Name: Cyfrowy indeks konkurencyjności oparty na PCR do wysokoprzepustowej analizy sprawności w Salmonelli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Poznaj cyfrowy indeks konkurencyjności oparty na PCR do precyzyjnej analizy sprawności bakterii Salmonella. Ta metoda umożliwia jednoczesne badanie wielu szczepów w jednej próbce, redukując zmienność między próbkami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez George F. Haddix President's Faculty Research Fund oraz National Institute of General Medical Science of the National Institutes of Health (NIH) pod numerem nagrody GM103427. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

<ol><li>Beuzón, C. R., Holden, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+mixed+infections+with+Salmonella+strains+to+study+virulence+genes+and+their+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo.</a> Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).</li>
<li>Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+mutations+in+invA+and+lpfC+on+the+ability+of+Salmonella+typhimurium+to+cause+murine+typhoid%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid.</a> Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).</li>
<li>Vital, M., Hammes, F., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+of+Escherichia+coli+O157+with+a+drinking+water+bacterial+community+at+low+nutrient+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations.</a> Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).</li>
<li>Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+combining+immunofluorescence+and+flow+cytometry+for+improved+understanding+of+competitive+interactions+between+lactic+acid+bacteria+%28LAB%29+and+methicillin-resistant+S.+aureus+%28MRSA%29+in+mixed+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture.</a> Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).</li>
<li>Becker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Salmonella+metabolism+limits+possibilities+for+new+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials.</a> Nature. 440 (7082), 303(2006).</li>
<li>Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+cost+of+the+green+fluorescent+protein+in+gastrointestinal+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria.</a> Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).</li>
<li>Santiviago, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+pools+of+targeted+Salmonella+deletion+mutants+identifies+novel+genes+affecting+fitness+during+competitive+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice.</a> PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477(2009).</li>
<li>Ahmer, B. M., Gunn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Salmonella+spp.+with+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 101(2011).</li>
<li>Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+identification+of+resistance+functions+in+Pseudomonas+aeruginosa+using+Tn-seq%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq.</a> MBio. 2 (1), (2011).</li>
<li>Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nature Methods. 6 (10), 767(2009).</li>
<li>van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome%E2%80%90wide+fitness+and+genetic+interactions+determined+by+Tn%E2%80%90seq%2C+a+high%E2%80%90throughput+massively+parallel+sequencing+method+for+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms.</a> Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).</li>
<li>Mutalik, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-barcoded+shotgun+expression+library+sequencing+for+high-throughput+characterization+of+functional+traits+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria.</a> Nature Communications. 10 (1), 308(2019).</li>
<li>Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+PCR-based+competitive+index+for+high-throughput+screening+of+Salmonella+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors.</a> Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li>
<li>Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+redox+balance+by+the+stringent+response+regulatory+protein+promotes+antioxidant+defenses+of+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).</li>
<li>Poteete, A. R., Fenton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%BB+red-dependent+growth+and+recombination+of+phage+P22%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">λ red-dependent growth and recombination of phage P22.</a> Virology. 134 (1), 161-167 (1984).</li>
<li>McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+SPI2+transcription+by+nitric+oxide-producing%2C+IFN%CE%B3-activated+macrophages+promotes+maturation+of+Salmonella+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).</li>
<li>Shaw, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+has+three+transketolase+enzymes+contributing+to+the+pentose+phosphate+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).</li>
<li>Freter, R., O'Brien, P., Macsai, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chemotaxis+in+the+association+of+motile+bacteria+with+intestinal+mucosa%3A+in+vivo+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies.</a> Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).</li>
<li>Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+phoA+gene+fusions+to+identify+a+pilus+colonization+factor+coordinately+regulated+with+cholera+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).</li>
<li>Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethidium+monoazide+for+DNA-based+differentiation+of+viable+and+dead+bacteria+by+5%27-nuclease+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR.</a> Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).</li>
<li>Nocker, A., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approaches+toward+preferential+detection+of+viable+cells+using+nucleic+acid+amplification+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques.</a> FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).</li>
<li>Nocker, A., Cheung, C. -Y., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+propidium+monoazide+with+ethidium+monoazide+for+differentiation+of+live+vs.+dead+bacteria+by+selective+removal+of+DNA+from+dead+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).</li>
<li>Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+detection+of+live+bacteria+combining+propidium+monoazide+sample+treatment+with+microarray+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology.</a> Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).</li>
<li>Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+monitoring+of+disinfection+efficacy+using+propidium+monoazide+in+combination+with+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR.</a> Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).</li>
<li>Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+propidium+monoazide+for+live%2Fdead+distinction+in+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).</li>
<li>Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Alternative+Electron+Acceptor+Tetrathionate+Supports+B12-Dependent+Anaerobic+Growth+ofSalmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+on+Ethanolamine+or+1%2C+2-Propanediol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol.</a> Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).</li>
<li>Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E.+coli+host+strains+significantly+affect+the+quality+of+small+scale+plasmid+DNA+preparations+used+for+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677(1993).</li>
<li>Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+in+Escherichia+coli%3A+Tc+R+and+Km+R+cassettes+with+the+option+of+Flp-catalyzed+excision+of+the+antibiotic-resistance+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.</a> Gene. 158 (1), 9-14 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zdolność do dokładnego ilościowego oznaczania mikroorganizmów ma ogromne znaczenie dla badań mikrobiologicznych, a możliwość wyliczenia unikalnych szczepów z początkowej populacji mieszanej okazała się nieocenionym narzędziem do oceny cech dopasowania i zjadliwości bakterii. Jednak techniki umożliwiające osiągnięcie tego celu nie rozwijają się w tempie nowoczesnych osiągnięć biologii molekularnej. Technologia umożliwiająca łatwą modyfikację chromosomów wielu bakterii, w tym S. Typhimurium jest dostępne od prawie...

