Name: Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) do izolacji RNA z komórek śródbłonka in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj metodę TRAP do izolacji RNA z komórek śródbłonka in vivo przy użyciu myszy transgenicznych z tagiem EGFP. Technika umożliwia analizę transkryptomu w tkankach mózgu, płuc i serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca dr Rena jest wspierana przez American Heart Association (13SDG14800019; BR), Fundacja Ann's Hope (FP00011709; BR), Amerykańskie Towarzystwo Onkologiczne (86-004-26; MCW Cancer Center do BR) oraz Narodowy Instytut Zdrowia (HL136423; BR); Jordan Palmer jest wspierany przez program stażowy MCW CTSI 500 Stars 2018; P. Moran jest wspierany przez Institutional Research Training Grant od NHLBI (5T35 HL072483-34).

Dla eksperymentów na zwierzętach, wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Kolegium Medycznego Wisconsin.
1. Przygotuj odczynniki
<ol>
	<li>Przygotować bufor do lizy do stężeń 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 100 μg/ml cykloheksymidu, inhibitorów proteazy i rekombinowanych inhibitorów RNazy do stężeń opisanych poniżej.
	<ol>
		<li>Do 500 ml wody dejonizowanej wolnej od RNaz dodać następujące odczynniki: 1,19 g HEPES, 5,59 g KCl, 0,24 g MgCl2, 35 mg DTT, 0,5 ml cykloheksymidu i NaOH w razie potrzeby do pH 7,4, inhibitory proteazy wolne od EDTA (jedna mini tabletka na 10 ml) i inhibitor RNazy (10 μl / ml).</li>
		<li>Przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C do 1 miesiąca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować wysokosolny polisomowy bufor płuczący do stężeń 10 mM HEPES, pH 7,4, 350 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1% obj./obj. CA-630, 0,5 mM DTT i 100 μg/ml cykloheksymidu.
	<ol>
		<li>Do 500 ml wody dejonizowanej wolnej od RNaz dodać następujące odczynniki: 1,19 g HEPES, 13,05 g KCl, 0,24 g MgCl2, 5 ml niejonowego, niedenaturującego detergentu, 5 probówek 7,7 mg DTT i 0,5 ml cykloheksymidu oraz NaOH w razie potrzeby do pH 7,4.</li>
		<li>Przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C do 1 miesiąca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zwiąż przeciwciało anty-GFP z kulkami magnetycznymi białka G przed rozpoczęciem eksperymentu.
	<ol>
		<li>Dodać 10 μg przeciwciała anty-GFP rozcieńczonego w 200 μl PBS do kulek białka G.</li>
		<li>Inkubować z obrotem od końca do końca przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umieść koraliki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant.</li>
		<li>Zawiesić kulki w 200 μl PBS i przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj lodowaty PBS ze 100 μg/ml cykloheksymidu.
	<ol>
		<li>Dodać 1 objętość roztworu cykloheksymidu (100 mg/ml) do 999 objętości lodowatego PBS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wyizoluj i zliza pożądanych tkanek
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji przez wstrzyknięcie IP ketaminy (500 mg/kg/masę ciała) i ksylazyny (10 mg/kg/masę ciała) i wyizoluj pożądane tkanki (tj. serce, płuca). Natychmiast przejdź do następnego kroku.</li>
	<li>Umieść żądane tkanki w 500 μl lodowatego PBS ze 100 μg/ml cykloheksymidu.</li>
	<li>Zmiel tkankę na zawiesinę komórkową za pomocą homogenizatora napędzanego silnikiem lub homogenizatora szklanego o małym prześwicie. W przypadku korzystania z homogenizatora napędzanego silnikiem należy ograniczyć homogenizację do mniej niż 1 minuty przy niskiej częstotliwości (<15 000 Hz), aby uniknąć denaturacji RNA.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 200 μl buforu do lizy, kilkakrotnie pipetując i ponownie pobierając bufor. Dalej homogenizować zawiesinę komórek za pomocą 10 pociągów w homogenizatorze szklanym o małym prześwicie lub przez 15 sekund przy niskiej częstotliwości (<15 000 Hz) w homogenizatorze napędzanym silnikiem.</li>
	<li>Odwirowywać homogenaty przez 10 minut w temperaturze 2 000 x g w temperaturze 4 °C w celu osadzania jąder i dużych szczątków komórkowych i utrzymywania supernatantu.</li>
