Name: Mapowanie wyłaniającej się organizacji przestrzennej komórek ssaków za pomocą mikrowzorców i obrazowania ilościowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Poznaj metodę mikrowzorcowania i obrazowania ilościowego do badania organizacji przestrzennej komórek ssaków in vitro. Technika umożliwia modelowanie wzorców komórkowych i odkrywanie zjawisk niewidocznych gołym okiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez stypendium podoktorskie Sir Henry'ego Wellcome'a (WT100133 do G.B.), stypendium Wellcome Trust Senior Fellowship (WT103789AIA do S.L.) oraz stypendium doktoranckie Wellcome Trust do (108906/Z/15/Z do D.W.). Jesteśmy również wdzięczni dr Manuelowi Thery'emu za jego rady dotyczące adaptacji techniki fotomodelowania.

<ol><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosystems+dynamics+in+self-organization+of+tissue+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture.</a> Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).</li>
<li>Turner, D. A., Baillie-Johnson, P., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+and+the+genetically+encoded+self-assembly+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Organoids and the genetically encoded self-assembly of embryonic stem cells.</a> BioEssays. 38 (2), 181-191 (2016).</li>
<li>Simunovic, M., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryoids%2C+organoids+and+gastruloids%3A+new+approaches+to+understanding+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis.</a> Development. 144 (6), 976-985 (2017).</li>
<li>Tewary, M., Shakiba, N., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+bioengineering%3A+building+from+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Stem cell bioengineering: building from stem cell biology.</a> Nature Reviews. Genetics. 19 (10), 595-614 (2018).</li>
<li>Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+and+reconstructing+the+mouse+and+human+early+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo.</a> Nature Cell Biology. 20 (8), 878(2018).</li>
<li>Laurent, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+microengineering+and+cellular+self-organization+towards+functional+tissue+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Convergence of microengineering and cellular self-organization towards functional tissue manufacturing.</a> Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 939(2017).</li>
<li>McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+shape%2C+cytoskeletal+tension%2C+and+RhoA+regulate+stem+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment.</a> Developmental Cell. 6 (4), 483-495 (2004).</li>
<li>Tewary, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+model+of+Reaction-Diffusion+and+Positional-Information+governs+self-organized+human+peri-gastrulation-like+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A stepwise model of Reaction-Diffusion and Positional-Information governs self-organized human peri-gastrulation-like patterning.</a> Development. , (2017).</li>
<li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).</li>
<li>Blin, G., Wisniewski, D., Picart, C., Thery, M., Puceat, M., Lowell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometrical+confinement+controls+the+asymmetric+patterning+of+brachyury+in+cultures+of+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Geometrical confinement controls the asymmetric patterning of brachyury in cultures of pluripotent cells.</a> Development. 145 (18), (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Micropatterning+in+cell+biology.+Pt.+A%22">Micropatterning in cell biology. Pt. A</a>. , Elsevier. Amsterdam. (2014).</li>
<li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+human+embryonic+stem+cell+colony+and+aggregate+size+heterogeneity+influences+differentiation+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), Dayton, Ohio. 2300-2310 (2008).</li>
<li>Heemskerk, I., Burt, K., Miller, M., Chabra, S., Guerra, M. C., Warmflash, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogen+dynamics+control+patterning+in+a+stem+cell+model+of+the+human+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Morphogen dynamics control patterning in a stem cell model of the human embryo.</a> bioRxiv. , 202366(2017).</li>
<li>Nemashkalo, A., Ruzo, A., Heemskerk, I., Warmflash, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogen+and+community+effects+determine+cell+fates+in+response+to+BMP4+signaling+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Morphogen and community effects determine cell fates in response to BMP4 signaling in human embryonic stem cells.</a> Development. 144 (17), 3042-3053 (2017).</li>
<li>Peerani, R., Onishi, K., Mahdavi, A., Kumacheva, E., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+signaling+thresholds+in+%E2%80%9Cengineered+stem+cell+niches%E2%80%9D+identifies+design+criteria+for+pluripotent+stem+cell+screens%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Manipulation of signaling thresholds in “engineered stem cell niches” identifies design criteria for pluripotent stem cell screens.</a> PloS One. 4 (7), e6438(2009).</li>
<li>Peerani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-mediated+control+of+human+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation.</a> The EMBO journal. 26 (22), 4744-4755 (2007).</li>
<li>Etoc, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Balance+between+Secreted+Inhibitors+and+Edge+Sensing+Controls+Gastruloid+Self-Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A Balance between Secreted Inhibitors and Edge Sensing Controls Gastruloid Self-Organization.</a> Developmental Cell. 39 (3), 302-315 (2016).</li>
<li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+micropatterns%3A+A+direct+printing+protocol+using+deep+UVs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep UVs.</a> Methods in Cell Biology. 97, 133-146 (2010).</li>
<li>Théry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).</li>
