Name: Przygotowanie całego szpiku kostnego do analizy cytometrii masowej komórek z linii neutrofili (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Poznaj metodę izolacji szpiku kostnego do analizy cytometrii masowej komórek z linii neutrofili. Protokół zachowuje integralność krótkożyjących komórek mieloidalnych, umożliwiając identyfikację rzadkich populacji immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować rdzeniowi LJI Flow Cytometry za pomoc w procedurze cytometrii masowej. Praca ta była wspierana przez granty NIH R01HL134236, P01HL136275 i R01CA202987 (wszystkie dla C.C.H) oraz ADA7-12-MN-31 (04) (dla C.C.H. i Y.P.Z).

Wszystkie eksperymenty były zgodne z zatwierdzonymi wytycznymi Komitetu Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytutu Alergii i Immunologii La Jolla, a zgodę na stosowanie gryzoni uzyskano od Instytutu Alergii i Immunologii La Jolla zgodnie z kryteriami określonymi w Przewodniku dla Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych z National Institutes of Health.
1. Żniwo szpiku kostnego myszy (BM)
<ol>
	<li>Kup myszy C57BL/6J od komercyjnego dostawcy. Karm standardową dietę gryzoni i trzymaj w klatkach z mikroizolatorami w obiekcie wolnym od patogenów.</li>
	<li>Użyj samców myszy w wieku 6-10 tygodni do celów eksperymentalnych. Eutanazja przez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Umieść mysz na sterylnej podkładce chirurgicznej brzuchem do góry. Wysterylizuj skórę brzucha i kończyn tylnych, rozpylając 70% etanolu. Użyj nożyczek chirurgicznych do preparowania, aby rozciąć jamę brzuszną.</li>
	<li>Usuń skórę, aby odsłonić kończyny tylne. Użyj pary kleszczy opatrunkowych z końcówką, aby przytrzymać piszczel myszy tuż poniżej kostki. Użyj innej pary zakrzywionych kleszczy opatrunkowych, aby ustabilizować piszczel poniżej kleszczy opatrunkowych z końcówką. Złam kość piszczelową i odsłoń kość, odrywając mięsień kleszczykami opatrunkowymi z końcówką. 
	nuta: Kość piszczelowa jest luźno przymocowana do stawu kolanowego i można ją łatwo wybrać za pomocą kleszczy opatrunkowych z końcówką.</li>
	<li>Umieść piszczel w zimnym 1x PBS.</li>
	<li>Następnie przesuń stabilizujące zakrzywione kleszcze opatrunkowe w dół do kości udowej. Wsuń kleszcze opatrunkowe z końcówką poniżej stawu kolanowego i przytrzymaj rzepkę. Zwichnij rzepkę, delikatnie pociągając ją do góry. Odsłoń kość udową, zrywając mięsień przyczepiony do rzepki. Przytrzymaj odsłoniętą kość udową za zakrzywione kleszcze opatrunkowe i odetnij kość udową od spodu kości za pomocą nożyczek chirurgicznych do preparowania.</li>
	<li>Umieść kość udową w zimnym 1x PBS.</li>
	<li>Przebić otwór w probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml za pomocą igły 18 G.</li>
	<li>Umieść zarówno kość piszczelową, jak i kość udową w tej samej probówce do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml z otwartym końcem kości skierowanym w dół do otworu.</li>
	<li>Umieść probówkę o pojemności 0,5 ml zawierającą kość piszczelową i kość udową w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml.</li>
	<li>Obracać dwuwarstwowe probówki zawierające zarówno kość piszczelową, jak i kość udową pod ciśnieniem 5 510 x g przez 30 s w mikrowirówce.</li>
	<li>Upewnij się, że BM został wyjęty z kości i granulowany na dnie probówki. Wrzuć probówkę o pojemności 0,5 ml zawierającą uświęcone kości. Mysz BM jest gotowa do kolejnych kroków. 
	UWAGA: Ludzki BM jest pozyskiwany w zasobach klinicznych, jak opisano wcześniej11.</li>
</ol>
2. Barwienie komórek BM dla CyTOF
