, 0,3 ml glicerolu, 5,8 g NaCl, 50 ml 1 M MgSO4, 1 ml 10x buforu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o pH 7,4 i 950 ml podwójnie destylowanej wody (DDW). Autoklaw lub sterylny filtr buforu BA.</li>
	<li>Szczepy z podwójną transformacją należy hodować w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 250 obr./min, wytrząsając w 1,5 ml LB z odpowiednimi antybiotykami (kanamycyna w końcowym stężeniu 25 μg/ml i ampicylina w końcowym stężeniu 100 μg/ml), na 48-dołkowych płytkach, przez okres 18 godzin (przez noc).</li>
	<li>Rano przygotuj następujące preparaty.
	<ol>
		<li>Płytka induktora. Na czystej 96-dołkowej płytce przygotować studzienki z podłożem półubogim (SPM) składającym się z 95% BA i 5% LB26 w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Liczba studzienek odpowiada pożądanej liczbie stężeń induktora. Dodaj C4-HSL do studzienek w płytce induktora, które będą zawierały najwyższe stężenie induktora (218 nM).</li>
		<li>Zaprogramuj robota tak, aby seryjnie rozcieńczał medium z każdej ze studni o najwyższym stężeniu do 23 niższych stężeń w zakresie od 0 do 218 nM. Objętość każdego rozcieńczenia induktora powinna być wystarczająca dla wszystkich szczepów (w tym duplikatów).</li>
		<li>Podczas przygotowywania rozcieńczeń induktora należy ogrzać 180 μl SPM w inkubatorze w temperaturze 37 °C na płytkach 96-dołkowych.</li>
		<li>Rozcieńczyć szczepy przez noc z kroku 2.2 przez współczynnik 100 przez seryjne rozcieńczenia: najpierw rozcieńczyć 100 μl bakterii przez zmieszanie 100 μl SPM na płytkach 48-dołkowych, a następnie ponownie rozcieńczyć 10-krotnie, pobierając 20 μl z rozcieńczonego roztworu do 180 μl wstępnie podgrzanego SPM, w 96-dołkowych płytkach odpowiednich do pomiarów fluorescencyjnych.</li>
		<li>Dodać rozcieńczony induktor z płytki induktora do 96-dołkowych płytek z rozcieńczonymi szczepami zgodnie z końcowymi stężeniami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytrząsać 96-dołkowe płytki w temperaturze 37 °C przez 6 godzin, wykonując pomiary gęstości optycznej przy fluorescencji 595 nm (OD595), mCherry (560 nm/612 nm) i mCerulean (460 nm/510 nm) za pomocą czytnika płytek co 30 minut. W celu normalizacji zmierz wzrost SMP bez dodawania komórek.</li>
</ol>
3. Wstępna analiza wyników
<ol>
	<li>Dla każdego dnia eksperymentu wybierz przedział czasowy wzrostu logarytmicznego zgodnie ze zmierzonymi krzywymi wzrostu, między fazą wzrostu liniowego a fazą stacjonarną (T0, Tkońcowy). Weź około 6−8 punktów czasowych, odrzucając pierwszy i ostatni pomiar, aby uniknąć błędu wynikającego z niedokładności wykrywania wzrostu wykładniczego (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2A, górny panel). 
	nuta: Odrzuć szczepy, które wykazują nieprawidłowe krzywe wzrostu lub szczepy, w których nie można było wykryć logarytmicznej fazy wzrostu i powtórz eksperyment.</silna></li>
	<li>Oblicz średnią znormalizowaną fluorescencję mCerulean i szybkość produkcji mCherry, na podstawie surowych danych zarówno fluorescencji mCerulean, jak i mCherry dla każdego stężenia induktora (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A</silna>).
	<ol>
		<li>Oblicz znormalizowany mCerulean w następujący sposób: 
		<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq1.jpg"> 
		gdzie ślepa próba (mCerulean) jest poziomem mCerulean [a.u.] tylko dla pożywki, ślepa próba (OD) jest gęstością optyczną tylko dla pożywki, a mCerulean i OD to odpowiednio wartości fluorescencji mCerulean i gęstości optycznej.</li>
		<li>Średnia mCerulean w różnych punktach czasowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B, dwa górne panele) w następujący sposób: 
		<img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq2.jpg"> 
		gdzie #Time punktów oznacza liczbę uwzględnianych punktów czasowych danych, T0 jest czasem, w którym rozpoczyna się faza wzrostu wykładniczego, a Tkońcowy jest czasem, w którym kończy się faza wzrostu wykładniczego.</silna></li>
		<li>Oblicz wskaźnik produkcji mCherry (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B, dwa dolne panele) w następujący sposób: 
		<img alt="Równanie 3" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq3.jpg"> 
		gdzie mCherry(t) to poziom mCherry [a.u.] w czasie t, OD to wartość gęstości optycznej, T0 to czas, w którym rozpoczyna się faza wzrostu wykładniczego, a Tfinal to czas, w którym kończy się faza wzrostu wykładniczego.</silna></li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na koniec wykreśl szybkość produkcji mCherry jako funkcję mCerulean, tworząc krzywe odpowiedzi na dawkę jako funkcję fluorescencji fuzyjnej RBP-mCerulean (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). Takie wykresy reprezentują produkcję genu reporterowego w funkcji obecności RBP w komórce.</silna></li>
</ol>
4. Funkcja odpowiedzi na dawkę, dopasowywanie rutyny i ekstrakcjiK RBP
<ol>
	<li>Zakładając, że szybkość translacji rybosomów z wiązanym RBP jest stała, modeluj tempo produkcji mCherry w następujący sposób (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2D, zielona linia): 
	<img alt="Równanie 4" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq4.jpg"> 
	gdzie [x] jest znormalizowaną średnią fluorescencją mCerulean obliczoną zgodnie z równaniem 2, szybkość produkcji mCherry jest wartością obliczoną zgodnie z równaniem 3, KRBP jest względnym powinowactwem wiązania [a.u.], Kunbound jest szybkością translacji rybosomu przy niezwiązanym RBP, n jest współczynnikiem kooperatywności, a C jest fluorescencją zasadową [a.u.]. C, n, Kniezwiązane i KRBP określa się, dopasowując dane dotyczące szybkości produkcji mCherry do modelu (równanie 4).</silna></li>
	<li>Korzystając z oprogramowania do analizy danych, przeprowadź procedurę dopasowania na poletkach przedstawiających szybkość produkcji mCherry jako funkcję uśrednionego mCerulean (krok 3.3) i wyodrębnij parametry dopasowania zgodnie ze wzorem w równaniu 4. 
	nuta: Pod uwagę brane są tylko wyniki dopasowania z R2 &gt; 0,6. W przypadku tych dopasowań błąd KRBP mieści się najczęściej w zakresie od 0,5% do 20% wartości KRBP, dla przedziału ufności 0,67, podczas gdy te z wyższym błędemK RBP można również zweryfikować na oko.</li>
	<li>Znormalizować wartościK RBP przez odpowiednią maksymalną wartość uśrednionego mCerulean dla każdej funkcji dawka-odpowiedź. 
	<img alt="Równanie 5" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq5.jpg"> 
	gdzie KRBP w [a.u.] jest wartością uzyskaną z procedury dopasowania w równaniu 4, a max (uśredniony mCerulean) jest maksymalnym uśrednionym sygnałem mCerulean [a.u] obserwowanym dla bieżącego odkształcenia. 
	nuta: Normalizacja ułatwia prawidłowe porównanie efektu regulacyjnego między szczepami poprzez wyeliminowanie zależności od poszczególnych maksymalnych poziomów ekspresji RBP.</li>
</ol>

