Cyfrowy indeks konkurencyjności oparty na PCR do wysokoprzepustowej analizy sprawności w Salmonelli
13 maja 2019
To oparte na molekularnym podejściu do określania sprawności bakterii umożliwia precyzyjne i dokładne wykrywanie mikroorganizmów za pomocą unikalnych kodów kreskowych genomowego DNA, które są określane ilościowo za pomocą cyfrowego PCR. W protokole opisano obliczanie indeksu konkurencyjnego dla szczepów Salmonella; Technologia ta jest jednak łatwa do zaadaptowania do protokołów wymagających bezwzględnej kwantyfikacji każdego genetycznie plastycznego organizmu.
Technika ta umożliwia dokładne i precyzyjne oznaczanie ilościowe mikroorganizmów z mieszanej populacji bardzo podobnych szczepów przy użyciu szybkich i wysokowydajnych technik molekularnych. Ostatecznie, umożliwiając porównanie dopasowania między szczepami. Możliwość jednoczesnej oceny wielu szczepów w jednej puli znacznie zmniejsza zmienność między osobami zdrowymi lub między organizmami, ponieważ wszystkie szczepy są narażone na dokładnie te same warunki.
Zdolność adaptacyjna tej techniki pozwala na jej zastosowanie w przypadku prawie każdego genetycznie plastycznego organizmu i prawie każdego projektu eksperymentalnego, który wymaga dokładnej kwantyfikacji drobnoustrojów. Rozpocznij tę procedurę od inżynierii markerów genetycznych na chromosomach bakteryjnych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Utwórz pulę genomowego DNA, która zawiera każdy kod kreskowy z wyjątkiem jednego.
Użyj tej puli jako rozcieńczalnika do wykonania serii rozcieńczeń z genomowym DNA zawierającym pojedynczy pozostały kod kreskowy. Przygotować reakcje do cyfrowego PCR w dwóch egzemplarzach zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi stosowania cyfrowego supermiksu PCR przeznaczonego do chemii opartej na sondzie. Użyj zbiorczego genomowego DNA jako matrycowego DNA.
Dodaj również sondę startera 20 X Master Mix zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przygotować powtórzone reakcje kontrolne do cyfrowego PCR zgodnie z zaleceniami producenta. Reakcje kontrolne dla każdej mieszaniny sondy muszą składać się z kontroli bez matrycy, kontroli ujemnych i kontroli pozytywnych.
Powtórz te kroki, aby utworzyć cyfrowe reakcje PCR dla każdej próbki genomowego DNA z kodem kreskowym. Generuj kropelki dla każdego warunku reakcji za pomocą generatora kropel, zgodnie z instrukcjami producenta. Przenieś nowo utworzone kropelki do odpowiedniej płytki 96-dołkowej.
Użyj końcówek do pipet o pojemności 200 mikrolitrów na pipecie wielokanałowej o pojemności od 5 do 50 mikrolitrów. Po wytworzeniu i przeniesieniu wszystkich kropel należy uszczelnić płytkę za pomocą zgrzewarki do płyt foliowych. Użyj zalecanego przez producenta termocyklera, aby wykonać warunki jazdy na rowerze.
Podczas wykonywania termocyklingu zaprogramuj oprogramowanie do analizy danych z informacjami o konfiguracji płytki, takimi jak nazwa próbki, typ eksperymentu i użyty Supermix. Uwzględnij również nazwę celu 1 i typ celu 1, a także nazwę celu 2 i typ celu 2. Po zakończeniu termocyklingu przenieś zakończone reakcje do czytnika kropelek i rozpocznij proces odczytu, zgodnie z instrukcjami producenta.
Po odczytaniu wszystkich studzienek i zakończeniu przebiegu otwórz plik danych QLP za pomocą oprogramowania do analizy danych. Wybierz wszystkie studzienki, które wykorzystują tę samą sondę startera Mastermix. Na karcie Kropelki sprawdź liczbę kropel analizowanych w każdym dołku, w tym zarówno kropli dodatnich, jak i ujemnych.
