Name: Biopsja ludzkiej blastocysty i witryfikacja (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Naucz się biopsji blastocysty i witryfikacji w procedurach IVF. Ta metoda umożliwia pobranie komórek trofektodermy do testów genetycznych przy minimalnym ryzyku dla embrionu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AG i RM zebrali dane i sporządzili manuskrypt. DC przeanalizował dane, sporządził reprezentatywne wyniki, przeprowadził statystyki i zrewidował manuskrypt. FMU i LR przeprowadziły krytyczną dyskusję na temat wyników i całego manuskryptu.

Protokół biopsji ludzkiej blastocysty, opisany tutaj, jest zgodny z wytycznymi Komitetu Etyki Badań Naukowych na Ludziach G.EN.E.R.A.
UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą Materiałów, aby zapoznać się z wymaganymi materiałami. Dalsze wymagane materiały obejmują obuwie i strój laboratoryjny, maskę chirurgiczną, osłonę włosów, rękawiczki chirurgiczne, trwały nietoksyczny marker, kleszcze i środek dezynfekujący. Stosowanie fartucha chirurgicznego, jednorazowych rękawiczek chirurgicznych, maski na twarz, osłony włosów jest obowiązkowe, aby zapobiec ryzyku zakażenia. Wszystkie obszary robocze, a także sprzęt biorący udział w procesie, muszą być dokładnie oczyszczone laboratoryjnym środkiem dezynfekującym (np. Oosafe) przed rozpoczęciem jakiejkolwiek procedury. Wszystkie używane materiały eksploatacyjne i media powinny być sterylne i pakowane pojedynczo lub porcjowane. Sugeruje się korzystanie z dedykowanego stanowiska do biopsji i rurki oraz ograniczenie dostępu do tego obszaru tylko do operatorów zaangażowanych w zabieg (embriologa i świadka).
1. Przygotowanie w dniu poprzedzającym zabieg biopsji
<ol>
	<li>Przygotuj naczynie do hodowli po biopsji.
	<ol>
		<li>Umieścić 6 kropli po 20 μl pożywki do hodowli in vitro (tabela materiałów) w naczyniu do hodowli in vitro i nałożyć na 6 ml wstępnie podgrzanego oleju mineralnego do hodowli zarodków (tabela materiałów).</li>
		<li>Do każdej kropli dodać kolejne 10 μl pożywki do hodowli in vitro. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w kontrolowanej atmosferze (5%O2, 6% CO2 ).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 4-dołkową płytkę do zapłodnienia in vitro do płukania blastocysty po biopsji.
	<ol>
		<li>Umieścić 600 μl pożywki do hodowli in vitro w pierwszych dwóch dołkach i nałożyć 300 μl wstępnie podgrzanego oleju mineralnego do hodowli zarodków.</li>
		<li>Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w kontrolowanej atmosferze (5%O2, 6% CO2 ).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dozować 1,5 μl roztworu ładującego (tabela materiałów) do każdej probówki do PCR, która ma być użyta do rurki komórek TE, odwirować ją i utrzymywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie w dniu zabiegu biopsji
<ol>
	<li>Przygotuj naczynie do biopsji.
	<ol>
		<li>Umieścić 3 krople 10 μl pożywki buforowanej HEPES (uzupełnionej albuminą surowicy ludzkiej) (tabela materiałów) w rzędzie w naczyniu do hodowli in vitro.</li>
		<li>Powtórzyć krok 1.1.1 w zależności od liczby dostępnych blastocyst (do 4 blastocyst na szalkę) i nałożyć 6 ml wstępnie podgrzanego oleju mineralnego do hodowli zarodków.</li>
		<li>Inkubować szalkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę przed wykonaniem procedury biopsji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Selekcja i klasyfikacja blastocyst
<ol>
	<li>Oceń blastocystę zgodnie z jej ekspansją i morfologicznym wyglądem ICM i TE (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Kryteria oceniania zostały zaczerpnięte z Gardner and Schoolcraft15 i wcześniej opisane przez Capalbo et al. oraz Cimadomo et al.4,11.
	<ol>
		<li>Zdefiniuj rozmiar i stopień ekspansji jako: A dla w pełni wykukłowanej blastocysty, B dla wylęgającej się blastocysty, C dla w pełni rozwiniętej blastocysty i D dla nierozwiniętej blastocysty (te zarodki są poddawane biopsji tylko wtedy, gdy nie rozszerzały się dalej do 7 dnia).</li>
		<li>Zdefiniuj stopień ICM: 1 dla zauważalnego ICM z kilkoma ściśle upakowanymi komórkami; 2 dla rozpoznawalnego z kilku, ale z grubsza upakowanymi komórkami; 3 dla trudnego do odróżnienia z bardzo małą liczbą komórek niskiej jakości.</li>
		<li>Zdefiniuj stopień TE w następujący sposób: 1 dla dobrze zorganizowanego nabłonka z kilkoma komórkami; 2 dla luźnego nabłonka z kilkoma komórkami; 3 dla kilku i/lub dużych komórek niskiej jakości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Biopsja trofektodermy
<ol>
	<li>Wykonaj biopsję TE na wszystkich żywych, w pełni rozwiniętych blastocystach (najlepiej klasy C ze względu na rozmiar i ekspansję).</li>
	<li>Zestaw pipet do trzymania i biopsji do każdej procedury biopsji. Zalecenia dotyczące pipety do biopsji są następujące: średnica wewnętrzna 30 μm, kąt gięcia 35°, odległość od końcówki do zgięcia 0,75 mm.</li>
	<li>Oznacz miskę do biopsji danymi pacjenta (imię i nazwisko kobiety, data urodzenia i dowód osobisty), a następnie ponumeruj każdą kroplę identyfikatorami zarodka i cyklu. Użyj trwałego, nietoksycznego markera.</li>
	<li>Przenieść blastocystę za pomocą pipety do strippingu 300 μm do pierwszej kropli naczynia biopsyjnego i wypłukać ją w celu usunięcia nadmiaru pożywki hodowlanej. Następnie przenieś blastocystę do drugiej kropli naczynia biopsyjnego.</li>
	<li>Przenieś naczynie do odwróconego mikroskopu i zalej pipetę biopsyjną, odsysając trochę pożywki z trzeciej kropli naczynia biopsyjnego.</li>
	<li>Przy 20-krotnym powiększeniu ustaw blastocystę tak, aby mieć wyraźny widok na ICM. Po uwidocznieniu zarodka na godzinie 7 (naprzeciwko obszaru, który będzie celem usunięcia komórek TE), zabezpiecz zarodek na pipecie przytrzymującej (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2a).</li>
	<li>Skoncentruj się na osłonce przejrzystej i upewnij się, że zarówno pipety, jak i blastocysta znajdują się na tej samej płaszczyźnie ogniskowej.</li>
	<li>Przełącz się na obiektyw laserowy (czas impulsu 0,3 ms, 6,5 μm) i ustaw wskaźnik laserowy na osłonie przejrzystej po przeciwnej stronie ICM. Przewiercić osłonę przezroczystą przez 2−3 impulsy laserowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 2b).</li>
	<li>Delikatnie dociśnij pipetę do biopsji do osłonki przejrzystej i przedmuchaj trochę pożywki przez szczelinę, aby oderwać komórki TE od jej wewnętrznej powierzchni i przyspieszyć zapadanie się blastocysty (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2c).</li>
	<li>Po odłączeniu TE (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2d), wejdź przez otwór (jeśli to konieczne, poszerz go ostatnim impulsem laserowym) i odessaj kilka komórek TE (najlepiej 7−813,16) do pipety do biopsji z delikatnym odsysaniem (<silna klasa="xfig">Rysunek 2e).</li>
	<li>Lekko przesuń pipetę do biopsji do tyłu, stosując umiarkowane ssanie, aby rozciągnąć komórki docelowe (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2f).</li>
	<li>Skieruj laser w stronę najcieńszej części aspirowanych komórek i wystrzel 2−5 impulsów laserowych na skrzyżowaniach między komórkami, aby oddzielić komórki docelowe od ciała zarodka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2g). Czas impulsów laserowych i liczbę impulsów można dostosować w zależności od jakości blastocysty; Staraj się jednak je minimalizować, aby uniknąć lizy komórek.</li>
	<li>Po oddzieleniu się fragmentu TE od blastocysty (<silna klasa="xfig">Ryc. 2h), uwolnij go do tej samej kropli biopsyjnej z dala od blastocysty. Jest to konieczne, aby zapobiec ich ponownemu zassaniu do pipety do biopsji (<silna klasa="xfig">Rysunek 2i).</li>
	<li>Uwolnij blastocystę z pipety trzymającej i natychmiast podnieś obie pipety, aby zapobiec przyklejaniu się do nich fragmentu.</li>
	<li>Zrób zdjęcie biopsyjnego fragmentu w celu kontroli jakości (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). 
	UWAGA: Jeśli w jednej procedurze ma zostać pobrana więcej niż jedna blastocysta (do czterech na miskę biopsyjną), należy wymienić pipetę do biopsji na nową, aby zapobiec zakażeniu krzyżowemu między zarodkami.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.1−4.13.</li>
	<li>Przenieś naczynie do biopsji z powrotem do okapu z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Oznacz naczynie do hodowli po biopsji identyfikatorem pary, a każdą kroplę zarodkiem i identyfikatorem cyklu.</li>
	<li>W obecności świadka przepłucz blastocystę w czystym pożywce IVF, a na koniec przenieś ją do odpowiedniej kropli naczynia po biopsji.</li>
	<li>Przenieść naczynie po biopsji do inkubatora w kontrolowanej atmosferze (37 °C, 6% CO2 , 5 % O2) do czasu witryfikacji. Wskazane jest wykonanie witryfikacji w ciągu 30 minut od zabiegu biopsji, aby zapobiec ponownemu namnażaniu się blastocysty.</li>