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić BM w 1 ml 1x bufor do lizy czerwonych krwinek (RBC). W przypadku ludzkiego BM należy ponownie zawiesić cały BM w 10-krotnej objętości 1x buforu do lizy czerwonych krwinek (RBC). Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Wirować probówkę o masie 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. W przypadku BM człowieka powtórz kroki 2.1 i 2.2 przed przejściem do kroku 2.3.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant i pozostawić osad w nienaruszonym stanie. Zawiesić osad z 1 ml zimnego 1x PBS. Przefiltruj granulki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml przez sitko o pojemności 70 μm. Komórki BM są teraz całkowicie odizolowane w rurce od resztek mięśniowych i kostnych. Umyj komórki, dodając do probówki 9 ml zimnego 1x PBS.</li>
	<li>Obracać probówkę o pojemności 15 ml w temperaturze 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki BM za pomocą 10 ml zimnego PBS. Weź podwielokrotność komórek do zliczenia. Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Porcjować 5 x 106 komórek BM do nowej probówki o pojemności 15 ml do barwienia CyTOF.</li>
	<li>Obracać probówkę o pojemności 15 ml w temperaturze 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki BM z cisplatyną 125 nM w 1 ml buforu barwiącego CyTOF jako wskaźnik żywotności próbki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po inkubacji dodać do probówki 4 ml buforu barwiącego CyTOF. Wirować probówkę o masie 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. W przypadku ludzkiego BM dodać 10% ludzkiej surowicy AB do buforu barwiącego CyTOF.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki BM za pomocą 50 μl roztworu blokującego receptor Fc. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Pominąć ten etap w przypadku BM człowieka.</li>
	<li>Dodać 50 μl domowego koktajlu przeciwciał CyTOF5 do próbki, tak aby całkowita objętość barwienia wynosiła 100 μL. Delikatnie odpipetować do mieszania. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Ostateczna objętość koktajlu przeciwciał wynosi 100 μl zarówno dla mysich próbek BM, jak i ludzkich BM.</li>
	<li>Po inkubacji dodać 2 ml buforu barwiącego CyTOF do każdej probówki w celu przepłukania komórek, wirować probówkę o masie 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Powtórz krok 2.12, aby uzyskać w sumie dwa prania.</li>
	<li>Przygotuj świeży 1,6% roztwór formaldehydu z 16% ampułki podstawowej. Rozcieńczyć 1 część wyjściowego formaldehydu z 9 częściami 1x PBS.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad z 1 ml świeżego 1,6% roztworu FA. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wirować probówkę o masie 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z roztworem interkalacyjnym 125 nM w 1 ml buforze do trwałej ondulacji.</li>
	<li>Próbkę inkubować przez noc w roztworze interkalacyjnym w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek do akwizycji CyTOF
<ol>
	<li>Delikatnie wirować i wirować komórki w temperaturze 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć komórki, dodając 2 ml buforu barwiącego CyTOF, wirować komórki w temperaturze 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant przez aspirację.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml diH2O. Zarezerwuj niewielką objętość (około 10 μl) z każdej probówki, aby policzyć komórki.</li>
	<li>Wirować komórki w temperaturze 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.3 i 3.4.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant i pozostawić komórki w osadzie. Komórki BM są teraz gotowe do ponownego zawieszenia do stężenia 1 x 106 komórek/ml w celu akwizycji CyTOF.</li>
</ol>

