Name: Test reporterowy lucyferazy oparty na RNA w transkrypcji in vitro w celu zbadania regulacji translacji w komórkach zakażonych pokswirusem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj metodę testu reporterowego lucyferazy opartego na RNA w transkrypcji in vitro do badania regulacji translacji w komórkach zakażonych wirusem ospy. Technika umożliwia analizę elementów cis w mRNA, w tym regionów 5'UTR i 3'UTR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt został sfinansowany przez National Institutes of Health (AI128406 www.nih.gov) dla ZY i częściowo przez Johnson Cancer Research Center (http://cancer.k-state.edu) w formie Graduate Student Summer Stypendend dla PD.

1. Przygotowanie matrycy DNA metodą PCR do transkrypcji in vitro
<ol>
	<li>Aby przygotować matrycę DNA metodą PCR, zaprojektuj startery. Podczas projektowania podkładów należy wziąć pod uwagę kluczowe cechy, takie jak długość podkładu, temperatura wyżarzania (Tm), zawartość GC, koniec 3' z G lub C itp. 
	nuta: Szczegółowo omówione w tej literaturze25,26,27.</li>
	<li>Zaprojektuj startery do generowania amplikonu PCR zawierającego następujące pierwiastki w kierunku od 5' do 3': promotor T7, lider poli(A), lucyferazy świetlika ORF i ogon poli(A) określany dalej jako T7_12A-Fluc. Zaprojektuj startery (do przodu i do tyłu), aby objąć wszystkie dodatkowe elementy, których nie ma w matrycy DNA (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). 
	nuta: Kolejność wszystkich elementów znajduje się w tabeli 1.</li>
	<li>Uwzględnij kilka dodatkowych nukleotydów w starterze do przodu (5'-3')28, a następnie promotor T7, lider poli(A) lub pożądana sekwencja 5'-UTR i około 20 nukleotydów, dostosuj napodstawie TM, odpowiadający końcowi 5' ORF genu reporterowego. Upewnij się, że odpowiedni region we starterze jest identyczny z nicią sensacyjną (+ nicią) genu. 
	nuta: W przypadku długich 5'-UTR zsyntetyzuj dwa fragmenty DNA: jeden z promotorem T7, a następnie długi 5'-UTR, a drugi z ORF genu reporterowego. Połącz te dwa fragmenty za pomocą nakładającego się rozszerzenia PCR29.</li>
	<li>Zaprojektuj odwrócony starter (5'-3') tak, aby zawierał ogon poli(A) i około 20 nukleotydów, dostosuj na podstawie TM, odpowiadającego końcowi 3' ORF genu reporterowego. Upewnij się, że odpowiedni region w starterze jest identyczny z nicią antysensowną (-nicią) genu, a kodon stop w ramce jest obecny przed ogonem poli(A). 
	nuta: Żądaną długość liter A w linii odniesienia z poli(A) lub ogonie z poli(A) można dostosować w podkładach. Na przykład, aby dodać 50 A w ogonie poli(A), odwrócony starter powinien pociągać za sobą 50 T. Podobnie, aby dodać 20 A do lidera poli(A), elementarz do przodu powinien pociągać za sobą 20 A.</li>
	<li>Do kontroli wewnętrznej zaprojektuj inny zestaw starterów zawierający następujące pierwiastki w kierunku od 5' do 3': Promotor T7, losowa sekwencja kodująca 5'-UTR zawierająca sekwencję Kozaka, lucyferazy Renilla ORF i ogon poli(A) określany dalej jako T7_Kozak-Rluc.</li>
	<li>W probówce do PCR dodaj odczynniki w następującej kolejności: woda wolna od DNazy, 2x polimeraza DNA o wysokiej wierności, startery i potwierdzona sekwencja matrycy DNA lucyferazy (Tabela 2). 
	nuta: Ilości poszczególnych składników w mieszaninie należy dostosować do objętości reakcji.</li>
	<li>Użyj standardowego 3-etapowego cyklu PCR (denaturacja, wyżarzanie, przedłużenie), aby wygenerować matrycę DNA, jak pokazano w tabeli 3. 
	nuta: Temperatura wyżarzania X °C zależy od użytego zestawu starterów, a czas wydłużenia T min zależy od wielkości amplikonu PCR i użytej polimerazy DNA.</li>
	<li>Wykryj produkt PCR, przeprowadzając 5-10% reakcji PCR w elektroforezie żelowej 1% agarozy Tris-acetate-EDTA (TAE) (zawierającej 0,1 μg / ml bromku etydyny) wraz z dostępnym na rynku wzorcem masy cząsteczkowej. Wizualizuj żel pod oświetlaczem UV, aby określić rozmiar produktu PCR.</li>
	<li>Po określeniu prawidłowego rozmiaru produktu PCR, ~1,7 kb dla T7_12A-Fluc i ~1,0 kb dla T7_Kozak-Rluc, należy go oczyścić za pomocą dostępnego na rynku zestawu do oczyszczania PCR. Eluuj DNA za pomocą 100 μl wody wolnej od nukleaz (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).</li>
	<li>Po oczyszczeniu sprawdź stężenie DNA za pomocą spektrofotometru i określ stosunek A260/A280 (dopuszczalne jest ~1,8-2,0).</li>
	<li>Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C lub natychmiast użyć do transkrypcji in vitro.</li>
</ol>
2. Generowanie mRNA przez transkrypcję in vitro
<ol>
	<li>Zsyntetyzuj RNA z produktu PCR in vitro, używając zestawu do transkrypcji in vitro (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A). 