</ol>
5. Rurki
UWAGA: Cała procedura musi być przeprowadzona w obecności świadka i wewnątrz okapu z przepływem laminarnym w temperaturze pokojowej. Podczas zabiegu należy przechowywać probówki do PCR w zimnym stojaku na probówki na lodzie (rysunek uzupełniający 1).
<ol>
	<li>Oznacz probówki PCR trwałym, nietoksycznym markerem. 
	nuta: Oznakowanie powinno być wykonane zgodnie z wymaganiami laboratorium genetycznego. Ogólnie rzecz biorąc, imię i nazwisko pacjenta (inicjały), identyfikator pary, identyfikator zarodka i identyfikator cyklu (na przykład: JD 12345 1.2 dla zarodka nr 1 drugiego cyklu należącego do Jane Doe, której identyfikator pary to 12345). Identyfikator zarodka powinien być również podany w postaci liter na korpusie probówki.</li>
	<li>Oznaczyć pokrywkę naczynia hodowlanego o wymiarach 60 mm x 15 mm identyfikatorami zarodków poddanych biopsji (rysunek uzupełniający 1) i przygotować w nim dwie krople 10 μl roztworu do przemywania biopsji (tabela materiałów).</li>
	<li>Zalać pipetę do striptizu o długości 140 μm (Rysunek Uzupełniający 1) roztworem do płukania biopsji z drugiej kropli naczynia z rurką.</li>
	<li>Umieść naczynie biopsyjne pod mikroskopem stereoskopowym, aby łatwo uwidocznić fragment(y) TE.</li>
	<li>Delikatnie wypuścić trochę roztworu do płukania biopsji na fragment TE, a następnie załadować go do pipety do zdejmowania izolacji.</li>
	<li>Przenieś fragment TE do drugiej kropli roztworu do płukania biopsji w naczyniu z rurką i ostrożnie wypłucz go 2−3 razy.</li>
	<li>Przenieść fragment TE na dno probówki do PCR (wcześniej oznaczonej po niej) z roztworem ładującym, zwracając uwagę, aby nie dotykać jej ścianek końcówką pipety do strippingu.</li>
	<li>Powtórz procedurę od kroku 5.3 do kroku 5.7 dla każdego fragmentu TE, zwracając uwagę, aby użyć nowej kapilary dla każdego fragmentu TE.</li>
	<li>Pod koniec procedury rurkowania włóż wszystkie probówki PCR do mini wirówki i wiruj je przez kilka sekund.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu wysłania ich do laboratorium genetycznego w celu przeprowadzenia badań.</li>
</ol>
6. Witryfikacja blastocyst
<ol>
	<li>Vitrify spowodowały zapadnięcie się blastocyst w ciągu 30 minut od biopsji TE, aby zapobiec ich ponownemu rozszerzaniu się.</li>
	<li>Oznacz płytkę witryfikacyjną danymi kobiety i identyfikatorami blastocyst, które muszą zostać zeszklone.</li>
	<li>Oznacz nośnik(i) witryfikacyjny imieniem i nazwiskiem kobiety, identyfikatorem pary, identyfikatorem zarodka, który zostanie na niego załadowany, a także datą zabiegu. Stosowane są specjalne krioetykiety, które zachowują swoją integralność nawet w bardzo niskiej temperaturze (-196 °C).</li>
	<li>W temperaturze pokojowej dozować 0,3 ml roztworu równoważącego (ES) (tabela materiałów) dla każdej blastocysty, która będzie witryfikowana.</li>
	<li>W obecności świadka przesunąć blastocystę w ES za pomocą pipety do strippingu 300 μm.</li>
	<li>Pozostaw blastocystę w ES na 13-15 minut. Po początkowym zmniejszeniu objętości obserwuje się stopniową ponowną ekspansję.</li>
	<li>Napełnij mały stojak chłodzący ciekłym azotem (LN2) i umieść go pod okapem z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Dozować 300 μl roztworu do witryfikacji (VS) (tabela materiałów) do drugiego dołka. Po całkowitym ponownym rozprężeniu blastocysty przenieś ją do roztworu VS na 1 minutę i przepłucz w celu rozcieńczenia ES.</li>
	<li>W obecności świadka należy obciążyć blastocystę na podporę witryfikacyjną i zająć się usunięciem nadmiaru VS. Delikatna warstwa roztworu powinna otaczać blastocystę.</li>
	<li>Zanurz nośnik witryfikacyjny w LN2 i przesuń go energicznie, aby zmniejszyć ryzyko tworzenia się pęcherzyków w pobliżu próbki.</li>
	<li>Umieść nasadkę ochronną, trzymając podporę witryfikacyjną zanurzoną w LN2.</li>
	<li>W obecności świadka przenieść podporę witryfikacyjną w długoterminowym zbiorniku magazynowym LN2.</li>
</ol>
7. Sztuczne kurczenie się blastocyst bez biopsji
<ol>
	<li>Jeśli nie zostanie przeprowadzona biopsja TE, należy sztucznie zapaść blastocysty bezpośrednio przed witryfikacją (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 4).
	<ol>
		<li>Przenieś szalkę hodowlaną z inkubatora do mikroskopu odwróconego i skup się na wybranym zarodku.</li>
		<li>Przełącz się na obiektyw laserowy (wstępnie ustawiony impuls: 0,3 ms, 6,5 μm), skieruj osłonę przejrzystą po przeciwnej stronie ICM, a następnie skieruj 1–2 impulsy laserowe na połączenia między komórkami TE w bezpiecznej odległości od ICM. Blastocysty powinny zapaść się w czasie krótszym niż 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuuj witryfikację zapadniętej blastocysty zgodnie z opisem w punkcie 6.</li>
</ol>
8. Przenośne ocieplenie blastocyst
<ol>
	<li>W dniu ET przygotuj 4-dołkową płytkę ET, umieszczając 600 μl wstępnie zbalansowanej pożywki hodowlanej IVF dla każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C w kontrolowanej atmosferze (5%O2, 6% CO2), jednocześnie ogrzewając blastocysty.</li>
	<li>Oznacz naczynie rozgrzewające imieniem i nazwiskiem kobiety, identyfikatorem pary, identyfikatorem zarodka, który zostanie w nim podgrzany.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem procedury należy rozlać 1 ml roztworu do rozmrażania (TS) (tabela materiałów) do jednodołkowego naczynia do zapłodnienia in vitro (rysunek uzupełniający 1) i podgrzać je do 37 °C w termostacie przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Napełnij mały wspornik chłodzący LN2 i umieść go w okapie z przepływem laminarnym w bliskiej odległości od obszaru roboczego.</li>
	<li>Przed przystąpieniem do zabiegu należy zapoznać się z informacjami o blastocystach podanymi na podkładzie witryfikacyjnym. Wszystkie identyfikatory powinny być zgodne z raportem genetycznym, a blastocysta do rozgrzania musi być wybrana spośród tych, które można przenieść. W toku postępowania wymagany jest świadek.</li>
	<li>Wyjmij jednodołkowe naczynie zawierające podgrzany TS z termostatu i umieść je na podgrzewanym stage pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Przeciągnij nasadkę ochronną w LN2 za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Szybko zanurz końcówkę nośnika witryfikacyjnego w TS o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Pod obserwacją mikroskopową delikatnie przesuwaj podporę witryfikacji, aż blastocysta zostanie uwolniona z końcówki.</li>
	<li>Pozostaw blastocystę na łącznie 1 minutę w TS, zwracając uwagę, aby utrzymać ją na dnie TS.</li>
	<li>W temperaturze pokojowej dozować 200 μl roztworu rozcieńczającego (DS) (tabela materiałów) do pierwszego dołka płytki witryfikacyjnej.</li>
	<li>Przenieś blastocystę do DS i umieść ją na dnie studzienki, uwalniając trochę TS na górze, aby stworzyć rodzaj gradientu. Pozostaw na 3 minuty.</li>
	<li>Dozować 200 μl roztworu myjącego (WS) do 2 różnych dołków (WS1 i WS2).</li>
	<li>Przenieś blastocystę do WS1 i umieść ją na dnie studzienki, uwalniając trochę pożywki DS na wierzchu. Następnie przenieś blastocystę do WS2 i pozostaw ją w spokoju na 1 minutę.</li>
	<li>Oznacz tabliczkę ET po ociepleniu imieniem i nazwiskiem kobiety, identyfikatorem pary, identyfikatorem zarodka, który będzie w niej hodowany.</li>
	<li>W obecności świadka przenieś podgrzaną blastocystę do wstępnie zbalansowanej pożywki hodowlanej na pochodzącej po podgrzaniu płytce ET.</li>
	<li>Wypłucz blastocystę w pierwszym dołku płytki ET i umieść ją w drugiej studzience.</li>
	<li>Przenieść naczynie z hodowlą po podgrzaniu do inkubatora w kontrolowanej atmosferze (37 °C, 6% CO2 , 5 % O2) i hodować blastocystę przez co najmniej 1,5 godziny przed sprawdzeniem jej przeżywalności i ponownej ekspansji. 
	UWAGA: Rysunek 5 pokazuje przykłady zdegenerowanych, krioprzeżywanych, ale nie ponownie rozprężonych oraz krioprzeżywalnych i w pełni rozwiniętych blastocyst.</li>
</ol>
9. Embriotransfer
<ol>
	<li>Aby wykonać ET, umieść naczynie na podgrzewanym stoliku okapu z przepływem laminarnym, tak aby zarodek był widoczny pod mikroskopem w małym powiększeniu.</li>
	<li>Weź około 0,4 ml pożywki hodowlanej IVF. Mocno przymocować końcówkę strzykawki do końcówki odbiorczej cewnika wewnętrznego, a następnie uwolnić pożywkę do 0,1 ml.</li>
	<li>Odsysać pożywkę hodowlaną do momentu zaobserwowania zarodków wchodzących do cewnika (minimalna ilość pożywki: 10−15 μL).</li>
	<li>Umieść cewnik w plastikowej obudowie i udaj się na salę operacyjną i umieść cewnik wewnętrzny w prowadnicy zewnętrznej.</li>
	<li>Po dotarciu do macicy nacisnąć tłok strzykawki, aby uwolnić zarodek (zarodki). Bardzo powoli odpuszczać pożywkę, aż tłok zacznie wskazywać 0,1 ml.</li>
	<li>Zabierz cewnik z powrotem do laboratorium i sprawdź pod mikroskopem, czy zarodek został przeniesiony.</li>
</ol>