<ol><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li>
<li>Iwasaki, H., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+lineage+commitment+from+the+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell.</a> Immunity. 26, 726-740 (2007).</li>
<li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).</li>
<li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13, 493-496 (2016).</li>
<li>Zhu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Early+Unipotent+Neutrophil+Progenitor+with+Pro-tumoral+Activity+in+Mouse+and+Human+Bone+Marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow.</a> Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).</li>
<li>Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+High-Dimensional+Data+Using+t-SNE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).</li>
<li>Amir, E. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).</li>
<li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+data+using+t-SNE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Visualizing data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).</li>
<li>Cloos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Protocol+to+Sample+and+Process+Bone+Marrow+for+Measuring+Measurable+Residual+Disease+and+Leukemic+Stem+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia.</a> Journal of Visualized Experiment. 133, 56386(2018).</li>
<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deep+profiler%E2%80%99s+guide+to+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A deep profiler’s guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).</li>
<li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+New+insights+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), 4579(2018).</li>
<li>Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of neutrophils.</a> Nature Reviews in Immunology. , (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W minionych dziesięcioleciach cytometria przepływowa oparta na fluorescencji była stosowana jako główna metoda badania linii komórkowych i heterogeniczności 1,2,3. Chociaż cytometria przepływowa dostarczyła danych wielowymiarowych, metoda ta jest ograniczona przez wybór parametrów i nakładanie się spektralne. Aby przezwyciężyć słabość cytometrii przepływowej, wykorzystaliśmy CyTOF, który wykorzystuje izotopy metali ciężkich zami...

W ciągu ostatnich kilku dekad, metody cytometryczne były potężnym narzędziem do badania układu krwiotwórczego w BM. Metody te obejmują cytometrię przepływową aktywowaną fluorescencją oraz nową metodę CyTOF wykorzystującą przeciwciała znakowane metalami ciężkimi. Doprowadziły one do odkrycia wielu typów komórek w heterogenicznym próbce biologicznej poprzez identyfikację ich unikalnych profili ekspresji markerów powierzchniowych. Zwiększone nakładanie się widma, które jest związane z większą liczbą kanałów, prowadzi do większej niedokładności danych w zastosowaniach cytometrii przepływowej aktywowanej fluorescencją. Dlatego niechciane komórki są rutynowo usuwane w celu wzbogacenia populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania do analizy cytometrii przepływowej aktywowanej fluorescencją. Na przykład Ly6G (lub Gr-1) i CD11b są uważane za markery dojrzałych komórek szpikowych, a komórki Ly6G+ (lub Gr-1+) i CD11b+ są rutynowo usuwane z próbek BM za pomocą zestawów do wzbogacania magnetycznego przed analizą cytometryczną krwiotwórczą komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) lub łącząc te markery w jednym kanale koktajlu zrzutowego1,2,3. Innym przykładem jest to, że neutrofile są rutynowo usuwane z próbki ludzkiej krwi w celu wzbogacenia jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) do badań immunologicznych. Jednak cały szpik kostny wyizolowany od myszy lub człowieka rzadko jest badany w stanie nienaruszonym do analizy cytometrycznej.
Ostatnio CyTOF stał się rewolucyjnym narzędziem do badania układu krwiotwórczego4,5,6. W przypadku CyTOF przeciwciała znakowane fluoroforem są zastępowane przeciwciałami znakowanymi reporterowo ciężkimi pierwiastkami. Metoda ta pozwala na jednoczesny pomiar ponad 40 markerów bez obaw o nakładanie się widma. Umożliwiło to analizę nienaruszonej próbki biologicznej bez etapów wstępnego zubożenia lub kanału zrzutowego. Dzięki temu możemy kompleksowo spojrzeć na układ krwiotwórczy z dużą wymiarowością z konwencjonalnych wykresów cytometrii przepływowej 2D. Populacje komórek pominięte w przeszłości podczas procesu wyczerpywania się lub bramkowania mogą teraz zostać wydobyte na światło dzienne za pomocą danych wielowymiarowych generowanych przez CyTOF4,5. Zaprojektowaliśmy panel przeciwciał, który jednocześnie mierzy 39 parametrów w układzie krwiotwórczym, z naciskiem na linię szpikową 7. W porównaniu z konwencjonalnymi danymi z cytometrii przepływowej, interpretacja i wizualizacja bezprecedensowych danych wielowymiarowych generowanych przez CyTOF z pojedynczych komórek jest wyzwaniem. Naukowcy zajmujący się obliczeniami opracowali techniki redukcji wymiarowości do wizualizacji wielowymiarowych zestawów danych. W tym artykule użyliśmy algorytmu viSNE, który wykorzystuje technikę t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) do analizy danych CyTOF i przedstawienia wysokowymiarowego wyniku na 2-wymiarowej mapie przy jednoczesnym zachowaniu wysokowymiarowej struktury danych8,9,10. Na wykresie tSNE podobne komórki są grupowane w podzbiory, a kolor jest używany do wyróżnienia cechy komórek. Na przykład na Rysunek 1 komórki szpikowe są podzielone na kilka podzbiorów komórek w oparciu o podobieństwa ich wzorców ekspresji 33 markerów powierzchniowych wynikających z CyTOF (Rysunek 1)4. Tutaj zbadaliśmy szpik kostny myszy za pomocą naszego wcześniej opisanego 39-markerowego panelu CyTOF za pomocą analizy viSNE7. Analiza viSNE naszych danych CyTOF ujawniła niezidentyfikowaną populację komórek, która wykazywała zarówno cechy HSPC (CD117+), jak i neutrofili (Ly6G+) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2) 7.
Podsumowując, przedstawiamy protokół przetwarzania świeżego całego szpiku kostnego do analizy CyTOF. W tym artykule użyliśmy jako przykładu szpiku kostnego myszy, podczas gdy protokół ten może być również używany do przetwarzania próbek ludzkiego szpiku kostnego. W protokole odnotowuje się również szczegóły dotyczące próbek ludzkiego szpiku kostnego. Zaletą tego protokołu jest to, że zawiera on szczegóły, takie jak czas inkubacji i temperatura, które zostały zoptymalizowane w celu zachowania komórek linii neutrofili w całym szpiku kostnym, aby umożliwić badanie na nienaruszonym całym szpiku kostnym. Protokół ten można również łatwo zmodyfikować do zastosowań w cytometrii przepływowej aktywowanej fluorescencją.