	UWAGA: Matryce DNA T7_12A-Fluc i T7_Kozak-Rluc służą odpowiednio do syntezy mRNA 12A-Fluc i Kozak-Rluc.
	<ol>
		<li>Aby to zrobić, weź probówkę do mikrowirówki i dodaj odczynniki w następującej kolejności: woda wolna od DNazy-RNazy, mieszanina buforowa NTP, analog czapki, produkt matrycowy PCR, mieszanina polimerazy T7-RNA (tabela 4). 
		nuta: Inne systemy cappingu mogą być również używane do sekwencyjnego cappingu RNA po transkrypcji in vitro zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
		<li>Przystąp do oczyszczania zsyntetyzowanego RNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom oczyszczony RNA w 1,5% agarozowym żelu Tris-boran-EDTA (TBE) (zawierającym 0,5 μg/ml bromku etydyny), aby sprawdzić RNA. Wizualizuj żel pod oświetlaczem UV (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
	<li>Sprawdź stężenie RNA za pomocą spektrofotometru i określ stosunek A260/A280 (dopuszczalne jest ~1,8-2,0).</li>
	<li>Podwielokrotnić oczyszczony RNA i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Transfekcja mRNA do komórek
<ol>
	<li>Wysiewamy komórki HeLa na 24-dołkowej płytce (aby następnego dnia były ok. ~80-90% zlewające się) i inkubować przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Infekuj komórki HeLa wirusem krowianki (VACV) przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 5 lub zachowaj niezainfekowane komórki HeLa dla porównania. 
	nuta: MOI to liczba zakaźnych cząstek wirusa na komórkę.</li>
	<li>MOI x = {[(liczba komórek * X) / miano wirusa] * 1000} μl wirusa na 1 ml pożywki.</li>
	<li>Po pożądanym h po infekcji (hpi) (w tym eksperymencie przy 10-12 hpi), transfekuj mRNA (500 ng całkowitego mRNA na dołek 24-dołkowych płytek) za pomocą kationowego odczynnika do transfekcji lipidów, jak pokazano w <silna klasa = "xfig">Rysunek 3C.
	<ol>
		<li>W przypadku jednej studzienki na 24-dołkowej płytce wymieszaj 480 ng sekwencji 12A zawierającej mRNA lucyferazy świetlika (12A-Fluc) i 20 ng sekwencji Kozaka zawierającej mRNA lucyferazy Renilla (Kozak-Rluc) w jednej probówce do mikrowirówki. Do innej probówki do mikrowirówki dodać 1,1 μl odczynnika do transfekcji kationów lipidowych.</li>
		<li>Dodać 55 μl zredukowanej pożywki surowicy do obu probówek. Wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Po 5 minutach inkubacji dodać 55 μl kationowego odczynnika do transfekcji lipidów zawierającego zredukowaną pożywkę surowicy do probówki zawierającej mRNA.</li>
		<li>Wymieszaj delikatnie, ale dokładnie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
		<li>Podczas inkubacji należy usunąć pożywkę do hodowli komórkowych i dodać 400 μl zredukowanej pożywki surowicy na dołek z 24-dołkowych płytek.</li>
		<li>Po inkubacji dodać 100 μl mieszaniny kroplami i równomiernie do jednego dołka z 24-dołkowymi płytkami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Mierz aktywność lucyferazy
<ol>
	<li>Pięć godzin po kotransfekcji mRNA 12A-Fluc i Kozak-Rluc zmierz aktywność lucyferazy za pomocą systemu testowego lucyferazy zdolnego do wykonania dwóch testów reporterowych (np. Zestaw do testów Dual Luciferase Reporter).</li>
	<li>Usuń zredukowaną pożywkę surowicy i poddaj komórki lizie, dodając 150 μl 1x bufor do lizy, składnik zestawu do oznaczania lucyferazy.</li>
	<li>Po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej zebrać lizat poprzez złomowanie komórek i przenieść do probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Odwirować lizat o stężeniu 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia resztek komórek.</li>
	<li>Dodać 30 μl supernatantu do nieprzezroczystej 96-dołkowej białej płytki testowej z twardym dnem.</li>
	<li>Zmierz podwójną luminescencję za pomocą zestawu do oznaczania lucyferazy i luminometru z wielomodowym czytnikiem płytek.</li>
	<li>Wykonać pomiar za pomocą funkcji kinetyki (w odniesieniu do każdego dołka) przy użyciu ustawień opisanych w tabeli 5. 
	nuta: Odczyt można również wykonać za pomocą ręcznego luminometru. Dodaj równą objętość lizatu i substratu dla Fluc do kuwety. Odczekaj 2 s i mierz przez 10 s za pomocą luminometru. Po pomiarze fluc szybko wyjmij kuwetę z luminometru i ręcznie dodaj równą objętość podłoża dla Rluc. Ponownie odczekaj 2 s i zmierz przez 10 s za pomocą luminometru.</li>
	<li>Eksportuj dane odczytu luminescencji do żądanego formatu pliku.</li>
	<li>Określ względną szybkość translacji z mRNA 12A-Fluc w niezakażonych i zakażonych VACV komórkach HeLa, dzieląc wartość Fluc przez wartość Rluc kontroli wewnętrznej. 
	UWAGA: Rysunek uzupełniający 1 przedstawia analizę surowych danych krok po kroku w celu uzyskania względnej aktywności fluc.</li>
</ol>