<ol><li>Cerretti, D. P., Mattheakis, L. C., Kearney, K. R., Vu, L., Nomura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+regulation+of+the+spc+operon+in+Escherichia+coli.+Identification+and+structural+analysis+of+the+target+site+for+S8+repressor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein.</a> Journal of Molecular Biology. 204 (2), 309-329 (1988).</li>
<li>Babitzke, P., Baker, C. S., Romeo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+translation+initiation+by+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of translation initiation by RNA binding proteins.</a> Annual Review of Microbiology. 63, 27-44 (2009).</li>
<li>Van Assche, E., Van Puyvelde, S., Vanderleyden, J., Steenackers, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+involved+in+post-transcriptional+regulation+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins involved in post-transcriptional regulation in bacteria.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 141(2015).</li>
<li>Chappell, J., Watters, K. E., Takahashi, M. K., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+renaissance+in+RNA+synthetic+biology%3A+new+mechanisms%2C+applications+and+tools+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 28, 47-56 (2015).</li>
<li>Wagner, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule-based+regulation+of+RNA-delivered+circuits+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells.</a> Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043(2018).</li>
<li>Bendak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+assessing+the+RNA-binding+potential+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein.</a> Nucleic Acids Research. 40 (14), e105(2012).</li>
<li>Strein, C., Alleaume, A. -M., Rothbauer, U., Hentze, M. W., Castello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+assay+for+RNA-binding+proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A versatile assay for RNA-binding proteins in living cells.</a> RNA. 20 (5), 721-731 (2014).</li>
<li>Ule, J., Jensen, K. B., Ruggiu, M., Mele, A., Ule, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li>
<li>Lee, F. C. Y., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+CLIP+Technologies+for+Studies+of+Protein-RNA+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions.</a> Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).</li>
<li>Katz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+Vivo+Binding+Assay+for+RNA-Binding+Proteins+Based+on+Repression+of+a+Reporter+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).</li>
<li>Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+RNA+structures+in+vitro+and+in+vivo+with+selective+2%E2%80%99-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+%28SHAPE-Seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Methods. 103, 34-48 (2016).</li>
<li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+translational+regulation+by+an+L7Ae-kink-turn+RNP+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch.</a> Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).</li>
<li>Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+properties+of+the+coat+protein+from+bacteriophage+GA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).</li>
<li>Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+binding+site+of+bacteriophage+MS2+coat+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein.</a> The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).</li>
<li>Lim, F., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+recognition+site+of+PP7+coat+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RNA recognition site of PP7 coat protein.</a> Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).</li>
<li>Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+Site+of+Bacteriophage+Q%CE%B2+Coat+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding Site of Bacteriophage Qβ Coat Protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (50), 31839-31845 (1996).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>NEB. Optimizing Restriction Endonuclease Reactions. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions">https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/optimizing-restriction-endonuclease-reactions</a> (2018).</li>
<li>Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/">https://worldwide.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/wizard-sv-gel-and-pcr-cleanup-system-protocol/</a> (2018).</li>
<li>NEB. Ligation Protocol with T4 DNA Ligase (M0202). , Available from:
 <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202">https://international.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202</a> (2018).</li>
<li>Routine Cloning Using Top10 Competent Cells - US. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html">https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cloning/competent-cells-protocol/routine-cloning-using-top10-competent-cells.html</a> (2018).</li>
<li>NucleoSpin Plasmid - plasmid Miniprep kit. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx">https://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/DNAandRNApurification/PlasmidDNApurificationeasyfastreliable/NucleoSpinPlasmidplasmidMiniprepkit/tabid/1379/language/en-US/Default.aspx</a> (2018).</li>
<li>Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+in+single-stranded+bacteriophage+as+an+aid+to+rapid+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing.</a> Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).</li>
<li>Addgene. Protocol - How to Create a Bacterial Glycerol Stock. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/">https://www.addgene.org/protocols/create-glycerol-stock/</a> (2018).</li>
<li>NEB. Making your own chemically competent cells. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells">https://international.neb.com/protocols/2012/06/21/making-your-own-chemically-competent-cells</a> (2018).</li>
<li>Luria-Bertani (LB) Medium Preparation · Benchling. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation">https://benchling.com/protocols/gdD7XI0J/luria-bertani-lb-medium-preparation</a> (2018).</li>
<li>Delebecque, C. J., Silver, P. A., Lindner, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+and+using+RNA+scaffolds+to+assemble+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Designing and using RNA scaffolds to assemble proteins in vivo.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1797-1807 (2012).</li>
<li>Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+gene+expression+using+two-color+RNA+labeling+in+live+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast.</a> Nature Methods. 10 (2), 119-121 (2013).</li>
<li>Espah Borujeni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+quantification+of+translation+inhibition+by+mRNA+structures+that+overlap+with+the+ribosomal+footprint+in+N-terminal+coding+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences.</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505, (2013).</li>
<li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li>
<li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2%E2%80%99-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+%28SHAPE-Seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).</li>
<li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486(2015).</li>
<li>Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+characterization+of+cellular+RNA+structure+and+function+with+in-cell+SHAPE-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq.</a> Nucleic Acids Research. 44 (2), e12(2016).</li>
<li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).</li>
<li>Bernardi, A., Spahr, P. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+Sequence+at+the+Binding+Site+for+Coat+Protein+on+RNA+of+Bacteriophage+R17%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana w artykule metoda ułatwia ilościowy pomiar in vivo powinowactwa wiązania RBP-RNA w komórkach E. coli . Protokół jest stosunkowo łatwy i można go przeprowadzić bez użycia zaawansowanych maszyn, a analiza danych jest prosta. Co więcej, wyniki są uzyskiwane natychmiast, bez stosunkowo długiego czasu oczekiwania związanego z wynikami sekwencjonowania nowej generacji (NGS).
Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że działa ona tylko w komórkach bakteryjnych. Jednak poprzednie badan...