<table><tbody><tr><td>CyTOF Antibodies (mysz)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45 (klon 30-F11) -89Y</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3089005B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human / Mouse CD45R/B220 (klon RA36B2)-176Yb</td><td>Fluidigm</td><td>Cat # 3176002B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Oczyszczony</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 120402; RRID:AB_961070</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Oczyszczony</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 135502; RRID:AB_1937293</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3166004B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 101101; RRID:AB_312774</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3148003B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3142003B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD127 (IL-7R&alpha;) (Clone A7R34)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3167004B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD16.2 (Fc&gamma; RIV) (Klon 9E9)-Oczyszczony</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 149502; RRID:AB_2565302</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD162 (klon 4RA10 (RUO))-Oczyszczony</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 557787; RRID:AB_647340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Oczyszczony</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 142402; RRID:AB_10916523</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Oczyszczony</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 149302; RRID:AB_2565277</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Oczyszczony</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 126502; RRID:AB_1027635</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 137625; RRID:AB_2563744</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Oczyszczony</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 119302; RRID:AB_345280</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysz CD41 (klon MWReg30)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3146009B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3156012B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD71 (Clone RI7217)-Oczyszczony</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 113802; RRID:AB_313563</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD90 (Clone G7)-Oczyszczony</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 105202; RRID:AB_313169</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb</td><td>Fluidigm Cat</td><td># 3159009B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Fc&epsilon; RI&alfa; (Klon MAR-1)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 134321; RRID:AB_2563768</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysz GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Oczyszczony</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 554404; RRID:AB_395370</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3174003B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ki67 (klon B56 (RUO))-Oczyszczony</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 556003; RRID:AB_396287</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3169015B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Oczyszczony</td><td>abcam</td><td>Cat# ab53457; RRID:AB_881409</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysz Ly-6G (klon 1A8)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 127637; RRID:AB_2563784</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse NK1.1 (klon PK136)-165Ho</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3165018B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Siglec-F (klon E50-2440 (RUO))-Oczyszczony</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 552125; RRID:AB_394340</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Mysz TCR&beta; (Klon H57-597)-143Nd</td><td>Fluidigm</td><td>(Klon H57-597)-143Nd</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysie TER-119 / Komórki erytroidalne (Klon TER-119)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 116241; RRID:AB_2563789</td><td></td></tr><tr><td>Chemikalia, peptydy i białka rekombinowane </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stabilizator przeciwciał</td><td>CANDOR Bioscience</td><td>Cat# 130050</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# A4503</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatin-194Pt</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 201194</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience 1x bufor</td> <td>do lizy RBCThermoFisher</td><td>Cat# 00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3 / Zestaw do barwienia czynnika transkrypcyjnego</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>EQ Czteroelementowe koraliki kalibracyjne</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 201078</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Omega Scientific Cat</td><td># FB-02</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Fosforan Buforowany roztwór soli GE</td><td>Lifesciences</td><td>Cat#SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Intercalator-Ir</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 201192B</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy do znakowania przeciwciał MAXPAR</td><td>Fluidigm</td><td>http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 158127</td><td></td></tr><tr><td>Azydek</td> <td>soduSigma-Aldrich</td><td>Cat# S2002</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# X100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>Cat# 25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Model eksperymentalny: Organizm/Szczepy</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mysz: C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Numer magazynowy: 000664</td><td></td></tr><tr><td>Software Alogrithm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normalizator na bazie koralików</td><td>Finck i wsp., 2013</td><td>https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf</td><td></td></tr><tr><td>Cytobank</td><td>Cytobank</td><td>https://www.cytobank.org/</td><td></td></tr> <tr><td>Cytofkit v1.r.0</td><td>Chen i wsp., 2016</td><td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html</td><td></td></tr><tr><td>t-SNE</td><td>van der Maaten i Hinton, 2008</td><td>https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie całego szpiku kostnego do analizy cytometrii masowej komórek z linii neutrofili