	<li>Do supernatantu dodać niejonowy, niedenaturujący detergent do 1% obj./obj. i DHPC do 30 mM. Inkubować na lodzie przez 5 minut.</li>
	<li>Odwirować lizat przez 10 minut przy 16 000 x g do granulowania nierozpuszczalnego materiału. Przenieś i zachowaj 15% klarownego lizatu jako dane wejściowe dla przyszłych kroków.</li>
</ol>
3. Izolowanie kompleksów rybosom/mRNA
<ol>
	<li>Dodać 50 μl kulek związanych z przeciwciałami do supernatantu z lizatu komórkowego i inkubować mieszaninę w temperaturze 4 °C z rotacją wierzchołka do końca przez 30 minut. W tym miejscu przeciwciała anty-GFP zwiążą rybosomy znakowane GFP, co pozwoli nam na dalszą izolację RNA od tych rybosomów.</li>
	<li>Zbierz koraliki na stojaku magnetycznym i umyj 5 razy buforem do mycia polisomów o wysokiej soli.
	<ol>
		<li>Pobrać i wylać płyn, gdy kulki zbiorą się z boku tuby. Następnie odpipetować i kilkakrotnie pobrać 200 μl polisomenowego buforu do płukania o wysokiej zawartości soli. Powtórz ten krok 5 razy i odrzuć cały bufor po ostatnim powtórzeniu. Natychmiast przejdź do następnego kroku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wyizoluj mRNA
<ol>
	<li>Umieść koraliki w buforze RLT. Poniższe kroki zostały zaczerpnięte bezpośrednio z protokołu RNeasy mini kit i nie zostały w żaden sposób rozwinięte. 
	UWAGA: Bufor RLT zawiera sole guanidyny; NIE mieszać z wybielaczem.</li>
	<li>Odwirować lizat przez 3 minuty przy pełnej prędkości 13 000 obr./min lub 16 000 g w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant o objętości 350 μl przez pipetowanie i przenieść go do nowej probówki do mikrofuge. W kolejnych krokach należy stosować tylko ten supernatant (lizat).</li>
	<li>Dodaj równą objętość 70% etanolu do probówki do mikrofuge.</li>
	<li>Przenieść do 700 μl próbki, łącznie z osadem, który mógł się utworzyć, do kolumny wirowej umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Delikatnie zamknij pokrywę i wiruj przez 15 sekund przy ≥8 000 x g, aby umyć membranę kolumny wirowej. Odrzuć przepływ.</li>
	<li>Dodać 350 μl buforu RW1 do kolumny wirowej. Delikatnie zamknij pokrywę i wiruj przez 15 sekund przy ≥8 000 x g, aby umyć membranę kolumny wirowej. Wyrzuć przepływ i ponownie użyj probówki zbiorczej w następnym kroku. 
	UWAGA: Bufor RW1 zawiera sole guanidyny; NIE mieszać z wybielaczem.</li>
	<li>Dodać 350 μl buforu RW1 do kolumny wirowej. Delikatnie zamknij pokrywę i wiruj przez 15 s przy ≥8 000 x g. Odrzuć przepływ.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu RPE do kolumny wirowej. Delikatnie zamknij pokrywę i wiruj przez 15 sekund przy ≥8 000 x g, aby umyć membranę kolumny wirowej. Odrzuć przepływ.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu RPE do kolumny wirowej. Delikatnie zamknij pokrywę i wiruj przez 2 minuty przy ≥8 000 x g, aby umyć membranę kolumny wirowej. Następnie ostrożnie wyjmij kolumnę wirową z rurki zbiorczej, upewniając się, że kolumna nie styka się z przepływem.</li>
	<li>Umieść kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wyrzuć starą probówkę wraz z przepływem. Delikatnie zamknij pokrywę i wiruj z pełną prędkością przez 1 minutę, aby usunąć resztki buforu.</li>
	<li>Umieść kolumnę wirującą w nowej probówce zbiorczej o pojemności 1.5 ml. Dodaj 30-50 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio do membrany kolumny wirowej. Delikatnie zamknij pokrywkę i odwiruj przez 1 minutę przy ≥8 000 x g, aby wymyć RNA.</li>
	<li>Jeśli oczekiwana wydajność RNA wynosi >30 μg, powtórz krok 4.10 z kolejnymi 30-50 μl wody wolnej od RNaz lub używając elucji z kroku 4.10 (jeśli wymagany jest wysoki [RNA]). Użyj ponownie probówki zbiorczej z kroku 4.10.</li>
	<li>Użyj oczyszczonego RNA do dalszej analizy, w tym sekwencjonowania RNA lub ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, lub przechowuj RNA rozpuszczone w H2O bez RNaz w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku.</li>
</ol>

