Mapowanie wyłaniającej się organizacji przestrzennej komórek ssaków za pomocą mikrowzorców i obrazowania ilościowego
30 kwietnia 2019
Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje mikrowzorce wraz z obrazowaniem ilościowym, aby ujawnić organizację przestrzenną w kulturach ssaków. Technika ta jest łatwa do wdrożenia w standardowym laboratorium biologii komórki i oferuje elastyczny system do badania wzorców in vitro.
Ta metoda umożliwia manipulowanie i ilościowe określanie, w jaki sposób komórki organizują się kolektywnie. Jest to ważne, ponieważ możemy modelować wzór in vitro i rozplątywać wskazówki ściśle sprzężone in vivo. Technika ta wymaga minimalnego specjalistycznego sprzętu, co pozwala na jej ustalenie w standardowym laboratorium biologicznym, i jest ilościowa, co umożliwia odkrycie zdarzeń związanych z wzorcami podwzrokowymi.
Metodę tę można łatwo zastosować do dowolnego systemu komórkowego, w którym mogą pojawić się wzorce, oraz do odkrywania nielosowych wzorców różnicowania, proliferacji i konkurencji między komórkami. Główną zaletą tej metody jest systematyczna optymalizacja parametrów mikrowzorcowania dla nowych typów komórek. Na przykład rozmiar i kształt wzoru, typ matrycy i czas adhezji komórek.
Zakładając rękawiczki, umieść kawałek filmu laboratoryjnego na dnie 10-centymetrowej kwadratowej szalki Petriego. Użyj 12-milimetrowego dziurkacza, aby wyciąć hydrofobowe szkiełka z tworzywa sztucznego, aby utworzyć szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 milimetrów, a następnie umieść szkiełka nakrywkowe na nowej szalce Petriego. Użyj pęsety, aby ostrożnie usunąć folię ochronną z szkiełek nakrywkowych.
Umieść maskę fotograficzną na czystej i stabilnej powierzchni, chromowaną stroną do góry i dodaj dwumikrolitrową kroplę podwójnie destylowanej wody w miejscu żądanego wzoru chipa. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do kropli i umieść uchwyt na plastikowych szkiełkach. Ostrożnie przymocuj tę kanapkę za pomocą zacisków, aby plastikowe elementy stykały się z maską fotograficzną.
Umieść zespół w lampie ultrafioletowej ozonu około dwóch centymetrów od źródła światła, aby uzyskać 10-minutowe oświetlenie. Pod koniec okresu oświetlenia chwyć kanapkę z maską fotograficzną na dole i ostrożnie zdejmij zaciski, utrzymując nacisk jedną ręką, aby zapobiec przesuwaniu się suwaków podczas demontażu kanapki. Gdy wszystkie zaciski zostaną usunięte, wyjmij uchwyt, uważając, aby wszystkie plastikowe kawałki nadal znajdowały się na masce i nie przykleiły się do uchwytu, a następnie dodaj podwójnie destylowaną wodę do wiórów, aby delikatnie odłączyć wióry od maski fotograficznej.
Umieść wióry z fotowzorem w komorze osadzania matrycy, podświetlaną stroną do góry i dodaj 200 mikrolitrów roztworu powlekającego na każdy chip. Następnie dodaj do komory trzycentymetrową szalkę Petriego wypełnioną podwójnie destylowaną wodą, aby ograniczyć parowanie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. W celu wysiewu komórek embrionalnych na wióry, należy umyć wiórki dwoma co najmniej pięciominutowymi płukaniami w świeżym, sterylnym PBS na pranie, a następnie dozować jeden razy dziesięć do piątych komórek w 200 mikrolitrach odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych na każdy chip.
Następnie zamknij komorę wysiewu. Inkubować przez godzinę, aby komórki przylgnęły do wiórów. Po przyczepieniu się komórek napełnij dołki płytki wielodołkowej 500 mikrolitrami ciepłego podłoża na dołek i użyj sterylnej pęsety, aby przenieść wióry do indywidualnych dołków na płytkę.
