Protokół in vitro do oceny poziomów, funkcji i powiązanych genów docelowych w komórkach nowotworowych

Aby uzyskać dostęp do neuronalnych interakcji docelowych mikroRNA z funkcjami mikroRNA, kluczowe znaczenie ma zrozumienie, w jaki sposób mikroRNA regulują różne procesy biologiczne zarówno w stanie zdrowym, jak i chorym. Protokół ten opisuje strategię rozmnażania w celu identyfikacji celów mikroRNA i funkcjonalnych mikroRNA, ponieważ walidacja bezpośredniego celu mikroRNA jest wyzwaniem. Nasz protokół może dostarczyć informacji na temat funkcji poszczególnych mikroRNA i implikacji mikroRNA w terapii raka.

Obliczanie połowy maksymalnego stężenia hamującego jest ważną metodą, nie tylko dla badań mikroRNA, ale także dla skutecznej oceny innych leków przeciwnowotworowych. Nasz protokół będzie pomocny dla nowych badaczy, ponieważ opisaliśmy podstawową metodę zrozumienia poziomu mikroRNA w komórce. Aby rozpocząć protokół, policz komórki za pomocą licznika komórek.

Umieść komórki w płytce 96-dołkowej. Następnego dnia przygotuj zestaw mieszanin do transfekcji w celu transfekcji komórek w kilku końcowych stężeniach mimiki kontrolnej mikroRNA i mimiki mikroRNA-107. Z zapasu 25 mikromolowych mikroRNA naśladujących kontrolę lub naśladujących mikroRNA-107, rozcieńczyć i dodać kontrolny naśladujący lub naśladujący mikroRNA-107 w zredukowanej pożywce surowicy wraz z odczynnikiem do transfekcji w probówkach do mikrowirówek.

Delikatnie wymieszać mieszaniny zawierające oligonukleoty za pomocą mikropipety. Po 10 minutach inkubacji w kapturze do hodowli komórkowych delikatnie wymieszaj mieszaniny zawierające oligonukleoty, a następnie dodaj 50 mikrolitrów mieszanin do każdej studzienki. Przechowywać transfekowane komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Ostrożnie zassać pożywkę do hodowli komórkowych w każdym dołku płytki i niezwłocznie wlać 100 mikrolitrów 10% kwasu trójchlorooctowego lub TCA do każdej studzienki. Trzymaj płytkę zawierającą 10% TCA w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie umyj talerz kilka razy, zanurzając go w wannie z wodą z kranu.

Usuń nadmiar wody z wnętrza studzienek, stukając w płytkę, aż nie będzie już wody, i wysusz płytkę. Odpipetować 50 mikrolitrów 0,4% roztworu SRB do każdej studzienki, w tym do studzienek ślepych. Delikatnie potrząsaj płytką, aż 0,4% roztwór SRB równomiernie pokryje dno studzienek.

Następnie inkubuj płytkę przez 40 do 60 minut. Po inkubacji przemyć płytkę 1% kwasem octowym, aż do całkowitego zmycia niezwiązanego barwnika. Odpipetować 100 mikrolitrów 10-milimolowego roztworu zasadowego Tris do odpowiednich studzienek, w tym studzienek ślepych.

Trzymaj talerz na shakerze przez 10 minut. Zmierz absorbancję przy 492 nanometrach. Obliczyć procentowy udział średniej absorbancji i odchylenie standardowe każdej grupy, korzystając z wartości absorbancji testu SRB.

Zaimportuj surowe dane, w tym stężenia po poddaniu działaniu substancji, średnią absorbancję i odchylenie standardowe, do oprogramowania, wyrównując dane w pionie. Kliknij kartę Create Graph (Utwórz wykres) i wybierz opcję Simple Scatter Error Bars (Proste słupki błędów punktowych). Wybierz kolumny arkusza jako wartości symbolu, a następnie kliknij przycisk Dalej.

W panelu Format danych wybierz pary X-Y i kliknij przycisk Dalej. Zaznacz odpowiednie kolumny danych w panelu Wybierz dane. Kliknij przycisk Zakończ, aby utworzyć wykres.

Kliknij dwukrotnie oś X, aby zmodyfikować typ skali w skalowaniu osi. Zmień typ skali z liniowej na logarytmiczną. Zmodyfikuj numer zakresu początkowego i końcowego odpowiednio na 0,01 i 200.

Kliknij prawym przyciskiem myszy dowolny wykres punktowy, wybierz opcję Dopasowanie krzywej i przejdź do podkategorii Zdefiniowane przez użytkownika. Wybrać krzywą dawka-odpowiedź. Kliknij następne przyciski, a następnie kliknij przycisk Zakończ.