<ol><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li>
<li>Best, B., Moran, P., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF%2FPKD-1+signaling+mediates+arteriogenic+gene+expression+and+angiogenic+responses+in+reversible+human+microvascular+endothelial+cells+with+extended+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPA%2FPKD-1-FoxO1+Signaling+Axis+Mediates+Endothelial+Cell+CD36+Transcriptional+Repression+and+Proangiogenic+and+Proarteriogenic+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosclerosis+Thrombosis%2C+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming.</a> Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).</li>
<li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Kinase+D1+Signaling+in+Angiogenic+Gene+Expression+and+VEGF-Mediated+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37(2016).</li>
<li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO1+transcriptional+activities+in+VEGF+expression+and+beyond%3A+a+key+regulator+in+functional+angiogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?</a> Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).</li>
<li>Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+TRAP-sequencing+technology+with+a+versatile+conditional+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model.</a> Nucleic Acids Research. 42, e14(2014).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+links+to+ER+positive+breast+cancer+progression+via+LPA%2FPKD-1-CD36+signaling-mediated+microvascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling.</a> Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK1%2F2-Akt1+crosstalk+regulates+arteriogenesis+in+mice+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).</li>
<li>Skuli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+HIF-2alpha+regulates+murine+pathological+angiogenesis+and+revascularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Angiogeneza jest złożonym, wieloetapowym procesem, w którym transkrypcja i ekspresja genów angiogennych specyficznych dla EC odgrywa zasadniczą rolę w różnicowaniu EC i przeprogramowywaniu angiogennym 3,4. Aby pokonać bariery wynikające z różnorodności komórkowej i złożoności architektonicznej w celu lepszego zrozumienia funkcji układu naczyniowego ssaków na poziomie molekularnym in vivo, stworzyliśmy myszy TRAP specyficzne dla EC, którym towarzyszy specyficzny <...

