Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) do izolacji RNA z komórek śródbłonka in vivo

Cześć, nazywam się Bin Ren, jestem profesorem nadzwyczajnym chirurgii i inżynierii biomedycznej na Uniwersytecie Alabama w Birmingham School of Medicine. Nasze laboratorium interesuje się biologią komórek śródbłonka, funkcją, angiogenezą, akuogenezą w kontekście tych powszechnych chorób sercowo-naczyniowych i nowotworów. Jedno z naszych badań koncentruje się na epigenetycznej i transkrypcyjnej regulacji transróżnicowania komórek śródbłonka i angiogenezy.

Aby zrozumieć mechanizmy transkrypcyjne angiogenezy, ustaliliśmy transgeniczne zmodyfikowane linie myszy, w których nie tylko usunęliśmy określone geny związane z angiogenezą w komórkach śródbłonka, ale także ulepszoną sondę GFP zostanie genetycznie znakowana na rybosomie natywnych komórek śródbłonka. W ten sposób możemy wyizolować i oczyścić pętle powiązanego informacyjnego RNA z komórek śródbłonka w różnych narządach tkankowych bezpośrednio u zwierząt transgenicznych. Następnie możemy użyć oczyszczonego informacyjnego RNA do dalszej analizy transkryptów i transkryptomu.

Poprzez sekwencjonowanie RNA i chill PCR w czasie rzeczywistym. W tym filmie moi studenci Patrick Moran i Jordan Palmer oraz technicy naukowi Nicholas Barnekow i Rong Yuan pokażą Ci podejście do genotypowania transgenicznych myszy i aspirującego informacyjnego RNA bezpośrednio ze śródbłonka u zwierząt transgenicznych. Genotypowanie jest ważnym wstępem w tym protokole, aby upewnić się, że lód ma znacznik GFP na rybosomach komórek śródbłonka.

Ponieważ wszystkie dalsze etapy izolacji RNAi opierają się na obecności rybosomów znakowanych GFP, konieczne jest określenie genotypu przed rozpoczęciem eksperymentu. Przed rozpoczęciem izolacji RNA należy wykonać kilka etapów przygotowawczych. Obejmują one przygotowanie buforu i wiązanie przeciwciała anty-GFP z kulkami białka G dina.

mogą przetrwać do jednego miesiąca w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a kulki związane z przeciwciałami mogą trwać do tygodnia w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Weź więc pod uwagę te ograniczenia podczas planowania eksperymentu. Stosowanie homogenizatora napędzanego zębami trzonowymi to doskonały sposób na zwiększenie wydajności RNA.

Pamiętaj, aby używać niższych ustawień częstotliwości i czasu trwania, aby zmniejszyć degradację RNA. Jak wspomniano wcześniej, genotypowanie jest ważnym krokiem wstępnym w protokole badania. Upewnienie się, że myszy, których RNA ma zostać wyizolowane przy użyciu techniki TRAP, są dodatnie dla genu TRAP, co najmniej heterozygoty, ale najlepiej homozygotyczne dla genu TRAP, jest ważnym krokiem, ponieważ upewnienie się, że znacznik GFP znajduje się na rybosomie, jest niezbędne do ściągnięcia za pomocą reakcji przeciwciała antygenowego i kulek anty-GFP, które zostaną przygotowane przed rozpoczęciem eksperymentu.

Odizoluj pożądane tkanki od myszy i natychmiast umieść je w lodowatym PBS ze 100 mikrogramami na mililitr roztworu cykloheksamidu. Gwarantuje to, że tłumaczenie zostanie zatrzymane, a transkryptom będzie dokładnym obrazem myszy przed eutanazją. Użyj homogenizatora napędzanego silnikiem, aby homogenizować tkankę w zawiesinę komórkową.

Idealne ustawienia czasu i częstotliwości będą musiały zostać określone przez indywidualne laboratorium w oparciu o konkretny homogenizator z napędem silnikowym, którego będziesz używać. Użycie zbyt wysokiego ustawienia częstotliwości może prowadzić do degradacji RNA i zakłócić resztę protokołu. Zawieś osad komórkowy w buforze do lizy, który powinieneś był przygotować przed rozpoczęciem eksperymentu.

Należy pamiętać o dalszej homogenizacji tej mieszaniny, aby zapewnić odpowiednią homogenizację przed przystąpieniem do reszty protokołu. Odwirowywać homogenat przez 10 minut w temperaturze 2 000 razy G w wirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Spowoduje to osadzenie jąder i dużych szczątków komórkowych, które mogą zakłócać dalszą reakcję immunoprecypitacji.

Dodać lipidy DHPC i CA-630 do supernatantu z poprzedniego etapu wirowania. Te lipidy pomogą oddzielić fazy białkowe od innych składników wewnątrzkomórkowych. Umieścić zawiesinę na lodzie na pięć minut i pozostawić do odsiadowania.