<li>Degot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Visualization+and+Quantitative+Analysis+of+Drug+Effects+Using+Micropatterned+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%29%22%5BJournal%5D)">Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (46), e2514(2010).</li>
<li>Beddington, R. S. P., Rashbass, P., Wilson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brachyury+-+a+gene+affecting+mouse+gastrulation+and+early+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brachyury - a gene affecting mouse gastrulation and early organogenesis.</a> Development. 116 (Supplement), 157-165 (1992).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Bhatt, S., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+the+mouse+T+gene+and+its+role+in+mesoderm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of the mouse T gene and its role in mesoderm formation.</a> Nature. 343 (6259), 657-659 (1990).</li>
<li>Hollnagel, A., Oehlmann, V., Heymer, J., Rüther, U., Nordheim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Id+Genes+Are+Direct+Targets+of+Bone+Morphogenetic+Protein+Induction+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Id Genes Are Direct Targets of Bone Morphogenetic Protein Induction in Embryonic Stem Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19838-19845 (1999).</li>
<li>Mountford, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicistronic+targeting+constructs%3A+reporters+and+modifiers+of+mammalian+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dicistronic targeting constructs: reporters and modifiers of mammalian gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4303-4307 (1994).</li>
<li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+tissue+culture+methods%22%5BJournal%5D)">Culture and differentiation of embryonic stem cells.</a> Journal of tissue culture methods. 13 (2), 89-94 (1991).</li>
<li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metadata+matters%3A+access+to+image+data+in+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).</li>
<li>Blin, G., Sadurska, D., Migueles, R. P., Chen, N., Watson, J. A., Lowell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nessys%3A+a+novel+method+for+accurate+nuclear+segmentation+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Nessys: a novel method for accurate nuclear segmentation in 3D.</a> bioRxiv. , 502872(2018).</li>
<li>Weiswald, L. -B., Guinebretière, J. -M., Richon, S., Bellet, D., Saubaméa, B., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+protein+expression+in+tumour+spheres%3A+development+of+an+immunostaining+protocol+for+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">In situ protein expression in tumour spheres: development of an immunostaining protocol for confocal microscopy.</a> BMC cancer. 10, 106(2010).</li>
<li>R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.R-project.org/">http://www.R-project.org/</a> (2013).</li>
<li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+human+embryonic+stem+cells+on+micropatterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2223-2232 (2016).</li>
<li>Ostblom, J., Nazareth, E. J. P., Tewary, M., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-explorer%3A+Analysis+of+spatially+organized+protein+expression+in+high-throughput+screens%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Context-explorer: Analysis of spatially organized protein expression in high-throughput screens.</a> PLOS Computational Biology. 15 (1), e1006384(2019).</li>
<li>Larue, L., Ohsugi, M., Hirchenhain, J., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+null+mutant+embryos+fail+to+form+a+trophectoderm+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">E-cadherin null mutant embryos fail to form a trophectoderm epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (17), 8263-8267 (1994).</li>
<li>Pieters, T., van Roy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cell-cell+adhesion+complexes+in+embryonic+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of cell-cell adhesion complexes in embryonic stem cell biology.</a> J Cell Sci. 127 (12), 2603-2613 (2014).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Morgani, S. M., Metzger, J. J., Nichols, J., Siggia, E. D., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropattern+differentiation+of+mouse+pluripotent+stem+cells+recapitulates+embryo+regionalized+cell+fate+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Micropattern differentiation of mouse pluripotent stem cells recapitulates embryo regionalized cell fate patterning.</a> eLife. 7, e32839(2018).</li>
<li>Ulman, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+objective+comparison+of+cell-tracking+algorithms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An objective comparison of cell-tracking algorithms.</a> Nature Methods. 14 (12), 1141(2017).</li>
<li>Moir, R. D., Yoon, M., Khuon, S., Goldman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Lamins+a+and+B1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear Lamins a and B1.</a> The Journal of Cell Biology. 151 (6), 1155-1168 (2000).</li>
<li>McDole, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Toto+Imaging+and+Reconstruction+of+Post-Implantation+Mouse+Development+at+the+Single-Cell+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In Toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level.</a> Cell. 175 (3), 859-876 (2018).</li>
<li>Stegmaier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Three-Dimensional+Cell+Segmentation+in+Large-Scale+Microscopy+Data+of+Developing+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos.</a> Developmental Cell. 36 (2), 225-240 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

W tym miejscu opisujemy metodę analizy pojawiających się wzorców w kulturach komórkowych. Do standaryzacji kształtu i wielkości kolonii komórkowych stosuje się uproszczone podejście do mikrowzorców, a my prezentujemy narzędzia do analizy obrazu i skrypty R, które umożliwiają wykrywanie i kwantyfikację wzorców w obrębie tych kolonii.
