Ocena mikrośrodowiska guza przepuszczalności naczyniowej za pośrednictwem drzwi z przerzutami związanych z rozsiewaniem komórek rakowych za pomocą obrazowania przyżyciowego i analizy tkanek stałych

Te uzupełniające się techniki oceniają i mierzą przepuszczalność naczyń krwionośnych guza przy użyciu dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej. Protokół stałotkankowy zapewnia większe pokrycie guza, ma wysoką przepustowość i nie wymaga sprzętu do obrazowania wielofotonowego. Z drugiej strony, protokół obrazowania przyżyciowego dostarcza w czasie rzeczywistym informacji o kinetyce, funkcji i dynamicznym oddziaływaniu komórek w mikrośrodowisku guza z przerzutami lub TMEM.

Tak więc przedstawione tutaj protokoły umożliwiają bezpośredni pomiar przepuszczalności naczyniowej zależnej od TMEM, która silnie koreluje z rozprzestrzenianiem się komórek rakowych, dlatego protokoły te mogą być wykorzystane do oceny potencjału przerzutowego guzów. Aby wygenerować fragmenty tkanki nowotworowej nadające się do przeszczepu, należy rozpocząć od eutanazji myszy z guzem, jak opisano w protokole tekstowym. Umieścić szalkę Petriego z pożywką do hodowli komórkowych DMEM/F12 na lodzie w dygestorium.

Przyłóż mysz do dygestorium i zdezynfekuj brzuch myszy 70% alkoholem etylowym. Używając sterylnych rękawiczek i narzędzi chirurgicznych, usuń guzy i umieść je na szalce Petriego. Pokrój guz na małe kawałki, odrzucając wszelkie martwicze części, gdy znajdują się na szalce Petriego.

Aby przeszczepić fragmenty guza do gospodarzy biorców, znieczulij myszy, które były hodowane z genetycznie zmodyfikowanymi, fluorescencyjnie znakowanymi makrofagami, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zmniejsz znieczulenie do około 3% izofluoranu i nałóż maść okulistyczną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu. Usuń włosy z ponad czwartego gruczołu sutkowego myszy.

Po oczyszczeniu skóry środkiem antyseptycznym użyj wysterylizowanych narzędzi, aby wykonać małe nacięcie około dwóch do trzech milimetrów tuż poniżej czwartego sutka. Wypreparuj, aż poduszeczka tłuszczowa sutka zostanie odsłonięta. Weź kawałek guza z szalki Petriego i pokryj go sztuczną macierzą zewnątrzkomórkową.

Przeszczep guzy pod czwartą poduszeczką tłuszczową sutka. Zamknij nacięcie za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Na koniec dodaj jeden mililitr antybiotyku enrofloksacyny do wody pitnej zwierząt.

Znieczulij mysz i włóż cewnik do żyły ogonowej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wykonaj podłużne nacięcie w linii środkowej, zaczynając bezpośrednio nad narządami płciowymi i przenieś nacięcie do poziomu górnej części czwartego gruczołu sutkowego. Przenieś nacięcie poprzecznie do górnej części czwartego gruczołu sutkowego.

Bardzo ważne jest, aby w tym momencie nie dopuścić do pogorszenia dopływu krwi. Ustabilizuj płat skóry, przymocowując mały kawałek sztywnej gumy o wymiarach dwa na dwa centymetry po stronie skóry. Guzy powinny znajdować się w środku obszaru stabilizowanego przez gumę.

Nałóż małą warstwę cyjanoakrylanu na zewnętrzną krawędź wykonanej na zamówienie ramy okna obrazowania. Teraz nałóż małą kroplę PBS na środek szkła nakrywkowego. Unikaj kontaktu cyjanoakrylanu na ramie okiennej z PBS ze szkłem, aby uniknąć przedwczesnej polimeryzacji cyjanoakrylanu.

Osusz otaczającą tkankę płata chusteczką laboratoryjną. Przymocuj małe okienko obrazowania do płata tkankowego z guzem w środku przezroczystego otworu. Przenieś znieczulony cewnik myszy i żyły ogonowej do etapu mikroskopu.

Zachowaj szczególną ostrożność, aby upewnić się, że cewnik żyły ogonowej nie wypadnie. W tym momencie należy wykonać długoterminowe obrazowanie przyżyciowe zgodnie z opisem w protokole tekstowym oraz w naszej poprzedniej publikacji JoVE. Aby uzyskać wyższą przepustowość analizy i większy zasięg guza, należy użyć immunofluorescencji w tkance utrwalonej, aby ocenić przepuszczalność naczyń za pośrednictwem TMEM.

Aby przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne, najpierw przygotuj próbki zgodnie z opisem w protokole tekstowym, a następnie przeprowadź pobieranie antygenu poprzez ogrzewanie skrawków zanurzonych w cytrynianie w pobliżu temperatury wrzenia przez 20 minut. Po pozostawieniu próbek do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez 15 do 20 minut, należy umyć próbki w PBS trzy razy przez dwie minuty przy każdym myciu. Blokować przez 60 do 90 minut w buforze blokującym, a następnie inkubować próbki z mieszaniną pierwotnych szczurów i szybkich przeciwciał, które są skierowane odpowiednio przeciwko endomucynie i tetrametylododaminie.