<ol><li>Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Symposia+of+the+Society+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">On protein synthesis.</a> Symposia of the Society for Experimental Biology. 12, 138-163 (1958).</li>
<li>Crick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+Dogma+of+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Central Dogma of Molecular Biology.</a> Nature. 227, 561-563 (1970).</li>
<li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Translation+Initiation+in+Eukaryotes%3A+Mechanisms+and+Biological+Targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of Translation Initiation in Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets.</a> Cell. 136, 731-745 (2009).</li>
<li>Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Regulation+of+Gene+Expression+during+Conditions+of+Cell+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Translational Regulation of Gene Expression during Conditions of Cell Stress.</a> Molecular Cell. 40, 228-237 (2010).</li>
<li>Shchelkunov, S. N., Marennikova, S. S., Moyer, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShchelkunov%2C+SN+%22Orthopoxviruses+Pathogenic+for+Humans%22">Orthopoxviruses Pathogenic for Humans</a>. , Springer US. (2005).</li>
<li>Gale, M., Tan, S. L., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Control+of+Viral+Gene+Expression+in+Eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Translational Control of Viral Gene Expression in Eukaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, 239-280 (2000).</li>
<li>Walsh, D., Mathews, M. B., Mohr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tinkering+with+Translation%3A+Protein+Synthesis+in+Virus-Infected+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Tinkering with Translation: Protein Synthesis in Virus-Infected Cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a012351(2013).</li>
<li>Cao, S., Dhungel, P., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+against+the+Tide%3A+Selective+Cellular+Protein+Synthesis+during+Virally+Induced+Host+Shutoff%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Going against the Tide: Selective Cellular Protein Synthesis during Virally Induced Host Shutoff.</a> Journal of Virology. 91, e00071-e00017 (2017).</li>
<li>Pelletier, J., Kaplan, G., Racaniello, V. R., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-independent+translation+of+poliovirus+mRNA+is+conferred+by+sequence+elements+within+the+5%E2%80%99+noncoding+region%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5’ noncoding region.</a> Molecular and Cellular Biology. 8, 1103-1112 (1988).</li>
<li>Pelletier, J., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+initiation+of+translation+of+eukaryotic+mRNA+directed+by+a+sequence+derived+from+poliovirus+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA.</a> Nature. 334, 320-325 (1988).</li>
<li>Guo, L., Allen, E., Miller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+a+cap-independent+translation+element+that+functions+in+either+the+3%E2%80%B2+or+the+5%E2%80%B2+untranslated+region%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Structure and function of a cap-independent translation element that functions in either the 3′ or the 5′ untranslated region.</a> RNA. 6, 1808-1820 (2000).</li>
<li>Simon, A. E., Miller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%E2%80%B2+Cap-Independent+Translation+Enhancers+of+Plant+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">3′ Cap-Independent Translation Enhancers of Plant Viruses.</a> Annual Review of Microbiology. 67, 21-42 (2013).</li>
<li>Marom, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+poly%28A%29+binding+proteins+mediate+internal+translational+initiation+by+a+plant+viral+IRES%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Diverse poly(A) binding proteins mediate internal translational initiation by a plant viral IRES.</a> RNA Biology. 6, 446-454 (2009).</li>
<li>Liu, B., Qian, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+reprogramming+in+cellular+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Review.+RNA%22%5BJournal%5D)">Translational reprogramming in cellular stress response.</a> Wiley Interdisciplinary Review. RNA. 5, 301-305 (2014).</li>
<li>Ahn, B. Y., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capped+poly%28A%29+leaders+of+variable+lengths+at+the+5%E2%80%99+ends+of+vaccinia+virus+late+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Capped poly(A) leaders of variable lengths at the 5’ ends of vaccinia virus late mRNAs.</a> Journal of Virology. 63, 226-232 (1989).</li>
<li>Ahn, B. Y., Jones, E. V., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+vaccinia+virus+gene+encoding+an+18-kilodalton+subunit+of+RNA+polymerase+and+demonstration+of+a+5%E2%80%99+poly%28A%29+leader+on+its+early+transcript%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5’ poly(A) leader on its early transcript.</a> Journal of Virology. 64, 3019-3024 (1990).</li>
<li>Schwer, B., Visca, P., Vos, J. C., Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discontinuous+transcription+or+RNA+processing+of+vaccinia+virus+late+messengers+results+in+a+5%E2%80%B2+poly%28A%29+leader%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Discontinuous transcription or RNA processing of vaccinia virus late messengers results in a 5′ poly(A) leader.</a> Cell. 50, 163-169 (1987).</li>
<li>Yang, Z., Martens, C. A., Bruno, D. P., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+initiation+and+3%E2%80%B2+end+formation+of+poxvirus+post-replicative+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pervasive initiation and 3′ end formation of poxvirus post-replicative RNAs.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 31050-31060 (2012).</li>