Energicznie wstrząsnąć płytką w celu oderwania wszelkich nieprzylegających komórek i natychmiast zastąpić supernatant świeżym, ciepłym podłożem. Następnie sprawdź pod mikroskopem, czy widoczny jest wzór. 48 godzin po ich posiewie komórki powinny uformować gęste kolonie, które rygorystycznie podążają za kształtem wzorów.
Pozostawiając wióry na płytce, usuń wszystko, z wyjątkiem wystarczającej ilości pożywki, aby zapobiec wyschnięciu frytek, i dodaj co najmniej 500 mikrolitrów paraformaldehydu lub roztworu utrwalającego na bazie PFA na dołek. Po dziesięciu minutach krótko przemyć studzienki trzykrotnie roztworem myjącym, a następnie raz przepłukać 50-milimolowym chlorkiem amonu rozcieńczonym w roztworze myjącym, aby ugasić resztkową aktywność sieciowania PFA. Po ostatnim przemyciu próbki należy traktować roztworem blokującym przez co najmniej 30 minut.
W celu barwienia immunologicznego kultur chipów, przenieś chipy do komory barwienia komórką do góry i natychmiast dodaj 100 mikrolitrów podstawowego roztworu przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania do każdego chipa. Po jednej godzinie na platformie obrotowej w temperaturze pokojowej umyć frytki trzykrotnie roztworem myjącym, jak pokazano, i inkubować wióry z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez jedną godzinę na platformie obrotowej. Pod koniec wtórnej inkubacji przeciwciał umyć chipy trzykrotnie w roztworze myjącym i zamontować chip na szkiełku mikroskopowym z 20 mikrolitrami dowolnego standardowego podłoża montażowego.
Aby zobrazować chipy, najpierw dostosuj prędkość skanowania, rozdzielczość obrazu, uśrednianie klatek i wzmocnienia detektora, aby określić optimum między jakością obrazu a czasem obrazowania. Następnie uzyskaj obrazy każdego chipa. Po uzyskaniu wszystkich obrazów zainstaluj i uruchom PickCells zgodnie z dokumentacją dostępną online, utwórz nowy eksperyment i zaimportuj obrazy do programu.
Użyj modułu Nessys do segmentacji jąder na podstawie sygnału obwiedni jądrowej. Użyj podstawowego modułu segmentacji, aby zidentyfikować sygnał autofluorescencji wzorca. Następnie kliknij Zakończ"i poczekaj, aż wszystkie obrazy zostaną przetworzone.
Aby utworzyć obiekty jądrowe i obliczyć podstawowe cechy obiektu, uruchom moduł Wewnętrzne cechy z paska zadań i zamknij panele Ellipsoid Fitter i Surface Extractor, aby otwarty był tylko panel Podstawowe funkcje. Wybierz jądro"jako Typ obiektu i wybierz podany prefiks podany dla podzielonych na segmenty obrazów. Następnie kliknij Oblicz"i poczekaj, aż wszystkie obrazy zostaną przetworzone.
Na tym etapie dodatkowe cechy muszą zostać zapisane w jądrach przed wyeksportowaniem danych do naszej analizy. Na przykład, aby zapisać nazwę obrazu, do którego należy każde jądro, jako atrybut jądra, kliknij Dane"i Nowy atrybut"i wybierz jądro"w wyskakującym oknie dialogowym. Kliknij OK"wybierz Zbieraj dane z innych obiektów połączonych z węzłem"i kliknij Dalej"W lewym panelu wybierz Obraz" i kliknij dwukrotnie znak zapytania, aby ustawić węzeł obrazu jako cel ścieżki.
Rozwiń okienko Operacja redukcji i wybierz pozycję Pobierz jeden"Rozwiń okienko Dostępne atrybuty i wybierz atrybut Nazwa. Następnie kliknij Zmień"i Dalej"Wprowadź nazwę obrazu, naciśnij Tab i kliknij Zakończ"Następnie wyeksportuj dane do pliku wartości rozdzielanych tabulatorami. Na potrzeby naszej analizy zapętl wyeksportowane dane do folderu danych w folderze R-Script.