Proponowana przez nas metoda jest do pewnego stopnia podobna do wcześniej opublikowanej metody31 , w której autorzy koncentrują się na warunkach hodowli, wykorzystując komercyjnie dostępne mikrowzorce, w celu uzyskania powtarzalnego tworzenia listków zarodkowych w koloniach ESC do badania wczesnych zdarzeń gastrulacji in vitro. Nasz cel jest bardziej skoncentrowany na dostarczeniu uogólnionego potoku do odkrycia tworzenia wzorców in vitro, gdzie zbiorowa organizacja komórek może stać się widoczna dopiero po analizie statystycznej. Z tego powodu zapewniamy solidny proces analizy obrazu, który umożliwia dokładną identyfikację i analizę pozycji jądra w przestrzeni 3D nad wieloma koloniami (patrz również sekcja "Zalety i ograniczenia metody wykrywania wzorców" w tym omówieniu). Zdecydowaliśmy się również na opracowanie prostego, wewnętrznego podejścia do mikrowzorów, które oferuje bardziej elastyczną i tańszą alternatywę dla komercyjnie dostępnych rozwiązań w dłuższej perspektywie, co mamy nadzieję będzie przydatne dla społeczności.
Na koniec zauważamy, że podczas rewizji tego manuskryptu wydano nowy pakiet do analizy wzorców in vitro podobny do naszych skryptów R32. Ten nowy pakiet akceptuje tabele cech komórek jako dane wejściowe, które można uzyskać z wysokoprzepustowych platform obrazowania. Uważamy, że tabela cech jąder wygenerowana w kroku 7 naszego protokołu mogłaby w zasadzie służyć jako dane wejściowe do tego nowego pakietu, chociaż sami nie testowaliśmy tej możliwości.
Możliwość dostosowania metody do innych typów komórek i geometrii kolonii
Podejście to prezentujemy w kontekście badania powstawania mezodermalnych czynników transkrypcyjnych w hodowlach komórek pluripotencjalnych w obecności surowicy. Metodę tę można jednak łatwo dostosować do innych typów komórek i hodowli bez surowicy, chociaż może być konieczna optymalizacja stężeń ECM/poloksamu 407 (patrz Tabela 1 dla badanych stężeń i Tabela 2 dla przewodnika rozwiązywania problemów). Metoda może być również dostosowana do większych lub mniejszych rozmiarów mikrowzorów oraz do szerokiej gamy kształtów w zależności od potrzeb użytkownika. Jednak podczas ustalania metody ważne jest, aby mieć świadomość, że nie wszystkie kombinacje kształtu/typu komórki są optymalne. Na przykład mESC wyraża wysokie poziomy E-kadheryny33, 34 umożliwiając tym komórkom tworzenie zbiorowych struktur obejmujących obszary pozbawione ECM. Komórki te nie są ściśle zgodne z geometriami o ostrych kątach lub z małymi otworami we wzorze. Zauważ na przykład, że na pierścieniu na rysunku 3B komórki są w trakcie kolonizacji obszaru centralnego. W naszych rękach mniejszy obszar centralny nie zmuszał mESC do tworzenia kolonii w kształcie pierścienia. Dlatego zdecydowanie zaleca się uwzględnienie różnorodności geometrii podczas projektowania fotomaski, aby móc przetestować i zidentyfikować optymalne rozmiary i krzywizny, które będą odpowiednie dla wybranego typu komórki.
Innym ważnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest długość eksperymentu i tempo proliferacji komórek. W przypadku niektórych szybko proliferujących typów komórek (w tym komórek pluripotencjalnych) utrzymanie komórek na mikrowzorcach przez wiele dni może być trudne (w przypadku mESC trzy dni to maksimum). Również wysiewanie komórek na mikrowzorcach nie zawsze przebiega optymalnie dla każdej kolonii, dlatego wskazane jest wysiewanie nadmiaru kolonii, aby mieć zapasowe.
Zalety i ograniczenia metody wykrywania wzorców
Szczególną zaletą tej metody jest możliwość wykrywania "uśrednionych" wzorców poprzez łączenie wyników analizy obrazu z wielu powtórzonych kolonii (ryc. 5). Może to ujawnić wzorce zdarzeń, które nie są widoczne podczas inspekcji poszczególnych kolonii. Wadą tego podejścia "uśredniającego" jest to, że może ono pominąć pewne rodzaje powtarzających się wzorów, na przykład małe plamki lub wąskie paski. Jednak tego typu wzory mogą zostać ujawnione za pomocą kombinacji starannie dobranych rozmiarówwzorów 8. Ponadto opisany tutaj potok analizy obrazu dostarcza danych ilościowych zarówno w rozdzielczości pojedynczej komórki, jak i kolonii, oferując możliwość zbadania poziomu zmienności między koloniami (ryc. 5) lub przeprowadzenia analizy sąsiadów w wielu skalach10.
