Test reporterowy lucyferazy oparty na RNA w transkrypcji in vitro w celu zbadania regulacji translacji w komórkach zakażonych pokswirusem

Nasz protokół testu lucyferazy na bazie RNA z transkrypcją in vitro pomaga badać regulację translacji w komórkach zakażonych wirusem ospy. Dodatkowo, dostosowana długość poli(A)litra pozwala na badanie jego regulacyjnego wpływu na translację. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie regulacji translacji przez elementy CIS, takie jak 5'UTR i 3'UTR w mRNA oraz szerokie spektrum inicjacji translacji.

Test reporterowy lucyferazy oparty na transkrypcji RNA in vitro może być dostosowany do włączenia modyfikacji czapeczki i innych modyfikacji oraz wykorzystany do zbadania wpływu na translację. Aby rozpocząć, zaprojektuj startery do przodu i do tyłu, aby wygenerować amplikon PCR zawierający następujące pierwiastki w kierunku od 5' do 3': Promotor T7, Poli(A)litr, Lucyferazy świetlika ORF w ogonie Poly(A) określanym jako T7_12A-Fluc, zawiera kilka dodatkowych nukleotydów w starterze do przodu, a następnie T7-Promotor Poly(A)litr lub pożądana sekwencja 5'UTR i około 20 nukleotydów odpowiadających końcowi 5' genu reporterowego ORF. Dostosuj długość startera w oparciu o temperaturę topnienia odpowiadającą końcowi 5' ORF genu reporterowego, upewniając się, że odpowiedni region startera jest identyczny z nicią sensacyjną genu.

Następnie zaprojektuj odwrócony starter, aby zawierał poli(A) ogon i około 20 nukleotydów. Dostosuj w oparciu o temperaturę topnienia odpowiadającą końcowi 3' ORF genu reporterowego, upewniając się, że odpowiedni region startera jest identyczny z nicią antysensowną genu, a przed ogonem Poly(A) znajduje się kodon stop w ramce. Do kontroli wewnętrznej zaprojektuj inny zestaw starterów zawierający następujące pierwiastki w kierunku od 5' do 3': T7-Promoter, losowa sekwencja kodująca 5'UTR zawierająca sekwencję Kozaka, Renilla Lucyferazy ORF i Poly(A)tail, określaną jako T7_Kozak-Rluc.

Aby przygotować reakcję, dodaj odczynniki w następującej kolejności do probówki PCR: woda wolna od DNazy, polimeraza DNA o wysokiej wierności 2X, startery i potwierdzona sekwencja matrycy DNA lucyferazy. Po standardowym trzyetapowym cyklu PCR w celu wygenerowania matrycy DNA, wykryj produkt PCR, przeprowadzając 5-10% reakcji PCR w 1% elektroforezie żelowej agarozy TAE wraz ze wzorcem masy cząsteczkowej. Aby określić rozmiar produktu PCR, zwizualizuj żel pod oświetlaczem UV.

Po ustaleniu prawidłowego rozmiaru produktu PCR, oczyść go za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania PCR przy użyciu 100 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz w celu elucji DNA. Sprawdzić stężenie oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru i przechowywać je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do natychmiastowego użycia do transkrypcji in vitro. Aby zsyntetyzować RNA z produktu PCR, dodaj następujące odczynniki do probówki mikrowirówkowej: woda wolna od DNazy-RNazy, mieszanina NTP, analog kapu, szablon produktu PCR i mieszanina polimerazy T7-RNA z zestawu do transkrypcji in vitro.

Dokładnie wymieszaj. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny, a następnie przystąpić do oczyszczania zsyntetyzowanego RNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA. Aby sprawdzić oczyszczone RNA, podgrzej RNA w temperaturze 70 stopni przez pięć minut, aby usunąć strukturę drugorzędową i uruchom go na 1,5 agarozowego żelu TBE.