<ol><li>Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+stage+versus+blastocyst+stage+embryo+transfer+in+assisted+reproductive+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118(2016).</li>
<li>Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+chromosome+screening+improves+embryo+selection%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis.</a> Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).</li>
<li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Biopsy+on+Human+Embryo+Developmental+Potential+during+Preimplantation+Genetic+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Research+International%22%5BJournal%5D)">The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis.</a> Biomedical Research International. 2016, 7193075(2016).</li>
<li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+standard+blastocyst+morphology%2C+euploidy+and+implantation%3A+an+observational+study+in+two+centers+involving+956+screened+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts.</a> Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).</li>
<li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+PGD%2FPGD-A+in+IVF+clinics%3A+considerations+for+the+best+laboratory+approach+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).</li>
<li>McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnancies+and+live+births+after+trophectoderm+biopsy+and+preimplantation+genetic+testing+of+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts.</a> Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).</li>
<li>Kokkali, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+a+healthy+infant+following+trophectoderm+biopsy+from+blastocysts+for+PGD+of+beta-thalassaemia+major%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major.</a> Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).</li>
<li>Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preincubation+of+human+oocytes+may+improve+fertilization+and+embryo+quality+after+intracytoplasmic+sperm+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection.</a> Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).</li>
<li>Wale, P. L., Gardner, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+chemical+and+physical+factors+on+mammalian+embryo+culture+and+their+importance+for+the+practice+of+assisted+human+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction.</a> Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).</li>
<li>Rienzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte%2C+embryo+and+blastocyst+cryopreservation+in+ART%3A+systematic+review+and+meta-analysis+comparing+slow-freezing+versus+vitrification+to+produce+evidence+for+the+development+of+global+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance.</a> Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).</li>
<li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+blastocyst+features%2C+trophectoderm+biopsy+and+other+laboratory+practice+with+post-warming+behavior+and+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation.</a> Human Reproduction. , (2018).</li>
<li>Evans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fresh+versus+frozen+embryo+transfer%3A+backing+clinical+decisions+with+scientific+and+clinical+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence.</a> Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).</li>
<li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consistent+and+reproducible+outcomes+of+blastocyst+biopsy+and+aneuploidy+screening+across+different+biopsy+practitioners%3A+a+multicentre+study+involving+2586+embryo+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies.</a> Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).</li>
<li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+mode+and+effects+analysis+of+witnessing+protocols+for+ensuring+traceability+during+PGD%2FPGS+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles.</a> Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).</li>
<li>Gardner, D. K., Schoolcraft, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGardner%2C+DK+%22Towards+Reproductive+Certainty%3A+Infertility+and+Genetics+Beyond+1999%22">Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999</a>. Jansen, R., Mortimer, D. , Parthenon Press. 377-388 (1999).</li>
<li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inconclusive+chromosomal+assessment+after+blastocyst+biopsy%3A+prevalence%2C+causative+factors+and+outcomes+after+re-biopsy+and+re-vitrification.+A+multicenter+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience.</a> Human Reproduction. , (2018).</li>
<li>de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+to+blastocyst+biopsy+for+preimplantation+genetic+diagnosis+and+single+embryo+transfer+at+Sydney+IVF%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF.</a> Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).</li>
<li>Capalbo, A., Rienzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaicism+between+trophectoderm+and+inner+cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass.</a> Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).</li>
<li>McCoy, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+Selection+against+Complex+Mitotic-Origin+Aneuploidy+during+Preimplantation+Development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development.</a> PLoS Genetics. 11 (10), e1005601(2015).</li>
<li>Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage-stage+biopsy+significantly+impairs+human+embryonic+implantation+potential+while+blastocyst+biopsy+does+not%3A+a+randomized+and+paired+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial.</a> Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+births+after+transfer+of+rebiopsy+and+revitrification+of+blastocyst+that+had+%E2%80%9Cno+diagnosis%E2%80%9D+following+trophectoderm+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy.</a> Fertility and Sterility. 106 (3), e164(2016).</li>
<li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+efficacy+of+blastocoel+fluid+and+spent+media+as+sources+of+DNA+for+preimplantation+genetic+testing+in+standard+clinical+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions.</a> Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).</li>
<li>Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+mitochondrial+DNA+in+blastocoele+fluid+and+embryo+culture+medium%3A+evidence+and+potential+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use.</a> Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).</li>
<li>Vera-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+composition+of+cell-free+DNA+in+spent+medium+from+human+embryo+culture+during+preimplantation+development%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development.</a> Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tylko doświadczeni wykwalifikowani embriolodzy, którzy ukończyli okres szkolenia, powinni wykonywać zarówno biopsję TE, jak i witryfikację blastocyst. Ponadto wymagany jest świadek, który monitoruje procedury i gwarantuje skuteczne śledzenie podczas i) przemieszczania się blastocysty poddanej biopsji z naczynia biopsyjnego (rysunek uzupełniający 1) do naczynia po biopsji (rysunek uzupełniający 1), następnie do płytki witryfikacyjnej (rysunek uzupełniający 1) i wreszcie d...