Ocena przydatności i zjadliwości organizmów chorobotwórczych jest podstawowym aspektem badań mikrobiologicznych. Umożliwia ona dokonywanie porównań między szczepami lub między zmutowanymi organizmami, co pozwala naukowcom określić znaczenie niektórych genów w określonych warunkach. Tradycyjnie, ocena zjadliwości wykorzystuje zwierzęcy model infekcji przy użyciu różnych szczepów bakteryjnych i obserwując wynik zakażonego zwierzęcia (np. dawka zakaźna50, dawka śmiertelna50, czas do śmierci, nasilenie objawów, brak objawów itp.). Procedura ta dostarcza cennych opisów zjadliwości, ale wymaga, aby szczepy powodowały znaczne różnice w wynikach w celu wykrycia różnic w stosunku do typu dzikiego. Co więcej, wyniki są półilościowe, ponieważ podczas gdy postęp choroby i nasilenie objawów można subiektywnie określić ilościowo w czasie, interpretacja zjadliwości w porównaniu z typem dzikim jest bardziej jakościowa (tj. bardziej, mniej lub równie zjadliwy). Powszechną alternatywą dla przeprowadzania testów zakaźności zwierząt jest generowanie wskaźników konkurencyjnych (CI), wartości, które bezpośrednio porównują dopasowanie lub zjadliwość szczepu z jego dzikim odpowiednikiem w infekcji mieszanej1. Technika ta ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjnym zwierzęcym modelem infekcji poprzez standaryzację zjadliwości do szczepu typu dzikiego i określenie wartości wymiernej odzwierciedlającej stopień osłabienia. Technikę tę można również zaadaptować do analizy interakcji genów u bakterii poprzez określenie anulowanego indeksu konkurencyjnego (COI)2. Obliczenie COI dla grupy zmutowanych organizmów pozwala naukowcom określić, czy dwa geny niezależnie przyczyniają się do patogenezy, czy też są zaangażowane w ten sam szlak wirulencji i zależne od siebie. Ponadto obliczenie CI wymaga zliczenia bakterii, co może dostarczyć cennych informacji na temat patogenezy organizmów. CI i COI pozwalają również naukowcom ocenić szczepy awirulentne, które nie powodują choroby klinicznej, ale nadal mają różnice w dopasowaniu. Technika ta jest ograniczona przez zastosowanie tradycyjnych markerów oporności na antybiotyki do identyfikacji szczepów, ograniczając w ten sposób liczbę szczepów wejściowych do zaledwie jednego lub dwóch na raz. Z powodu tego ograniczenia wymagana jest duża liczba grup eksperymentalnych i powtórzeń, co oprócz zwiększenia kosztów pracy i materiałów, zwiększa również możliwości zmienności warunków eksperymentalnych i niedokładnych wyników. (Szczegółowy przegląd korzyści i zastosowań stosowania infekcji mieszanych do badania zjadliwości, dopasowania i interakcji genów można znaleźć w C.R. Beuzón i D.W. Holden 1)
Podjęto próby obejścia tego ograniczenia, takie jak użycie komórek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą cytometrii przepływowej3,4,5. Technika ta określa ilościowo komórki za pomocą 1) znakowanych przeciwciał przeciwko markerom fenotypowym lub 2) endogennie wytwarzanych białek fluorescencyjnych. Użycie znakowanych przeciwciał ma limit wykrywalności 1,000 komórek/ml, a zatem wymaga dużej liczby komórek do analizy3. Komórki wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych mają zmienioną fizjologię i są podatne na zmiany przystosowania wynikające z wysokiej ekspresji białek6. Obie metody są ograniczone liczbą markerów fluorescencyjnych wykrywalnych za pomocą cytometrii przepływowej. Postęp w kwantyfikacji molekularnej osiągnięto dzięki opracowaniu techniki mikromacierzy, która wykryła osłabienie w 120 szczepach z początkowej infekcji mieszanej ponad 1000 szczepów w modelu mysim7. Technika ta wykorzystywała analizę mikromacierzy RNA ze zmutowanych szczepów, co doprowadziło do znacznej zmienności wyników. Niemniej jednak ustalono, że duże pule infekcji mieszanych mogą być użytecznym narzędziem i że dzięki zastosowaniu czułych technik wykrywania można zidentyfikować różnice w zjadliwości bakterii. Wraz z opracowaniem sekwencjonowania nowej generacji, Tn-seq rozszerzyło użyteczność mutacji transpozonów, umożliwiając potężną metodę ilościowego oznaczania bakterii, które zostały losowo zmutowane8,9,10,11. Niedawno opracowano alternatywny protokół, który eliminuje potrzebę stosowania transpozonów, a zamiast tego wykorzystuje kody kreskowe DNA do