Mapowanie wyłaniającej się organizacji przestrzennej komórek ssaków za pomocą mikrowzorców i obrazowania ilościowego
April 30th, 2019
Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje mikrowzorce wraz z obrazowaniem ilościowym, aby ujawnić organizację przestrzenną w kulturach ssaków. Technika ta jest łatwa do wdrożenia w standardowym laboratorium biologii komórki i oferuje elastyczny system do badania wzorców in vitro.
Ta metoda umożliwia manipulowanie i ilościowe określanie, w jaki sposób komórki organizują się kolektywnie. Jest to ważne, ponieważ możemy modelować wzór in vitro i rozplątywać wskazówki ściśle sprzężone in vivo. Technika ta wymaga minimalnego specjalistycznego sprzętu, co pozwala na jej ustalenie w standardowym laboratorium biologicznym, i jest ilościowa, co umożliwia odkrycie zdarzeń związanych z wzorcami podwzrokowymi.
Metodę tę można łatwo zastosować do dowolnego systemu komórkowego, w którym mogą pojawić się wzorce, oraz do odkrywania nielosowych wzorców różnicowania, proliferacji i konkurencji między komórkami. Główną zaletą tej metody jest systematyczna optymalizacja parametrów mikrowzorcowania dla nowych typów komórek. Na przykład rozmiar i kształt wzoru, typ matrycy i czas adhezji komórek.
Zakładając rękawiczki, umieść kawałek filmu laboratoryjnego na dnie 10-centymetrowej kwadratowej szalki Petriego. Użyj 12-milimetrowego dziurkacza, aby wyciąć hydrofobowe szkiełka z tworzywa sztucznego, aby utworzyć szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 milimetrów, a następnie umieść szkiełka nakrywkowe na nowej szalce Petriego. Użyj pęsety, aby ostrożnie usunąć folię ochronną z szkiełek nakrywkowych.
Umieść maskę fotograficzną na czystej i stabilnej powierzchni, chromowaną stroną do góry i dodaj dwumikrolitrową kroplę podwójnie destylowanej wody w miejscu żądanego wzoru chipa. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do kropli i umieść uchwyt na plastikowych szkiełkach. Ostrożnie przymocuj tę kanapkę za pomocą zacisków, aby plastikowe elementy stykały się z maską fotograficzną.
Umieść zespół w lampie ultrafioletowej ozonu około dwóch centymetrów od źródła światła, aby uzyskać 10-minutowe oświetlenie. Pod koniec okresu oświetlenia chwyć kanapkę z maską fotograficzną na dole i ostrożnie zdejmij zaciski, utrzymując nacisk jedną ręką, aby zapobiec przesuwaniu się suwaków podczas demontażu kanapki. Gdy wszystkie zaciski zostaną usunięte, wyjmij uchwyt, uważając, aby wszystkie plastikowe kawałki nadal znajdowały się na masce i nie przykleiły się do uchwytu, a następnie dodaj podwójnie destylowaną wodę do wiórów, aby delikatnie odłączyć wióry od maski fotograficznej.
Umieść wióry z fotowzorem w komorze osadzania matrycy, podświetlaną stroną do góry i dodaj 200 mikrolitrów roztworu powlekającego na każdy chip. Następnie dodaj do komory trzycentymetrową szalkę Petriego wypełnioną podwójnie destylowaną wodą, aby ograniczyć parowanie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. W celu wysiewu komórek embrionalnych na wióry, należy umyć wiórki dwoma co najmniej pięciominutowymi płukaniami w świeżym, sterylnym PBS na pranie, a następnie dozować jeden razy dziesięć do piątych komórek w 200 mikrolitrach odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych na każdy chip.
Następnie zamknij komorę wysiewu. Inkubować przez godzinę, aby komórki przylgnęły do wiórów. Po przyczepieniu się komórek napełnij dołki płytki wielodołkowej 500 mikrolitrami ciepłego podłoża na dołek i użyj sterylnej pęsety, aby przenieść wióry do indywidualnych dołków na płytkę.
Energicznie wstrząsnąć płytką w celu oderwania wszelkich nieprzylegających komórek i natychmiast zastąpić supernatant świeżym, ciepłym podłożem. Następnie sprawdź pod mikroskopem, czy widoczny jest wzór. 48 godzin po ich posiewie komórki powinny uformować gęste kolonie, które rygorystycznie podążają za kształtem wzorów.