<li>Dhungel, P., Cao, S., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%E2%80%99-poly%28A%29+leader+of+poxvirus+mRNA+confers+a+translational+advantage+that+can+be+achieved+in+cells+with+impaired+cap-dependent+translation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The 5’-poly(A) leader of poxvirus mRNA confers a translational advantage that can be achieved in cells with impaired cap-dependent translation.</a> PLOS Pathogens. 13, e1006602(2017).</li>
<li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-kingdom+mimicry+underlies+ribosome+customization+by+a+poxvirus+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Trans-kingdom mimicry underlies ribosome customization by a poxvirus kinase.</a> Nature. 546, 651-655 (2017).</li>
<li>Dai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+Profiling+Reveals+Translational+Upregulation+of+Cellular+Oxidative+Phosphorylation+mRNAs+during+Vaccinia+Virus-Induced+Host+Shutoff%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Ribosome Profiling Reveals Translational Upregulation of Cellular Oxidative Phosphorylation mRNAs during Vaccinia Virus-Induced Host Shutoff.</a> Journal of Virology. 91, e01858-e01816 (2017).</li>
<li>De Silva, F. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin-independent+plasmid+replication+occurs+in+vaccinia+virus+cytoplasmic+factories+and+requires+all+five+known+poxvirus+replication+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Origin-independent plasmid replication occurs in vaccinia virus cytoplasmic factories and requires all five known poxvirus replication factors.</a> Journal of Virology. 2, 23(2005).</li>
<li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+high-resolution+analysis+of+vaccinia+virus+and+host+cell+transcriptomes+by+deep+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Simultaneous high-resolution analysis of vaccinia virus and host cell transcriptomes by deep RNA sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 11513-11518 (2010).</li>
<li>Yang, Z., Bruno, D. P., Martens, C. A., Porcella, S. F., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Analysis+of+the+5%E2%80%B2+and+3%E2%80%B2+Ends+of+Vaccinia+Virus+Early+mRNAs+Delineates+Regulatory+Sequences+of+Annotated+and+Anomalous+Transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Analysis of the 5′ and 3′ Ends of Vaccinia Virus Early mRNAs Delineates Regulatory Sequences of Annotated and Anomalous Transcripts.</a> Journal of Virology. 85, 5897-5909 (2011).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li>
<li>Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+concepts+for+PCR+primer+design%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+and+Applications%22%5BJournal%5D)">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods and Applications. 3, S30-S37 (1993).</li>
<li>Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, T. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInnis%2C+MA+%22PCR+Protocols%3A+A+Guide+to+Methods+and+Applications%22">PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications</a>. , Academic Press. (2012).</li>
<li>Baklanov, M. M., Golikova, L. N., Malygin, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+on+DNA+Transcription+of+Nucleotide+Sequences+Upstream+to+T7+Promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Effect on DNA Transcription of Nucleotide Sequences Upstream to T7 Promoter.</a> Nucleic Acids Research. 24, 3659-3660 (1996).</li>
<li>Thornton, J. A. Splicing by Overlap Extension PCR to Obtain Hybrid DNA Products. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThornton%2C+JA+%22The+Genetic+Manipulation+of+Staphylococci%3A+Methods+and+Protocols%22">The Genetic Manipulation of Staphylococci: Methods and Protocols</a>. , Humana Press. New York. 43-49 (2017).</li>
<li>Akichika, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-specific+terminal+N6-methylation+of+RNA+by+an+RNA+polymerase+II%E2%80%93associated+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cap-specific terminal N6-methylation of RNA by an RNA polymerase II–associated methyltransferase.</a> Science. , (2018).</li>
<li>Sun, H., Zhang, M., Li, K., Bai, D., Yi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap-specific%2C+terminal+N6-methylation+by+a+mammalian+m6Am+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Cap-specific, terminal N6-methylation by a mammalian m6Am methyltransferase.</a> Cell Research. 1, (2018).</li>
<li>Boulias, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+m6Am+methyltransferase+PCIF1+reveals+the+location+and+functions+of+m6Am+in+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Identification of the m6Am methyltransferase PCIF1 reveals the location and functions of m6Am in the transcriptome.</a> bioRxiv. , 485862(2018).</li>
<li>Dominissini, D., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N4-acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+by+NAT10+Regulates+Stability+and+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation.</a> Cell. 175, 1725-1727 (2018).</li>
<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+m6A%2C+m6Am%2C+and+m1A+Demethylation+Mediated+by+FTO+in+the+Cell+Nucleus+and+Cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm.</a> Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).</li>
<li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m6A+RNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).</li>
</ol>