łatwiejszej identyfikacji i śledzenia zmian genomowych oraz ich wpływu na fitness12. Technologia ta jest dużym postępem, ale wprowadzanie genomowych kodów kreskowych jest nadal procesem losowym. Aby przezwyciężyć losowość poprzednich eksperymentów, Yoon i in. opracowali metodę obliczania CI szczepów Salmonelli przy użyciu unikalnych kodów kreskowych DNA wstawionych w precyzyjnych miejscach na chromosomach bakterii13. Unikalne szczepy z kodami kreskowymi wykryto przy użyciu metody opartej na qPCR z zielonym SYBR i starterami specyficznymi dla każdego unikalnego kodu kreskowego. Technika ta była ograniczona ograniczeniami narzuconymi przez qPCR, w tym różnicami w wydajności starterów i niską czułością, o czym świadczy potrzeba zagnieżdżonego PCR przed qPCR. Niemniej jednak podejście to wykazało, że ukierunkowane modyfikacje genomu mogą zostać wykorzystane do wykrywania i potencjalnego ilościowego określania puli wielu szczepów bakteryjnych.
W poniższym protokole opisujemy nowatorską metodologię przeprowadzania eksperymentów z konkurencją bakteryjną z dużymi pulami mieszanych inokulantów, a następnie dokładnej kwantyfikacji przy użyciu bardzo czułej techniki cyfrowego PCR. Protokół polega na genetycznym znakowaniu szczepów bakteryjnych za pomocą unikalnego kodu kreskowego DNA umieszczonego w nieszkodliwym regionie chromosomu. Modyfikacja ta pozwala na szybkie i dokładne ilościowe oznaczanie szczepów przy użyciu nowoczesnej technologii molekularnej zamiast tradycyjnych seryjnych rozcieńczeń, posiewu replik i liczenia jednostek tworzących kolonie, które opierają się na markerach fenotypowych (tj. oporności na antybiotyki). Modyfikacje pozwalają na jednoczesną ocenę wielu szczepów w jednym inokulum, co znacznie zmniejsza możliwość zmienności eksperymentalnej, ponieważ wszystkie szczepy są wystawione na dokładnie te same warunki. Co więcej, chociaż technika ta została opracowana w serowarze Salmonella enterica Typhimurium, jest ona wysoce elastyczna w odniesieniu do każdego genetycznie plastycznego organizmu i prawie każdego projektu eksperymentalnego, w którym wymagane jest dokładne zliczanie bakterii, zapewniając nowe narzędzie do zwiększenia dokładności i przepustowości w laboratoriach mikrobiologicznych bez ograniczeń narzuconych przez poprzednie metody.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22600028</td><td>Zaopatrz się u dowolnego producenta</td></tr><tr><td>16 ml probówek hodowlanych</td><td>MidSci</td><td>8599</td><td>Kup od dowolnego producenta</td></tr><tr><td>5-200 &mu; L końcówki do pipet</td><td>RAININ</td><td>30389241</td><td>Kupuj alternatywne marki końcówek z ostrożnością w oparciu o jakość produkcji</td></tr><tr><td>5-50 &mu; Pipeta wielokanałowa</td><td>L RAININ</td><td>17013804</td><td>Używaj ostrożnie alternatywnych pipet wielokanałowych</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific BP160-500</td><td>Zakup od dowolnego producenta</td></tr><tr><td>Analiza BLAST</td><td>NCBI</td><td>Nie dotyczy</td><td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td></tr><tr><td>Termocykler dotykowy C1000 z modułem reakcyjnym 96-studniowej</td><td>Bio Rad</td><td>1851197</td><td>Należy zakupić dostawy ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.</td></tr><tr><td>Chemicznie kompetentny DH5&alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td>Zaopatrz się w dowolny producent lub przygotuj się samodzielnie</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>Zaopatrz się w dowolny producent</td></tr><tr><td>Cytation5 Czytnik mikropłytek</td><td>BioTek</td><td>CYT5MF</td><td>Kup od dowolnego producenta, użyj dowolnego systemu zdolnego do dokładnego ilościowego określenia</td></tr><tr><td>oprogramowania do analizy danych DNA (QuantaSoft i QuantaSoft Data Analysis Pro)</td><td>Bio Rad</td><td>Nie dotyczy</td><td>Należy zakupić dostawy ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.</td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe ddPCR</td><td>Bio Rad</td><td>12001925</td><td>Należy zaopatrywać się w materiały ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.</td></tr><tr><td>ddPCR Droplet Reader Oil</td><td>Bio Rad</td><td>1863004</td><td>Należy zakupić dostawy ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.