Głównym celem współczesnej embriologii ludzkiej jest maksymalizacja liczby żywych urodzeń w jednym stymulowanym cyklu oraz zmniejszenie kosztów, czasu i wysiłku związanego z osiągnięciem ciąży. Aby osiągnąć ten cel, należy zastosować zwalidowane podejścia do selekcji zarodków w celu identyfikacji zarodków zdolnych do reprodukcji w kohorcie uzyskanej podczas cyklu IVF. Zgodnie z najnowszymi dowodami, hodowla blastocyst 1 w połączeniu z kompleksowymi badaniami chromosomowymi i euploidalnym transferem zarodków (ET) jest najskuteczniejszym sposobem na zwiększenie efektywności IVF2. Oczywiste jest, że badanie aneuploidalne wymaga próbki embrionalnej, która obecnie jest w większości reprezentowana z kilku komórek pobranych z trofektodermy (TE), tj. odcinka blastocysty, który daje początek aneksom zarodka (np. łożysku) podczas ciąży. Poza analizą kariotypu, również mutacje pojedynczych genów mogą być oceniane na podstawie biopsji TE w ramach strategii klinicznej znanej jako preimplantacyjne testy genetyczne (PGT; -A dla aneuploidii, -SR dla strukturalnych rearanżacji chromosomów, -M dla chorób monogenowych). Inne metody biopsji oocytów/zarodków zostały teoretyzowane i przyjęte klinicznie w ciągu ostatnich dziesięcioleci, a mianowicie biopsja ciał polarnych i biopsja blastomerów. Jednak ich stosowanie jest obecnie ograniczone, ponieważ ich wady proceduralne (np. większe obciążenie pracą i ryzyko wpływu na rozrodczość) oraz ograniczenia diagnostyczne (np. problemy z analizą pojedynczych komórek) pośrednio utrudniają wystarczającą równowagę między kosztami, ryzykiem i korzyściami (przegląd patrz3).
W tym artykule, jeden z głównych protokołów biopsji TE jest dokładnie opisany wraz z późniejszymi procedurami witryfikacji, ogrzewania i transferu. Opisany tutaj przepływ pracy jest idealny dla zatłoczonej jednostki PGT.
Jak już wcześniej opisała nasza grupa4,5, procedura polega na sekwencyjnym otwarciu osłonki przejrzystej w pełni rozwiniętych blastocyst i usunięciu kilku komórek TE (średnio 7-8). W porównaniu z metodą biopsji blastocysty wspomaganej laserowo w dniu 36, ta procedura może ułatwić codzienny harmonogram na oddziale IVF, gdzie delikatne procedury, takie jak biopsja blastocysty i witryfikacja, muszą być wykonywane na czas. Gdy tylko blastocysta osiągnie pełną ekspansję, biopsję można przeprowadzić, wybierając komórki TE do usunięcia, zapobiegając w ten sposób ryzyku przepukliny wewnętrznej masy komórkowej (ICM), co w przeciwnym razie utrudniłoby procedurę. W literaturze opisano również trzeci protokół biopsji blastocysty, który polega na laserowym wylęganiu się, gdy zarodek osiągnął już stadium blastocysty, na kilka godzin przed zabiegiem5,7. Podejście to jest jednak bardziej czasochłonne i odpowiada głównie jednostkom IVF, które wdrażają biopsję TE w rękach mało doświadczonych operatorów i ze względu na umiarkowanie niskie dzienne obciążenie pracą.
Docytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika (ICSI)8 powinno być skonsolidowaną techniką, jeśli ma na celu przeprowadzanie analiz genetycznych w IVF. Podobnie, odpowiedni system hodowli w celu bezpiecznego pobrania zarodków do stadium blastocysty ma kluczowe znaczenie dla wdrożenia strategii biopsji TE. Odpowiednia liczba inkubatorów, a także stosowanie niskiego ciśnienia tlenu są kluczowymi warunkami wstępnymi do osiągnięcia tego celu, aby nie zagrozić wskaźnikowi blastocyst9. Jednocześnie potrzebny jest skuteczny program krioprezerwacji, aby bezpiecznie zarządzać cyklem PGT. W ciągu ostatniej dekady wdrożenie witryfikacji zwiększyło wskaźniki krioprzeżywalności zarodków nawet do >99%10,11. Dało to wystarczająco dużo czasu na wykonanie badań genetycznych i odroczenie transferu zarodków do następnego cyklu miesiączkowego, na niestymulowanym i prawdopodobnie bardziej podatnym endometrium12.
Zarówno biopsja TE, jak i witryfikacja są wymagającymi zadaniami wymagającymi rygorystycznych umiejętności, a ich skuteczność może być różna u niedoświadczonych operatorów. W związku z tym zaleca się przeprowadzenie specjalnego okresu szkolenia przed umożliwieniem każdemu operatorowi klinicznego wykonania tych procedur; Ponadto utrzymanie umiejętności operatorów powinno być okresowo oceniane poprzez monitorowanie kluczowych wskaźników efektywności (KPI) dla procedur kriokonserwacji i biopsji. W tym celu każda klinika IVF powinna ustalić wewnętrzne KPI, które muszą być zbliżone do tych publikowanych przez międzynarodowe konsorcja i/lub wyników publikowanych przez laboratoria referencyjne.
TE biopsja, rozgrzewanie witryfikacji i procedury obserwowania są zatwierdzonymi technikami w naszej jednostce, które zostały ujednolicone dla wszystkich zaangażowanych operatorów, jak opisano w trzech poprzednich publikacjach11,13,14.