Otwórz nasze studio"i otwórz szablon mapy z koszem R-Script"Następnie ustaw katalog roboczy na lokalizację pliku źródłowego i uruchom skrypt, aby wygenerować mapy gęstości. Po upływie jednej godziny od wysiewu komórek poszczególne wzorce kultur komórkowych mogą nie być w pełni zlewne, ponieważ komórki namnażają się w czasie. Jednak wzory zostaną w pełni skolonizowane, a na zewnątrz powierzchni kleju znajdzie się tylko bardzo niewiele komórek.
Wzór, który nie jest wyraźny do dwóch godzin po wysiewie, wskazuje na niepowodzenie procedury. Przestrzenne uwięzienie embrionalnych komórek macierzystych myszy na dużych dyskach lub mikrowzorach pierścieniowych kieruje wzorcowaniem subpopulacji komórek wykazujących ekspresję mezodermalnego markera brachyury. Na przykład, gdy embrionalne komórki macierzyste myszy są hodowane na mikrowzorach o dużym dysku, komórki brachyury-dodatnie są preferencyjnie ograniczone do obrzeży wzorca, gdzie lokalna gęstość komórek jest najniższa.
Ten wzorzec jest potwierdzony przez mapę intensywności brachyury mózgu. Dane te pokazują, że metoda może ujawnić informacje subwizualne, ponieważ inspekcja jednej kolonii nie jest wystarczająca do zidentyfikowania jakiejkolwiek formy organizacji przestrzennej w wyrażaniu markerów zainteresowania. Wyjaśnia to w szczególności istotna zmienność między koloniami.
Technika ta pokazuje również, że nie istnieje wykrywalny wzorzec dla inhibitora wiązania DNA, co może wskazywać, że wzorzec T nie jest napędzany przez sygnalizację morfogenetyczną białka kości w tym kontekście. Zawsze pamiętaj, która strona szkiełka nakrywkowego została usunięta i pokryta, a także upewnij się, że komórki prawidłowo przylegają przed zmyciem nadmiaru komórek. Metoda ta pozwala na badanie sygnałów środowiskowych ważnych w kierowaniu samoorganizacją komórek, a także może informować o modelach matematycznych, które pomagają nam lepiej radzić sobie z podstawowymi wzorcami.
Przegląd
Metoda ta umożliwia manipulowanie organizacją komórek in vitro oraz jej kwantyfikację, co pozwala badaczom modelować wzory i wyodrębniać sygnały występujące in vivo. Jest ona łatwa do wdrożenia w standardowych laboratoriach biologicznych i ułatwia odkrywanie zdarzeń związanych z tworzeniem wzorów, które są niewidoczne dla oka.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Techniki mikrowzorowania
- Obrazowanie ilościowe
Wstęp
- Zrozumienie organizacji komórek jest kluczowe dla badania biologii rozwoju.
- Modele in vitro mogą pomóc w odtworzeniu złożonych środowisk in vivo.
- Mikrowzorcowanie umożliwia kontrolowane badania zachowania komórek.
- Obrazowanie ilościowe dostarcza informacji na temat zjawisk niewidocznych gołym okiem.
Cel badania
- Opracowanie metody badania wzorców komórkowych in vitro.
- Optymalizacja parametrów mikrowzorowania dla różnych typów komórek.
- Umożliwienie wykrywania nielosowych wzorców w zachowaniu komórek.
Zastosowane metody
- Mikrowzorowanie płytek z wykorzystaniem hydrofobowych szkiełek plastikowych.
- Wysiew komórek embrionalnych na wzorowane płytki.
- Immunobarwienie w celu wizualizacji wzorów komórkowych.
- Ilościowe obrazowanie i analiza z wykorzystaniem narzędzi programistycznych.
Główne wyniki
- Komórki utworzyły gęste kolonie, które przylgnęły do mikrowzorców.
- Pomyślna wizualizacja organizacji komórek oraz wzorców ich różnicowania.
- Uzyskano ilościowe dane dotyczące zachowania komórek.