Wirować lizat przez 10 minut w temperaturze 13 000 razy G, aby osadzać dowolny rozpuszczalny materiał. Zachowaj 15% klarownego lizatu na przyszłe kroki. Dodać kulki związane z przeciwciałem anty-GFP do supernatantu lizatu komórkowego i inkubować mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza z obrotem od końca do końca przez 30 minut.

W tym miejscu przeciwciała anty-GFP zwiążą rybosomy oznaczone GFP, co pozwoli nam na dalszą izolację RNA z tych rybosomów. Zbierz koraliki na stojaku magnetycznym i umyj je pięć razy za pomocą bufora do mycia polisomów o wysokiej zawartości soli, który przygotujesz przed rozpoczęciem izolacji. Natychmiast przejdź do kolejnego kroku, w którym umieścisz koraliki w buforze RLT.

Wirować lizat przez trzy minuty z pełną prędkością, a następnie ostrożnie usunąć supernatant i przenieść go do nowej probówki do mikrodymowania. Dodać jedną objętość 70% etanolu do oczyszczonego lizatu i natychmiast wymieszać przez pipetowanie. Przejdź natychmiast do następnego etapu, w którym przeniesiesz do 700 mikrolitrów próbki, w tym wszelkie osady, które mogły się uformować, do kolumny wirującej umieszczonej w dwumililitrowej probówce zbiorczej.

Wirować lizat przez 15 sekund w temperaturze większej niż 8 000 razy G, aby umyć membranę kolumny wirowej. Odrzuć przepływ i przejdź do następnego kroku. Dodać 350 mikrolitrów buforu RW1 do kolumny wirowej.

Wirować przez 15 sekund w temperaturze większej niż 8 000 razy G, aby przemyć membranę kolumny wirowej i odrzucić przepływ. Powtórz ten krok, używając kolejnych 350 mikrolitrów buforu RW1 przed przejściem do następnego kroku. Dodaj 500 mikrolitrów buforu RPE do kolumny wirowej.

Wirować przez 15 sekund w temperaturze większej niż 8 000 razy G, aby umyć membranę kolumny wirowej. Odrzuć przepływ i kontynuuj powtarzanie tego kroku, dodając kolejne 500 mikrolitrów buforu RPE do kolumny wirowej. Tym razem wirować przez dwie minuty w temperaturze większej niż 8.000 razy G, aby umyć membranę kolumny wirowej.

Odrzuć przepływ i umieść kolumnę wirową w nowej dwumililitrowej probówce zbiorczej i kontynuuj wirowanie z pełną prędkością przez jedną minutę, aby usunąć resztki buforu, które mogą znajdować się na kolumnie wirowej. Wyrzuć przepływ i umieść kolumnę wirującą w nowej 1.5-mililitrowej probówce zbiorczej. Kontynuuj dodawanie od 30 do 50 mikrolitrów wody wolnej od RNaz bezpośrednio do membrany kolumny wirowej.

Wirować przez jedną minutę w temperaturze większej niż 8 000 razy G, aby wymyć RNA z błony kolumny wirowej. W tym momencie twoje RNA rozpuszcza się w wodzie wolnej od RNaz i może być przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez okres do jednego roku. Kontynuuj ilościowe określanie i sprawdzanie czystości wyizolowanego RNA za pomocą spektrofotometru.

Szukasz piku na 260 nanometrach, czyli kwas nukleinowy, w tym RNA, wchłania się maksymalnie. Ilość jest przedstawiona w prawej dolnej części obrazu w nanogramach na mikrolitr. Jakość można wywnioskować na podstawie stosunku 260 do 230, który jest wyświetlany o jedną pozycję powyżej ilości w prawej dolnej części ekranu.

Nasze podejście wykazało niską wydajność RNA, zwłaszcza gdy oczyściliśmy mRNA z tkanek serca lub z wcześniej zamrożonych tkanek. W związku z tym musimy zoptymalizować warunki do zwiększenia plonów. Jednak zaobserwowaliśmy u myszy z niedoborem CD-36 specyficznych dla EC, poziom efryny B2 i DLL4 był znacznie zwiększony zarówno w śródbłonku płuc, jak i serca, w porównaniu z kontrolą.

Wyniki te były zgodne z naszymi wcześniejszymi badaniami in vitro, które sugerują, że jakość RNA jest wystarczająca do dalszej analizy. Wydajność była niska ze względu na rygorystyczne warunki panujące w naszym miejscu pracy. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, konieczne jest utworzenie strefy roboczej wolnej od RNaz oraz odkażenie powierzchni roboczych i sprzętu, które mogą zostać zanieczyszczone RNazą, a także częsta zmiana rękawic w celu ekstrakcji wysokiej jakości RNA i zwiększenia wydajności.

Kluczowe znaczenie ma również znalezienie odpowiednich stężeń przeciwciał GFP w matrycy powinowactwa i zastosowanie odpowiednich stężeń inhibitora RNazy w buforze do lizy tkanek oraz użycie wyrobów i odczynników z tworzyw sztucznych wolnych od RNaz do ekstrakcji RNA z rybosomów śródbłonka tkanek docelowych.