Autorzy pragną zadeklarować brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Wszystkie cztery podstawowe etapy mają kluczowe znaczenie dla powodzenia testu reporterowego lucyferazy opartej na transkrypcji RNA in vitro. Szczególną uwagę należy zwrócić na konstrukcję startera, zwłaszcza dla sekwencji promotora T7. Polimeraza RNA T7 rozpoczyna transkrypcję od podkreślonego pierwszego G (GGG-5'-UTR-AUG-) w promotorze T7 dodanym przed sekwencją 5'-UTR. Chociaż miejsce rozpoczęcia transkrypcji (TSS) zaczyna się od pierwszego G na końcu 5', zmniejszenie liczby G mniej niż trzech w regionie promot...

Zgodnie z centralnym dogmatem, informacja genetyczna przepływa od DNA do RNA, a następnie do białka1,2. Ten przepływ informacji genetycznej jest wysoce regulowany na wielu poziomach, w tym translacji mRNA3,4. Opracowanie testów reporterowych do pomiaru regulacji ekspresji genów ułatwi zrozumienie mechanizmów regulacyjnych związanych z tym procesem. Tutaj opisujemy protokół badania translacji mRNA przy użyciu testu reporterowego lucyferazy opartej na transkrypcji RNA in vitro w komórkach zakażonych wirusem ospy.
Poxwirusy zawierają wiele bardzo niebezpiecznych patogenów ludzkich i zwierzęcych5. Podobnie jak wszystkie inne wirusy, pokswirusy polegają wyłącznie na maszynerii komórek gospodarza do syntezy białek6,7,8. Aby skutecznie syntetyzować białka wirusowe, wirusy wyewoluowały wiele strategii przejmowania kontroli nad komórkową maszynerią translacyjną w celu przekierowania jej do translacji wirusowych mRNA7,8. Jednym z powszechnie stosowanych przez wirusy mechanizmów jest wykorzystanie elementów cis w ich transkryptach. Godnymi uwagi przykładami są wewnętrzne miejsce wprowadzania rybosomów (IRES) i wzmacniacz translacji niezależny od czapek (CITE)9,10,11. Te cis-elementy sprawiają, że transkrypty wirusowe mają przewagę translacyjną, przyciągając maszynerię translacyjną za pomocą różnych mechanizmów12,13,14. Ponad 100 mRNA pokswirusa ma ewolucyjnie konserwatywny element cis działający w regionie 5'-nieulegającym translacji (5'-UTR): lider 5'-poly(A) na samych końcach 5' tych mRNA15,16. Długości tych liderów 5'-poli(A) są niejednorodne i są generowane przez poślizg polimerazy RNA kodowanej przez pokswirusa podczas transkrypcji17,18. My i inni odkryliśmy niedawno, że lider 5'-poli(A) daje przewagę translacyjną mRNA w komórkach zakażonych wirusem krowianki (VACV), prototypowym członkiem poxviruses19,20.
Test reporterowy lucyferazy oparty na transkrypcji in vitro na bazie RNA został początkowo opracowany w celu zrozumienia roli lidera 5'-poli(A) w translacji mRNA podczas infekcji pokswirusem19,21. Chociaż testy reporterowe lucyferazy oparte na plazmidowym DNA są szeroko stosowane, istnieje kilka wad, które komplikują interpretację wyników w komórkach zakażonych wirusem ospy. Po pierwsze, plazmidy są zdolne do replikacji w komórkach zakażonych wirusem VACV22. Po drugie, krypcyjna transkrypcja często występuje z plazmidowego DNA18,23,24. Po trzecie, transkrypcja sterowana przez promotor VACV generuje poli(A)-lidera o niejednorodnych długościach, co w konsekwencji utrudnia kontrolowanie długości poli(A)-lidera w niektórych eksperymentach18. Test reporterowy lucyferazy oparty na RNA z transkrypcją in vitro pozwala obejść te problemy, a interpretacja danych jest prosta.
Są cztery kluczowe kroki w tej metodzie: (1) reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) w celu wygenerowania matrycy DNA do transkrypcji in vitro; (2) transkrypcja in vitro w celu wytworzenia mRNA; (3) transfekcja w celu dostarczenia mRNA do komórek; oraz (4) wykrywanie aktywności lucyferazy jako wskaźnika translacji (<silna klasa="xfig">Ryc. 1). Otrzymany amplikon PCR zawiera następujące pierwiastki w kierunku od 5' do 3': promotor T7, lider poli(A) lub pożądana sekwencja 5'-UTR, otwarta ramka odczytu lucyferazy świetlika (ORF), po której następuje ogon poli(A). Amplikon PCR jest używany jako matryca do syntezy mRNA przez transkrypcję in vitro przy użyciu polimerazy T7. Podczas transkrypcji in vitro kap m7G lub inny analog kapu jest włączany do nowo zsyntetyzowanego mRNA. Zamknięte transkrypty są transfekowane do komórek niezakażonych lub zakażonych wirusem VACV. Lizat komórkowy jest pobierany w pożądanym czasie po transfekcji w celu zmierzenia aktywności lucyferazy, która wskazuje na produkcję białka z transfekowanego mRNA. Ten test reporterowy może być wykorzystany do badania regulacji translacji przez element cis, obecny w 5'-UTR, 3'-UTR lub innych regionach mRNA. Co więcej, test oparty na transkrybowanym RNA in vitro może być wykorzystany do badania różnych mechanizmów inicjacji translacji, w tym inicjacji zależnej od czapeczki, inicjacji niezależnej od czapeczki, ponownej inicjacji i inicjacji wewnętrznej, takiej jak IRES.

<table><tbody><tr><td>2X-Q5 Master mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492</td><td>Polimeraza DNA o wysokiej wierności stosowana w PCR</td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411L</td><td>Anti reverse Cap analog lub ARCA</td></tr><tr><td>Corning 96 Well Half-Area biała mikropłytka polistyrenowa z płaskim dnem Corning</td><td></td><td>3693</td><td>Nieprzezroczysta 96-dołkowa biała płytka z solidnym dnem</td></tr><tr><td>System testów reporterowych z podwójną lucyferazy</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>Zestaw do testowania podwójnej lucyferazy (DLAK)</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit Zestaw</td> do oczyszczania <td>PCR OMEGA BIO-TEK</td><td>D6492</td><td>Luminometr mikropłytkowy</td></tr><tr><td>GloMax Navigator</td><td>Promega</td><td>GM2010</td><td>Określany jako luminometr wielomodowy</td></tr><tr><td>HiScribe T7 Szybki zestaw do syntezy RNA o wysokiej wydajności</td> New <td>England Biolabs</td><td>E2050S</td><td>In Zestaw do transkrypcji in vitro</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Kationowy odczynnik do transfekcji lipidów</td></tr><tr><td>NanoDrop2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Służy do pomiaru stężenia DNA i RNA</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Zredukowane podłoże surowicy</td></tr><tr><td>Purelink RNA Mini Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12183018A</td><td>Zestaw do oczyszczania RNA</td></tr><tr><td>System zamykania krowianki System zamykania</td><td>New England Biolabs</td><td>M2080</td><td></td></tr></tbody></table>

test reporterowy lucyferazy oparty na rna w transkrypcji in vitro w celu zbadania regulacji translacji w komórkach zakażonych pokswirusem

