Przygotowanie całego szpiku kostnego do analizy cytometrii masowej komórek z linii neutrofili
19 czerwca 2019
Tutaj prezentujemy protokół przetwarzania świeżego szpiku kostnego (BM) wyizolowanego od myszy lub człowieka do wysokowymiarowej cytometrii masowej (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analizy komórek linii neutrofili.
Ten protokół cytometrii masowej zachowuje integralność całego szpiku kostnego, umożliwiając uratowanie informacji, które zostały utracone podczas konwencjonalnego przygotowywania próbki do analizy niedostatecznie badanych komórek. Ten szybki i łatwy w obsłudze protokół izolacji szpiku kostnego ułatwia pozyskiwanie żywotnych, krótkożyciowych populacji komórek szpikowych, takich jak rzadkie podzbiory linii neutrofili. Wykorzystanie cytometrii masowej do identyfikacji wcześniej niedocenianych komórek odpornościowych, takich jak komórki linii neutrofili, może mieć szerokie implikacje dla wielu różnych chorób.
Protokół ten zachowuje integralność krótko żyjących komórek szpikowych, które są obecne w szpiku kostnym i mogą być łatwo stosowane do innych typów tkanek, takich jak guz lity. Uprościliśmy protokół, aby był jak najbardziej przyjazny dla użytkownika, ale jak we wszystkich badaniach biologicznych może wymagać kilku prób, aby sobie z nim poradzić. Kiedy robisz to po raz pierwszy, możesz najpierw przygotować wszystkie odczynniki, a następnie ściśle przestrzegać protokołu.
Jeśli wystąpią jakiekolwiek problemy, możesz połączyć się z CyTOForum i porozmawiać z innymi użytkownikami CyTOF, którzy mogą pomóc w rozwiązaniu problemu. W przypadku przygotowania próbek biologicznych proste sztuczki mogą mieć ogromny wpływ na wynik końcowy. Demonstracja wizualna jest znacznie łatwiejsza do zrozumienia przez nowego użytkownika protokołu.
Jeśli robisz to po raz pierwszy, możesz najpierw przygotować odczynniki, a następnie ściśle przestrzegać protokołu. Aby pobrać szpik kostny, umieść sześcio- do 10-tygodniową czarną mysz sześciokątną C57 w pozycji leżącej na sterylnej podkładce chirurgicznej i użyj 70% etanolu do sterylizacji brzucha i kończyn tylnych. Użyj nożyczek chirurgicznych do preparowania, aby otworzyć jamę brzuszną i usunąć skórę, aby odsłonić tylne kończyny.
Używając pary kleszczy opatrunkowych z końcówką, przytrzymaj piszczel myszy tuż poniżej kostki i użyj pary zakrzywionych kleszczy opatrunkowych, aby ustabilizować piszczel poniżej kleszczy opatrunkowych z końcówką. Użyj kleszczy opatrunkowych z końcówką, aby złamać kość piszczelową i usunąć mięsień, aby odsłonić kość. Przed umieszczeniem kości piszczelowej w zimnym PBS przesuń stabilizujące zakrzywione kleszcze opatrunkowe do kości udowej i wsuń kleszczyki opatrunkowe z końcówką poniżej stawu kolanowego, aby przytrzymać rzepkę.
Delikatnie pociągnij do góry, aby zwichnąć rzepkę i usuń mięsień z rzepki, aby odsłonić kość udową. Przytrzymaj odsłoniętą kość udową za zakrzywione kleszcze opatrunkowe i użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć kość udową od spodu kości. Następnie umieść kość udową w PBS.
Następnie użyj igły o rozmiarze 18, aby wybić otwór w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 0,5 mililitra i umieść obie kości w probówce tak, aby otwarte końce kości były skierowane w dół do otworu. Umieść probówkę o pojemności 0,5 mililitra w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 1,7 mililitra i odkręć dwuwarstwowe probówki w mikrowirówce. Pod koniec wirowania potwierdzić, że szpik kostny został wyekstrahowany na dno probówki.
Aby wybarwić komórki szpiku kostnego do cytometrii masowej, ponownie zawiesić szpik kostny w jednym mililitrze buforu do lizy czerwonych krwinek na 10 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze zimnego PBS. Przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i umyj komórki dziewięcioma mililitrami świeżego, zimnego PBS.
