Name: Protokół in vitro do oceny poziomów, funkcji i powiązanych genów docelowych w komórkach nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj metody identyfikacji i walidacji celów mikroRNA w komórkach nowotworowych, w tym transfekcję, test SRB oraz analizę reporterową lucyferazy. Protokół umożliwia ocenę funkcji miRNA w proliferacji komórek rakowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Program Badań Podstawowych przez Narodową Fundację Badawczą Korei (NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji (2017R1D1A3B03035662); oraz Hallym University Research Fund, 2017 (HRF-201703-003).

<ol><li>He, L., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+small+RNAs+with+a+big+role+in+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).</li>
<li>Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+Targeting+Caspase-3+and+-7+in+PANC-1+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li>
<li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs-103%2F107+coordinately+regulate+macropinocytosis+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).</li>
<li>Henry, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-199a-3p+targets+CD44+and+reduces+proliferation+of+CD44+positive+hepatocellular+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).</li>
<li>Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA-200+family+coordinately+regulates+cell+adhesion+and+proliferation+in+hair+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).</li>
<li>Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%2C+Regulatory+Messengers+Inside+and+Outside+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).</li>
<li>Khoshinani, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+miR-155%2FFOXO3a+and+miR-222%2FPTEN+in+acquired+radioresistance+of+colorectal+cancer+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Radiology%22%5BJournal%5D)">Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line.</a> Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-155+increases+colon+cancer+chemoresistance+to+cisplatin+by+targeting+forkhead+box+O3%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Letters%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3.</a> Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).</li>
<li>Catanzaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+miR-107%2C+miR-181c+and+miR-29a-3p+Promote+Activation+of+Notch2+Signaling+in+Pediatric+High-Grade+Gliomas+%28pHGGs%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs).</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).</li>
<li>Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hunting+of+targets%3A+challenge+in+miRNA+research%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The hunting of targets: challenge in miRNA research.</a> Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).</li>
<li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+RNA+extraction+from+tissues+for+microRNA+and+target+gene+expression+analysis%3A+not+all+kits+are+created+equal%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).</li>
<li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+Antitumor+Activity+of+Oxaliplatin+with+Epigenetic+Modifying+Agents%2C+5-Aza-CdR+and+FK228%2C+in+Human+Gastric+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells.</a> Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).</li>
<li>Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+miR-301a-3p+sensitizes+pancreatic+cancer+cells+to+gemcitabine+treatment+via+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN.</a> American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).</li>
<li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+MicroRNA+miR-107+regulates+cyclin-dependent+kinase+6+expression+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer.</a> Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).</li>
<li>van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+the+3-%284%2C5-dimethylthiazol-2-yl%29-2%2C5-diphenyl-2H-tetrazolium+bromide+%28MTT%29+assay+when+compared+to+three+commonly+used+cell+enumeration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays.</a> BMC Research Notes. 8, 47(2015).</li>
<li>Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+MTT+and+MTS-based+assays+for+measurement+of+antiproliferative+activity+of+green+tea+polyphenols%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols.</a> PloS One. 5 (4), e10202(2010).</li>
<li>Wu, L., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Let+me+count+the+ways%3A+mechanisms+of+gene+regulation+by+miRNAs+and+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs.</a> Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).</li>
<li>Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+microRNA+targeting+sites+by+luciferase+reporter+gene+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay.</a> Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).</li>
<li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-synuclein+binds+to+AKT+and+promotes+cancer+cell+survival+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biology%22%5BJournal%5D)">Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation.</a> Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).</li>
<li>Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-synuclein+promotes+cancer+cell+survival+and+inhibits+stress-+and+chemotherapy+drug-induced+apoptosis+by+modulating+MAPK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).</li>
<li>Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Target+Identification-Experimental+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches.</a> Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).</li>
<li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+identifies+microRNA+signature+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer.</a> International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).</li>
<li>Nuovo, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+methodology+for+the+combined+in+situ+analyses+of+the+precursor+and+mature+forms+of+microRNAs+and+correlation+with+their+putative+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets.</a> Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).</li>
<li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44 (1), 31-38 (2008).</li>
<li>Diederichs, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+argonautes+in+microRNA+processing+and+posttranscriptional+regulation+of+microRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression.</a> Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).</li>
<li>Orellana, E. A., Kasinski, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforhodamine+B+%28SRB%29+Assay+in+Cell+Culture+to+Investigate+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protocol%22%5BJournal%5D)">Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation.</a> Bio Protocol. 6 (21), (2016).</li>
<li>Lawrie, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Reviews%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in hematological malignancies.</a> Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li>
<li>Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and anticancer drugs.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).</li>
<li>Moeng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-107+Targets+IKBKG+and+Sensitizes+A549+Cells+to+Parthenolide%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide.</a> Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).</li>
<li>Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+combination+studies+and+their+synergy+quantification+using+the+Chou-Talalay+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method.</a> Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).</li>
<li>Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-canonical+site+reveals+the+cooperative+mechanisms+of+microRNA-mediated+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Strategie określania celów miRNA w dobrej wierze z funkcjami miRNA będącego przedmiotem zainteresowania są niezbędne do zrozumienia wielorakich ról miRNA. Identyfikacja docelowych genów miRNA może być wskazówką do interpretacji zdarzeń sygnalizacji komórkowej modulowanych przez miRNA w komórce. Odkrycie funkcjonalnie ważnych genów docelowych miRNA może dostarczyć podstawowej wiedzy potrzebnej do opracowania terapii opartej na miRNA w leczeniu raka.
Kilka metod, takich jak mikromacierze, sekwen...