W złożonych tkankach, takich jak mózg, serce i płuca ssaków, wysoki poziom niejednorodności komórkowej komplikuje analizę danych dotyczących ekspresji genów pochodzących z całych próbek tkanek. Aby zaobserwować profile ekspresji genów w określonym typie komórki in vivo, opracowano niedawno nową metodologię, która umożliwia badanie całego translowanego dopełniacza mRNA dowolnego genetycznie zdefiniowanego typu komórki. Ta metodologia jest znana jako technika oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP)1,2. Jest to przydatne narzędzie do badania biologii komórek śródbłonka i angiogenezy w połączeniu z genetycznym manipulowaniem innymi genami związanymi z angiogenezą u zwierząt.
Wykazaliśmy, że angiogenna sygnalizacja PKD-1 i transkrypcja angiogennego genu CD36 są kluczowe dla różnicowania komórek śródbłonka (EC) i funkcjonalnej angiogenezy3,4,5,6. Aby określić molekularne mechanizmy sygnalizacji angiogennej i metabolicznej w transkrypcji genów i transróżnicowaniu EC, stworzyliśmy genetycznie zmodyfikowane myszy TRAP ze specyficznie usuniętymi genami angiogennymi na podstawie techniki TRAP1,2. Co więcej, u naszych zwierząt TRAP nie tylko mają one niedobór genu pkd-1 lub cd36 w śródbłonku naczyniowym lub globalną delecję genu cd36, ale także wzmocnione białko zielonej fluorescencji (EGFP) jest genetycznie znakowane na rybosomach translujących EC. TRAP umożliwia oczyszczanie z powinowactwem mRNA związanego z rybosomami bezpośrednio z śródbłonka naczyniowego docelowych tkanek, umożliwiając analizę ekspresji genów i identyfikację nowych transkryptomów, które są związane z różnicowaniem EC i angiogenezą bezpośrednio w warunkach in vivo. Udało nam się wyizolować RNA związane z rybosomami ze śródbłonka u tych genetycznie zmodyfikowanych zwierząt. Oczyszczone RNA może być wykorzystane do dalszej charakterystyki genów angiogennych lub arteriogennych w regulacji różnicowania i funkcji EC. Protokół ten zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący wdrażania podejścia TRAP do izolacji mRNA w EC bezpośrednio in vivo.

<table><tbody><tr><td>2100 Bioanalizator elektroforezy z nanochipami i pikochipami</td><td>Agilent</td><td>G2939AA, 5067-1511 i 5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Skrobaki do komórek</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizatory</td><td>Fisher Scientific</td><td>K8855100020</td><td></td></tr><tr><td>Magnet (Dynamag-2)</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td>Zależy od skali oczyszczania; próbki w probówkach o pojemności 1,5 ml można zagęścić </td></tr><tr><td>a Miniwirówka</td> DynaMag-2 <td>Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop 2000C</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td>z wirnikiem do probówek mikrowirówek 1,5 ml</td></tr> bez <tr><td>RNaz Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Applied Biosystems&nbsp;</td><td></td><td></td>AM12450</tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml bez rnazy</td><td>Applied Biosystems&nbsp;</td><td></td><td></td>AM12501</tr><tr><td>1000-&mu; Bez RNaz; l Końcówki</td><td>filtracyjne Rainin</td><td>RT-1000F</td><td></td></tr><tr><td>RNazo-free 200-&mu; l końcówki filtracyjne</td><td>Rainin&nbsp;</td><td>RT-200F</td><td></td></tr><tr><td>bez RNaz 20-&mu; l końcówki filtracyjne</td><td>Rainin&nbsp;</td><td>RT-20F</td><td></td></tr><tr><td>Wirnik do homogenizatorów</td><td>Yamato&nbsp;</td><td>LT-400D</td><td></td></tr><tr><td>Rotator rurowy, marki Labquake</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-687-12Q</td><td></td></tr></tbody></table>

translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (trap) do izolacji rna z komórek śródbłonka in vivo

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Wiele badań ograniczało się do stosowania testów komórkowych in vitro i całych tkanek lub izolowania określonych typów komórek od zwierząt do analizy in vitro transkryptomu i ekspresji genów za pomocą sekwencjonowania qPCR i RNA. Kompleksowa analiza transkryptomu i ekspresji genów określonych typów komórek w złożonych tkankach i narządach będzie miała kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów komórkowych i molekularnych, za pomocą których geny są regulowane, oraz ich związku z homeostazą tkanek i funkcjami narządów. W tym artykule przedstawiono na przykład metodologię izolacji RNA związanego z rybosomem bezpośrednio in vivo w śródbłonku naczyniowym płuc zwierząt. Opisane zostaną konkretne materiały i procedury do przetwarzania tkanek i oczyszczania RNA, w tym ocena jakości i wydajności RNA, a także qPCR w czasie rzeczywistym do testów genów tętniczych. Podejście to, znane jako technika oczyszczania powinowactwa do rybosomów (TRAP), może być wykorzystane do charakterystyki ekspresji genów i analizy transkryptomu niektórych typów komórek bezpośrednio in vivo w dowolnym określonym typie w złożonych tkankach.