</td></tr><tr><td>ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)</td><td>Bio Rad</td><td>1863024</td><td>Należy zakupić dostawy ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.</td></tr><tr><td>Wkłady DG8 do generatora kropel QX200/QX100</td><td>Bio Rad</td><td>1864008</td><td>Należy zakupić dostawy ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.</td></tr><tr><td>Uszczelki DG8 do generatora kropel QX200/QX100</td><td>Bio Rad</td><td>1863009</td><td>Należy zakupić dostawy ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.</td></tr><tr><td>Olej do wytwarzania kropelek do sond</td><td>Bio Rad</td><td>1863005</td><td>Należy zakupić dostawy ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.</td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>Zaopatrz się w dowolny producent</td></tr><tr><td>Agar Luria-Bertani</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1425-2</td><td>Zaopatrz się w dowolny producent lub zrób to sam z agaru, tryptonu, trawienia drożdży i</td></tr><tr><td>NaCl Bulion Luria-Bertani</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td>Zaopatrz się w dowolny producent lub zrób to sam z tryptonu, trawienia drożdży i NaCl</td></tr><tr><td>Zgrzewanie płytowe PCR, folia, przebijalne</td><td>Bio Rad</td><td>1814040</td><td>Należy zakupić dostawy ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.</td></tr><tr><td>Probówki do PCR</td><td>Eppendorf</td><td>951010022</td><td>Zaopatrz się w płytki</td></tr><tr><td>Petriego</td> dowolnego producenta <td>ThermoFisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>Kup od dowolnego producenta</td></tr><tr><td>pPCR Script Cam SK+</td><td>Stratagene/Agilent</td><td>211192</td><td>Produkt nie jest już dostępny w handlu</td></tr><tr><td>Wzór podkładu/sondy</td><td>IDT</td><td>Nie dotyczy</td><td>https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index</td></tr><tr><td>pSKAP i pSKAP_Barcodes</td><td>Numery</td><td>plazmidów Addgene 122702-122726</td><td>www.addgene.org</td></tr><tr><td>Uszczelniacz płytek PCR PX1</td><td>Bio Rad</td><td>1814000</td><td>Należy zakupić dostawy ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.</td></tr><tr><td>QX200 Generator kropel</td><td>Bio Rad</td><td>1864002</td><td>Należy zakupić dostawy ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.</td></tr><tr><td>QX200 Czytnik kropelek</td><td>Bio Rad</td><td>1864003</td><td>Należy zakupić materiały ddPCR od Bio Rad. Alternatywy nie są jeszcze dostępne.</td></tr><tr><td>Salmonella typhimurium szczep ATCC 14028s</td><td>ATCC</td><td>ATCC 14028s</td><td>www.atcc.org</td></tr><tr><td>Take3 Micro-Volume Plate</td><td>BioTek</td><td>TAKE3</td><td>Zaopatrz się od dowolnego producenta, użyj dowolnego systemu zdolnego do dokładnego ilościowego oznaczania DNA</td></tr><tr><td>Thermo Scientific FastDigest BamHI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FERFD0054</td><td>Zaopatrz się od dowolnego producenta</td></tr><tr><td>Thermo Scientific FastDigest DpnI</td><td>ThermoFisher Scientific FERFD1704</td><td></td><td>Zaopatrz się u dowolnego producenta</td></tr><tr><td>Thermo Scientific FastDigest HindIII</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FERFD0504</td><td>Zaopatrz się w dowolny producent</td></tr><tr><td>Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FERK0832</td><td>Kup od dowolnego producenta</td></tr><tr><td>Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit</td><td>ThermoFisher Naukowe</td><td>FERK0503</td><td>Zaopatrz się od dowolnego producenta</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F534L</td><td>Zaopatrz się od dowolnego producenta</td></tr><tr><td>Thermo Scientific T4 Ligaza DNA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FEREL0011</td><td>Zaopatrz się od dowolnego producenta</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Bio Rad</td><td>1861096</td><td>Kup od dowolnego producenta</td></tr><tr><td>Oświetlacz UVP Visi-Blue</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>UV95043301</td><td>Lub inny transiluminator, który umożliwia wizualizację DNA</td></tr><tr><td>Woda, Biologia molekularna</td><td>Klasa ThermoFisher Scientific BP28191</td><td></td><td>Zaopatrz się w dowolnego producenta</td></tr></tbody></table>