MikroRNA (miRNA) to małe regulatorowe RNA, które głównie modulują proces translacji i degradacji informacyjnych RNA (mRNA) poprzez reakcję na nietranslowane regiony 3' (3' UTR) w bona fide docelowych genach1. Ekspresja miRNA może być regulowana przez mechanizmy transkrypcyjne i potranskrypcyjne. Brak równowagi takich mechanizmów regulacyjnych powoduje niekontrolowane i charakterystyczne poziomy ekspresji miRNA w wielu chorobach, w tym nowotworach2. Pojedyncze miRNA może mieć wiele interakcji z różnymi mRNA. W związku z tym pojedyncze mRNA może być kontrolowane przez różne miRNA. W związku z tym wewnątrzkomórkowe sieci sygnalizacyjne są pod silnym wpływem wyraźnie wyrażonych miRNA, które mogą inicjować i pogarszać fizjologiczne zaburzenia i choroby2,3,4,5,6. Chociaż zmienioną ekspresję miRNA zaobserwowano w różnych typach nowotworów, mechanizmy molekularne, które modulują sposoby działania komórek rakowych w połączeniu z miRNA, są nadal w dużej mierze nieznane.
Coraz więcej dowodów pokazuje, że onkogenne lub tłumiące nowotwory role miRNA zależą od typów nowotworów. Na przykład, celując w skrzynkę widełkową o3 (FOXO3), miR-155 promuje proliferację komórek, przerzuty i chemooporność raka jelita grubego7,8. W przeciwieństwie do tego, ograniczenie inwazji komórek glejaka jest indukowane przez miR-107 poprzez regulację neurogennego białka homologicznego locus notch 2 (NOTCH2) expression9. Ocena interakcji miRNA-cel w związku z funkcjami miRNA jest nieodzowną częścią lepszego zrozumienia, w jaki sposób miRNA regulują różne procesy biologiczne zarówno w stanie zdrowym, jak i chorym10. Ponadto odkrycie celów miRNA w dobrej wierze może dodatkowo zapewnić precyzyjną strategię terapii opartej na miRNA różnymi lekami przeciwnowotworowymi. Jednak głównym wyzwaniem w dziedzinie miRNA jest identyfikacja bezpośrednich celów miRNA. W tym miejscu przedstawiono szczegółowe metody jako powtarzalne podejścia eksperymentalne do oznaczania docelowego genu miRNA. Udany projekt eksperymentalny identyfikacji celu miRNA obejmuje różne etapy i rozważania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Porównanie poziomów dojrzałych miRNA w komórkach nowotworowych i normalnych komórkach może być jedną z powszechnych procedur wyboru interesującego miRNA (<silna klasa = "xfig" >Figura 1A). Badanie funkcjonalne wybranego miRNA w celu wykrycia wpływu miRNA na proliferację komórek jest ważne, aby zawęzić listę najlepszych potencjalnych celów miRNA będącego przedmiotem zainteresowania (<silna klasa = "xfig">Figura 1B). W oparciu o eksperymentalnie potwierdzone funkcje miRNA, wymagany jest systematyczny przegląd literatury i bazy danych w połączeniu z programem przewidywania celu miRNA w celu wyszukania najistotniejszych informacji na temat funkcji genów (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C). Identyfikację prawdziwych genów docelowych miRNA można osiągnąć, wdrażając eksperymenty, takie jak test lucyferazy wraz z klonowaniem 3' UTR genu, PCR w czasie rzeczywistym i western blotting (<silna klasa = "xfig">Figura 1D). Celem obecnego protokołu jest zapewnienie kompleksowych metod kluczowych eksperymentów, opartej na sondzie reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR), testu sulforodaminy B (SRB) po transfekcji mimicznej miRNA, generowania krzywej dawka-odpowiedź oraz testu lucyferazy wraz z klonowaniem 3' UTR genu. Obecny protokół może być przydatny do lepszego zrozumienia funkcji poszczególnych miRNA i implikacji miRNA w terapii raka.