Nasze poprzednie badania4,7 sugerują, że CD36 może pełnić funkcję przełącznika dla różnicowania tętniczek i arteryalizacji naczyń kapilarnych poprzez szlak sygnalizacyjny LPA/PKD-1. Aby zbadać, czy oś sygnalizacyjna LPA/PKD-1-CD36 jest niezbędna dla arteriogenezy in vivo, opracowaliśmy nowe linie TRAP, które nie tylko wykazują globalny niedobór cd36 lub specyficzny dla śródbłonka niedobór cd36 lub pkd-1, ale także umożliwiają selektywną izolację RNA związanego z ...

Prezentujemy podejście do oczyszczania mRNA związanego z rybosomami z komórek śródbłonka naczyń krwionośnych (EC) bezpośrednio w tkankach mózgu, płuc i serca myszy za pomocą specyficznego dla EC znacznika genetycznego wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) w rybosomach w połączeniu z oczyszczaniem RNA.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) do izolacji RNA z komórek śródbłonka in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Cześć, nazywam się Bin Ren, jestem profesorem nadzwyczajnym chirurgii i inżynierii biomedycznej na Uniwersytecie Alabama w Birmingham School of Medicine. Nasze laboratorium interesuje się biologią komórek śródbłonka, funkcją, angiogenezą, akuogenezą w kontekście tych powszechnych chorób sercowo-naczyniowych i nowotworów. Jedno z naszych badań koncentruje się na epigenetycznej i transkrypcyjnej regulacji transróżnicowania komórek śródbłonka i angiogenezy.Aby zrozumieć mechanizmy transkrypcyjne angiogenezy, ustaliliśmy transgeniczne zmodyfikowane linie myszy, w których nie tylko usunęliśmy określone geny związane z angiogenezą w komórkach śródbłonka, ale także ulepszoną sondę GFP zostanie genetycznie znakowana na rybosomie natywnych komórek śródbłonka. W ten sposób możemy wyizolować i oczyścić pętle powiązanego informacyjnego RNA z komórek śródbłonka w różnych narządach tkankowych bezpośrednio u zwierząt transgenicznych. Następnie możemy użyć oczyszczonego informacyjnego RNA do dalszej analizy transkryptów i transkryptomu.Poprzez sekwencjonowanie RNA i chill PCR w czasie rzeczywistym. W tym filmie moi studenci Patrick Moran i Jordan Palmer oraz technicy naukowi Nicholas Barnekow i Rong Yuan pokażą Ci podejście do genotypowania transgenicznych myszy i aspirującego informacyjnego RNA bezpośrednio ze śródbłonka u zwierząt transgenicznych. Genotypowanie jest ważnym wstępem w tym protokole, aby upewnić się, że lód ma znacznik GFP na rybosomach komórek śródbłonka.Ponieważ wszystkie dalsze etapy izolacji RNAi opierają się na obecności rybosomów znakowanych GFP, konieczne jest określenie genotypu przed rozpoczęciem eksperymentu. Przed rozpoczęciem izolacji RNA należy wykonać kilka etapów przygotowawczych. Obejmują one przygotowanie buforu i wiązanie przeciwciała anty-GFP z kulkami białka G dina.mogą przetrwać do jednego miesiąca w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a kulki związane z przeciwciałami mogą trwać do tygodnia w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Weź więc pod uwagę te ograniczenia podczas planowania eksperymentu. Stosowanie homogenizatora napędzanego zębami trzonowymi to doskonały sposób na zwiększenie wydajności