Biopsja ludzkiej blastocysty i witryfikacja

Zarówno biopsja blastocysty, jak i witryfikacja były rewolucją w in vitro, zapłodnieniu in vitro, umożliwiając embriologom z całego świata wykonywanie preimplantacyjnych badań genetycznych na ludzkich zarodkach przy minimalnym ryzyku dla zarodka. Biopsja trofektodermy pozwoliła na pobranie około siedmiu komórek z w pełni rozwiniętego zarodka, umożliwiając w ten sposób solidną analizę genetyczną na dalszych etapach. Ponadto do tej pory nie wykazano żadnego wpływu tego podejścia.

Skuteczność kliniczna tego przepływu pracy pozwala pacjentom ze stanami monogenowymi i wszystkim pacjentom ze zwiększonym ryzykiem nieprawidłowości chromosomalnych w obrębie blastocysty na skorzystanie z preimplantacyjnych badań genetycznych. Wciąż istnieje możliwość udoskonalenia obecnych strategii selekcji zarodków. Na przykład profilowanie miRNomiczne i proteomiczne stanowią intrygujące opcje uzupełniające preimplantacyjne badania genetyczne na pojedynczej biopsji trofektodermy.

Niedoświadczeni operatorzy często mają problemy z otwieraniem i penetracją osłony przejrzystej. To tylko kwestia skupienia. Blastocysta, obiektyw laserowy i pipety powinny znajdować się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej.

Po oznaczeniu naczynia biopsyjnego szczegółowymi danymi pacjenta, za pomocą stałego, nietoksycznego markera, ponumeruj każdą 10-mikrolitrową kroplę pożywki buforowanej przez HEPES z zarodkiem i identyfikatorem cyklu. Za pomocą pipety do usuwania izolacji o długości 300 mikrometrów przenieś żywotną, w pełni rozwiniętą blastocystę do pierwszej kropli naczynia biopsyjnego i przepłucz kroplę w celu usunięcia nadmiaru pożywki hodowlanej, przed przeniesieniem blastocysty do drugiej kropli w naczyniu. Umieścić naczynie pod mikroskopem odwróconym i zalać pipetę biopsyjną pożywką z trzeciej kropli naczynia biopsyjnego. Pod 20-krotnym powiększeniem ustaw blastocystę tak, aby uzyskać wyraźny widok wewnętrznej masy komórki na godzinie siódmej i zabezpiecz zarodek na pipecie trzymającej.

Skoncentruj się na osłonce przejrzystej, tak aby zarówno pipety, jak i blastocysta znajdowały się na tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Przełącz się na obiektyw laserowy i umieść wskaźnik laserowy na osłonie przezroczystej po przeciwnej stronie wewnętrznej masy komórkowej. Wywierć osłonkę przejrzystą dwoma lub trzema impulsami laserowymi i delikatnie dociśnij pipetę do biopsji do osłony przejrzystej, aby umożliwić wdmuchnięcie medium przez szczelinę w celu oderwania komórek trofektodermy od wewnętrznej powierzchni.

Po odłączeniu trofektodermy wejdź przez otwór i odessaj od siedmiu do ośmiu komórek trofektodermy do pipety do biopsji, delikatnie odsysając. Stosując umiarkowane ssanie w celu rozciągnięcia komórek docelowych, lekko przesuń pipetę do biopsji do tyłu i skieruj laser w stronę najcieńszej części zasysanych komórek. Wystrzel od dwóch do pięciu impulsów laserowych na połączenia między komórkami, aby oddzielić komórki docelowe od ciała zarodka.

Gdy fragment trofektodermy zostanie oddzielony od blastocysty, uwolnij fragment do tej samej kropli biopsyjnej z dala od blastocysty, aby zapobiec zassaniu fragmentu z powrotem do pipety do biopsji. Uwolnij blastocystę z pipety przytrzymującej i natychmiast podnieś obie pipety, aby zapobiec przywieraniu fragmentu do pipet. Następnie zobrazuj fragment poddany biopsji w celu kontroli jakości.

Gdy wszystkie blastocysty zostaną poddane biopsji, jak właśnie pokazano, przenieś naczynie biopsyjne z powrotem do okapu z przepływem laminarnym i oznacz naczynie do hodowli po biopsji identyfikatorem pary, a każdą kroplę identyfikatorami zarodka i cyklu. W obecności świadka przepłucz blastocystę w czystym pożywce IVF i przenieś blastocystę do odpowiedniej kropli w naczyniu po biopsji. Następnie umieść naczynie po biopsji w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 6% dwutlenku węgla i 5% tlenu.

W obecności świadka i w okapie z przepływem laminarnym w temperaturze pokojowej oznacz probówki do PCR trwałym, nietoksycznym markerem. Oznacz pokrywkę naczynia do hodowli w rurkach o wymiarach 60 x 15 milimetrów identyfikatorami zarodków poddanych biopsji i dodaj do naczynia dwie 10-mikrolitrowe krople roztworu do płukania biopsji. Zalać 140-mikrometrową pipetę do usuwania izolacji roztworem do płukania biopsji z drugiej kropli naczynia z rurką pod mikroskopem stereoskopowym, aby uwidocznić fragmenty trofektodermy.