Kolejną ważną zaletą metody uśredniania jest to, że daje ona możliwość mapowania preferencyjnej lokalizacji wielu markerów bez ograniczeń dostępnych fluoroforów kanałów detekcji. Rzeczywiście, chociaż w prezentowanej tu pracy posługujemy się tylko dwoma markerami różnicowania, zdolność do standaryzacji kolonii i wyodrębniania "uśrednionych" wzorców umożliwia porównanie map rozmieszczenia z różnych zestawów kolonii w celu ujawnienia uogólnionych relacji przestrzennych markerów względem siebie.
Ponadto, mimo że skupiliśmy się tutaj na badaniu markerów różnicowania, metoda analizy może zostać rozszerzona o badanie innych procesów biologicznych, dla których dostępne są markery jądrowe. Na przykład mikrowzorzec linii komórkowej zawierającej wskaźnik cyklu komórkowego ubikwitynacjifluorescencji 35 (FUCCI) umożliwiłby zbadanie, w jaki sposób geometria na poziomie kolonii może wpływać na zdarzenia cyklu komórkowego w grupie.
Kierunki na przyszłość
Metoda ta jest podatna na średnioprzepustową analizę obrazów, jednak pozyskiwanie obrazów nie jest obecnie w pełni zautomatyzowane i może stać się ograniczeniem w przypadku bardzo dużych eksperymentów. Regularne rozmieszczenie kolonii powinno umożliwić stworzenie w pełni zautomatyzowanych procedur akwizycji, podobnych do tych, które zostały opracowane dla średniej liczby pojedynczych komórek20. Jednak ze względu na to, że rozmiar pola wymagany do zobrazowania kolonii jest duży, co może wymagać mozaikowania, a także dlatego, że kolonie są trójwymiarowe, wysoce pożądane jest zmniejszenie zarówno rozmiaru zestawu danych, jak i czasu akwizycji poprzez obrazowanie tylko odpowiednich kolonii. W związku z tym w przyszłości możliwe jest podjęcie działań mających na celu opracowanie "inteligentnego" mikroskopu zdolnego do identyfikacji odpowiednich kolonii i dostosowania współrzędnych obrazowania do każdej próbki. Pozwoli to nie tylko skrócić czas i wysiłek, ale także zapobiec potencjalnym uprzedzeniom operatora.
Potoki analizy mogą być również bardziej wydajne dzięki zmniejszeniu liczby kroków, które użytkownik musi wykonać. Mamy w planach zbudowanie mechanizmu budowania potoków i zintegrowanie R bezpośrednio z naszym oprogramowaniem (zobacz także problemy pickcells-api#3 i pickcells-rjava#1 w narzędziu do śledzenia problemów w naszych repozytoriach kodu [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues]). Pełna automatyzacja procedury analizy zmniejszy czas i wysiłek oraz ograniczy potencjalne błędy użytkowników.
Na koniec zauważamy, że nasza metoda analizy nie oddaje jeszcze w pełni dynamicznej natury wzorców komórkowych. Niektóre ograniczone informacje dynamiczne można wyodrębnić, badając szeregi czasowe obrazówmigawkowych 8,10,36. Jednak możliwość rejestrowania historii populacji komórek jest wysoce pożądana, jeśli chcemy lepiej zrozumieć, w jaki sposób pojawiają się wzorce. Jednym z ograniczeń jest to, że dokładne śledzenie pojedynczych komórek w gęstej populacji komórek 3D pozostaje bardzo trudnym zadaniem37. Nasza metoda wykrywania komórek wykorzystuje otoczkę jądrową i działa szczególnie dobrze w przypadku gęstych i nakładających się na siebie populacji komórek28. Żywe reportery otoczki jądrowej są łatwo dostępne28,38, a jedną z zalet techniki mikromodelowania jest to, że można ją wykorzystać do zapobiegania przemieszczaniu się komórek poza pole widzenia podczas długotrwałego obrazowania. Ogólnie rzecz biorąc, jesteśmy przekonani, że zautomatyzowane śledzenie komórek będzie możliwe do osiągnięcia przy użyciu kombinacji niedawno opracowanych narzędzi 28,39,40 i że powinno to przynieść nowe informacje na temat podstawowych zasad samoorganizacji.