cyfrowy indeks konkurencyjności oparty na pcr do wysokoprzepustowej analizy sprawności w salmonelli

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Wskaźnik konkurencyjności jest powszechną metodą używaną do oceny przydatności bakterii i/lub zjadliwości. Użyteczność tego podejścia jest zilustrowana jego łatwością wykonania i zdolnością do standaryzacji dopasowania wielu szczepów do organizmu typu dzikiego. Technika ta jest jednak ograniczona ze względu na dostępne markery fenotypowe i liczbę szczepów, które można oceniać jednocześnie, co stwarza potrzebę przeprowadzenia dużej liczby powtórzonych eksperymentów. Równolegle z dużą liczbą eksperymentów, koszty pracy i materiałów związanych z ilościowym określaniem bakterii na podstawie markerów fenotypowych nie są bez znaczenia. Aby przezwyciężyć te negatywne aspekty, zachowując jednocześnie aspekty pozytywne, opracowaliśmy podejście oparte na molekularnym określaniu ilościowym mikroorganizmów po inżynierii markerów genetycznych na chromosomach bakteryjnych. Unikalne, 25 kodów kreskowych DNA par zasad umieszczono w nieszkodliwym locus na chromosomie dzikich i zmutowanych szczepów Salmonelli. Eksperymenty konkursowe in vitro przeprowadzono przy użyciu inokulantów składających się z połączonych szczepów. Po przeprowadzeniu zawodów liczby bezwzględne każdego szczepu zostały określone ilościowo za pomocą cyfrowego PCR, a na podstawie tych wartości obliczono wskaźniki konkurencyjności dla każdego szczepu. Nasze dane wskazują, że to podejście do ilościowego oznaczania Salmonelli jest niezwykle czułe, dokładne i precyzyjne w wykrywaniu zarówno bardzo licznych (wysoka sprawność), jak i rzadkich (niskiej sprawności) mikroorganizmów. Ponadto technikę tę można łatwo dostosować do prawie każdego organizmu z chromosomami zdolnymi do modyfikacji, a także do różnych projektów eksperymentalnych, które wymagają bezwzględnej kwantyfikacji mikroorganizmów.