<table><tbody><tr><td>Probówka stożkowa 15 ml</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Thermo Scientific 142475</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 50 ml</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>6x barwnik ładujący DNA</td><td>Real Biotech Corporation</td><td>RD006</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>8-nasadkowy</td><td>pasek Zastosowany Biosystems</td><td>N8010535</td><td>Do syntezy cDNA</td></tr><tr><td>8-probówkowy pasek</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8010580</td><td>Do syntezy cDNA</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma</td><td>A6283-1L</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Agaroza A</td><td>Bio Basic</td><td>D0012</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td>10 000 U/ml</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Bio basic Canada Inc</td><td>AB0028</td><td>25 g</td></tr><tr><td>pasków probówek AriaMx 96</td><td>Agilent Technologies</td><td>401493</td><td>Do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>System AriaMx do PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Agilent Technologies</td><td>G8830A</td><td>qPCR amplifikacja, wykrywanie i analiza danych</td></tr><tr><td>AsiSI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0630</td><td>10 000 jednostek/ml</td></tr><tr><td>komórek CAPAN-1</td><td>ATCC</td><td>HTB-79</td><td></td></tr><tr><td>Kaptur do hodowli komórkowych</td><td>Labtech</td><td></td><td>Model: LCB-1203B-A2</td></tr><tr><td>Komory liczące z ukośnikiem w kształcie litery V</td><td>Paul Marienfeld</td><td>650010</td><td>Licznik komórek</td></tr><tr><td>Bufor CutSmart</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td>10X stężenie</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu DNA</td><td>Bionics</td><td>DN30200</td><td>200 prep</td></tr><tr><td>drabinka DNA</td><td>NIPPON Genetics EUROPE</td><td>MWD1</td><td>1 Kb drabinka</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td>100 jednostek</td></tr><tr><td>System testów reporterowych z podwójną lucyferazy</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td>100 testów</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>26140-079</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>HIT kompetentne komórki</td><td>Real Biotech Corporation (RBC)</td><td>RH617</td><td>Kompetentne komórki</td></tr><tr><td>HPNE komórki</td><td></td><td>ATCC CRL-4023</td><td></td></tr><tr><td>Bulion agarowy LB</td><td>Bio Basic</td><td>SD7003</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td>0,75 mL</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778-075</td><td>0,75 mL</td></tr><tr><td>Luminometr</td><td>Promega</td><td></td><td>Model: E5311</td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>TECAN</td><td></td><td>Infinite F50</td></tr><tr><td>kontrola miRNA naśladuje</td><td>Ambion</td><td>4464058</td><td>5 nmole</td></tr><tr><td>miRNA-107 naśladuje</td><td>Ambion</td><td>4464066</td><td>5 nmole</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>50 prep</td></tr><tr><td>Mupid-2plus (system do elektroforezy)</td><td>TaKaRa</td><td></td><td>Model: AD110</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189</td><td>20 000 jednostek/ml</td></tr><tr><td>Program Oligo Explorer</td><td>GeneLink</td><td></td><td>Do projektowania podkładów</td></tr><tr><td>Nasadki pasków tub optycznych (8x pasek)</td><td>Agilent Technologies</td><td>401425</td><td>Do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>komórek PANC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna</td><td>Gibco</td><td></td><td>14040117 1000 ml</td></tr><tr><td>minipreparat DNA plazmidu S& V zestaw</td><td>Bionics</td><td>DN10200</td><td>200 przygotowanie</td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL DNA polimeraza</td><td>TaKaRa</td><td>R050A</td><td>250 jednostek</td></tr><tr><td>Wytrząsarka</td><td>TECAN</td><td></td><td>Platforma wibracyjna</td></tr><tr><td>Inkubator wstrząsający</td><td>Labtech</td><td></td><td>Model: LSI-3016A</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Sigmaplot 14</td><td>Systat Software Inc</td><td></td><td>Do generowania krzywej dawka-odpowiedź</td></tr><tr><td>Sulforodamina B w proszku</td><td>Sigma</td><td>S1402-5G</td><td>5 g</td></tr><tr><td>SYBR green master mix</td><td>Smobio</td><td>TQ12001805401-3</td><td>Wiążący barwnik fluorescencyjny do</td></tr><tr><td>dsDNA T4 Ligaza DNA</td><td>TaKaRa</td><td>2011A</td><td>25 000 U</td></tr><tr><td>TaqMan master mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4324018</td><td>200 reakcji, bez AmpErase UNG</td></tr><tr><td>Test mikroRNA TaqMan (has-miR-107)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4427975</td><td>ID testu: 000443 (50RT, 150 PCR rxns)</td></tr><tr><td>Test mikroRNA TaqMan (has-miR-301)</td>Identyfikator testu <td>4427975</td> <td>Applied Biosystems</td><td>: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)</td></tr><tr><td>Zestaw TaqMan miR RT</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366597</td><td>1,000 reakcji</td></tr><tr><td>Inkubator Thermo CO2 (BB15)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>37 &deg; C i 5% inkubacji CO2</td></tr><tr><td>Kwas trichlorooctowy</td><td>Sigma</td><td>91228-100G</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Sigma</td><td>T4661-100G</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Woda ultraczysta</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Termocykler Veriti 96 well</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>Do amplifikacji DNA (lub cDNA)</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146</td><td>20 000 jednostek/ml</td></tr></tbody></table>