W systemach ssaków, wzorce są emergentną właściwością zbiorowego zachowania komórek, a więc wzorce mogą powstawać in vitro, jeśli odpowiednie wskazówki zostaną dostarczone do komórek1,2,3,4,5,6. Jednym ze sposobów ujawnienia wewnętrznej zdolności komórek do samoorganizacji in vitro jest zmuszenie komórek do tworzenia grup/kolonii o określonych kształtach i rozmiarach7,8,9,10. Techniką, która to umożliwia, jest micropatterning11. Mikromodelowanie umożliwia precyzyjne określenie miejsca, w którym cząsteczki macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) osadzają się na powierzchni. To z kolei dyktuje, gdzie komórki mogą przylegać, a tym samym kontroluje, jak komórki organizują się przestrzennie.
Mikromodelowanie to technika o wielu zastosowaniach, na przykład mikromodelowanie umożliwia standaryzację warunków początkowych przed różnicowaniem12. Co ważne, mikrowzorce umożliwiają łatwą kontrolę wielkości, kształtu i odstępów między koloniami komórkowymi, a właściwość ta może być wykorzystana do opracowania eksperymentów mających na celu zbadanie zbiorowej odpowiedzi komórek na morfogen lub na sygnały fizyczne7,8,10,13,14,15,16,17.
Opracowano kilka metod tworzenia mikrowzorów11. Techniki fotowzorcowania są prawdopodobnie najłatwiejszymi metodami do ustanowienia18. Podejścia te mają również tę zaletę, że są precyzyjne, ponieważ mogą być używane do kontrolowania kształtu pojedynczych komórek18,19,20. Wymagają jednak również drogiego specjalistycznego sprzętu, w tym powlekarki wirowej, komory plazmowej i środka czyszczącego UVO (UV-Ozone), które na ogół nie są łatwo dostępne w standardowych laboratoriach biologicznych. Aby ułatwić przyjęcie tej techniki, dostosowaliśmy protokół tak, aby wymagał tylko lampy UVO. Zaczynamy od dostępnych na rynku szkiełek plastikowych, które można przyciąć nożyczkami lub dziurkaczem do pożądanego formatu.
Jednym z ważnych zastosowań mikrowzorów jest możliwość standaryzacji kolonii w celu porównania poszczególnych kolonii w wielu powtórzeniach. Pozwala to na pytanie, w jakim stopniu tworzenie się wzorców w tych koloniach jest powtarzalne, oraz na zbadanie czynników, które wpływają na odporność procesu tworzenia wzorców. Co ważne, kwantyfikacja "uśrednionych" wzorców w wielu standaryzowanych koloniach może również ujawnić procesy wzorcowe, które w przeciwnym razie nie byłyby widoczne. Zaletą możliwości ilościowego określenia wzorców na standaryzowanych koloniach jest możliwość dokładnego pomiaru ekspresji białek, najlepiej na poziomie pojedynczej komórki. Jednak komórki na mikrowzorach są często ciasno upakowane, co utrudnia ich segmentację z dużą dokładnością. Komórki często organizują się w trzech, a nie dwóch wymiarach, a wykrycie i zachowanie informacji trójwymiarowych (3D) podczas segmentacji może być trudne. Po pomyślnej segmentacji komórek potrzebne są metody obliczeniowe do wyodrębnienia informacji o wzorcach z wynikowych zestawów danych.
Opracowaliśmy narzędzia do segmentacji i analizy obrazów, aby pomóc przezwyciężyć te problemy. Ta metoda analizy wykorzystuje wyłącznie bezpłatne oprogramowanie o otwartym kodzie źródłowym i nie wymaga znajomości wiersza poleceń ani programowania do wdrożenia. Aby zilustrować tę metodę, używamy mysich embrionalnych komórek macierzystych (mES), które spontanicznie wyrażają marker wczesnego różnicowania brachyury (Tbra)21,22. Chociaż żaden widoczny układ przestrzenny nie jest wykrywalny wizualnie, metoda ta pozwala na stworzenie mapy preferencyjnego rozmieszczenia komórek T+ w koloniach. Pokazujemy również, że wzorzec Tbra kontrastuje z brakiem preferencyjnej lokalizacji komórek wyrażających Id1, bezpośredni odczyt szlaku białka morfogenetycznego kości (BMP)23. Omówiono również obecne ograniczenia metody i sposób, w jaki można ją zaadaptować do innych systemów eksperymentalnych.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>uchwyt w dygestoriach</td></tr><tr><td>1 i razy; Mistrzowska kwarcowa antyrefleksyjna chromowa maska</td><td>fotograficzna Toppan Photomask</td><td>Niestandardowy projekt</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>4-dołkowe płytki</td><td>Nunclon Delta</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>5% Surowica osła</td><td>Sigma</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwjądrowy kompleks porów</td><td>Abcam</td><td>ab24609</td><td>Mysz monoklonalna, użyj 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-Id1</td><td>Biocheck</td><td>37-2</td><td>Królik poliklonalny, stosować 1:200</td></tr><tr><td>Anti-Lamin B1</td><td>Abcam</td><td>ab16048</td><td>Poliklonalny