Regulacja potranskrypcyjna oparta na białku wiążącym RNA (RBP), a konkretnie charakterystyka interakcji między RBP a RNA, była intensywnie badana w ostatnich dziesięcioleciach. Istnieje wiele przykładów translacyjnej regulacji w dół u bakterii pochodzących z RBP hamujących lub bezpośrednio konkurujących z wiązaniem rybosomów1,2,3. W dziedzinie biologii syntetycznej interakcje RBP-RNA stają się znaczącym narzędziem do projektowania obwodów genetycznych opartych na transkrypcji4,5. W związku z tym rośnie zapotrzebowanie na charakterystykę takich oddziaływań RBP-RNA w kontekście komórkowym.
Najczęstszymi metodami badania interakcji białko-RNA są test przesunięcia mobilności elektroforetycznej (EMSA)6, który jest ograniczony do ustawień in vitro, oraz różne testy pull-down7, w tym metoda CLIP8,9. Chociaż takie metody umożliwiają odkrycie miejsc wiązania RNA de novo, mają wady, takie jak pracochłonne protokoły i kosztowne reakcje głębokiego sekwencjonowania, a także mogą wymagać specyficznego przeciwciała do ściągania RBP. Ze względu na podatność RNA na środowisko, wiele czynników może wpływać na interakcje RBP-RNA, podkreślając znaczenie badania wiązania RBP-RNA w kontekście komórkowym. Na przykład, my i inni wykazaliśmy znaczące różnice między strukturami RNA in vivo i in vitro10,11.
Na podstawie podejścia poprzedniego badania12, niedawno wykazaliśmy10, że podczas umieszczania wstępnie zaprojektowanych miejsc wiązania dla kapsydów RBP z bakteriofagów GA13, MS214, PP715, oraz Qβ16 w regionie inicjacji translacji reporterowego mRNA ekspresja reporterowa jest silnie stłumiona. Przedstawiamy stosunkowo prostą i ilościową metodę, opartą na tym zjawisku represji, do pomiaru powinowactwa między RBP a odpowiadającymi immiejscami wiązania RNA in vivo.