protokół in vitro do oceny poziomów, funkcji i powiązanych genów docelowych w komórkach nowotworowych

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

MikroRNA (miRNA) to małe regulatorowe RNA, które są znane z modulacji licznych wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych w wielu chorobach, w tym nowotworach. Te małe regulatorowe RNA oddziałują głównie z nieulegającymi translacji regionami 3' (3' UTR) docelowych informacyjnych RNA (mRNA), co ostatecznie prowadzi do zahamowania procesów dekodowania mRNA i zwiększenia docelowych degradacji mRNA. W oparciu o poziomy ekspresji i funkcje wewnątrzkomórkowe, miRNA mogą służyć jako czynniki regulacyjne onkogennych i supresyjnych nowotworów mRNA. Identyfikacja bona fide docelowych genów miRNA wśród setek, a nawet tysięcy obliczeniowo przewidywanych celów jest kluczowym krokiem w kierunku rozpoznania ról i podstawowych mechanizmów molekularnych miRNA będącego przedmiotem zainteresowania. Dostępne są różne programy do przewidywania celu miRNA w celu wyszukiwania możliwych interakcji miRNA-mRNA. Jednak najtrudniejszym pytaniem jest to, jak zweryfikować bezpośrednie geny docelowe interesującego nas miRNA. Protokół ten opisuje powtarzalną strategię kluczowych metod identyfikacji celów miRNA związanych z funkcją miRNA. Protokół ten przedstawia praktyczny przewodnik po procedurach krok po kroku w celu odkrycia poziomów miRNA, funkcji i powiązanych docelowych mRNA przy użyciu opartej na sondzie reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR), testu sulforodaminy B (SRB) po transfekcji mimicznej miRNA, generowaniu krzywej dawka-odpowiedź i teście lucyferazy wraz z klonowaniem 3' UTR genu, co jest niezbędne do prawidłowego zrozumienia ról poszczególnych miRNA.