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Każdy mRNA poxwirusa transkrybowany po replikacji DNA wirusa ma ewolucyjnie zachowanego, nieszablonowego lidera 5'-poli(A) w 5'-UTR. Aby przeanalizować rolę lidera 5'-poli(A) w translacji mRNA podczas infekcji pokswirusem, opracowaliśmy test reporterowy lucyferazy oparty na transkrypcji RNA in vitro. Ten test reporterowy składa się z czterech podstawowych etapów: (1) PCR w celu amplifikacji matrycy DNA do transkrypcji in vitro; (2) transkrypcja in vitro w celu wytworzenia mRNA przy użyciu polimerazy RNA T7; (3) Transfekcja w celu wprowadzenia do komórek transkrybowanego mRNA in vitro; (4) Wykrywanie aktywności lucyferazy jako wskaźnika translacji. Opisany tutaj test reporterowy lucyferazy oparty na RNA omija problemy z replikacją plazmidu w komórkach zakażonych pokswirusem i tajemniczą transkrypcją z plazmidu. Protokół ten może być wykorzystany do określenia regulacji translacji przez elementy cis w mRNA, w tym 5'-UTR i 3'-UTR w systemach innych niż komórki zakażone wirusem ospy. Co więcej, za pomocą tej metody można badać różne tryby inicjacji translacji, takie jak zależna od cap, niezależna od cap, reinicjacja i inicjacja wewnętrzna.

Cztery etapy testu reporterowego lucyferazy opartego na RNA transkrybowanym in vitro: PCR w celu wygenerowania matrycy DNA do transkrypcji in vitro, transkrypcja in vitro w celu otrzymania mRNA, transfekcja mRNA oraz pomiar aktywności lucyferazy, zostały przedstawione na schemacie (Rycina 1). Projektowanie starterów dla obu matryc DNA (Fluc i Rluc) oraz ogólny schemat PCR z rozszerzeniem nawisów (overhang extension PCR) zilustrowano na schemacie (<strong clas...

Prezentujemy protokół do badania regulacji translacji mRNA w komórkach zakażonych wirusem poxvirus za pomocą testu reporterowego in vitro transkrybowanego RNA lucyferazy. Test może być stosowany do badania regulacji translacji przez cis elementy mRNA, w tym region 5'-nieulegający translacji (UTR) i 3'-UTR. Za pomocą tej metody można również badać różne tryby inicjacji tłumaczenia.

Test reporterowy lucyferazy oparty na RNA w transkrypcji in vitro w celu zbadania regulacji translacji w komórkach zakażonych pokswirusem