<table><tbody><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>SIGMA</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>ALFA AESAR</td><td>33337</td><td></td></tr><tr><td>48 płytek</td><td>Axygen</td><td>P-5ML-48-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 8-pasmowe</td><td>Axygen</td><td>RESMW8I</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe</td><td>Axygen</td><td>P-DW-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe do czytnika płytek</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005029</td><td></td></tr><tr><td>ApaLI</td><td>NEB</td><td>R0507</td><td></td></tr><tr><td>Sekwencje miejsca wiązania</td><td>Gen9 Inc. i Twist Bioscience</td><td></td><td>patrz Tabela 1</td></tr><tr><td>E. komórki TOP10</td><td>Invitrogen</td><td>C404006</td><td></td></tr><tr><td>Eagl-HF</td><td>NEB</td><td>R3505</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator 071205</td><td></td><td></td>glicerolu <td>BIO LAB</td></tr><tr><td></td><td>Inkubator</td><td></td> <td>TECAN</td> liconic</tr><tr><td>Roztwór kanamycyny</td><td>SIGMA</td><td>K4000</td><td></td></tr><tr><td>KpnI- HF</td><td>NEB</td><td>R0142</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>Zrobotyzowany system transportu cieczy</td><td>TECAN</td><td>EVO 100, MCA 96-kanałowe</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie analityczne Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multipipeta 8 torów</td><td>Axygen</td><td>BR703710</td><td></td></tr><tr><td>N-butanoilo-L-homoseryna lakton (C4-HSL)</td><td>cayman</td><td>K40982552 019</td><td></td></tr><tr><td>PBS Bufor Branże</td><td>biologiczne</td><td>020235A Czytnik płytek</td><td></td></tr><tr><td></td><td>TECAN</td><td>Infinite F200 PRO</td><td></td></tr><tr><td>Q5 HotStart Polimeraza</td><td>NEB</td><td>M0493</td><td></td></tr><tr><td>Sekwencje RBP</td><td>Addgene</td><td>27121 & 40650</td><td>patrz Tabela 2</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCL)</td><td>BIO LAB</td><td>190305</td><td></td></tr><tr><td>SV Żel i system oczyszczania PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr></tbody></table>