Delikatnie wypuść trochę roztworu do płukania biopsji na fragment trofektodermy i załaduj fragment do pipety do zdejmowania izolacji. Przenieś fragment do drugiej kropli roztworu do płukania biopsji i ostrożnie spłucz tkankę dwa do trzech razy. Przenieść fragment trofektodermy na dno odpowiednio oznakowanej probówki do PCR z roztworem ładującym, uważając, aby nie dotknąć ścianek probówki końcówką pipety do strippingu.

Kiedy wszystkie fragmenty zostaną dodane do ich probówek, wiruj wszystkie probówki w mini wirówce przez kilka sekund, aby osadzać fragmenty. Następnie przechowuj próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, dopóki nie zostaną wysłane do odpowiedniego laboratorium genetycznego w celu przeprowadzenia testów. W ciągu 30 minut od biopsji trofektodermy oznacz płytkę witryfikacyjną danymi pacjenta i identyfikatorami blastocyst, które muszą zostać zeszklone.

Za pomocą specjalnych krioetykiet odpornych na zimno oznacz podłoża witryfikacyjne imieniem i nazwiskiem pacjenta, identyfikatorem pary, identyfikatorem zarodka, który zostanie do niego załadowany, oraz datą zabiegu. W temperaturze pokojowej dozować 300 mikrolitrów roztworu równoważącego na każdą blastocystę, która zostanie zeszklona i, w obecności świadka, użyć pipety do strippingu o długości 300 mikrometrów, aby przenieść blastocystę do jednej objętości roztworu równoważącego. Pozostaw blastocystę w roztworze równoważącym na 13 do 15 minut.

Po początkowym zmniejszeniu objętości obserwuje się stopniową ponowną ekspansję. Pod koniec równoważenia dodać 300 mikrolitrów roztworu witryfikacyjnego do drugiego dołka płytki witryfikacyjnej i przenieść całkowicie ponownie rozprężoną blastocystę do roztworu witryfikacyjnego na jedną minutę. Pod koniec inkubacji przepłukać blastocystę w celu rozcieńczenia roztworu równoważącego i, w obecności świadka, obciążyć blastocystę na podłożu witryfikacyjnym

Usunąć nadmiar roztworu witryfikacyjnego. Delikatna warstwa roztworu powinna otaczać blastocystę. Zanurz podporę witryfikacyjną w ciekłym azocie i energicznie przesuń podporę, aby zmniejszyć ryzyko tworzenia się pęcherzyków w pobliżu próbki.

Następnie umieść nasadkę ochronną na podporze, gdy nośnik do witryfikacji jest nadal zanurzony w ciekłym azocie. Spośród 1 544 procedur biopsji trofektodermy przeprowadzonych w tym reprezentatywnym okresie dwóch lat, od jednej do czterech blastocyst było biopsowanych na procedurę przez okres od trzech do 22 minut na procedurę. Na tych wykresach pokazany jest średni czas biopsji dla każdego operatora w trymestrze badania, ze średnią ogólną wartością 8,24 minuty.

Pomocne jest uzyskanie obrazu każdego fragmentu poddanego biopsji w celu kontroli jakości, aby ocenić, czy przyczyną niejednoznacznych diagnoz był wymiar i/lub jakość fragmentu, rurki lub niektóre problemy z przetwarzaniem próbki w laboratorium genetycznym. W tym badaniu 572 blastocysty euploidalne zostały ogrzane w celu poddania się transferowi zarodka po zdiagnozowaniu euploidii. Wszystkie blastocysty uległy zeszkleniu w ciągu 30 minut, przy czym 2,4% blastocyst nie rozszerzyło się ponownie między 31 a 90 minutami, a 4,9% nie rozszerzyło się ponownie po 90 minutach od ponownego rozgrzania.

Szczególnie w przypadku blastocyst o niskiej jakości i/lub siódmej dnia, czas między biopsją a witryfikacją wydaje się kluczowy dla osiągnięcia ponownej ekspansji po ociepleniu. Należy zwrócić uwagę, aby skupić się przed otwarciem osłonki przejrzystej podczas odsłaniania połączenia między komórką trofektodermy a wypalaniem, a także należy uważać, aby zapobiec ponownemu rozszerzaniu się blastocysty przed witryfikacją. Istnieją dwa inne podejścia do biopsji blastocysty, oba polegające na otwarciu osłonki przejrzystej i oczekiwaniu na spontaniczne wygięcie komórek trofektodermy.

Podejścia te są łatwiejsze, ale wymagają więcej manipulacji i są bardziej czasochłonne. Skuteczność tego przepływu pracy pozwala na wdrożenie technologii molekularnych w zapłodnieniu in vitro w celu próby wybrania blastocysty z największą szansą na zagnieżdżenie się przed transferem zarodka. Pamiętaj, aby nie używać żadnych urządzeń ani roztworów, które mogą być toksyczne dla zarodków i aby zapobiec zanieczyszczeniu DNA poprzez stosowanie materiałów wolnych od DNA.