<table><tbody><tr><td><mocny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stojak na zimne rurki</td><td>Biocision</td><td>XTPCR96</td><td></td></tr><tr><td>Elektroniczny kontroler pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>710931</td><td></td></tr><tr><td>Flexipet Regulowany zestaw uchwytów</td><td>Cook</td><td>G18674</td><td>Uchwyt do ściągania izolacji</td></tr><tr><td>Gilson Pipetman</td><td>Gilson</td><td>66003</td><td>p20</td></tr><tr><td>IVF Elektroniczny system obserwacyjny</td><td>CooperChirurgiczna płodność i Genomic Solutions</td><td></td><td>RI Witness ART System zarządzania</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>Kaptur z przepływem laminarnym</td><td>IVF TECH</td><td></td><td>Przepływ powietrza klasy A</td></tr><tr><td>Obiektyw laserowy</td><td>RI</td><td>Saturn 5</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacze</td><td>Nikon Narishige</td><td>NT-88-V3</td><td></td></tr><tr><td>Mini wirówka do probówek PCR</td><td>Eppendorf</td><td>CSLQSPIN</td><td>do probówek do PCR 0,2 mLl</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>Leica M80</td><td></td></tr><tr><td>Termostat</td><td>Panasonic</td><td>MCO-5AC-PE</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator trójgazowy</td><td>Panasonic</td><td>MCO-5M-PE</td><td>02/CO2</td></tr><tr><td><mocny>Materiały eksploatacyjne</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta do biopsji</td><td>RI</td><td>7-71-30FB35720</td><td>30 &micro; m ID, płaskie 35 & deg; C</td></tr><tr><td>Cryolock</td><td>Cryolock</td><td>CL-R-CT</td><td></td></tr><tr><td>CSCM complete</td><td>Irvine Scientific</td><td>90165</td><td>Pożywka do hodowli in vitro uzupełniona</td></tr><tr><td>cewnikiem do transferu zarodków</td> HSA <td>Cook</td><td>G17934</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta flexipet</td><td>Cook</td><td>G26712</td><td>140&micro; m końcówka do pipety do zdejmowania izolacji</td></tr><tr><td>Pipeta Flexipet</td><td>Cook</td><td>G46020</td><td>300&micro; m Zdejmowanie izolacji z końcówek do pipet</td></tr><tr><td>Pipeta podtrzymująca</td><td>RI</td><td>7-71-IH35/20</td><td>30 &micro; m ID, płaskie 35 & deg; C</td></tr><tr><td>Albumina surowicy ludzkiej</td><td>Irvine Scientific</td><td>9988</td><td></td></tr><tr><td>IVF Naczynie z jednej studni</td><td>Falcon</td><td>353653</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny do hodowli zarodków</td><td>Irvine Scientific</td><td>9305</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże</td><td>HTF Irvine Scientific</td><td>90126</td><td>Pożywka buforowana Hepes</td></tr><tr><td>Nuclon Delta Surface</td><td>Thermofisher scientific</td><td>176740</td><td>Naczynie IVF 4- Płytka studzienkowa z przesuwaną</td></tr><tr><td>pokrywką Primaria Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>353802</td><td>60 mm x15 mm</td></tr><tr><td>Reproplate</td><td>Kitazato</td><td>83016</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td>10ml</td></tr><tr><td>Sterylne jednorazowe końcówki Gilsona</td><td>Eppendorf</td><td>0030 075.021</td><td>200 &micro; L</td></tr><tr><td>Zestaw rurek</td><td>Dostarczony przez laboratorium</td><td></td> genetyczne <td>Probówki do PCR (0,2 ml), roztwór ładujący, roztwór do płukania biopsji</td></tr><tr><td>Pożywka do witryfikacji</td><td>Kitazato</td><td>VT801</td><td>Roztwory równoważące i witryfikacyjne</td></tr><tr><td>Media ocieplające</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>Roztwory do rozmrażania i rozcieńczania</td></tr></tbody></table>