test do ilościowego określania wiązania białka-rna u bakterii

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Na etapie inicjacji translacji białek, rybosom wiąże się z regionem inicjacji mRNA. Inicjacja translacji może zostać zablokowana przez wiązanie białka wiążącego RNA (RBP) z regionem inicjacji mRNA, który zakłóca wiązanie rybosomów. W prezentowanej metodzie wykorzystujemy to zjawisko blokowania do ilościowego określenia powinowactwa wiązania RBP do ich pokrewnych i niepokrewnych miejsc wiązania. Aby to zrobić, wprowadzamy miejsce wiązania testu w regionie inicjacji reporterowego mRNA i indukujemy ekspresję testowego RBP. W przypadku wiązania RBP-RNA zaobserwowaliśmy sigmoidalne tłumienie ekspresji reporterowej w funkcji stężenia RBP. W przypadku braku powinowactwa lub bardzo niskiego powinowactwa między miejscem wiązania a RBP nie zaobserwowano istotnej represji. Metoda jest przeprowadzana w żywych komórkach bakteryjnych i nie wymaga drogich ani wyrafinowanych maszyn. Jest to przydatne do ilościowego określania i porównywania powinowactwa wiązania różnych RBP, które funkcjonują w bakteriach, do zestawu zaprojektowanych miejsc wiązania. Ta metoda może być nieodpowiednia w przypadku miejsc wiązania o dużej złożoności strukturalnej. Wynika to z możliwości zahamowania inicjacji rybosomalnej przez złożoną strukturę mRNA przy braku RBP, co skutkowałoby niższą podstawową ekspresją genu reporterowego, a tym samym mniej obserwowalną represją reporterową przy wiązaniu RBP.

Prezentowana metoda wykorzystuje konkurencję między RBP a rybosomem do wiązania się z cząsteczką mRNA (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Konkurencja ta znajduje odzwierciedlenie w zmniejszającym się poziomie mCherry w funkcji zwiększonej produkcji RBP-mCerulean, ze względu na rosnące stężenie induktora. W przypadku nasilającej się fluorescencji mCerulean, przy braku istotnych zmian w mCherry, stwierdza się brak wiązania RBP. Reprezentatywne wyniki zarówno dla szczepu pozytywnego, jak i ujem...

W tej metodzie, określamy ilościowo powinowactwo wiązania białek wiążących RNA (RBP) do pokrewnych i niepokrewnych miejsc wiązania za pomocą prostego, żywego, reporterowego testu w komórkach bakteryjnych. Test opiera się na represji genu reporterowego.