RNA.Pamiętaj, aby używać niższych ustawień częstotliwości i czasu trwania, aby zmniejszyć degradację RNA. Jak wspomniano wcześniej, genotypowanie jest ważnym krokiem wstępnym w protokole badania. Upewnienie się, że myszy, których RNA ma zostać wyizolowane przy użyciu techniki TRAP, są dodatnie dla genu TRAP, co najmniej heterozygoty, ale najlepiej homozygotyczne dla genu TRAP, jest ważnym krokiem, ponieważ upewnienie się, że znacznik GFP znajduje się na rybosomie, jest niezbędne do ściągnięcia za pomocą reakcji przeciwciała antygenowego i kulek anty-GFP, które zostaną przygotowane przed rozpoczęciem eksperymentu.Odizoluj pożądane tkanki od myszy i natychmiast umieść je w lodowatym PBS ze 100 mikrogramami na mililitr roztworu cykloheksamidu. Gwarantuje to, że tłumaczenie zostanie zatrzymane, a transkryptom będzie dokładnym obrazem myszy przed eutanazją. Użyj homogenizatora napędzanego silnikiem, aby homogenizować tkankę w zawiesinę komórkową.Idealne ustawienia czasu i częstotliwości będą musiały zostać określone przez indywidualne laboratorium w oparciu o konkretny homogenizator z napędem silnikowym, którego będziesz używać. Użycie zbyt wysokiego ustawienia częstotliwości może prowadzić do degradacji RNA i zakłócić resztę protokołu. Zawieś osad komórkowy w buforze do lizy, który powinieneś był przygotować przed rozpoczęciem eksperymentu.Należy pamiętać o dalszej homogenizacji tej mieszaniny, aby zapewnić odpowiednią homogenizację przed przystąpieniem do reszty protokołu. Odwirowywać homogenat przez 10 minut w temperaturze 2 000 razy G w wirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Spowoduje to osadzenie jąder i dużych szczątków komórkowych, które mogą zakłócać dalszą reakcję immunoprecypitacji.Dodać lipidy DHPC i CA-630 do supernatantu z poprzedniego etapu wirowania. Te lipidy pomogą oddzielić fazy białkowe od innych składników wewnątrzkomórkowych. Umieścić zawiesinę na lodzie na pięć minut i pozostawić do odsiadowania.Wirować lizat przez 10 minut w temperaturze 13 000 razy G, aby osadzać dowolny rozpuszczalny materiał. Zachowaj 15% klarownego lizatu na przyszłe kroki. Dodać kulki związane z przeciwciałem anty-GFP do supernatantu lizatu komórkowego i inkubować mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza z obrotem od końca do końca przez 30 minut.W tym miejscu przeciwciała anty-GFP zwiążą rybosomy oznaczone GFP, co pozwoli nam na dalszą izolację RNA z tych rybosomów. Zbierz koraliki na stojaku magnetycznym i umyj je pięć razy za pomocą bufora do mycia polisomów o wysokiej zawartości soli, który przygotujesz przed rozpoczęciem izolacji. Natychmiast przejdź do kolejnego kroku, w którym umieścisz koraliki w buforze RLT.Wirować lizat przez trzy minuty z pełną prędkością, a następnie ostrożnie usunąć supernatant i przenieść go do nowej probówki do mikrodymowania. Dodać jedną objętość 70% etanolu do oczyszczonego lizatu i natychmiast wymieszać przez pipetowanie. Przejdź natychmiast do następnego etapu, w którym przeniesiesz do 700 mikrolitrów próbki, w tym wszelkie osady, które mogły się uformować, do kolumny wirującej umieszczonej w dwumililitrowej probówce