Następnie zwizualizuj żel pod oświetlaczem UV. Sprawdź stężenie oczyszczonego RNA za pomocą spektrofotometru. Podajemy go i przechowujemy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Wysiewaj komórki HeLa na 24-dołkowej płytce, aby osiągnąć 80-90% zlewności następnego dnia i inkubuj przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Zainfekuj komórki HeLa wirusem krowianki przy wielokrotności infekcji wynoszącej pięć i zachowaj niezainfekowane komórki HeLa dla porównania. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 10 do 12 godzin.

Po pożądanych godzinach po infekcji wymieszaj 480 nanogramów sekwencji 12A zawierającej mRNA lucyferazy świetlika i 20 nanogramów sekwencji Kozaka zawierającej mRNA lucyferazy Renilla w jednej probówce do mikrowirówki. Do innej probówki do mikrowirówki dodaj 1,1 mikrolitra odczynnika do transfekcji kationowych lipidów. Dodać 55 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy do obu probówek, wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Następnie dodaj 55 mikrolitrów kationowego odczynnika do transfekcji lipidów zawierającego zredukowaną pożywkę surowicy do probówki zawierającej mRNA. Wymieszaj delikatnie, ale dokładnie pipetą i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Podczas inkubacji należy usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z komórek i dodać 400 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy na dołek.

Po zakończeniu inkubacji dodać 100 mikrolitrów mieszaniny kroplami i równomiernie na dołek płytki 24-dołkowej. Pięć godzin po kotransfekcji z 12A Fluc i mRNA Kozak Rluc usuń zredukowaną pożywkę surowicy z komórek i poddaj komórki lizie, dodając 150 mikrolitrów buforu do lizy 1X z zestawu testowego lucyferazy, który jest w stanie wykonać dwa testy reporterowe. Po inkubacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej zeskrobać komórki za pomocą gumowej i sterylnej strzykawki i przenieść do probówki mikrowirówkowej.

Aby rozdrobnić resztki komórek, odwiruj lizat z prędkością 12 000 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść 30 mikrolitrów supernatantu na studzienkę z nieprzezroczystej, 96-dołkowej białej płytki testowej o stałych ściankach i stałym dnie. Użyj zestawu do oznaczania lucyferazy i luminometru z wielomodowym czytnikiem płytek, aby zmierzyć podwójną luminescencję za pomocą funkcji kinetycznej, jak opisano w manuskrypcie.

Po wyeksportowaniu danych odczytu luminescencji do pożądanego formatu pliku, określ względną szybkość translacji z mRNA 12A Fluc w niezakażonych i zakażonych VACV komórkach HeLA, dzieląc wartość Fluc przez wartość Rluc kontroli wewnętrznej. Test ten został wykorzystany do przetestowania wydajności translacji mRNA Fluc, które zawiera 5'Poli(A)litr w komórkach niezakażonych i zakażonych VACV. Zarówno komórki niezakażone, jak i zakażone VACV zostały z powodzeniem transfekowane mRNA Fluc i Rluc.

Dzielenie Fluc przez Rluc znormalizowało skuteczność transfekcji w stabilności RNA w komórkach. 5'Poli(A)litr zawierający mRNA ma przewagę translacyjną podczas infekcji VACV w porównaniu z komórkami niezakażonymi. Nie było to spowodowane różnicową wydajnością transfekcji ani stabilnością mRNA, ponieważ poziom RNA był podobny w komórkach niezakażonych i zakażonych VACV pięć godzin po transfekcji mRNA.

Zachowaj szczególną ostrożność podczas projektowania starterów, ponieważ może to wpłynąć nie tylko na wydajność reakcji PCR, ale także na wszystkie dalsze procesy wymagające amplifikowanego DNA. Ta metoda jest ważnym testem do szybkiego testowania regulacji translacji przez elementy CIS. Jeśli to możliwe, metoda ta powinna być potwierdzona innymi uzupełniającymi doświadczeniami.

Należy zachować ostrożność podczas stosowania wirusa krowianki i unikać narażenia na chemikalia, takie jak bromek etydyny i fenol.