Użycie tej metodologii wymaga przeprowadzenia odpowiednich reakcji kontrolnych w celu sprawdzenia czułości i swoistości każdej sondy używanej do identyfikacji docelowego DNA. W tym reprezentatywnym eksperymencie zwalidowaliśmy osiem unikalnych kodów kreskowych DNA z ośmioma odpowiadającymi im sondami do identyfikacji. Wszystkie osiem sond miało niski odsetek wyników fałszywie dodatnich zarówno w NTC, jak i w reakcjach kontroli negatywnej (Tabela 3), co podkreśla ich specy...

To oparte na molekularnym podejściu do określania sprawności bakterii umożliwia precyzyjne i dokładne wykrywanie mikroorganizmów za pomocą unikalnych kodów kreskowych genomowego DNA, które są określane ilościowo za pomocą cyfrowego PCR. W protokole opisano obliczanie indeksu konkurencyjnego dla szczepów Salmonella; Technologia ta jest jednak łatwa do zaadaptowania do protokołów wymagających bezwzględnej kwantyfikacji każdego genetycznie plastycznego organizmu.

Cyfrowy indeks konkurencyjności oparty na PCR do wysokoprzepustowej analizy sprawności w Salmonelli

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Technika ta umożliwia dokładne i precyzyjne oznaczanie ilościowe mikroorganizmów z mieszanej populacji bardzo podobnych szczepów przy użyciu szybkich i wysokowydajnych technik molekularnych. Ostatecznie, umożliwiając porównanie dopasowania między szczepami. Możliwość jednoczesnej oceny wielu szczepów w jednej puli znacznie zmniejsza zmienność między osobami zdrowymi lub między organizmami, ponieważ wszystkie szczepy są narażone na dokładnie te same warunki.Zdolność adaptacyjna tej techniki pozwala na jej zastosowanie w przypadku prawie każdego genetycznie plastycznego organizmu i prawie każdego projektu eksperymentalnego, który wymaga dokładnej kwantyfikacji drobnoustrojów. Rozpocznij tę procedurę od inżynierii markerów genetycznych na chromosomach bakteryjnych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Utwórz pulę genomowego DNA, która zawiera każdy kod kreskowy z wyjątkiem jednego.Użyj tej puli jako rozcieńczalnika do wykonania serii rozcieńczeń z genomowym DNA zawierającym pojedynczy pozostały kod kreskowy. Przygotować reakcje do cyfrowego PCR w dwóch egzemplarzach zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi stosowania cyfrowego supermiksu PCR przeznaczonego do chemii opartej na

digital-pcr-based-competitive-index-for-high-throughput-analysis

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisujemy metodę multipleksowej reakcji PCR do szybkiego wykrywania serowarów Salmonella enterica Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium. Konkretne serowary Salmonella można zidentyfikować, kierując multipleksową reakcję PCR na geny i sekwencje unikalne dla klastra biosyntezy antygenu O oraz flagelliny danego serowaru. Następnie izolatowi Salmonella przypisuje się serowar na podstawie pojawienia się specyficznych amplikonów (produktów PCR) o określonej wielkości, odpowiadających...

PCR allelotypowania w celu identyfikacji serowarów Salmonella enterica: Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium

Systematyczne, wielkoskalowe przesiewy syntetycznych interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych powiązań między szlakami sygnałowymi. W niniejszej pracy opisujemy opracowaną przez nas technologię wysokoprzepustowych ilościowych przesiewów macierzy syntetycznych interakcji genetycznych, nazwaną eSGA, służącą do wyjaśniania relacji epistatycznych i badania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

W tym filmie demonstrujemy technikę duplex digital PCR (ddPCR) — modyfikację tradycyjnej techniki PCR, która jest przydatna do jednoczesnego wykrywania dwóch różnych markerów genetycznych. Pojedyncza reakcja PCR jest dzielona na zemulgowane kropelki o wielkości nanolitrów, które są niezależnie amplifikowane, a wykrywanie różnokolorowych sygnałów amplifikacji fluorescencji z frakcji kropel służy do obliczenia początkowego stężenia sekwencji docelowych.

Duplex Digital PCR do jednoczesnej kwantyfikacji podwójnych markerów genetycznych

Ten manuskrypt opisuje dupleksowy cyfrowy test PCR, który może być używany do jednoczesnego ilościowego oznaczania Enterococcus spp. i markerów genetycznych HF183 jako wskaźników ogólnego i związanego z człowiekiem zanieczyszczenia kałem w wodach rekreacyjnych.