Test do ilościowego określania wiązania białka-RNA u bakterii

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Charakterystyka wiązania białek z RNA in vivo pozostaje dużym wyzwaniem ze względu na złożony charakter RNA i wiele czynników wpływających na jego interakcję z białkami. Białko wiążące RNA lub powinowactwo RBP-RNA mierzy się w żywych komórkach bakteryjnych. Ponieważ środowisko komórkowe wpływa zarówno na strukturę RNA, jak i wynikowe wiązanie RBP-RNA, pomiar powinowactwa in vivo ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia takich interakcji w systemach naturalnych.Sekret sukcesu tkwi w konstrukcji plazmidów. W projekcie należy wykorzystać kilka fal delta i unikać wstawiania kodonów stop i mutacji przesunięcia ramki odczytu. Rozpocznij ten protokół od zaprojektowania kasety miejsca wiązania.Każdy mini gen zawiera miejsce restrykcyjne EagI, 40 zasad z pięciu głównych końców genu oporności na kanamycynę, promotor pLac / Ara, miejsce wiązania rybosomów, AUG genu mCherry, dystans, miejsce wiązania RBP, 80 zasad z pięciu głównych końców genu mCherry i miejsce restrykcyjne ApaLI. Aby zwiększyć wskaźnik powodzenia testu, należy zaprojektować trzy kasety w miejscu wiązania dla każdego miejsca wiązania z przekładkami składającymi się z co najmniej jednej, dwóch i trzech podstaw. Podwójne trawienie zarówno mini genów, jak i wektora docelowego za pomocą EagI, HF i ApaLI przed wykonaniem oczyszczania kolumnowego składników trawiennych.Zwiąż strawione mini geny ze szkieletem miejsca wiązania zawierającym resztę genu reporterowego mCherry, terminatora i genu oporności na kanamycynę. Następnie przekształć roztwór ligacji w 10 najlepszych komórek Escherichia coli. Po zidentyfikowaniu dodatnich transformantów za pomocą sekwencjonowania Sangera, oczyszczone plazmidy należy przechowywać w formacie 96 dołków w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Szczepy bakterii należy również przechowywać w postaci zapasów glicerolu w formacie 96 dołków w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Zamówienie niestandardowe wymaganej sekwencji RBP bez kodonu stop jako dwuniciowego mini genu DNA z miejscami restrykcyjnymi na końcach. Przekształć przygotowane plazmidy w chemicznie kompetentne komórki bakteryjne zawierające już plazmid RBP mCerulean.Aby zaoszczędzić czas, należy poszczepić komórki za pomocą pipetera ośmiokanałowego na ośmiopasmowych płytkach zawierających agar Luria-Bertani z odpowiednimi antybiotykami. Kolonie powinny pojawić się w ciągu 16 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wybierz pojedynczą kolonię dla każdego podwójnego transformantu i przenieś do 48 płytek dołkowych zawierających 1,5 mililitra LB z odpowiednimi antybiotykami.Hoduj komórki przez okres 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 250 obr./min. Przechowuj nocki jako zapas glicerolu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w 96-dołkowych płytkach. Rano zaprogramuj robota tak, aby podgrzał 180 mikrolitrów podłoża półporowego lub SPM w 96-dołkowych płytkach.Zaprogramuj robota tak, aby przygotował płytkę induktora. Na czystej 96-dołkowej płytce przygotuj dołki z SPM składającym się z 95% BA i 5% LB. Liczba studzienek odpowiada pożądanej liczbie stężeń induktora.Dodaj C4-HSL do studzienek w płytce induktora, które będą zawierały najwyższe stężenie induktora. Następnie zaprogramuj robota tak, aby seryjnie rozcieńczał pożywkę z każdej z dołków o najwyższym stężeniu do 23 niższych stężeń w zakresie od zera do 218 nanomolów. Objętość każdego rozcieńczenia induktora powinna być wystarczająca dla wszystkich szczepów.Aby rozcieńczyć szczepy na noc, zaprogramuj robota tak, aby rozcieńczał 10-krotnie, mieszając 20 mikrolitrów bakterii ze 180 mikrolitrami SPM w 48-dołkowych płytkach. Następnie ponownie rozcieńczyć 10-krotnie, pobierając 20 mikrolitrów z rozcieńczonego roztworu na wstępnie przygotowaną płytkę naprężającą odpowiednią do pomiaru fluorescencyjnego. Teraz zaprogramuj robota tak, aby dodał rozcieńczony induktor z płytki induktora do 96-dołkowych płytek z rozcieńczonymi szczepami zgodnie z końcowymi stężeniami.Potrząsaj 96-dołkowymi płytkami w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin. W tym czasie co 30 minut należy wykonywać pomiary gęstości optycznej lub średnicy zewnętrznej przy 595 nanometrach, a także fluorescencji mCherry i mCerulean za pomocą czytnika płytek. W celu normalizacji zmierz wzrost SPM bez dodawania komórek.Pokazano tutaj trójwymiarowe wykresy dla dodatniego szczepu. Wykresy przedstawiają surowe poziomy OD, fluorescencję mCerulean i fluorescencję mCherry w funkcji czasu i stężenia induktora. Poziomy ekspresji w stanie ustalonym mCerulean obliczono dla każdego stężenia induktora zarówno dla szczepów dodatnich, jak i ujemnych.Szybkość produkcji mCherry została również obliczona dla każdego stężenia induktora zarówno dla szczepów dodatnich, jak i ujemnych. Szybkość produkcji mCherry wykreślono jako funkcję średniej fluorescencji mCerulean uśrednionej dla dwóch duplikatów biologicznych dla dwóch szczepów. Pasowanie KRBP przy użyciu wzoru dopasowania jest pokazane dla dodatniego szczepu wykazującego specyficzną odpowiedź wiązania.Dla szczepu ujemnego nie wyodrębniono wartości KRBP. Znormalizowane krzywe odpowiedzi na dawkę określono dla 30 różnych szczepów w oparciu o dwa RBP jako 10 miejsc wiązania w różnych lokalizacjach. Obserwuje się trzy typy reakcji: wysokie powinowactwo, niskie powinowactwo i brak powinowactwa.Poniżej przedstawiono ilościowe wyniki KRBP dla dwóch RBP, białka płaszcza MS2 i białka płaszcza PP7 z 10 różnymi kasetami miejsc wiązania. Przedstawiono tutaj krzywe odpowiedzi na dawkę dla białka płaszcza MS2 z miejscem wiązania mutanta w czterech różnych miejscach, aby pokazać wpływ odstępów między mutantami na produkcję mCherry. Pokazana jest sekwencja badanego zmutowanego miejsca wiązania.Ważne jest, aby zastosować technikę strukturalną, taką jak shape seek, aby chemicznie zbadać strukturę kompleksu białko-RNA i zwizualizować, na które regiony mRNA wpływa wiązanie RNA. Ostatnio zastosowaliśmy tę technikę w sposób wysokoprzepustowy, aby jednocześnie zmierzyć powinowactwo RBP do 10 000 miejsc wiązania.