Pomyślne i dokładne potwierdzenie poziomów miRNA jest istotne dla interpretacji danych, na podstawie których możliwa jest klasyfikacja miRNA w oparciu o ich przewidywaną rolę w rozwoju i progresji choroby. Poziomy miRNA-107 i miRNA-301 zmierzono w trzech liniach komórkowych trzustki przy użyciu ilościowej PCR z zastosowaniem sond. Synteza cDNA zarówno specyficznego miRNA, jak i genu referencyjnego w jednej reakcji może zwiększyć powtarzalność danych. PANC-1 i CAPAN-1 to ludzkie linie komórkowe gruczolakoraka przewodowego...

Ten protokół wykorzystuje opartą na sondzie reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR), test sulforodaminy B (SRB), klonowanie 3' nietranslowanych regionów (3' UTR) oraz test lucyferazy w celu weryfikacji docelowych genów interesującego miRNA i zrozumienia funkcji miRNA.

Protokół in vitro do oceny poziomów, funkcji i powiązanych genów docelowych w komórkach nowotworowych

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Aby uzyskać dostęp do neuronalnych interakcji docelowych mikroRNA z funkcjami mikroRNA, kluczowe znaczenie ma zrozumienie, w jaki sposób mikroRNA regulują różne procesy biologiczne zarówno w stanie zdrowym, jak i chorym. Protokół ten opisuje strategię rozmnażania w celu identyfikacji celów mikroRNA i funkcjonalnych mikroRNA, ponieważ walidacja bezpośredniego celu mikroRNA jest wyzwaniem. Nasz protokół może dostarczyć informacji na temat funkcji poszczególnych mikroRNA i implikacji mikroRNA w terapii raka.Obliczanie połowy maksymalnego stężenia hamującego jest ważną metodą, nie tylko dla badań mikroRNA, ale także dla skutecznej oceny innych leków przeciwnowotworowych. Nasz protokół będzie pomocny dla nowych badaczy, ponieważ opisaliśmy podstawową metodę zrozumienia poziomu mikroRNA w komórce. Aby rozpocząć protokół, policz komórki za pomocą licznika komórek.Umieść komórki w płytce 96-dołkowej. Następnego dnia przygotuj zestaw mieszanin do transfekcji w celu transfekcji komórek w kilku końcowych stężeniach mimiki kontrolnej mikroRNA i mimiki mikroRNA-107. Z zapasu 25 mikromolowych mikroRNA naśladujących kontrolę lub naśladujących mikroRNA-107, rozcieńczyć i dodać kontrolny naśladujący lub naśladujący mikroRNA-107 w zredukowanej pożywce surowicy wraz z odczynnikiem do transfekcji w probówkach do mikrowirówek.Delikatnie wymieszać mieszaniny zawierające oligonukleoty za pomocą mikropipety. Po 10 minutach inkubacji w kapturze do hodowli komórkowych delikatnie wymieszaj mieszaniny zawierające oligonukleoty, a następnie dodaj 50 mikrolitrów mieszanin do każdej studzienki. Przechowywać transfekowane komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych.Ostrożnie zassać pożywkę do hodowli komórkowych w każdym dołku płytki i niezwłocznie wlać 100 mikrolitrów 10% kwasu trójchlorooctowego lub TCA do każdej studzienki. Trzymaj płytkę zawierającą 10% TCA w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie umyj talerz kilka