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

W tym artykule prezentujemy protokół, który jest zoptymalizowany pod kątem zachowania komórek linii neutrofili w świeżym BM do analizy całego BM CyTOF. Wykorzystaliśmy panel CyTOF z 39 przeciwciałami do pomiaru szpiku do oceny układu krwiotwórczego ze szczególnym uwzględnieniem komórek linii neutrofili przy użyciu tego protokołu. Wynik CyTOF przeanalizowano za pomocą algorytmu redukcji wymiarów o otwartych zasobach, viSNE, a dane przedstawiono w celu zademonstrowania wyniku tego protokołu. Odkryliśmy nowe populacje komórek z linii neutrofili w oparciu o ten protokół. Ten protokół świeżego preparatu całego BM może być wykorzystany do: 1) analizy CyTOF w celu odkrycia niezidentyfikowanych populacji komórek z całego BM, 2) badania całych defektów BM u pacjentów z chorobami krwi, takimi jak białaczka, 3), wspomagania optymalizacji protokołów cytometrii przepływowej aktywowanej fluorescencją, które wykorzystują świeży cały BM.

Rysunek 1 przedstawia przykładowy wynik eksperymentów CyTOF. Na tym wykresie tSNE komórki z wielu tkanek mysich zostały pogrupowane w podzbiory na podstawie podobieństwa profili ekspresji markerów powierzchniowych, zmierzonych za pomocą 33-parametrowego panelu CyTOF. Komórki o bardziej zbliżonych właściwościach zostały automatycznie zgrupowane razem, takie jak neutrofile, makrofagi lub komórki DC, w oparciu o ekspresję 33 markerów w każdej komórce.
<strong class="...

Tutaj prezentujemy protokół przetwarzania świeżego szpiku kostnego (BM) wyizolowanego od myszy lub człowieka do wysokowymiarowej cytometrii masowej (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analizy komórek linii neutrofili.