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

Nasz protokół testu lucyferazy na bazie RNA z transkrypcją in vitro pomaga badać regulację translacji w komórkach zakażonych wirusem ospy. Dodatkowo, dostosowana długość poli(A)litra pozwala na badanie jego regulacyjnego wpływu na translację. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie regulacji translacji przez elementy CIS, takie jak 5'UTR i 3'UTR w mRNA oraz szerokie spektrum inicjacji translacji.Test reporterowy lucyferazy oparty na transkrypcji RNA in vitro może być dostosowany do włączenia modyfikacji czapeczki i innych modyfikacji oraz wykorzystany do zbadania wpływu na translację. Aby rozpocząć, zaprojektuj startery do przodu i do tyłu, aby wygenerować amplikon PCR zawierający następujące pierwiastki w kierunku od 5' do 3': Promotor T7, Poli(A)litr, Lucyferazy świetlika ORF w ogonie Poly(A) określanym jako T7_12A-Fluc, zawiera kilka dodatkowych nukleotydów w starterze do przodu, a następnie T7-Promotor Poly(A)litr lub pożądana sekwencja 5'UTR i około 20 nukleotydów odpowiadających końcowi 5' genu reporterowego ORF. Dostosuj długość startera w oparciu o temperaturę topnienia odpowiadającą końcowi 5' ORF genu reporterowego, upewniając się, że odpowiedni region startera jest identyczny z nicią sensacyjną genu.Następnie zaprojektuj odwrócony starter, aby zawierał poli(A) ogon i około 20 nukleotydów. Dostosuj w oparciu o temperaturę topnienia odpowiadającą końcowi 3' ORF genu reporterowego, upewniając się, że odpowiedni region startera jest identyczny z nicią antysensowną genu, a przed ogonem Poly(A) znajduje się kodon stop w ramce. Do kontroli wewnętrznej zaprojektuj inny zestaw starterów zawierający następujące pierwiastki w kierunku od 5' do 3': T7-Promoter, losowa sekwencja kodująca 5'UTR zawierająca sekwencję Kozaka, Renilla Lucyferazy ORF i Poly(A)tail, określaną jako T7_Kozak-Rluc.Aby przygotować reakcję, dodaj odczynniki w następującej kolejności do probówki PCR: woda wolna od DNazy, polimeraza DNA o wysokiej wierności 2X, startery i potwierdzona sekwencja matrycy DNA lucyferazy. Po standardowym trzyetapowym cyklu PCR w celu wygenerowania matrycy DNA, wykryj produkt PCR, przeprowadzając 5-10% reakcji PCR w 1% elektroforezie żelowej agarozy TAE wraz ze wzorcem masy cząsteczkowej. Aby określić rozmiar produktu PCR, zwizualizuj żel pod oświetlaczem UV.Po ustaleniu prawidłowego rozmiaru produktu PCR, oczyść go za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania PCR przy użyciu 100 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz w celu elucji DNA. Sprawdzić stężenie oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru i przechowywać je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do natychmiastowego użycia do transkrypcji in vitro. Aby zsyntetyzować RNA z produktu PCR, dodaj następujące odczynniki do probówki mikrowirówkowej: woda wolna od DNazy-RNazy, mieszanina NTP, analog kapu, szablon produktu PCR i mieszanina polimerazy T7-RNA z zestawu do transkrypcji in vitro.Dokładnie wymieszaj. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny, a następnie przystąpić do oczyszczania zsyntetyzowanego RNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA. Aby sprawdzić oczyszczone RNA, podgrzej RNA w temperaturze 70 stopni przez pięć minut, aby usunąć strukturę drugorzędową i uruchom go na 1,5 agarozowego żelu TBE.Następnie zwizualizuj żel pod oświetlaczem UV. Sprawdź stężenie oczyszczonego RNA za pomocą spektrofotometru. Podajemy go i przechowujemy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Wysiewaj komórki HeLa na 24-dołkowej płytce, aby osiągnąć 80-90% zlewności następnego dnia i inkubuj przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Zainfekuj komórki HeLa wirusem krowianki przy wielokrotności infekcji wynoszącej pięć i zachowaj niezainfekowane komórki HeLa dla porównania. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 10 do 12 godzin.Po pożądanych godzinach po infekcji wymieszaj 480 nanogramów sekwencji 12A zawierającej mRNA lucyferazy świetlika i 20 nanogramów sekwencji Kozaka zawierającej mRNA lucyferazy Renilla w jednej probówce do mikrowirówki. Do innej probówki do mikrowirówki dodaj 1,1 mikrolitra odczynnika do transfekcji kationowych lipidów. Dodać 55 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy do obu probówek, wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Następnie dodaj 55 mikrolitrów kationowego odczynnika do transfekcji lipidów zawierającego zredukowaną pożywkę surowicy do probówki zawierającej mRNA. Wymieszaj delikatnie, ale dokładnie pipetą i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Podczas inkubacji należy usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z komórek i dodać 400 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy na dołek.Po zakończeniu inkubacji dodać 100 mikrolitrów mieszaniny kroplami i równomiernie na dołek płytki 24-dołkowej. Pięć godzin po kotransfekcji z 12A Fluc i mRNA Kozak Rluc usuń zredukowaną pożywkę surowicy z komórek i poddaj komórki lizie, dodając 150 mikrolitrów buforu do lizy 1X z zestawu testowego lucyferazy, który jest w stanie wykonać dwa testy reporterowe. Po inkubacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej zeskrobać komórki za pomocą gumowej i sterylnej strzykawki i przenieść do probówki mikrowirówkowej.Aby rozdrobnić resztki komórek, odwiruj lizat z prędkością 12 000 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść 30 mikrolitrów supernatantu na studzienkę z nieprzezroczystej, 96-dołkowej białej płytki testowej o stałych ściankach i stałym dnie. Użyj zestawu do oznaczania lucyferazy i luminometru z wielomodowym czytnikiem płytek, aby zmierzyć podwójną luminescencję za pomocą funkcji kinetycznej, jak opisano w manuskrypcie.Po wyeksportowaniu danych odczytu luminescencji do pożądanego formatu pliku, określ względną szybkość translacji z mRNA 12A Fluc w niezakażonych i zakażonych VACV komórkach HeLA, dzieląc wartość Fluc przez wartość Rluc kontroli wewnętrznej. Test ten został wykorzystany do przetestowania wydajności translacji mRNA Fluc, które zawiera 5'Poli(A)litr w komórkach niezakażonych i zakażonych VACV. Zarówno komórki niezakażone, jak i zakażone VACV zostały z powodzeniem transfekowane mRNA Fluc i Rluc.Dzielenie Fluc przez Rluc znormalizowało skuteczność transfekcji w stabilności RNA w komórkach. 5'Poli(A)litr zawierający mRNA ma przewagę translacyjną podczas infekcji VACV w porównaniu z komórkami niezakażonymi. Nie było to spowodowane różnicową wydajnością transfekcji ani stabilnością mRNA, ponieważ poziom RNA był podobny w komórkach niezakażonych i zakażonych VACV pięć godzin po transfekcji mRNA.Zachowaj szczególną ostrożność podczas projektowania starterów, ponieważ może to wpłynąć nie tylko na wydajność reakcji PCR, ale także na wszystkie dalsze procesy wymagające amplifikowanego DNA. Ta metoda jest ważnym testem do szybkiego testowania regulacji translacji przez elementy CIS. Jeśli to możliwe, metoda ta powinna być potwierdzona innymi uzupełniającymi doświadczeniami.Należy zachować ostrożność podczas stosowania wirusa krowianki i unikać narażenia na chemikalia, takie jak bromek etydyny i fenol.