Pozostawiając wióry na płytce, usuń wszystko, z wyjątkiem wystarczającej ilości pożywki, aby zapobiec wyschnięciu frytek, i dodaj co najmniej 500 mikrolitrów paraformaldehydu lub roztworu utrwalającego na bazie PFA na dołek. Po dziesięciu minutach krótko przemyć studzienki trzykrotnie roztworem myjącym, a następnie raz przepłukać 50-milimolowym chlorkiem amonu rozcieńczonym w roztworze myjącym, aby ugasić resztkową aktywność sieciowania PFA. Po ostatnim przemyciu próbki należy traktować roztworem blokującym przez co najmniej 30 minut.
W celu barwienia immunologicznego kultur chipów, przenieś chipy do komory barwienia komórką do góry i natychmiast dodaj 100 mikrolitrów podstawowego roztworu przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania do każdego chipa. Po jednej godzinie na platformie obrotowej w temperaturze pokojowej umyć frytki trzykrotnie roztworem myjącym, jak pokazano, i inkubować wióry z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez jedną godzinę na platformie obrotowej. Pod koniec wtórnej inkubacji przeciwciał umyć chipy trzykrotnie w roztworze myjącym i zamontować chip na szkiełku mikroskopowym z 20 mikrolitrami dowolnego standardowego podłoża montażowego.
Aby zobrazować chipy, najpierw dostosuj prędkość skanowania, rozdzielczość obrazu, uśrednianie klatek i wzmocnienia detektora, aby określić optimum między jakością obrazu a czasem obrazowania. Następnie uzyskaj obrazy każdego chipa. Po uzyskaniu wszystkich obrazów zainstaluj i uruchom PickCells zgodnie z dokumentacją dostępną online, utwórz nowy eksperyment i zaimportuj obrazy do programu.
Użyj modułu Nessys do segmentacji jąder na podstawie sygnału obwiedni jądrowej. Użyj podstawowego modułu segmentacji, aby zidentyfikować sygnał autofluorescencji wzorca. Następnie kliknij Zakończ"i poczekaj, aż wszystkie obrazy zostaną przetworzone.
Aby utworzyć obiekty jądrowe i obliczyć podstawowe cechy obiektu, uruchom moduł Wewnętrzne cechy z paska zadań i zamknij panele Ellipsoid Fitter i Surface Extractor, aby otwarty był tylko panel Podstawowe funkcje. Wybierz jądro"jako Typ obiektu i wybierz podany prefiks podany dla podzielonych na segmenty obrazów. Następnie kliknij Oblicz"i poczekaj, aż wszystkie obrazy zostaną przetworzone.
Na tym etapie dodatkowe cechy muszą zostać zapisane w jądrach przed wyeksportowaniem danych do naszej analizy. Na przykład, aby zapisać nazwę obrazu, do którego należy każde jądro, jako atrybut jądra, kliknij Dane"i Nowy atrybut"i wybierz jądro"w wyskakującym oknie dialogowym. Kliknij OK"wybierz Zbieraj dane z innych obiektów połączonych z węzłem"i kliknij Dalej"W lewym panelu wybierz Obraz" i kliknij dwukrotnie znak zapytania, aby ustawić węzeł obrazu jako cel ścieżki.
Rozwiń okienko Operacja redukcji i wybierz pozycję Pobierz jeden"Rozwiń okienko Dostępne atrybuty i wybierz atrybut Nazwa. Następnie kliknij Zmień"i Dalej"Wprowadź nazwę obrazu, naciśnij Tab i kliknij Zakończ"Następnie wyeksportuj dane do pliku wartości rozdzielanych tabulatorami. Na potrzeby naszej analizy zapętl wyeksportowane dane do folderu danych w folderze R-Script.
Otwórz nasze studio"i otwórz szablon mapy z koszem R-Script"Następnie ustaw katalog roboczy na lokalizację pliku źródłowego i uruchom skrypt, aby wygenerować mapy gęstości. Po upływie jednej godziny od wysiewu komórek poszczególne wzorce kultur komórkowych mogą nie być w pełni zlewne, ponieważ komórki namnażają się w czasie. Jednak wzory zostaną w pełni skolonizowane, a na zewnątrz powierzchni kleju znajdzie się tylko bardzo niewiele komórek.
Wzór, który nie jest wyraźny do dwóch godzin po wysiewie, wskazuje na niepowodzenie procedury. Przestrzenne uwięzienie embrionalnych komórek macierzystych myszy na dużych dyskach lub mikrowzorach pierścieniowych kieruje wzorcowaniem subpopulacji komórek wykazujących ekspresję mezodermalnego markera brachyury. Na przykład, gdy embrionalne komórki macierzyste myszy są hodowane na mikrowzorach o dużym dysku, komórki brachyury-dodatnie są preferencyjnie ograniczone do obrzeży wzorca, gdzie lokalna gęstość komórek jest najniższa.