Przygotowanie całego szpiku kostnego do analizy cytometrii masowej komórek z linii neutrofili

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Ten protokół cytometrii masowej zachowuje integralność całego szpiku kostnego, umożliwiając uratowanie informacji, które zostały utracone podczas konwencjonalnego przygotowywania próbki do analizy niedostatecznie badanych komórek. Ten szybki i łatwy w obsłudze protokół izolacji szpiku kostnego ułatwia pozyskiwanie żywotnych, krótkożyciowych populacji komórek szpikowych, takich jak rzadkie podzbiory linii neutrofili. Wykorzystanie cytometrii masowej do identyfikacji wcześniej niedocenianych komórek odpornościowych, takich jak komórki linii neutrofili, może mieć szerokie implikacje dla wielu różnych chorób.Protokół ten zachowuje integralność krótko żyjących komórek szpikowych, które są obecne w szpiku kostnym i mogą być łatwo stosowane do innych typów tkanek, takich jak guz lity. Uprościliśmy protokół, aby był jak najbardziej przyjazny dla użytkownika, ale jak we wszystkich badaniach biologicznych może wymagać kilku prób, aby sobie z nim poradzić. Kiedy robisz to po raz pierwszy, możesz najpierw przygotować wszystkie odczynniki, a następnie ściśle przestrzegać protokołu.Jeśli wystąpią jakiekolwiek problemy, możesz połączyć się z CyTOForum i porozmawiać z innymi użytkownikami CyTOF, którzy mogą pomóc w rozwiązaniu problemu. W przypadku przygotowania próbek biologicznych proste sztuczki mogą mieć ogromny wpływ na wynik końcowy. Demonstracja wizualna jest znacznie łatwiejsza do zrozumienia przez nowego użytkownika protokołu.Jeśli robisz to po raz pierwszy, możesz najpierw przygotować odczynniki, a następnie ściśle przestrzegać protokołu. Aby pobrać szpik kostny, umieść sześcio- do 10-tygodniową czarną mysz sześciokątną C57 w pozycji leżącej na sterylnej podkładce chirurgicznej i użyj 70% etanolu do sterylizacji brzucha i kończyn tylnych. Użyj nożyczek chirurgicznych do preparowania, aby otworzyć jamę brzuszną i usunąć skórę, aby odsłonić tylne kończyny.Używając pary kleszczy opatrunkowych z końcówką, przytrzymaj piszczel myszy tuż poniżej kostki i użyj pary zakrzywionych kleszczy opatrunkowych, aby ustabilizować piszczel poniżej kleszczy opatrunkowych z końcówką. Użyj kleszczy opatrunkowych z końcówką, aby złamać kość piszczelową i usunąć mięsień, aby odsłonić kość. Przed umieszczeniem kości piszczelowej w zimnym PBS przesuń stabilizujące zakrzywione kleszcze opatrunkowe do kości udowej i wsuń kleszczyki opatrunkowe z końcówką poniżej stawu kolanowego, aby przytrzymać rzepkę.Delikatnie pociągnij do góry, aby zwichnąć rzepkę i usuń mięsień z rzepki, aby odsłonić kość udową. Przytrzymaj odsłoniętą kość udową za zakrzywione kleszcze opatrunkowe i użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć kość udową od spodu kości. Następnie umieść kość udową w PBS.Następnie użyj igły o rozmiarze 18, aby wybić otwór w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 0,5 mililitra i umieść obie kości w probówce tak, aby otwarte końce kości były skierowane w dół do otworu. Umieść probówkę o pojemności 0,5 mililitra w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 1,7 mililitra i odkręć dwuwarstwowe probówki w mikrowirówce. Pod koniec wirowania potwierdzić, że szpik kostny został wyekstrahowany na dno probówki.Aby wybarwić komórki szpiku kostnego do cytometrii masowej, ponownie zawiesić szpik kostny w jednym mililitrze buforu do lizy czerwonych krwinek na 10 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze zimnego PBS. Przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i umyj komórki dziewięcioma mililitrami świeżego, zimnego PBS.Ponownie zawiesić osad komórek szpiku kostnego w 10 mililitrach świeżego, zimnego PBS do liczenia i przenieść pięciokrotną porcję komórek od 10 do szóstej do nowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze buforu barwiącego cytometrii masowej, uzupełnionym 125 nanomolową cisplatyną. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej umyj komórki w czterech mililitrach świeżego buforu do cytometrii masowej.Ponownie zawiesić osad w 50 mikrolitrach roztworu blokującego receptor FC. Po 10 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza dodaj do komórek 50 mikrolitrów interesującego Cię koktajlu przeciwciał i delikatnie pipetuj do wymieszania. Temperatura na różnych etapach inkubacji jest bardzo ważna dla zachowania żywotności komórek szpiku kostnego.Po 30 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza umyj komórki dwa razy w dwóch mililitrach świeżego buforu cytometrii masowej na płukanie, a następnie ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze świeżo przygotowanego 1,6% formaldehydu na 15 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze stałego buforu do trwałej ondulacji uzupełnionego 125 nanomolowym roztworem interkalacyjnym do inkubacji przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przed analizą komórek za pomocą cytometrii masowej delikatnie odwirować i odwirować zawiesinę komórkową przed umyciem komórek w dwóch mililitrach świeżego buforu do barwienia cytometrii masowej.Następnie umyj komórki dwa razy w jednym mililitrze wody destylowanej na pranie, ostrożnie odsysając supernatant po drugim płukaniu przed ponownym zawieszeniem komórek na poziomie od jednego do 10 do szóstego stężenia bufora cytometrii masowej na mililitr do analizy cytometrii masowej. Na tym stochastycznym wykresie osadzania sąsiadów z rozkładem T komórki w wielu tkankach myszy zostały zgrupowane w podzbiory w oparciu o podobieństwo ich profili ekspresji markerów powierzchniowych, mierzonych za pomocą 33-parametrowego panelu cytometrii masowej. Komórki o bardziej podobnych właściwościach zostały automatycznie zgrupowane razem na podstawie ekspresji tych markerów w każdej komórce.Za pomocą tej metody zachowano integralność całego szpiku kostnego, co doprowadziło do odkrycia nieznanej wcześniej populacji komórek, która jednocześnie wykazuje jednoczesną ekspresję markerów powierzchni neutrofili i hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych. Ta populacja komórek, która wcześniej była pomijana w badaniach nad progenitorami szpiku, z powodu zubożenia komórek Ly6G dodatnich, wykazuje wyraźny wzór ekspresji markerów powierzchniowych. Co ważniejsze, dane te doprowadziły do odkrycia niewielkiego podzbioru klastra komórek Ly6G dodatniego, który nie wyraża Ly6G, ale był zgrupowany blisko komórek Ly6G dodatnich CD117, co sugeruje podobieństwo tych komórek do linii neutrofili w oparciu o ekspresję 33 markerów powierzchniowych użytych w tym eksperymencie cytometrii masowej.Następnie można zbudować 13-kolorowy panel sortowania komórek aktywowany florescencją, co pozwoli na izolację progenitorów neutrofili za pomocą cytometrii przepływowej do dalszych testów funkcjonalnych. Ważne jest, aby jak najszybciej przeprowadzić procedurę izolacji szpiku kostnego i utrzymać komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza podczas procedury barwienia.