in-vitro-transcribed-rna-based-luciferase-reporter-assay-to-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejsza metoda opisuje wysokowydajną syntezę in vitro zarówno zmodyfikowanego (z czapeczką), jak i niezmodyfikowanego (bez czapeczki) mRNA z liniowego plazmidu zawierającego gen lucyferazy Gaussia (GLuc). RNA zostaje poddane oczyszczaniu, a następnie część mRNA bez czapeczki zostaje enzymatycznie zmodyfikowana z wykorzystaniem enzymu czapeczkującego wirusa Vaccinia. W ostatnim kroku mRNA jest transfekowane do komórek HeLa, a następnie analizowana jest aktywność lucyferazy w supernatantach...

Transkrypcja in vitro i capping mRNA lucyferazy Gaussia z następującą transfekcją komórek HeLa

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

Ten film demonstruje metodę śledzenia infekcji wirusowych w modelach mysich przy użyciu rekombinowanego wirusa grypy A z ekspresją białka rekombinowanego i fluorescencji, wyrażającego bi-reporter. Metoda ta umożliwia prowadzenie badań zarówno in vivo, jak i ex vivo, umożliwiając naukowcom uzyskanie wglądu w dynamikę wirusa i efekty interwencji.

Wirus wirusa grypy reporterowej lucyferazy-fluorescencji do śledzenia infekcji wirusowych

Ten film demonstruje test do badania regulacji translacji w komórkach zakażonych wirusem poxvirus. Niezakażone i zakażone wirusem komórki były współtransfekowane mRNA kodującymi lucyferazy świetlika (Fluc) i lucyferazy Renilla (Rluc), przy czym mRNA Fluc zawierało sekwencję liderową 5' poli(A). Po dodaniu substratów bioluminescencyjnych na lizowanych komórkach, zmierz sygnał z obu lucyferazy, aby zidentyfikować przewagę translacyjną mRNA Fluc w komórkach zakażonych wirusem, przyznaną przez...

Test reporterowy lucyferazy do badania regulacji translacji w komórkach zakażonych ospą

Opisujemy użycie fluorescencyjnego wirusa krowianki reporterowej, który umożliwia pomiar zakaźności wirusa i ekspresji genów w czasie rzeczywistym poprzez specyficzną dla etapu ekspresję spektralnie odrębnych fluoroforów reporterowych. Szczegółowo opisujemy metodę opartą na płytkach do dokładnej identyfikacji etapu, na którym replikacja wirusa jest zaburzona w odpowiedzi na hamowanie małych cząsteczek.

Wirusy reporterowe krowianki do ilościowego określania funkcji wirusa na wszystkich etapach ekspresji genów

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Transfekcja do linii komórkowej makrofagów, RAW264.7, jest trudna ze względu na naturalną reakcję komórki na obce materiały. Opisaliśmy tutaj delikatną, ale solidną procedurę transfekcji genów reporterowych lucyferazy do komórek RAW264.7.

Transfekcja komórek RAW264.7 z genem reporterowym lucyferazy

Przedstawiono test bioluminescencji in vitro w celu określenia komórkowego rytmu dobowego w komórkach nabłonka sutka. Metoda ta wykorzystuje plazmidy reporterowe komórek ssaków eksprymujące zdestabilizowaną lucyferazy pod kontrolą promotora genu PERIOD 2. Można go dostosować do innych typów komórek w celu oceny specyficznego dla narządu wpływu na rytm okołodobowy.

In vitro Test bioluminescencji w celu scharakteryzowania rytmu okołodobowego w komórkach nabłonka sutka

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

Aby zidentyfikować nowe regulatory czynników transkrypcyjnych, opracowaliśmy podejście do badania przesiewowego bibliotek RNAi lentiwirusowych lub retrowirusowych za pomocą testu reporterowego opartego na podwójnej lucyferazie. Takie podejście oferuje szybki i stosunkowo niedrogi sposób na przebadanie przesiewowe setek kandydatów w jednym eksperymencie.

Identyfikacja regulatorów czynników transkrypcyjnych za pomocą średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek tablicowych i reportera opartego na podwójnej lucyferazie

Opracowaliśmy test reporterowy biogenezy mikroRNA do wykorzystania w komórkach in vitro z czterema plazmidami: jeden z miRNA intronicznym, jeden z celem, jeden do nadekspresji białka regulatorowego i jeden dla lucyferazy Renilla. MiRNA zostało przetworzone i mogło kontrolować ekspresję lucyferazy poprzez wiązanie się z sekwencją docelową.

Test reporterowy do analizy dojrzewania intronowego mikroRNA w komórkach ssaków

Poznaj metodę testu reporterowego lucyferazy opartego na RNA w transkrypcji in vitro do badania regulacji translacji w komórkach zakażonych wirusem ospy. Technika umożliwia analizę elementów cis w mRNA, w tym regionów 5'UTR i 3'UTR.

Test reporterowy lucyferazy oparty na RNA w transkrypcji in vitro w celu zbadania regulacji translacji w komórkach zakażonych pokswirusem (Wideo) | JoVE Journal

Test reporterowy lucyferazy oparty na RNA w transkrypcji in vitro w celu zbadania regulacji translacji w komórkach zakażonych pokswirusem

Przeglądaj więcej filmów