Przejdź do karty raportu, a następnie sprawdź wartości n, k i R. Uruchom PCR zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie przejdź do podwójnego trawienia, łącząc mieszaniny reakcyjne, w tym enzymy restrykcyjne Exo1 i Not1 w probówce.

Inkubuj mieszaniny przez trzy do czterech godzin w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Podwójnie strawione produkty umieszczono na 1% żelu agarozowym. Następnie przetnij pasma w świetle UV.

Oczyść podwójnie strawione produkty PCR i wektory lucyferazy z wyciętych prążków. Kontynuuj ligację produktów PCR do wektorów lucyferazy, przygotowując 20 mikrolitrów mieszanin reakcji ligacji, w tym ligazy DNA. Krótko odwirować probówkę przez 10 do 15 sekund.

Inkubować ligację w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez noc za pomocą termocyklera. Następnego dnia wykonaj transformację, dodając mieszaniny ligacyjne do probówki zawierającej kompetentne komórki. Delikatnie postukaj w tubkę i trzymaj ją na lodzie przez 20 minut.

Szybko i delikatnie przenieś rurkę do bloku grzewczego o temperaturze 42 stopni Celsjusza na 30 sekund do jednej minuty. Po szoku cieplnym umieść probówkę na lodzie na 20 minut. Rozłóż kompetentne komórki na płytce agarowej LB.

Hoduj kompetentne komórki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia wybierz pojedynczą kolonię i ponownie zawieś E. coli w jednej z 8-paskowych probówek zawierających ultraczystą wodę i powtórz ten krok, aby ponownie zawiesić E. coli od czterech do ośmiu losowo wybranych kolonii. Przenieś 25 mikrolitrów zawiesiny E. coli do innego zestawu 8-paskowych probówek.

Wykonaj PCR kolonii przy użyciu zawiesiny E. coli. Przygotuj test lucyferazy na 24-dołkowej płytce. Dodaj od jednej do dwóch razy dziesięć do czterech komórek w pożywce do hodowli komórkowych o pojemności 500 mikrolitrów dla każdej studzienki.

Po całonocnej inkubacji należy przetransfekować 50 nanogramów wektorów lucyferazy do komórek z mimikiem kontrolnym lub specyficznym naśladowcą mikroRNA za pomocą odczynnika do transfekcji. Następnego dnia dwukrotnie umyj wnętrze studzienek solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Nałożyć 200 mikrolitrów odczynnika do lizy do studzienek i w wystarczającym stopniu przeprowadzić lizę komórek przed pomiarem aktywności lucyferazy.

Utrzymuj talerz w potrząsaniu przez co najmniej 15 minut. Przenieś od pięciu do 10 mikrolitrów lizatu komórkowego do nowej probówki, dodaj 100 mikrolitrów odczynnika i natychmiast wymieszaj roztwór przez pipetowanie. Następnie odczytaj aktywność lucyferazy świetlika za pomocą iluminometru przez 10 do 15 sekund.

Dodaj 100 mikrolitrów odczynnika dwa do tej samej probówki, a następnie wymieszaj przez dwukrotne pipetowanie. Na koniec odczytaj aktywność lucyferazy renilla przez 10 do 15 sekund za pomocą iluminometru. RTPCR wykazuje znaczną redukcję komórek mikroRNA-107 i PANC-1 oraz CAPAN-1 w porównaniu z komórkami HPNE.

Poziomy mikroRNA-301 były znacznie podwyższone w komórkach PANC-1 i CAPAN-1 w porównaniu z komórkami HPNE. Test SRB w tym badaniu wyraźnie pokazuje, że proliferacja komórek PANC-1 zmniejszyła się po transfekcji mimicznej mikroRNA-107. Badania przesiewowe 11 potencjalnych przewidywanych celów mikroRNA-107 wyraźnie pokazują, że tylko synukleina gamma lub SNCG, pozytywny regulator wzrostu komórek nowotworowych, bezpośrednio oddziałuje z komórkami mikroRNA-107 i PANC-1, co wskazuje, że mikroRNA-107 może negatywnie regulować proliferację komórek PANC-1 poprzez modulację ekspresji SNCG.

Testy proliferacji dorosłych komórek, które wykorzystują jednostkę opartą na tetra hydroleum i CFSE, mają zastosowanie do badań przesiewowych efektu takich jak mimiki mikroRNA, w zależności od typów komórek. W oparciu o eksperymentalnie zweryfikowaną funkcję mikroRNA, wymagany jest systematyczny przegląd bazy danych i programu przewidywania celów, aby zawęzić listę potencjalnych celów przed testami lucyferazy. Do oceny skuteczności połączenia mikroRNA z lekami przeciwnowotworowymi korzystne jest obliczenie skorygowanych wartości IC w oparciu o nasz protokół oceny indeksu kombinacji.