zbiorczej.Wirować lizat przez 15 sekund w temperaturze większej niż 8 000 razy G, aby umyć membranę kolumny wirowej. Odrzuć przepływ i przejdź do następnego kroku. Dodać 350 mikrolitrów buforu RW1 do kolumny wirowej.Wirować przez 15 sekund w temperaturze większej niż 8 000 razy G, aby przemyć membranę kolumny wirowej i odrzucić przepływ. Powtórz ten krok, używając kolejnych 350 mikrolitrów buforu RW1 przed przejściem do następnego kroku. Dodaj 500 mikrolitrów buforu RPE do kolumny wirowej.Wirować przez 15 sekund w temperaturze większej niż 8 000 razy G, aby umyć membranę kolumny wirowej. Odrzuć przepływ i kontynuuj powtarzanie tego kroku, dodając kolejne 500 mikrolitrów buforu RPE do kolumny wirowej. Tym razem wirować przez dwie minuty w temperaturze większej niż 8.000 razy G, aby umyć membranę kolumny wirowej.Odrzuć przepływ i umieść kolumnę wirową w nowej dwumililitrowej probówce zbiorczej i kontynuuj wirowanie z pełną prędkością przez jedną minutę, aby usunąć resztki buforu, które mogą znajdować się na kolumnie wirowej. Wyrzuć przepływ i umieść kolumnę wirującą w nowej 1.5-mililitrowej probówce zbiorczej. Kontynuuj dodawanie od 30 do 50 mikrolitrów wody wolnej od RNaz bezpośrednio do membrany kolumny wirowej.Wirować przez jedną minutę w temperaturze większej niż 8 000 razy G, aby wymyć RNA z błony kolumny wirowej. W tym momencie twoje RNA rozpuszcza się w wodzie wolnej od RNaz i może być przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez okres do jednego roku. Kontynuuj ilościowe określanie i sprawdzanie czystości wyizolowanego RNA za pomocą spektrofotometru.Szukasz piku na 260 nanometrach, czyli kwas nukleinowy, w tym RNA, wchłania się maksymalnie. Ilość jest przedstawiona w prawej dolnej części obrazu w nanogramach na mikrolitr. Jakość można wywnioskować na podstawie stosunku 260 do 230, który jest wyświetlany o jedną pozycję powyżej ilości w prawej dolnej części ekranu.Nasze podejście wykazało niską wydajność RNA, zwłaszcza gdy oczyściliśmy mRNA z tkanek serca lub z wcześniej zamrożonych tkanek. W związku z tym musimy zoptymalizować warunki do zwiększenia plonów. Jednak zaobserwowaliśmy u myszy z niedoborem CD-36 specyficznych dla EC, poziom efryny B2 i DLL4 był znacznie zwiększony zarówno w śródbłonku płuc, jak i serca, w porównaniu z kontrolą.Wyniki te były zgodne z naszymi wcześniejszymi badaniami in vitro, które sugerują, że jakość RNA jest wystarczająca do dalszej analizy. Wydajność była niska ze względu na rygorystyczne warunki panujące w naszym miejscu pracy. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, konieczne jest utworzenie strefy roboczej wolnej od RNaz oraz odkażenie powierzchni roboczych i sprzętu, które mogą zostać zanieczyszczone RNazą, a także częsta zmiana rękawic w celu ekstrakcji wysokiej jakości RNA i zwiększenia wydajności.Kluczowe znaczenie ma również znalezienie odpowiednich stężeń przeciwciał GFP w matrycy powinowactwa i zastosowanie odpowiednich stężeń inhibitora RNazy w buforze do lizy tkanek oraz użycie wyrobów i odczynników z tworzyw sztucznych wolnych od RNaz do ekstrakcji RNA z rybosomów śródbłonka tkanek docelowych.