królik, stosować 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-Tbra</td><td>R& D</td><td>AF2085</td><td>Kozioł ployklonal, stosować 1:400</td></tr><tr><td>Roztwór blokujący</td><td>NA</td><td>NA</td><td>0,1% TritonX-100 0,01% Pluronic F-127 5% Surowica dla osła 0,003% Azek sodu W PBS</td></tr><tr><td>CGR8 mESC</td><td>NA</td><td></td><td>Odniesienie: Mountford i wsp. PNAS, 1994</td></tr><tr><td>Roztwór utrwalający</td><td>NA</td><td>NA</td><td>4% PFA rozcieńczony w roztworze myjącym</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td>Partie surowicy <td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>muszą zostać przetestowane w celu zapewnienia zgodności z konserwacją ESC</td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Medium</td><td>Sigma</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>Film laboratoryjny</td><td>VWR</td><td>291-1212</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do edytora układu</td><td>LayoutEditor</td><td>NA</td><td>https://layouteditor.com/</td></tr> <tr><td>Edytor układu Oprogramowanie</td><td>Klayout</td><td>NA</td><td>https://www.klayout.de/</td></tr> <tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>mESC Pożywka</td><td>hodowlana NA</td><td></td><td>GMEM 10% FCS 100 U/ml LIF 100 nM 2-merkaptoetanol 1 razy; aminokwasy endogenne kwasy, 2 mM L-glutamina 1 mM pirogronian sodu</td></tr><tr><td>NH4Cl 50mM</td><td>Sigma</td><td>9718</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>UWAGA: Toksyczny, należy obchodzić się z nierozcieńczonymi substancjami w dygestoriach i nosić sprzęt ochronny</td></tr><tr><td>PBS (barwienie immunologiczne)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td>Rozcieńczyć w 200 ml ddH2O</td></tr><tr><td>PBS (hodowla tkankowa)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice plastikowe</td><td>Ibidi</td><td>IB-10813</td><td></td></tr><tr><td>Poloxamer 407</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Sondy molekularne</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma</td><td>8591</td><td>UWAGA: Toksyczny, uchwyt w dygestoriach i noszenie sprzętu ochronnego</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>UVO cleaner</td><td>Jetlight, USA</td><td>42-220</td><td>UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta s Zalecenia bezpieczeństwa</td></tr><tr><td>Roztwór myjący</td><td>NA</td><td>NA</td><td>0,1% TritonX-100 0,01% Pluronic F-127 W PBS</td></tr></tbody></table>

mapowanie wyłaniającej się organizacji przestrzennej komórek ssaków za pomocą mikrowzorców i obrazowania ilościowego

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

Podstawowym celem w biologii jest zrozumienie, w jaki sposób wzorce pojawiają się podczas rozwoju. Kilka grup wykazało, że wzorce można osiągnąć in vitro, gdy komórki macierzyste są przestrzennie ograniczone do mikrowzorców, tworząc w ten sposób modele eksperymentalne, które oferują unikalne możliwości zidentyfikowania, in vitro, podstawowych zasad organizacji biologicznej.
Tutaj opisujemy naszą własną implementację metodologii. Dostosowaliśmy technikę foto-patterningu, aby zmniejszyć zapotrzebowanie na specjalistyczny sprzęt, aby ułatwić ustalenie metody w standardowym laboratorium biologii komórki. Opracowaliśmy również darmową, otwartą i łatwą w instalacji platformę do analizy obrazu, aby precyzyjnie zmierzyć preferencyjne położenie subpopulacji komórek w koloniach o standardowych kształtach i rozmiarach. Metoda ta umożliwia ujawnienie istnienia zdarzeń wzorcowych nawet w pozornie zdezorganizowanych populacjach komórek. Technika ta zapewnia wgląd ilościowy i może być wykorzystana do rozdzielenia wpływów środowiska (np. sygnałów fizycznych lub sygnalizacji endogennej) na dany proces wzorcowania.

Opisana tutaj metoda fotowzorowania umożliwia precyzyjną organizację hodowlanych komórek w kolonie o zdefiniowanych kształtach i rozmiarach. Sukces tej procedury powinien być wyraźnie widoczny bezpośrednio po wysiewaniu komórek (krok 3.7), ponieważ przylegające komórki będą gromadzić się zgodnie z projektem fotomaski, jak pokazano na Rysunku 2a. Po 1 h od wysiewania poszczególne wzory mogą nie być w pełni zlewne (tylko kilka komórek na wzór), jednak w miarę proliferacji komórek z czasem wzory zostaną całkowicie skolonizowane, a poza powierzchniami adhezyjnymi znajdzie się jedynie bardzo niewiele komórek (Rysunek 2b). Dokładny wygląd hodowli będzie zależny od linii komórkowej. Na przykład mESC tworzą kopułowate kolonie10. Chip, na którym wzorowanie nie jest wyraźne od 1 do 2 h po wysiewaniu komórek, wskazuje na niepowodzenie procedury (Rysunek 2c,d).