Wyklucz z analizy każdą studzienkę, która ma mniej niż 10 000 kropel ogółem. Przejdź do zakładki Amplituda 1D i zbadaj amplitudy dodatnich i ujemnych kropel. Upewnij się, że składają się z 2 odrębnych populacji.
W oprogramowaniu użyj funkcji progowania, aby odciąć się między dodatnimi i ujemnymi kroplami dla każdej użytej sondy. Po zastosowaniu odpowiednich progów do wszystkich studzienek, oprogramowanie obliczy liczbę kopii DNA w każdej reakcji. Eksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego, aby ułatwić dalszą analizę.
Korzystając z tych wartości, oblicz początkową liczbę kopii każdego unikalnego genomowego kodu kreskowego w próbce. Określić średni odsetek wyników fałszywie dodatnich z ujemnych reakcji kontrolnych i odjąć tę wartość od wartości uzyskanych w reakcjach eksperymentalnych. W razie potrzeby pomnóż wartości w oparciu o rozcieńczenia, które zostały wykonane podczas ustawiania każdego eksperymentu.
Teraz określ względną przydatność organizmu, obliczając indeks konkurencyjności lub zniesiony indeks konkurencyjności na podstawie cyfrowej kwantyfikacji szczepu z kodem kreskowym opartej na PCR. Wykonaj ten krok dla każdego szczepu z kodem kreskowym we wszystkich punktach czasowych. Genomowe DNA zawierające kod kreskowy AA rozcieńczono na tle wszystkich innych genomowych DNA z kodem kreskowym.
Kanał 1 reprezentuje sondę FAM dla kodu kreskowego AA, podczas gdy kanał 2 reprezentuje sondę HEX dla kodu kreskowego AO. Wyniki każdej sondy są prezentowane zarówno jako amplituda fluorescencji pojedynczej kropli, jak i histogram reprezentujący częstotliwość intensywności fluorescencji wszystkich kropel w wybranych studzienkach. Dla każdego warunku dodatnie i ujemne kropelki powinny tworzyć 2 odrębne populacje.
Populacje należy rozdzielić za pomocą funkcji progów w celu zdefiniowania dodatnich i ujemnych kropel. Wartości progowe będą się różnić w zależności od użytych sond, ale wszystkie studnie, które wykorzystują tę samą mieszankę sond, powinny mieć identyczne progi. W przypadku AA, który został rozcieńczony, histogram wydaje się przedstawiać tylko pojedynczą populację, ponieważ dodatnie kropelki są znacznie liczniejsze niż ujemne kropelki.
Jednak 2 odrębne populacje są nadal widoczne po zbadaniu amplitudy fluorescencji kropel w lewych panelach. W miarę rozcieńczania genomowego DNA z kodem kreskowym AA nastąpił spadek liczby dodatnich kropel, podczas gdy liczba dodatnich kropelek AO pozostaje stała. Po zastosowaniu odpowiednich progów do wszystkich studzienek, oprogramowanie obliczy liczbę kopii DNA w każdej reakcji.
Jeśli rutynowo wykonujesz PCR w ramach swoich badań, możesz zastosować tę technikę, aby ocenić sprawność swojego organizmu modelowego. Procedura ta jest zwykle stosowana do określania końcowych wyników eksperymentów poprzedzających. Jego prawdziwą użytecznością jest promowanie łatwości i wszechstronności we wszelkich eksperymentach, które opierają się na kwantyfikacji bakterii.
Używamy tej techniki do oceny dopasowania salmonelli w mysim modelu infekcji. Dodatkowo technika ta jest dostosowywana do stosowania z innymi mikroorganizmami chorobotwórczymi w naszym laboratorium.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To podejście oparte na molekularnej podstawie umożliwia dokładne ilościowe określenie mikroorganizmów z mieszanych populacji podobnych szczepów przy użyciu genomowych kodów kreskowych DNA. Protokół umożliwia porównanie sprawności pomiędzy szczepami i jest przystosowywalny do różnych genetycznie plastycznych organizmów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Biologia molekularna
- Inżynieria genetyczna
Tło
- Ilościowe określenie mikroorganizmów jest kluczowe dla zrozumienia konkurencyjnej sprawności.
- Tradycyjne metody mogą wprowadzać zmienność między szczepami.