biopsja ludzkiej blastocysty i witryfikacja

Human Blastocyst Biopsy and Vitrification

Biopsja blastocysty jest wykonywana w celu uzyskania wiarygodnej diagnozy genetycznej podczas cykli IVF z preimplantacyjnymi testami genetycznymi. Następnie, idealny przebieg pracy pociąga za sobą bezpieczny i wydajny protokół witryfikacji, ze względu na czas realizacji technik diagnostycznych i transfer wybranego zarodka (zarodków) na fizjologicznym endometrium w następnym naturalnym cyklu. Biopsja obejmująca sekwencyjne otwieranie osłonki przejrzystej i pobieranie 5-10 komórek trofektodermy (najlepiej 7-8) ogranicza zarówno liczbę wymaganych manipulacji, jak i narażenie zarodka na nieoptymalne warunki środowiskowe. Po odpowiednim przeszkoleniu technika była powtarzalna u różnych operatorów pod względem czasu biopsji (~8 min, w zakresie 3-22 min w zależności od liczby zarodków do biopsji na talerz), uzyskanych rozstrzygających diagnoz (~97,5%) i odsetka żywych urodzeń po transferze blastocysty euploidalnej (>40%). Wskaźnik przeżycia po biopsji, witryfikacji i ociepleniu wynosił aż 99,8%. Szybkość reekspansji po 1,5 godziny od ocieplenia wynosiła aż 97%, w dużej mierze zależała od czasu między biopsją a witryfikacją (najlepiej ≤30 min), jakości morfologicznej blastocysty i dnia biopsji. Ogólnie rzecz biorąc, lepiej jest zeszkleić zapadniętą blastocystę; w związku z tym, w cyklach innych niż PGT, można wykonać sztuczny skurcz wspomagany laserem w celu wywołania zapadnięcia się zarodka przed krioprezerwacją. Najbardziej obiecującą perspektywą na przyszłość jest nieinwazyjna analiza pożywki hodowlanej IVF po posiewie blastocyst jako przypuszczalnego źródła embrionalnego DNA. Jednak ta potencjalna awangarda jest nadal badana, a niezawodny protokół musi jeszcze zostać zdefiniowany i zweryfikowany.

Rysunek 6 przedstawia schemat wszystkich wyników procedury biopsji, który może zostać zastosowany w celu standaryzacji protokołu i monitorowania pracy każdego operatora. Głównym wynikiem proceduralnym jest czas wykonania biopsji/biopsji; głównym wynikiem technicznym jest jakość wykresu uzyskanego po badaniu genetycznym, który może prowadzić do diagnozy rozstrzygającej lub nierozstrzygającej, z których ta druga wymaga ponownej biopsji niezdiagnozowanej blastoc...

Biopsja blastocysty i witryfikacja są niezbędne do skutecznego przeprowadzenia preimplantacyjnych badań genetycznych. Podejście polegające na sekwencyjnym otwieraniu osłonki przejrzystej i pobieraniu 7-8 komórek trofektodermy w 5-7 dniu po inseminacji ogranicza zarówno liczbę wymaganych manipulacji, jak i narażenie zarodka na nieoptymalne warunki środowiskowe.

Biopsja ludzkiej blastocysty i witryfikacja

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow ...