translating-ribosome-affinity-purification-trap-for-rna-isolation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Główną przeszkodą w analizach biochemicznych rybosomów zawierających powstające peptydylo-tRNA była obecność innych rybosomów w tych samych próbkach — rybosomów niezaangażowanych w translację konkretnej analizowanej sekwencji mRNA. Opracowaliśmy prostą metodologię pozwalającą na wyłączną puryfikację rybosomów zawierających interesujące nas powstające peptydylo-tRNA.

Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających peptydylo-tRNA do analiz funkcjonalnych i strukturalnych

Ten film demonstruje test in vitro do ekstrakcji RNA w celu identyfikacji białek wiążących RNA (RBP), które oddziałują z sekwencjami elementów bogatych w adenylan-urydylan (ARE) w mRNA. Docelowe RBP z lizatu komórkowego miesza się z sondą RNA w celu utworzenia kompleksów RNA-białko. Kompleksy izoluje się poprzez oczyszczanie powinowactwa z wykorzystaniem powinowactwa znacznika destiobiotyny sondy RNA do kulki magnetycznej znakowanej streptawidyną.

Test ściągania białka RNA w celu wyizolowania białek wiążących RNA poprzez ekstrakcję powinowactwa

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) jest w stanie uchwycić specyficzną dla typu komórki translację mRNA. W tym miejscu przedstawiamy pierwszy protokół TRAP poświęcony izolacji mRNA w rzadkich populacjach komórek zarodków Drosophila.

TRAP-rc, Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów z rzadkich populacji komórek zarodków Drosophila

Ten manuskrypt opisuje podejście do izolacji wybranych pokrewnych RNP powstałych w komórkach eukariotycznych poprzez specyficzne wzbogacenie ukierunkowane na oligonukleotydy. Wykazujemy możliwość zastosowania tego podejścia poprzez wyizolowanie pokrewnego RNP związanego z retrowirusowym regionem 5' bez translacji, który składa się z helikazy DHX9 / RNA A.

Izolacja pokrewnych kompleksów RNA-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami

Opisano procedurę tandemowej izolacji RNA (TRIP) w celu odzyskania endogennie utworzonych kompleksów mRNA-białko. W szczególności kompleksy RNA-białko są sieciowane in vivo, poliadenylowane RNA są izolowane z ekstraktów z kulkami oligo(dT), a poszczególne mRNA są wychwytywane za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych RNA. Białka związane z mRNA są wykrywane za pomocą analizy immunoblot.

Procedura izolacji tandemowego RNA oparta na oligonukleotydach w celu odzyskania eukariotycznych kompleksów mRNA-białko

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) umożliwia szybką i efektywną izolację mRNA translującego specyficznego dla typu komórki. Tutaj demonstrujemy metodę, która łączy hydrodynamiczne wstrzykiwanie żyły ogonowej w mysim modelu ponownego zasiedlania wątroby i TRAP w celu zbadania profilu ekspresji repopulujących hepatocytów.

Profilowanie ekspresji genów specyficzne dla typu komórki w wątrobie myszy

Tutaj opisujemy immunoprecypitację rybosomów i związanego z nimi RNA z wybranych populacji dorosłych męskich komórek rozrodczych myszy za pomocą systemu RiboTag. Strategiczna hodowla i staranna immunoprecypitacja skutkują czystymi, powtarzalnymi wynikami, które informują o translatomie komórek rozrodczych i dostarczają wglądu w mechanizmy zmutowanych fenotypów.

Immunoprecypitacja RiboTag w komórkach rozrodczych samca myszy

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w modyfikacjach powstających łańcuchów, celowaniu, składaniu i ścieżkach montażu. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelu eukarionta Saccharomyces cerevisiae.

Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

Ten protokół ma na celu wyizolowanie specyficznych dla typu komórki translujących rybosomalnych mRNA za pomocą mysiego modelu NuTRAP.

Izolowanie RNA specyficznych dla typu komórki z zatrzaskowo mrożonych próbek tkanek heterogenicznych bez sortowania komórek

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Poznaj metodę TRAP do izolacji RNA z komórek śródbłonka in vivo przy użyciu myszy transgenicznych z tagiem EGFP. Technika umożliwia analizę transkryptomu w tkankach mózgu, płuc i serca.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) do izolacji RNA z komórek śródbłonka in vivo

Przeglądaj więcej filmów