an-assay-for-quantifying-protein-rna-binding-in-bacteria

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film demonstruje różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego - techniki systematycznego, wysokoprzepustowego badania przesiewowego białek wiążących drugi przekaźnik nukleotydów wewnątrzkomórkowych. Technika ta pozwala na bezpośrednie wiązanie przekaźników z nadekspresyjnym białkiem docelowym w lizacie komórkowym - z pominięciem konieczności oczyszczania białka.

Różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego: wysokoprzepustowa technika identyfikacji wewnątrzkomórkowych białek wiążących drugi przekaźnik nukleotydu bakteryjnego

Ten film demonstruje test in vivo na bakteriach w celu zbadania interakcji białek wiążących RNA (RBP) z RNA. Komórki bakteryjne są przekształcane za pomocą dwóch konstruktów plazmidowych - plazmidu miejsca wiązania kodującego mRNA zawierającego fluorescencyjny gen reporterowy za miejscem wiązania RBP - podczas gdy plazmid RBP ulega ekspresji białek RBP pod kontrolą induktora. Po wzroście produkcji RBP za pośrednictwem induktora, RBP wiążą się z mRNA, powodując translacyjną represję reportera...

Test represji genu reporterowego w celu zbadania regulacji translacyjnej genu docelowego

Ten film demonstruje test in vitro do ekstrakcji RNA w celu identyfikacji białek wiążących RNA (RBP), które oddziałują z sekwencjami elementów bogatych w adenylan-urydylan (ARE) w mRNA. Docelowe RBP z lizatu komórkowego miesza się z sondą RNA w celu utworzenia kompleksów RNA-białko. Kompleksy izoluje się poprzez oczyszczanie powinowactwa z wykorzystaniem powinowactwa znacznika destiobiotyny sondy RNA do kulki magnetycznej znakowanej streptawidyną.