Zarówno biopsja blastocysty, jak i witryfikacja były rewolucją w in vitro, zapłodnieniu in vitro, umożliwiając embriologom z całego świata wykonywanie preimplantacyjnych badań genetycznych na ludzkich zarodkach przy minimalnym ryzyku dla zarodka. Biopsja trofektodermy pozwoliła na pobranie około siedmiu komórek z w pełni rozwiniętego zarodka, umożliwiając w ten sposób solidną analizę genetyczną na dalszych etapach. Ponadto do tej pory nie wykazano żadnego wpływu tego podejścia.Skuteczność kliniczna tego przepływu pracy pozwala pacjentom ze stanami monogenowymi i wszystkim pacjentom ze zwiększonym ryzykiem nieprawidłowości chromosomalnych w obrębie blastocysty na skorzystanie z preimplantacyjnych badań genetycznych. Wciąż istnieje możliwość udoskonalenia obecnych strategii selekcji zarodków. Na przykład profilowanie miRNomiczne i proteomiczne stanowią intrygujące opcje uzupełniające preimplantacyjne badania genetyczne na pojedynczej biopsji trofektodermy.Niedoświadczeni operatorzy często mają problemy z otwieraniem i penetracją osłony przejrzystej. To tylko kwestia skupienia. Blastocysta, obiektyw laserowy i pipety powinny znajdować się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej.Po oznaczeniu naczynia biopsyjnego szczegółowymi danymi pacjenta, za pomocą stałego, nietoksycznego markera, ponumeruj każdą 10-mikrolitrową kroplę pożywki buforowanej przez HEPES z zarodkiem i identyfikatorem cyklu. Za pomocą pipety do usuwania izolacji o długości 300 mikrometrów przenieś żywotną, w pełni rozwiniętą blastocystę do pierwszej kropli naczynia biopsyjnego i przepłucz kroplę w celu usunięcia nadmiaru pożywki hodowlanej, przed przeniesieniem blastocysty do drugiej kropli w naczyniu. Umieścić naczynie pod mikroskopem odwróconym i zalać pipetę biopsyjną pożywką z trzeciej kropli naczynia biopsyjnego. Pod 20-krotnym powiększeniem ustaw blastocystę tak, aby uzyskać wyraźny widok wewnętrznej masy komórki na godzinie siódmej i zabezpiecz zarodek na pipecie trzymającej.Skoncentruj się na osłonce przejrzystej, tak aby zarówno pipety, jak i blastocysta znajdowały się na tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Przełącz się na obiektyw laserowy i umieść wskaźnik laserowy na osłonie przezroczystej po przeciwnej stronie wewnętrznej masy komórkowej. Wywierć osłonkę przejrzystą dwoma lub trzema impulsami laserowymi i delikatnie dociśnij pipetę do biopsji do osłony przejrzystej, aby umożliwić wdmuchnięcie medium przez szczelinę w celu oderwania komórek trofektodermy od wewnętrznej powierzchni.Po odłączeniu trofektodermy wejdź przez otwór i odessaj od siedmiu do ośmiu komórek trofektodermy do pipety do biopsji, delikatnie odsysając. Stosując umiarkowane ssanie w celu rozciągnięcia komórek docelowych, lekko przesuń pipetę do biopsji do tyłu i skieruj laser w stronę najcieńszej części zasysanych komórek. Wystrzel od dwóch do pięciu impulsów laserowych na połączenia między komórkami, aby oddzielić komórki docelowe od ciała zarodka.Gdy fragment trofektodermy zostanie oddzielony od blastocysty, uwolnij fragment do tej samej kropli biopsyjnej z dala od blastocysty, aby zapobiec zassaniu fragmentu z powrotem do pipety do biopsji. Uwolnij blastocystę z pipety przytrzymującej i natychmiast podnieś obie pipety, aby zapobiec przywieraniu fragmentu do pipet. Następnie zobrazuj fragment poddany biopsji w celu kontroli jakości.Gdy wszystkie blastocysty zostaną poddane biopsji, jak właśnie pokazano, przenieś naczynie biopsyjne z powrotem do okapu z przepływem laminarnym i oznacz naczynie do hodowli po biopsji identyfikatorem pary, a każdą kroplę identyfikatorami zarodka i cyklu. W obecności świadka przepłucz blastocystę w czystym pożywce IVF i przenieś blastocystę do odpowiedniej kropli w naczyniu po biopsji. Następnie umieść naczynie po biopsji w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 6% dwutlenku węgla i 5% tlenu.W obecności świadka i w okapie z przepływem laminarnym w temperaturze pokojowej oznacz probówki do PCR trwałym, nietoksycznym markerem. Oznacz pokrywkę naczynia do hodowli w rurkach o wymiarach 60 x 15 milimetrów identyfikatorami zarodków poddanych biopsji i dodaj do naczynia dwie 10-mikrolitrowe krople roztworu do płukania biopsji. Zalać 140-mikrometrową pipetę do usuwania izolacji roztworem do płukania biopsji z drugiej kropli naczynia z rurką pod mikroskopem stereoskopowym, aby uwidocznić fragmenty trofektodermy.Delikatnie wypuść trochę roztworu do płukania biopsji na fragment trofektodermy i załaduj fragment do pipety do zdejmowania izolacji. Przenieś fragment do drugiej kropli roztworu do płukania biopsji i ostrożnie spłucz tkankę dwa do trzech razy. Przenieść fragment trofektodermy na dno odpowiednio oznakowanej probówki do PCR z roztworem ładującym, uważając, aby nie dotknąć ścianek probówki końcówką pipety do strippingu.Kiedy wszystkie fragmenty zostaną dodane do ich probówek, wiruj wszystkie probówki w mini wirówce przez kilka sekund, aby osadzać fragmenty. Następnie przechowuj próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, dopóki nie zostaną wysłane do odpowiedniego laboratorium genetycznego w celu przeprowadzenia testów. W ciągu 30 minut od biopsji trofektodermy oznacz płytkę witryfikacyjną danymi pacjenta i identyfikatorami blastocyst, które muszą zostać zeszklone.Za pomocą specjalnych krioetykiet odpornych na zimno oznacz podłoża witryfikacyjne imieniem i nazwiskiem pacjenta, identyfikatorem pary, identyfikatorem zarodka, który zostanie do niego załadowany, oraz datą zabiegu. W temperaturze pokojowej dozować 300 mikrolitrów roztworu równoważącego na każdą blastocystę, która zostanie zeszklona i, w obecności świadka, użyć pipety do strippingu o długości 300 mikrometrów, aby przenieść blastocystę do jednej objętości roztworu równoważącego. Pozostaw blastocystę w roztworze równoważącym na 13 do 15 minut.Po początkowym zmniejszeniu objętości obserwuje się stopniową ponowną ekspansję. Pod koniec równoważenia dodać 300 mikrolitrów roztworu witryfikacyjnego do drugiego dołka płytki witryfikacyjnej i przenieść całkowicie ponownie rozprężoną blastocystę do roztworu witryfikacyjnego na jedną minutę. Pod koniec inkubacji przepłukać blastocystę w celu rozcieńczenia roztworu równoważącego i, w obecności świadka, obciążyć blastocystę na podłożu witryfikacyjnym.Usunąć nadmiar roztworu witryfikacyjnego. Delikatna warstwa roztworu powinna otaczać blastocystę. Zanurz podporę witryfikacyjną w ciekłym azocie i energicznie przesuń podporę, aby zmniejszyć ryzyko tworzenia się pęcherzyków w pobliżu próbki.Następnie umieść nasadkę ochronną na podporze, gdy nośnik do witryfikacji jest nadal zanurzony w ciekłym azocie. Spośród 1 544 procedur biopsji trofektodermy przeprowadzonych w tym reprezentatywnym okresie dwóch lat, od jednej do czterech blastocyst było biopsowanych na procedurę przez okres od trzech do 22 minut na procedurę. Na tych wykresach pokazany jest średni czas biopsji dla każdego operatora w trymestrze badania, ze średnią ogólną wartością 8,24 minuty.Pomocne jest uzyskanie obrazu każdego fragmentu poddanego biopsji w celu kontroli jakości, aby ocenić, czy przyczyną niejednoznacznych diagnoz był wymiar i/lub jakość fragmentu, rurki lub niektóre problemy z przetwarzaniem próbki w laboratorium genetycznym. W tym badaniu 572 blastocysty euploidalne zostały ogrzane w celu poddania się transferowi zarodka po zdiagnozowaniu euploidii. Wszystkie blastocysty uległy zeszkleniu w ciągu 30 minut, przy czym 2,4% blastocyst nie rozszerzyło się ponownie między 31 a 90 minutami, a 4,9% nie rozszerzyło się ponownie po 90 minutach od ponownego rozgrzania.Szczególnie w przypadku blastocyst o niskiej jakości i/lub siódmej dnia, czas między biopsją a witryfikacją wydaje się kluczowy dla osiągnięcia ponownej ekspansji po ociepleniu. Należy zwrócić uwagę, aby skupić się przed otwarciem osłonki przejrzystej podczas odsłaniania połączenia między komórką trofektodermy a wypalaniem, a także należy uważać, aby zapobiec ponownemu rozszerzaniu się blastocysty przed witryfikacją. Istnieją dwa inne podejścia do biopsji blastocysty, oba polegające na otwarciu osłonki przejrzystej i oczekiwaniu na spontaniczne wygięcie komórek trofektodermy.Podejścia te są łatwiejsze, ale wymagają więcej manipulacji i są bardziej czasochłonne. Skuteczność tego przepływu pracy pozwala na wdrożenie technologii molekularnych w zapłodnieniu in vitro w celu próby wybrania blastocysty z największą szansą na zagnieżdżenie się przed transferem zarodka. Pamiętaj, aby nie używać żadnych urządzeń ani roztworów, które mogą być toksyczne dla zarodków i aby zapobiec zanieczyszczeniu DNA poprzez stosowanie materiałów wolnych od DNA.