Duże i grube kolonie mogą czasami stanowić wyzwanie w kontekście jednorodnego barwienia. Sugerujemy przeprowadzenie fiksacji i permeabilizacji komórek w jednym kroku (sekcja 4), ponieważ może to poprawić penetrację przeciwciał29. Jest to powód, dla którego wybrany roztwór fiksacyjny zawiera detergent. Rysunek 3 przedstawia sygnał fluorescencyjny spodziewany po immunobarwieniu. Zauważmy, że jasne komórki Id1-dodatnie znajdują się w gęstych obszarach (jasne obszary NPC) kolonii (Rysunek 3A). Takie wskazówki są pomocne przy ocenie jakości procedury barwienia przeciwciałami. Należy również zauważyć, że mikrowzory utworzone za pomocą obecnej techniki wykazują autofluorescencję. Sygnał ten (Rysunek 3A,B najlewiejsze obrazy) jest przydatny na etapie analizy do przestrzennej rejestracji kolonii względem siebie i stworzenia wyników pokazanych na Rysunku 5. Sygnał autofluorescencji jest zazwyczaj najsilniejszy, gdy próbka jest wzbudzana laserem 405 nm i w tym celu ten kanał powinien pozostać niebarwiony. Rysunek 3 pokazuje również, jak komórki są precyzyjnie ograniczone do wzorów o różnych kształtach.
Analiza danych obrazowych jest przeprowadzana w programie PickCells, darmowym oprogramowaniu o otwartym kodzie źródłowym opracowanym w naszym laboratorium (Blin et al., w przygotowaniu). Oprogramowanie to zawiera moduły analizy obrazu służące do odczytu i sortowania obrazów konfokalnych (Rysunek 4-1), segmentacji (Rysunek 4-2,4-4) i kurateli segmentowanych obiektów (Rysunek 4-3,4-5), obliczania cech obiektów, takich jak współrzędne lub średnia intensywność (Rysunek 4-6), oraz eksportu danych (Rysunek 4-7,4-8). Co istotne, opracowaliśmy niezawodną metodę segmentacji jąder komórkowych o nazwie Nessys28, która jest szczególnie odpowiednia dla gęstych i heterogenicznych populacji komórek, takich jak komórki hodowane na mikrowzorach (Rysunek 3). Rysunek 4-2 przedstawia reprezentatywny wynik działania modułu Nessys, w którym każda pojedyncza komórka otrzymuje dokładny, unikalny identyfikator kolorystyczny. Konieczna powinna być jedynie minimalna edycja, choć jest ona możliwa, jeśli użytkownik tak zdecyduje (Rysunek 4-3). Na koniec PickCells udostępnia szereg modułów wizualizacyjnych do prezentacji danych. Przykład przedstawiono na Rysunku 4-6: kolonia w kształcie pierścienia jest renderowana w 3D, a jądra komórkowe są zakodowane kolorami zgodnie z ich położeniem wzdłuż osi z. Po zwalidowaniu analizy w PickCells dane mogą zostać wyeksportowane w celu utworzenia map przestrzennych w programie R przy użyciu skryptów dostępnych pod adresem (https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr), jak pokazano na Rysunku 530.
Wykazaliśmy niedawno, że ograniczenie przestrzenne mESC na małych (30 00 µm2) dyskowych lub eliptycznych mikowzorach kieruje rozmieszczeniem subpopulacji komórek wykazujących ekspresję markeru mezodermalnego Tbra10. Aby zaprezentować naszą metodę, badamy tutaj, czy na rozmieszczenie Tbra może wpływać sygnalizacja BMP w większych koloniach (90 0 µm2). Rysunek 5A pokazuje, że gdy mESC są hodowane na dużych dyskowych mikowzorach, komórki Tbra+ są preferencyjnie ograniczone do peryferii wzorca (mapa gęstości Tbra+), gdzie lokalna gęstość komórek jest najniższa (patrz niebieska mapa po lewej stronie Rysunku 5A). To rozmieszczenie Tbra zostało potwierdzone przez mapę średniej intensywności Tbra.
Dane te wykazują, że metoda ta pozwala na ujawnienie informacji niewidocznych gołym okiem. Rzeczywiście, na podstawie Rysunku 3 widać, że wizualna ocena pojedynczej kolonii nie jest wystarczająca do zidentyfikowania jakiejkolwiek formy organizacji przestrzennej ekspresji Tbra. Wynika to w szczególności z istotnej zmienności między koloniami, która została ilościowo określona i przedstawiona na najbardziej prawym panelu Rysunku 5A.