Test ściągania białka RNA w celu wyizolowania białek wiążących RNA poprzez ekstrakcję powinowactwa

W tym filmie opisujemy systematyczną ewolucję ligandów metodą wykładniczego wzbogacania (SELEX) w celu identyfikacji specyficznych sekwencji wiążących RNA dla docelowego białka. Białko jest inkubowane z dużą pulą randomizowanych sekwencji RNA, a sekwencje RNA wiążące białka są izolowane, amplifikowane PCR i sekwencjonowane w celu zidentyfikowania ich miejsc wiązania białek.

Test wiązania in vitro oparty na SELEX w celu identyfikacji interakcji RNA-białko

Opisano zestaw testów kolorymetrycznych do szybkiego rozróżniania białek, RNA, DNA i cukrów redukujących w potencjalnie heterogenicznych próbkach biomolekularnych.

Szybkie testy kolorymetryczne w celu jakościowego rozróżnienia RNA i DNA w próbkach biomolekularnych

Opracowaliśmy ilościowy test wiążący DNA, oparty na ELISA, do pomiaru interakcji czynników transkrypcyjnych z DNA.  Wysoką swoistość białka RUNX2 osiągnięto dzięki oligonukleotydowi rozpoznającemu DNA i swoistemu przeciwciału monoklonalnemu. Detekcja kolorymetryczna z reakcją substratową przeciwciał sprzężoną z enzymem była monitorowana w czasie rzeczywistym.

Test ilościowy do badania interakcji białko-DNA, odkrywania transkrypcyjnych regulatorów ekspresji genów i identyfikowania nowych środków przeciwnowotworowych

Tutaj prezentujemy protokoły do szybkiego badania i charakteryzowania enzymów pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Test dyfuzji mikroszkiełkowej i test uwalniania barwnika wykorzystują docelowe substraty bakteryjne do jakościowej i ilościowej oceny aktywności enzymatycznej.

Testy jakościowe i ilościowe do wykrywania i charakterystyki białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych

Białka, które wiążą określone sekwencje RNA, odgrywają kluczową rolę w ekspresji genów. Szczegółowa charakterystyka tych miejsc wiązania ma kluczowe znaczenie dla naszego zrozumienia regulacji genów. W tym miejscu opisano jednoetapowe podejście do mutagenezy saturacji miejsc wiązania białek w RNA. Podejście to jest istotne dla wszystkich miejsc wiązania białek w RNA.

Nowe podejście do mutagenezy saturacji: jednoetapowa charakterystyka miejsc wiązania białek regulatorowych w RNA przy użyciu fosforotionianów

Różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego (DRaCALA) może być wykorzystane do identyfikacji małych białek wiążących ligand organizmu za pomocą biblioteki ORFeome.

Identyfikacja białek wiążących małe ligandy za pomocą zróżnicowanego promieniowego działania kapilarnego testu ligandowego (DRaCALA)

Tutaj opisujemy metodę bakteryjnej koekspresji różnie znakowanych białek za pomocą zestawu kompatybilnych wektorów, a następnie konwencjonalne techniki pulldown do badania kompleksów białkowych, które nie mogą się składać in vitro.

Test pulldown w połączeniu z koekspresją w komórkach bakteryjnych jako efektywne czasowo narzędzie do testowania trudnych interakcji białko-białko

Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną metodę in vitro do odkrywania, ilościowego i walidacji interaktorów białkowych specyficznych sekwencji RNA, przy użyciu całkowitego ekstraktu białkowego z komórek ludzkich, kulek streptawidyny pokrytych biotynylowanym RNA oraz analizy spektrometrii mas.

Zoptymalizowana ilościowa analiza typu pull-down białek wiążących RNA przy użyciu krótkiego biotynylowanego RNA

Poznaj metodę ilościowego określania wiązania białek RNA z RNA w żywych komórkach bakteryjnych. Technika ta wykorzystuje test z genem reporterowym do badania interakcji białko-RNA in vivo.

Test do ilościowego określania wiązania białka-RNA u bakterii

Przeglądaj więcej filmów