Dupleksowy cyfrowy test PCR do jednoczesnej kwantyfikacji Enterococcus spp. i ludzkiego markera HF183 związanego z kałem w wodzie

Salmonella spp./Shigella spp. są częstymi patogenami przypisywanymi biegunce. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową platformę do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp. przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym w połączeniu z hodowlą sterowaną.

Wysokoprzepustowa platforma do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp.

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek DNA z mikrobiomów żywności i środowiska do wspólnego wykrywania i subtypowania Salmonelli poprzez sekwencjonowanie quasimetagenomiczne. Połączone zastosowanie wzbogacania hodowli, separacji immunomagnetycznej (IMS) i amplifikacji z wielokrotnym przemieszczeniem (MDA) pozwala na skuteczną koncentrację genomowego DNA Salmonelli z próbek żywności i środowiska.

Analiza quasi-metagenomiczna salmonelli z próbek żywności i środowiska

Immunoprecypitacja chromatyny w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji (ChIP-seq) to metoda stosowana do ustalania interakcji między czynnikami transkrypcyjnymi a kontrolowanymi przez nie sekwencjami genomowymi. Protokół ten przedstawia techniki wykonywania sekwencji ChIP-seq z biofilmami bakteryjnymi, na przykładzie biofilmu bakteryjnego Salmonella enterica Typhimurium serovar.

Odkrywanie celów regulatorowych CsgD w biofilmie Salmonelli przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

Salmonella atakuje i replikuje się wewnątrz komórek nabłonka jelitowego zarówno w wakuolach specyficznych dla Salmonelli, jak i w wolnych w cytozolu (hiperreplikacja). Opisano tutaj wysokoprzepustowy protokół oparty na mikroskopii fluorescencyjnej w celu ilościowego określenia wewnątrzkomórkowych fenotypów Salmonelli za pomocą dwóch uzupełniających się analiz obrazu za pomocą ImageJ, osiągając rozdzielczość pojedynczej komórki i punktację.

Automatyczna analiza wewnątrzkomórkowych fenotypów salmonelli za pomocą ImageJ

Tutaj przedstawiamy zasadę, strukturę i instrukcję inteligentnego, wysokoprzepustowego systemu testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe/przesiewowego fagów. Jego zastosowanie ilustruje przykład Salmonelli wyizolowanej z drobiu w Shandong w Chinach. Obliczany jest indeks Lar, a jego znaczenie w ocenie oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe jest szczegółowo omawiane.

Zastosowanie inteligentnego, wysokowydajnego systemu badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe/przesiewowego fagów oraz wskaźnika Lar oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

Ten protokół opisuje, jak utrzymać Escherichia coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) poprzez wykonywanie codziennych transferów i okresowych zamrażania oraz jak przeprowadzać testy konkurencji w celu zmierzenia poprawy kondycji u wyewoluowanych bakterii. Procedury te mogą służyć jako szablon dla naukowców rozpoczynających własne eksperymenty z ewolucją drobnoustrojów.

Codzienne transfery, archiwizacja populacji i pomiar sprawności w długoterminowym eksperymencie ewolucji z Escherichia coli

Dokładne określenie ilościowe Salmonelli u drobiu na niskich poziomach jest aktualnym wyzwaniem przemysłowym i regulacyjnym. Protokół ten opisuje test MPN, który umożliwia ilościowe określenie salmonelli w surowych i gotowych do przyrządzenia produktach drobiowych. Metoda ta jest szybka, czuła i zgodna z wytycznymi FSIS, zwiększając bezpieczeństwo żywności i wspierając wysiłki na rzecz zdrowia publicznego.

Zmodyfikowany test liczbowy "Najbardziej prawdopodobny" w celu ilościowego określenia salmonelli w surowych i gotowych do przyrządzenia produktach z kurczaka

Poznaj cyfrowy indeks konkurencyjności oparty na PCR do precyzyjnej analizy sprawności bakterii Salmonella. Ta metoda umożliwia jednoczesne badanie wielu szczepów w jednej próbce, redukując zmienność między próbkami.

Cyfrowy indeks konkurencyjności oparty na PCR do wysokoprzepustowej analizy sprawności w Salmonelli

Przeglądaj więcej filmów