Ponownie zawiesić osad komórek szpiku kostnego w 10 mililitrach świeżego, zimnego PBS do liczenia i przenieść pięciokrotną porcję komórek od 10 do szóstej do nowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze buforu barwiącego cytometrii masowej, uzupełnionym 125 nanomolową cisplatyną. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej umyj komórki w czterech mililitrach świeżego buforu do cytometrii masowej.
Ponownie zawiesić osad w 50 mikrolitrach roztworu blokującego receptor FC. Po 10 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza dodaj do komórek 50 mikrolitrów interesującego Cię koktajlu przeciwciał i delikatnie pipetuj do wymieszania. Temperatura na różnych etapach inkubacji jest bardzo ważna dla zachowania żywotności komórek szpiku kostnego.
Po 30 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza umyj komórki dwa razy w dwóch mililitrach świeżego buforu cytometrii masowej na płukanie, a następnie ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze świeżo przygotowanego 1,6% formaldehydu na 15 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze stałego buforu do trwałej ondulacji uzupełnionego 125 nanomolowym roztworem interkalacyjnym do inkubacji przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przed analizą komórek za pomocą cytometrii masowej delikatnie odwirować i odwirować zawiesinę komórkową przed umyciem komórek w dwóch mililitrach świeżego buforu do barwienia cytometrii masowej.
Następnie umyj komórki dwa razy w jednym mililitrze wody destylowanej na pranie, ostrożnie odsysając supernatant po drugim płukaniu przed ponownym zawieszeniem komórek na poziomie od jednego do 10 do szóstego stężenia bufora cytometrii masowej na mililitr do analizy cytometrii masowej. Na tym stochastycznym wykresie osadzania sąsiadów z rozkładem T komórki w wielu tkankach myszy zostały zgrupowane w podzbiory w oparciu o podobieństwo ich profili ekspresji markerów powierzchniowych, mierzonych za pomocą 33-parametrowego panelu cytometrii masowej. Komórki o bardziej podobnych właściwościach zostały automatycznie zgrupowane razem na podstawie ekspresji tych markerów w każdej komórce.
Za pomocą tej metody zachowano integralność całego szpiku kostnego, co doprowadziło do odkrycia nieznanej wcześniej populacji komórek, która jednocześnie wykazuje jednoczesną ekspresję markerów powierzchni neutrofili i hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych. Ta populacja komórek, która wcześniej była pomijana w badaniach nad progenitorami szpiku, z powodu zubożenia komórek Ly6G dodatnich, wykazuje wyraźny wzór ekspresji markerów powierzchniowych. Co ważniejsze, dane te doprowadziły do odkrycia niewielkiego podzbioru klastra komórek Ly6G dodatniego, który nie wyraża Ly6G, ale był zgrupowany blisko komórek Ly6G dodatnich CD117, co sugeruje podobieństwo tych komórek do linii neutrofili w oparciu o ekspresję 33 markerów powierzchniowych użytych w tym eksperymencie cytometrii masowej.
Następnie można zbudować 13-kolorowy panel sortowania komórek aktywowany florescencją, co pozwoli na izolację progenitorów neutrofili za pomocą cytometrii przepływowej do dalszych testów funkcjonalnych. Ważne jest, aby jak najszybciej przeprowadzić procedurę izolacji szpiku kostnego i utrzymać komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza podczas procedury barwienia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę przetwarzania świeżego szpiku kostnego pochodzenia mysiego lub ludzkiego w celu wysokowymiarowej analizy cytometrii masowej komórek linii neutrofilowej. Celem procedury jest zachowanie integralności krótkożyjących komórek mieloidalnych, co ułatwia badanie rzadkich populacji komórek odpornościowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Cytometria masowa
- Analiza szpiku kostnego
- Komórki linii neutrofilowej
Wstęp
- Konwencjonalne przygotowanie próbek często prowadzi do utraty istotnych informacji.
- Krótkożyjące komórki mieloidalne są trudne do badania ze względu na ich szybką degradację.
- Cytometria masowa umożliwia identyfikację wcześniej niedocenianych komórek odpornościowych.
- Protokół ten można dostosować do innych rodzajów tkanek, takich jak guzy lite.
Cel badania
- Dostarczenie przystępnego protokołu izolacji szpiku kostnego.
- Umożliwienie analizy rzadkich subpopulacji linii neutrofilowej.
- Pogłębienie wiedzy na temat populacji komórek odpornościowych w różnych jednostkach chorobowych.
Zastosowane metody
- Izolacja świeżego szpiku kostnego z materiału mysiego lub ludzkiego.
- Zastosowanie technik cytometrii masowej.