preparation-whole-bone-marrow-for-mass-cytometry-analysis-neutrophil

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film opisuje szczegółowy protokół izolowania świeżego całego szpiku kostnego z tylnych kończyn myszy w celu zbadania całych wad BM u pacjentów z chorobami krwi, takimi jak białaczka.

Pobieranie szpiku kostnego z tylnej kończyny myszy

Opisujemy protokół izolacji i oczyszczania neutrofili ze szpiku kostnego myszy poprzez wirowanie w gradiacji gęstości oraz znakowanie neutrofili za pomocą barwników CellTracker. Jest to prosta, szybka, powtarzalna i ekonomiczna metoda uzyskiwania dużej liczby neutrofili do dalszych badań funkcjonalnych lub eksperymentów adoptywnych w zakresie transferu i śledzenia.

Izolacja, oczyszczanie i znakowanie neutrofili szpiku kostnego myszy do badań funkcjonalnych i eksperymentów z transferem adoptywnym

Zgłaszamy protokół wykorzystujący sortowanie komórek aktywowane fluorescencją do izolowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) o wysokiej czystości ze szpiku kostnego myszy podatnych na toczeń do badań funkcjonalnych pDC.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu oczyszczenia plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

Tutaj udostępniamy metodę identyfikacji i izolowania dużej liczby komórek szpikowych sterowanych przez GM-CSF za pomocą szybkiego sortowania komórek. Na podstawie ekspresji Ly6C i CD115 można zidentyfikować pięć odrębnych populacji (pospolite przodki szpiku, progenitorzy granulocytów/makrofagów, monocyty, makrofagi pochodzące z monocytów i DC pochodzące z monocytów).

Generowanie dużej liczby progenitorów szpiku i prekursorów komórek dendrytycznych z mysiego szpiku kostnego przy użyciu nowej strategii sortowania komórek

Diagnoza MDS jest trudna ze względu na brak kryteriów morfologicznych lub cytogenetyki bez informacji. MFC może pomóc udoskonalić proces diagnostyczny MDS. Aby analiza MFC stała się przydatna w praktyce klinicznej, musi opierać się na parametrach o wystarczającej swoistości i czułości, a dane powinny być powtarzalne dla różnych operatorów.

Cytometria przepływowa sterowana bazą danych do oceny dojrzewania komórek szpiku kostnego

Pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować 6 podzbiorów komórek progenitorowych szpiku myszy za pomocą kombinacji sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego (MACS i FACS). Protokół ten może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo oraz analiz RNA/białka.

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Opisujemy stopniowe protokoły mierzące oddychanie mitochondrialne mysich i ludzkich neutrofili oraz komórek HL60 za pomocą analizatora metabolicznego przepływu zewnątrzkomórkowego.

Pomiar w czasie rzeczywistym mitochondrialnego profilu bioenergetycznego neutrofili

Sukces transkryptomiki i multiomiki pojedynczej komórki/pojedynczego jądra w dużej mierze zależy od jakości komórek/jąder. Dlatego izolowanie komórek/jąder od tkanek i ich oczyszczanie musi być wysoce ustandaryzowane. Protokół ten opisuje przygotowanie jąder z mózgu i szpiku kostnego do dalszego testu multiomu pojedynczego jądra.

Wysokiej jakości preparatyka jąder mózgu i szpiku kostnego do oznaczania wieloomów pojedynczych jąder

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół izolowania i charakteryzowania mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego z mysich modeli zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej. Technika ta identyfikuje zmiany w niekrwiotwórczej niszy szpiku kostnego, w tym w komórkach śródbłonka i mezenchymalnych komórek zrębu, wraz z postępem choroby.

Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej

Ten manuskrypt przedstawia protokół przygotowania biblioteki ATAC-seq neutrofili z mysiego szpiku kostnego, mający na celu zagwarantowanie optymalnej żywotności neutrofili i wysokiej jakości biblioteki. Oferuje instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania BMC, sortowania immunomagnetycznego i budowy biblioteki, służąc jako cenny przewodnik, szczególnie dla nowicjuszy w badaniu neutrofili.

Przygotowanie biblioteki ATAC-Seq mysich neutrofili pochodzących ze szpiku kostnego

Poznaj metodę izolacji szpiku kostnego do analizy cytometrii masowej komórek z linii neutrofili. Protokół zachowuje integralność krótkożyjących komórek mieloidalnych, umożliwiając identyfikację rzadkich populacji immunologicznych.

Przygotowanie całego szpiku kostnego do analizy cytometrii masowej komórek z linii neutrofili

Przeglądaj więcej filmów