- Cyfrowa PCR oferuje rozwiązanie wysokowydajne dla dokładnego pomiaru.
- Genomowe kodowanie DNA umożliwia unikalną identyfikację szczepów.
Cel badania
- Opracowanie metody precyzyjnego ilościowego określenia sprawności bakterii.
- Zmniejszenie zmienności w warunkach eksperymentalnych między szczepami.
- Dostarczenie elastycznego protokołu przydatnego w różnych projektach eksperymentalnych.
Zastosowane metody
- Inżynieria markerów genetycznych na chromosomach bakterii.
- Tworzenie puli genomowego DNA z unikalnymi kodami kreskowymi.
- Wykorzystanie cyfrowej PCR do ilościowego określenia mikroorganizmów.
- Ocenianie indeksów konkurencji między różnymi szczepami Salmonella.
Główne wyniki
- Osiągnięto dokładne ilościowe określenie mikroorganizmów.
- Zaobserwowano zmniejszenie zmienności w porównaniach sprawności.
- Metoda okazała się przystosowana do różnych genetycznie plastycznych organizmów.
- Wykazano wysokowydajne możliwości.
Wnioski
- Ta technika zwiększa dokładność ilościowego określenia mikroorganizmów.
- Umożliwia sensowne porównania sprawności pomiędzy szczepami.
- Protokół jest wszechstronny dla różnych potrzeb eksperymentalnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This digital PCR-based competitive index method addresses a key bottleneck in bacterial fitness assessment by enabling high-throughput, simultaneous quantification of multiple strains in a single competitive assay. By reducing well-to-well variability and eliminating dependence on phenotypic markers, the approach enhances predictive confidence in target validation and lead identification workflows. Its adaptability across genetically malleable organisms supports translational continuity from discovery through preclinical de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying fitness differences between wild-type and mutant strains under identical conditions.
- Operational Value: Reduces experimental variability by pooling strains, minimizing well-to-well and organism-to-organism differences.
- Predictive Value: Provides sensitive detection of both high- and low-fitness variants, supporting accurate strain prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, barcode-specific readouts that enable precise comparison of microbial abundance across conditions.
- Operational Value: Uses digital PCR to deliver absolute quantification with high sensitivity and precision across a wide dynamic range.
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated barcoded strain pools for reproducible, high-throughput fitness screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports extrapolation from in vitro competition to in vivo models, as demonstrated in murine Salmonella infection studies.
- Mechanistic De-risking: Allows fitness assessment in complex biological contexts, reducing uncertainty in virulence and pathogenesis studies.
- Scalability: Easily adaptable to other pathogens and experimental designs requiring absolute microbial quantification.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling fitness assessment after strain engineering and before lead optimization, particularly in antimicrobial and virulence target validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring competitive fitness of isogenic strains in controlled environments.
- Screening: Enables multiplexed fitness profiling of strain libraries through barcode-based quantification.
- Analytics: Generates absolute DNA copy number outputs that feed into competitive index calculations for fitness ranking.
- Translational Research: Connects in vitro fitness data to in vivo pathogenesis models, as shown in murine infection applications.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genomic barcoding platform applicable across multiple bacterial targets and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in fitness measurements by reducing technical noise and marker limitations.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput through standardized digital PCR workflows and pooled strain formats.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by delivering reliable fitness data with fewer replicates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains based on quantitative fitness profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic engineering to chromosomally integrate unique DNA barcodes without affecting fitness.
- Dependent on access to digital PCR instrumentation and compatible supermix for probe-based detection.
- Necessitates standardized thresholding and droplet analysis protocols across wells and experiments.
- Requires careful dilution series design and false positive rate subtraction from control reactions.
- Adaptation to new organisms depends on chromosomal modification efficiency and barcode insertion site neutrality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:43
Validate the Sensitivity and Specificity of Each Primer-probe Set for Each Genomic Barcode Using Digital PCR
3:09
Analyze Digital PCR Data and Calculate Absolute Copy Numbers
4:52
Results: Representative Digital PCR Results of Diluted AA-barcoded gDNA
6:28
Conclusion