human-blastocyst-biopsy-and-vitrification

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

MicroSecure Vitrification został opracowany jako niekomercyjny, aseptyczny system zamkniętych urządzeń do witryfikacji, który jest zgodny z dobrymi praktykami FDA w zakresie produkcji i obchodzenia się z tkankami. Ze względu na wycofanie z przemysłu hydrofobowych słomek zarodkowych, procedura witryfikacji została zmodyfikowana tak, aby obejmowała wewnętrzną uszczelkę przed standardową wewnętrzną zatyczką bawełnianą.

Zmodyfikowana witryfikacja MicroSecure: bezpieczna, prosta i wysoce skuteczna procedura kriokonserwacji ludzkich blastocyst

Techniki wspomaganego rozrodu (ARTs) są w ciągłym emulucie ocenianym w celu poprawy wyników i zmniejszenia związanego z tym ryzyka. Manuskrypt ten opisuje minimalnie inwazyjną procedurę transferu zarodków z skutecznym protokołem kriokonserwacji, który pozwala na wykorzystanie królików jako idealnego zwierzęcego modelu rozrodu człowieka.

Małoinwazyjny transfer zarodków i witryfikacja zarodków w optymalnym stadium zarodka w modelu królika

Tutaj prezentujemy poklatkowy protokół morfometryczny, aby śledzić intensywność kurczenia się i ponownego rozszerzania blastocyst podczas interwencji prewitryfikacyjnych i regeneracji po ociepleniu. Zastosowanie protokołu jest możliwe w laboratoriach zapłodnienia pozaustrojowego wyposażonych w mikroskopy poklatkowe i jest zalecane w opracowaniu optymalnej metody witryfikacji blastocyst.

Protokół morfometryczny do obiektywnej oceny zachowania blastocyst podczas etapów witryfikacji i ocieplania

Tutaj opisujemy metodę ogrzewania zeszklonych ludzkich blastocyst, hodowli ich przez okres implantacji in vitro, trawienia ich do pojedynczych komórek i zbierania wczesnych komórek trofoblastu do dalszych badań.

Jednokomórkowy zbiór komórek trofoblastu w zarodkach ludzkich w okresie okołoimplantacyjnym

Niniejsze badanie przedstawia protokół badań przesiewowych chromosomów ludzkich embrionów, który wykorzystuje zużytą pożywkę hodowlaną, co pozwala uniknąć biopsji zarodka i umożliwia identyfikację ploidalności chromosomów za pomocą NGS. W niniejszym artykule przedstawiono szczegółową procedurę, w tym przygotowanie pożywki hodowlanej, amplifikację całego genomu (WGA), przygotowanie biblioteki sekwencjonowania nowej generacji (NGS) oraz analizę danych.

Badania przesiewowe chromosomów ludzkich zarodków przedimplantacyjnych przy użyciu zużytej pożywki hodowlanej: pobieranie próbek i analiza ploidalności chromosomów

Gdy transformujący czynnik wzrostu ß białka prekursorowe rodziny są ektopowo wyrażane w zarodkach Xenopus laevis, ulegają one dimeryzacji, rozszczepianiu i są wydzielane do blastocoele, który zaczyna się w późnym stadium blastuli do wczesnego stadium gastruli. Opisano metodę zasysania produktów rozszczepienia z jamy blastocoele do analizy immunoblot.

Analiza produktów rozpadu rodziny transformujących czynników wzrostu wydzielanych do blastocoele zarodków Xenopus laevis

W tym miejscu przedstawiamy protokół Spatula Montevideo do witryfikacji zarodków przedimplantacyjnych myszy i owiec, składający się z domowej szpatułki i wykorzystujący domowe roztwory. Zarodki są szybko równoważone w dwóch roztworach krioprotekcyjnych o rosnącym stężeniu, ładowane na szpatułkę, zanurzane w ciekłym azocie, a na koniec zamykane słomką o pojemności 0,5 ml.

Szpatułka Montevideo Urządzenie do witryfikacji zarodków ssaków

Głównymi typami komórek przylegających pochodzących z ludzkich mięśni są komórki miogenne i fibroblasty. W tym przypadku populacje komórek są wzbogacane za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie na podstawie antygenu CD56. Późniejsze znakowanie immunologiczne za pomocą specyficznych przeciwciał i zastosowanie technik analizy obrazu pozwala na ilościowe określenie cech cytoplazmatycznych i jądrowych w poszczególnych komórkach.

Izolacja i ilościowa charakterystyka immunocytochemiczna pierwotnych komórek miogennych i fibroblastów z ludzkich mięśni szkieletowych

Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Oto protokół do hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) i nerwowych komórek macierzystych (NSC) w zamkniętym systemie hodowli komórek, który pozwala na maksymalną sterylność i odtwarzalność, zastępując tradycyjną komorę bezpieczeństwa biologicznego i inkubator. To urządzenie spełnia wytyczne dobrej klinicznej praktyki produkcyjnej (cGMP) i dobrej praktyki klinicznej (cGLP).

Hodowla ludzkich pluripotencjalnych i nerwowych komórek macierzystych w zamkniętym systemie hodowli komórek do badań podstawowych i przedklinicznych

Naucz się biopsji blastocysty i witryfikacji w procedurach IVF. Ta metoda umożliwia pobranie komórek trofektodermy do testów genetycznych przy minimalnym ryzyku dla embrionu.

Biopsja ludzkiej blastocysty i witryfikacja

Przeglądaj więcej filmów