razy, zanurzając go w wannie z wodą z kranu.Usuń nadmiar wody z wnętrza studzienek, stukając w płytkę, aż nie będzie już wody, i wysusz płytkę. Odpipetować 50 mikrolitrów 0,4% roztworu SRB do każdej studzienki, w tym do studzienek ślepych. Delikatnie potrząsaj płytką, aż 0,4% roztwór SRB równomiernie pokryje dno studzienek.Następnie inkubuj płytkę przez 40 do 60 minut. Po inkubacji przemyć płytkę 1% kwasem octowym, aż do całkowitego zmycia niezwiązanego barwnika. Odpipetować 100 mikrolitrów 10-milimolowego roztworu zasadowego Tris do odpowiednich studzienek, w tym studzienek ślepych.Trzymaj talerz na shakerze przez 10 minut. Zmierz absorbancję przy 492 nanometrach. Obliczyć procentowy udział średniej absorbancji i odchylenie standardowe każdej grupy, korzystając z wartości absorbancji testu SRB.Zaimportuj surowe dane, w tym stężenia po poddaniu działaniu substancji, średnią absorbancję i odchylenie standardowe, do oprogramowania, wyrównując dane w pionie. Kliknij kartę Create Graph (Utwórz wykres) i wybierz opcję Simple Scatter Error Bars (Proste słupki błędów punktowych). Wybierz kolumny arkusza jako wartości symbolu, a następnie kliknij przycisk Dalej.W panelu Format danych wybierz pary X-Y i kliknij przycisk Dalej. Zaznacz odpowiednie kolumny danych w panelu Wybierz dane. Kliknij przycisk Zakończ, aby utworzyć wykres.Kliknij dwukrotnie oś X, aby zmodyfikować typ skali w skalowaniu osi. Zmień typ skali z liniowej na logarytmiczną. Zmodyfikuj numer zakresu początkowego i końcowego odpowiednio na 0,01 i 200.Kliknij prawym przyciskiem myszy dowolny wykres punktowy, wybierz opcję Dopasowanie krzywej i przejdź do podkategorii Zdefiniowane przez użytkownika. Wybrać krzywą dawka-odpowiedź. Kliknij następne przyciski, a następnie kliknij przycisk Zakończ.Przejdź do karty raportu, a następnie sprawdź wartości n, k i R. Uruchom PCR zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie przejdź do podwójnego trawienia, łącząc mieszaniny reakcyjne, w tym enzymy restrykcyjne Exo1 i Not1 w probówce.Inkubuj mieszaniny przez trzy do czterech godzin w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Podwójnie strawione produkty umieszczono na 1% żelu agarozowym. Następnie przetnij pasma w świetle UV.Oczyść podwójnie strawione produkty PCR i wektory lucyferazy z wyciętych prążków. Kontynuuj ligację produktów PCR do wektorów lucyferazy, przygotowując 20 mikrolitrów mieszanin reakcji ligacji, w tym ligazy DNA. Krótko odwirować probówkę przez 10 do 15 sekund.Inkubować ligację w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez noc za pomocą termocyklera. Następnego dnia wykonaj transformację, dodając mieszaniny ligacyjne do probówki zawierającej kompetentne komórki. Delikatnie postukaj w tubkę i trzymaj ją na lodzie przez 20 minut.Szybko i delikatnie przenieś rurkę do bloku grzewczego o temperaturze 42 stopni Celsjusza na 30 sekund do jednej minuty. Po szoku cieplnym umieść probówkę na