Po inkubacji przemyć próbki trzykrotnie w PBST przez dwie minuty każda. Inkubować próbki z mieszaniną drugorzędowych przeciwciał osła przeciwko Rat IgG i rapid IgG, a następnie myć próbki trzykrotnie w PBST przez dwie minuty każda. Wykonaj rutynowe barwienie DAPI i zamontuj szkiełka za pomocą twardego medium montażowego bez glicerolu.

Przechowuj próbki w ciemnym miejscu do czasu skanowania. Aby uzyskać optymalne wyniki, zeskanuj slajdy za pomocą cyfrowego skanera całych slajdów. Aby przeprowadzić analizę obrazu, przechwyć 10 pól o dużej mocy na przypadek za pomocą dowolnego oprogramowania odpowiedniego dla patologii cyfrowej.

Zapisz kanały endomucin i TMR oddzielnie jako TIFF. Za pomocą ImageJ prześlij pliki TIFF i przekonwertuj je na obrazy 8-bitowe. Proguj obrazy 8-bitowe do poziomu kontroli negatywnej i wygeneruj dwa binaryzowane obrazy przedstawiające maski endomucyny i TMR.

Z narzędzi binarnych wybierz opcję Wypełnij otwory na masce endomucin. Wygeneruj obraz Dextran z progiem i zapisz go jako ROI Dextran. Wygeneruj również progowy obraz endomucyny i zapisz go jako naczyniowy ROI, a następnie wygeneruj odwrócony obraz endomucyny i zapisz go jako zewnątrznaczyniowy ROI.

Następnie wygeneruj przecięty obraz ROI zewnątrznaczyniowego i ROI dekstranu i zapisz go jako ROI dekstranu zewnątrznaczyniowego. Na koniec zapisz cały obraz jako zwrot z inwestycji w guz. Podziel obszar ROI dekstranu zewnątrznaczyniowego przez obszar ROI guza i pomnóż przez 100, aby uzyskać procentowy obszar, który dekstran zewnątrznaczyniowy pokrywa w całym guzie.

Powtórz ten proces dla 10 do 20 pól o dużej mocy na przypadek i wygeneruj średni dekstran zewnątrznaczyniowy dla każdego przypadku. Pokazany tutaj jest obraz zdrowego, rozwijającego się gruczołu sutkowego u transgenicznego zwierzęcia. Naczynia krwionośne są znakowane przez dekstran TMR na czerwono, nabłonek plastyczny sutka jest znakowany przez białko fluorescencyjne dendra2 na zielono, a makrofagi są znakowane cyjanowym białkiem fluorescencyjnym.

W przeciwieństwie do tego, przeszczepiony inwazyjny rak ciągliwy znakowany dendra2 jest pokazany u zwierzęcia z oznakowanymi makrofagami i naczyniami. Zdrową tkankę płucną wizualizowano przez okienko obrazowania płuc u myszy z oznaczonym naczyniem. Przerzuty do płuc są widoczne po wstrzyknięciu komórek nowotworowych do transgenicznego zwierzęcia z oznakowanymi makrofagami i naczyniami krwionośnymi.

Pokazane tutaj są zdjęcia z filmu z obrazowaniem przyżyciowym poklatkowego naczyń neoangiogennych znakowanych dekstranem o dużej masie cząsteczkowej w obrębie przeszczepionego raka inwazyjnego piersi znakowanego dendra2. Przerywana żółta linia oznacza zarys obszaru przejściowego przecieku naczyniowego przed, w trakcie i po wycieku. Drzwi TMEM są rejestrowane w obrazowaniu na żywo.

Immunofluorescencja wielokanałowa pokazuje endomucynę, dekstran o dużej masie cząsteczkowej, ich połączony obraz wraz z DAPI, a także odpowiednie progowe naczynia krwionośne i maski dekstranu zewnątrznaczyniowego. Pokazano również odpowiedni sekwencyjny przekrój immunohistochemii TMEM. Profil naczyniowy z dala od TMEM pojawia się jako nieprzeciekowy profil naczyniowy, podczas gdy profil naczyniowy związany z TMEM pojawia się jako nieszczelny profil naczyniowy.

Bardzo ważne jest, aby unikać przecinania naczyń krwionośnych zaopatrujących guz podczas chirurgicznego odsłonięcia guza. Opisana tutaj metodologia może być połączona z leczeniem farmakologicznym, tym samym, co hamowanie funkcji TMEM, zapobieganie przepuszczalności naczyń krwionośnych, a nawet normalizacja unaczynienia guza w celu zmierzenia ich wpływu i skuteczności. Dzięki tym protokołom wykazaliśmy wcześniej, że chemioterapia zwiększa przepuszczalność naczyń krwionośnych i rozsiewanie komórek rakowych, a w rzeczywistości, że te zmiany proprzerzutowe można obejść poprzez jednoczesne podawanie inhibitorów funkcji TMEM.