Ten wzorzec jest potwierdzony przez mapę intensywności brachyury mózgu. Dane te pokazują, że metoda może ujawnić informacje subwizualne, ponieważ inspekcja jednej kolonii nie jest wystarczająca do zidentyfikowania jakiejkolwiek formy organizacji przestrzennej w wyrażaniu markerów zainteresowania. Wyjaśnia to w szczególności istotna zmienność między koloniami.
Technika ta pokazuje również, że nie istnieje wykrywalny wzorzec dla inhibitora wiązania DNA, co może wskazywać, że wzorzec T nie jest napędzany przez sygnalizację morfogenetyczną białka kości w tym kontekście. Zawsze pamiętaj, która strona szkiełka nakrywkowego została usunięta i pokryta, a także upewnij się, że komórki prawidłowo przylegają przed zmyciem nadmiaru komórek. Metoda ta pozwala na badanie sygnałów środowiskowych ważnych w kierowaniu samoorganizacją komórek, a także może informować o modelach matematycznych, które pomagają nam lepiej radzić sobie z podstawowymi wzorcami.
Przegląd
Ta metoda umożliwia manipulację i ilościową ocenę organizacji komórek in vitro, pozwalając badaczom na modelowanie wzorców i rozdzielania sygnałów in vivo. Jest prosta w implementacji w standardowych laboratoriach biologicznych i ułatwia odkrywanie subwizualnych zdarzeń wzorców.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Techniki mikrowzorcowania
- Ilościowe obrazowace
Tło
- Rozumienie organizacji komórek jest kluczowe dla badań nad biologią rozwojową.
- Modele in vitro mogą pomóc w replikacji złożonych środowisk in vivo.
- Mikrowzórcowanie umożliwia kontrolowane badania zachowania komórek.
- Ilościowe obrazowace dostarcza wglądu w zjawiska subwizualne.
Cel badania
- Rozwój metody badania wzorców komórek in vitro.
- Optymalizacja parametrów mikrowzorcowania dla różnych typów komórek.
- Ułatwienie odkrywania nielosowych wzorców w zachowaniu komórek.
Zastosowane metody
- Mikrowzórcowanie chipów za pomocą wodoodpornych plastikowych poślizgów.
- Zasiewanie komórek zarodkowych na wzorcowanych chipach.
- Barwienie immunologiczne do wizualizacji wzorców komórek.
- Ilościowe obrazowace i analiza przy użyciu narzędzi oprogramowania.
Główne wyniki
- Komórki tworzyły gęste kolonie, które przylegały do mikrowzrorców.
- Sukcesywne wizualizowanie wzorców organizacji i różnicowania komórek.
- Zestawiono ilościowe dane dotyczące zachowania komórek.
- Metoda może być dostosowana do różnych typów komórek i warunków.
Wnioski
- Metoda zapewnia niezawodny sposób badania organizacji komórek in vitro.
- Pozwola na badanie złożonych pytań biologicznych w kontrolowanym środowisku.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować badania różnych systemów i warunków komórkowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative micropatterning and imaging of mammalian cells enables biopharma teams to interrogate emergent spatial organization and patterning mechanisms in vitro, decoupling environmental and endogenous cues. This approach supports predictive confidence in early discovery by revealing sub-visual patterning events and non-random differentiation within controlled systems. The method's accessibility and quantitative outputs position it as a reusable capability for target validation and mechanistic de-risking across diverse cell models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of spatial patterning and cell fate decisions in controlled environments.
- Supports functional target validation by decoupling physical and signaling influences on cell organization.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing sub-visual and non-random differentiation patterns.
- Provides quantitative data to inform predictive models and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, reproducible biological systems for downstream screening workflows.
- Standardizes assay conditions through defined micropatterns and quantitative imaging outputs.
- Enables reliable detection of subtle phenotypic changes and spatial heterogeneity.
- Supports scalability and platform reuse across multiple cell types and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro patterning models with disease-relevant spatial organization for translational continuity.
- Provides quantitative benchmarks for preclinical model validation and risk-adjusted advancement.
- Enables assessment of environmental and signaling contributions to cell fate relevant to disease modeling.
- Supports predictive de-risking by informing mathematical and computational models of patterning.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through assay development and translational research, enabling hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking in a standardized, quantitative framework.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of spatial patterning and environmental cue effects.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Provides high-content imaging and statistical outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by quantifying disease-relevant organization.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, open-source platform adaptable to diverse cell systems and R&D needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage research.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability across teams and projects.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, quantitative imaging, and data analysis.
- Needs standard laboratory equipment and open-source image analysis software.
- Demands cross-team standardization of micropatterning parameters for new cell types.
- Adaptable to various model systems with systematic optimization of pattern size, shape, and matrix.
- Potential limitations include colony-to-colony variability and need for robust statistical analysis.