lodzie na 20 minut. Rozłóż kompetentne komórki na płytce agarowej LB.Hoduj kompetentne komórki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia wybierz pojedynczą kolonię i ponownie zawieś E. coli w jednej z 8-paskowych probówek zawierających ultraczystą wodę i powtórz ten krok, aby ponownie zawiesić E. coli od czterech do ośmiu losowo wybranych kolonii. Przenieś 25 mikrolitrów zawiesiny E. coli do innego zestawu 8-paskowych probówek.Wykonaj PCR kolonii przy użyciu zawiesiny E. coli. Przygotuj test lucyferazy na 24-dołkowej płytce. Dodaj od jednej do dwóch razy dziesięć do czterech komórek w pożywce do hodowli komórkowych o pojemności 500 mikrolitrów dla każdej studzienki.Po całonocnej inkubacji należy przetransfekować 50 nanogramów wektorów lucyferazy do komórek z mimikiem kontrolnym lub specyficznym naśladowcą mikroRNA za pomocą odczynnika do transfekcji. Następnego dnia dwukrotnie umyj wnętrze studzienek solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Nałożyć 200 mikrolitrów odczynnika do lizy do studzienek i w wystarczającym stopniu przeprowadzić lizę komórek przed pomiarem aktywności lucyferazy.Utrzymuj talerz w potrząsaniu przez co najmniej 15 minut. Przenieś od pięciu do 10 mikrolitrów lizatu komórkowego do nowej probówki, dodaj 100 mikrolitrów odczynnika i natychmiast wymieszaj roztwór przez pipetowanie. Następnie odczytaj aktywność lucyferazy świetlika za pomocą iluminometru przez 10 do 15 sekund.Dodaj 100 mikrolitrów odczynnika dwa do tej samej probówki, a następnie wymieszaj przez dwukrotne pipetowanie. Na koniec odczytaj aktywność lucyferazy renilla przez 10 do 15 sekund za pomocą iluminometru. RTPCR wykazuje znaczną redukcję komórek mikroRNA-107 i PANC-1 oraz CAPAN-1 w porównaniu z komórkami HPNE.Poziomy mikroRNA-301 były znacznie podwyższone w komórkach PANC-1 i CAPAN-1 w porównaniu z komórkami HPNE. Test SRB w tym badaniu wyraźnie pokazuje, że proliferacja komórek PANC-1 zmniejszyła się po transfekcji mimicznej mikroRNA-107. Badania przesiewowe 11 potencjalnych przewidywanych celów mikroRNA-107 wyraźnie pokazują, że tylko synukleina gamma lub SNCG, pozytywny regulator wzrostu komórek nowotworowych, bezpośrednio oddziałuje z komórkami mikroRNA-107 i PANC-1, co wskazuje, że mikroRNA-107 może negatywnie regulować proliferację komórek PANC-1 poprzez modulację ekspresji SNCG.Testy proliferacji dorosłych komórek, które wykorzystują jednostkę opartą na tetra hydroleum i CFSE, mają zastosowanie do badań przesiewowych efektu takich jak mimiki mikroRNA, w zależności od typów komórek. W oparciu o eksperymentalnie zweryfikowaną funkcję mikroRNA, wymagany jest systematyczny przegląd bazy danych i programu przewidywania celów, aby zawęzić listę potencjalnych celów przed testami lucyferazy. Do oceny skuteczności połączenia mikroRNA z lekami przeciwnowotworowymi korzystne jest obliczenie skorygowanych wartości IC w oparciu o nasz protokół oceny indeksu kombinacji.