- Metodę można dostosować do różnych typów komórek i warunków.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia niezawodny sposób badania organizacji komórek in vitro.
- Umożliwia ona zgłębianie złożonych zagadnień biologicznych w kontrolowanym środowisku.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować badanie różnych układów i warunków komórkowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe mikrowzorowanie i obrazowanie komórek ssaków pozwala zespołom biofarmaceutycznym na badanie wyłaniającej się organizacji przestrzennej i mechanizmów wzorowania in vitro, oddzielając sygnały środowiskowe od endogennych. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną na wczesnym etapie odkrywania leków, ujawniając podprogowe zdarzenia wzorowania oraz nierandomowe różnicowanie w kontrolowanych systemach. Dostępność tej metody oraz jej ilościowe wyniki sprawiają, że stanowi ona wielokrotnego użytku narzędzie do walidacji celów i ograniczania ryzyka mechanistycznego w różnorodnych modelach komórkowych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia systematyczną analizę wzorców przestrzennych i decyzji dotyczących losów komórek w kontrolowanych środowiskach.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez oddzielenie wpływów fizycznych od sygnałowych na organizację komórek.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ujawnianie subwizualnych i nielosowych wzorców różnicowania.
- Dostarcza danych ilościowych służących do opracowywania modeli predykcyjnych i triage'u portfela projektów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane, powtarzalne systemy biologiczne do dalszych etapów procesów przesiewowych.
- Standaryzuje warunki testowe poprzez zdefiniowane mikrowzory i ilościowe wyniki obrazowania.
- Umożliwia niezawodną detekcję subtelnych zmian fenotypowych oraz heterogeniczności przestrzennej.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy dla wielu typów komórek i warunków eksperymentalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uzgadnia modele wzorcowania in vitro z organizacją przestrzenną istotną dla danej choroby w celu zachowania ciągłości translacyjnej.
- Zapewnia ilościowe punkty odniesienia dla walidacji modeli przedklinicznych i rozwoju skorygowanego o ryzyko.
- Umożliwia ocenę wpływu czynników środowiskowych i sygnałowych na losy komórek w kontekście modelowania chorób.
- Wspiera predykcyjne ograniczanie ryzyka poprzez dostarczanie danych do matematycznych i obliczeniowych modeli wzorcowania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje procesy od wczesnego etapu odkrywania, poprzez rozwój testów, aż po badania translacyjne, umożliwiając weryfikację hipotez, wyjaśnienie szlaków sygnałowych oraz ograniczanie ryzyka biologicznego w ramach ustandaryzowanego, ilościowego schematu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wzorców przestrzennych i efektów bodźców środowiskowych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki niezbędne do standaryzacji testów i oceny związków.
- Analityka: Umożliwia obrazowanie wysokotreściowe oraz analizy statystyczne dla rzetelnego porównania warunków.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia in vitro z modelami przedklinicznymi poprzez kwantyfikację organizacji istotnej w kontekście choroby.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Oferuje elastyczną platformę otwartoźródłową, którą można dostosować do różnorodnych układów komórkowych i potrzeb badawczo-rozwojowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną we wczesnych etapach badań.
- Wartość operacyjna: sprzyja standaryzacji, powtarzalności i skalowalności w ramach zespołów i projektów.
- Wartość strategiczna: umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne zarządzanie kapitałem w portfelu projektów.
- Wpływ na portfel: wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów odkrywczych.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórkowej, obrazowaniu ilościowym oraz analizie danych.
- Wymaga standardowego wyposażenia laboratoryjnego oraz otwartoźródłowego oprogramowania do analizy obrazu.
- Wymaga standaryzacji parametrów mikrowzorowania między zespołami dla nowych typów komórek.
- Możliwość adaptacji do różnych systemów modelowych poprzez systematyczną optymalizację rozmiaru, kształtu i macierzy wzoru.
- Potencjalne ograniczenia obejmują zmienność między koloniami oraz konieczność przeprowadzenia rygorystycznej analizy statystycznej.