- Zachowanie integralności komórek podczas przetwarzania.
- Przygotowanie odczynników przed wykonaniem protokołu.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie zachowuje integralność krótkotrwałych komórek mieloidalnych.
- Ułatwia identyfikację rzadkich komórek linii neutrofilowej.
- Wykazuje możliwość zastosowania w innych typach tkanek.
- Zapewnia uproszczone podejście dla badaczy.
Wnioski
- Niniejszy protokół jest skuteczny w wielowymiarowej analizie komórek szpiku kostnego.
- Otwiera on możliwości badania niedocenianych komórek odpornościowych.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować różne konteksty chorobowe.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zachowanie krótkożyjących komórek mieloidalnych w pełnym szpiku kostnym umożliwia odkrycie rzadkich populacji linii neutrofilowej, które są tracone podczas konwencjonalnego przygotowania. Niniejszy protokół wspomaga walidację celów terapeutycznych poprzez ujawnienie wcześniej niedocenianych podgrup immunologicznych, które mają znaczenie dla nowotworów hematologicznych i chorób zapalnych. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania dzięki zachowaniu integralności komórkowej niezbędnej do wielowymiarowej analizy cytometrii masowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez zachowanie komórek linii neutrofilowej, które współwyrażają markery macierzyste i progenitorowe.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza ryzyko biologiczne dzięki wykrywaniu rzadkich populacji komórek, które pomijano w badaniach z deplekcją Ly6G.
- Wartość naukowa: Wspiera selekcję projektów w portfelu badawczym poprzez identyfikację nowych populacji komórek do walidacji funkcjonalnej w modelach chorób.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do późniejszej analizy CyTOF z wykorzystaniem panelu 33 parametrów w celu ilościowego oznaczenia ekspresji markerów powierzchniowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie standaryzacji i powtarzalności analizy poprzez ustandaryzowane etapy pobierania szpiku kostnego i barwienia.
- Wartość naukowa: Umożliwienie wiarygodnej oceny związków poprzez zachowanie żywotności krótkotrwałych komórek mieloidalnych podczas przesiewu leków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zapewnia system istotny dla badania chorób, umożliwiający analizę defektów całego szpiku kostnego w białaczkach i zaburzeniach krwi.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej dzięki zachowaniu podzbiorów linii neutrofili.
- Wartość naukowa: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie profili markerów powierzchniowych z tożsamością linii neutrofili niezależnie od ekspresji Ly6G.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć – od wczesnej identyfikacji celów po walidację przedkliniczną – umożliwiając wysokorozdzielcze profilowanie immunologiczne szpiku kostnego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez ujawnianie nowych populacji linii neutrofili z markerami typu macierzystego.
- Przesiewy: Zapewnia gotowość do analizy i wyniki ilościowe dzięki standaryzowanemu przygotowaniu komórek i barwieniu w cytometrii masowej.
- Analityka: Umożliwia analizę porównawczą poprzez klasteryzację viSNE i redukcję wymiarowości danych CyTOF obejmujących 33 parametry.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez zachowanie funkcjonalności komórek do późniejszej izolacji metodą cytometrii przepływowej oraz do dalszych analiz.
- Zastosowania instytucjonalne: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania metody przygotowania szpiku kostnego, która ma zastosowanie w modelach guzów litych oraz chorób hematologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna dzięki wykrywaniu wcześniej nieznanych populacji komórek linii neutrofilowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki zdefiniowanym etapom pobierania, lizy, barwienia i fiksacji.
- Wartość strategiczna: Lepsze podejmowanie decyzji go/no-go poprzez ograniczenie biologicznego ryzyka na późnych etapach dzięki wczesnemu odkrywaniu podgrup immunologicznych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko poprzez identyfikację nowych celów do walidacji funkcjonalnej w kontekście chorobowym.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w pobieraniu szpiku kostnego oraz w sterylnej technice chirurgicznej z wykorzystaniem modeli mysich.
- Metoda zależy od dostępności aparatury do cytometrii masowej oraz paneli przeciwciał sprzężonych z metalami.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia spójnej żywotności komórek i wydajności barwienia.
- Wymaga rozważenia adaptacji metody przy zastosowaniu w próbkach ludzkich lub tkankach guzów litych.
- Ograniczeniem jest konieczność szybkiego przetwarzania próbek i utrzymywania niskiej temperatury w celu zachowania integralności krótkożyjących komórek mieloidalnych.