an-vitro-protocol-for-evaluating-microrna-levels-functions-associated

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Biblioteka Target ID jest opartą na plazmidach, genomową kolekcją klonowanego cDNA, służącą do identyfikacji celów miRNA. W niniejszym materiale prezentujemy sposób jej użycia i zastosowania.

Przesiew genomowy w celu identyfikacji celów miRNA z wykorzystaniem biblioteki MISSION Target ID

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) jest szybką i czułą metodą badania poziomów ekspresji różnych cząsteczek mikroRNA (miRNA) w próbkach nowotworowych. Zastosowanie tej metody pozwala na amplifikację, kwantyfikację i analizę ekspresji setek różnych cząsteczek miRNA z tej samej matrycy cDNA.

Wykrywanie mikroRNA w guzach prostaty za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Ten film pokazuje dostarczanie in vivo inhibitorów miRNA jako środków terapeutycznych przeciwko wzrostowi guza w ortotopowych modelach mysich. Donowotworowe podawanie syntetycznych inhibitorów miRNA lub antagomiR pozwala im wiązać i hamować endogenne miRNA, powodując w ten sposób regulację mRNA w górę i zahamowanie wzrostu guza.

Modelowanie leczenia wewnątrznowotworowego inhibitorami miRNA: metoda analizy wpływu inhibitorów miRNA na wzrost guza w modelu mysim

Sygnalizacja molekularna zarówno przez estrogen, jak i mikroRNA jest kluczowa dla rozwoju i wzrostu raka piersi. Estrogen aktywuje receptory estrogenowe, które są czynnikami transkrypcyjnymi. Wiele czynników transkrypcyjnych może regulować ekspresję mikroRNA, a mikroRNA regulowane estrogenem można profilować przy użyciu różnych technik na dużą skalę.

Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania ekspresji miRNA w próbkach pobranych od pacjentów z rakiem piersi za pomocą hybrydyzacji miRNA in situ.

Kliniczno-patologiczna analiza ekspresji miRNA w tkankach raka piersi przy użyciu hybrydyzacji miRNA in situ

Ten raport opisuje szybką i niezawodną metodę walidacji celów mRNA komórkowych miRNA. Metoda wykorzystuje syntetyczne biotynylowane miRNA oparte na zablokowanych kwasach nukleinowych (LNA) do wychwytywania docelowego mRNA. Następnie kulki magnetyczne pokryte streptawidyną są wykorzystywane do ściągania docelowego mRNA w celu ilościowego oznaczania w reakcji łańcuchowej polimerazy qPCR.

Test pulldown na bazie biotyny do walidacji celów mRNA komórkowych miRNA

Przedstawiamy protokół do oceny poziomów ekspresji krążących mikroRNA (miRNA) w próbkach osocza od pacjentów z rakiem. W szczególności wykorzystaliśmy dostępny na rynku zestaw do cyrkulacji ekstrakcji miRNA i odwrotnej transkrypcji. Na koniec przeanalizowaliśmy panel 24 wybranych miRNA przy użyciu niestandardowych płytek sondy wstępnie wykrytej w czasie rzeczywistym.

Wykrywanie niestandardowego panelu krążącego mikroRNA u pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego

Ten protokół opisuje mysie modele ksenoprzeszczepu i ortotopowego nowotworu ludzkiej tarczycy jako platformę do testowania terapii inhibitorami opartymi na mikroRNA. Takie podejście idealnie nadaje się do badania funkcji niekodujących RNA i ich potencjału jako nowych celów terapeutycznych.

Hamowanie in vivo mikroRNA w celu zmniejszenia wzrostu guza u myszy

terapia miRNA ma znaczący potencjał w regulowaniu progresji raka. Zademonstrowano tu podejścia analityczne stosowane do identyfikacji aktywności kombinatorycznego leczenia miRNA w zatrzymywaniu cyklu komórkowego i angiogenezie.

Analiza skojarzonych zabiegów miRNA w celu regulacji cyklu komórkowego i angiogenezy

Opisany tutaj jest protokół charakteryzujący moduły biologicznie synergicznych miRNA i ich łączenie w krótkie transgeny, co pozwala na jednoczesną nadekspresję dla zastosowań terapii genowej.

Charakterystyka funkcjonalnie powiązanych miRNA w glejaku i ich inżynieria w sztuczne klastry do terapii genowej

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Poznaj metody identyfikacji i walidacji celów mikroRNA w komórkach nowotworowych, w tym transfekcję, test SRB oraz analizę reporterową lucyferazy. Protokół umożliwia ocenę funkcji miRNA w proliferacji komórek rakowych.

Protokół in vitro do oceny poziomów, funkcji i powiązanych genów docelowych w komórkach nowotworowych

Przeglądaj więcej filmów