Technika ta wykazuje również, że dla Id1 (celu sygnalizacji BMP) nie występuje wykrywalny wzorzec, co może wskazywać, że w tym kontekście wzorzec T nie jest sterowany przez sygnalizację BMP.
Mikrowzorowanie umożliwia wymuszenie na koloniach przyjęcia niemal dowolnej pożądanej geometrii. Jest to szczególnie przydatne do badania odpowiedzi układu na różne geometrie. Przykładowo, można przypuszczać, że jeśli w centrum kolonii wytworzy się gradient morfogenów, utworzenie otworu w kolonii zaburzy ten gradient. Co ciekawe, wciąż obserwujemy wzorowanie na mikrowzorze w kształcie pierścienia, choć w mniej stabilny sposób (Rycina 5B).
<img alt="Schemat przepływu pracy od fotowzorowania do analizy obrazu; obejmuje konfigurację lampy UV, wzrost komórek, immunobarwienie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd metody. Schemat przedstawiający główne etapy metody. Dla każdego etapu pod nazwą zadania podano szacowany czas jego trwania, a schemat ilustruje cel procedury. W przypadku dostępności zamieszczono również odniesienie do odpowiedniej ryciny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe kultur komórkowych ilustrujące wzorce wzrostu i różnice w gęstości w eksperymencie laboratoryjnym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2: Wygląd hodowli 1 h i 48 h po wysianiu komórek na mikowzorce. Obrazy w polu jasnym mESC wysianych na mikrowzory. (a) Przewidywana organizacja komórek 1 h po wysianiu; wzory powinny być wyraźnie identyfikowalne. (b) Oczekiwany wynik po 48 h hodowli. Komórki mESC proliferowały i nadal są ściśle ograniczone do kształtów wzoru. (c–d) Możliwe nieoptymalne wyniki: albo bardzo niewiele komórek przylega do tworzywa poza obrzeżem szkiełka (c), albo komórki przylegają pomiędzy wzorami (d). Patrz Tabela 2 do przewodnika rozwiązywania problemów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej markerów komórkowych Id1, NPC, Tbra, LaminB1; struktury tarczowate vs. pierścieniowate." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy konfokalne immunobarwionych kolonii hodowanych na mikrowzorcach. 
Reprezentatywne kolonie mESC po immunofluorescencji na (A) Id1 a kompleks porów jądrowych lub (B) Tbra i LaminB1. Dla każdego barwienia przedstawiono kolonię wyhodowaną na mikro-wzorcu w kształcie dysku oraz kolonię wyhodowaną na mikro-wzorcu w kształcie pierścienia. Poszczególne kanały przedstawiono jako obrazy w skali szarości. Zwróć uwagę na wyraźny sygnał autofluorescencji mikro-wzorca (pobudzenie laserem 405 nm). Pasek skali reprezentuje 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat przepływu pracy w mikroskopii konfokalnej; segmentacja jąder komórkowych, analiza wzorców, ekstrakcja cech, eksport danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4: Schemat procedury analizy obrazów. Lista obrazów konfokalnych 3D zostaje zaimportowana do programu PickCells w celu przeprowadzenia analizy (1). Ten przykład przedstawia eksperyment z dwoma różnymi kształtami (dyskami i pierścieniami, tak jak w Rysunek 2). Konwencja nazewnictwa obrazów jest przedstawiona po lewej stronie, a interfejs programu PickCells po prawej. Następnie wykorzystuje się moduł Nessys do automatycznej segmentacji jąder (2). Na zrzucie ekranu każde poszczególne jądro ma przypisany unikalny kolor, co wskazuje na prawidłową segmentację. Autofluorescencja wzorca została również poddana segmentacji, tym razem z wykorzystaniem modułu „basic segmentation” (4). Tło pojawia się w kolorze niebieskim, a sygnał biały zostanie zdefiniowany jako kształt wzorca. Następnie dokonuje się wizualnej inspekcji wysegmentowanych kształtów w celu zapewnienia dokładności segmentacji, a w razie potrzeby są one edytowane przy użyciu modułu edytora segmentacji (3–5). Zrzuty ekranu przedstawiają obrysy wykrytych kształtów. Kształty różowe i żółte zostały poddane edycji. Na koniec obliczono cechy obiektów i wyeksportowano je do pliku w celu późniejszego przetworzenia w programie R (6–7). Przedstawiono zrzut ekranu kolonii wyrenderowanej w widoku 3D (6). W krokach od 2 do 6 obok numeru kroku zamieszczono ikony dostępne w interfejsie PickCells w momencie pisania niniejszego artykułu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza gęstości i intensywności komórek, wyniki mikroskopii fluorescencyjnej, diagramy porównawcze dla Tbra+." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59634/59634fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki dla dwóch różnych czynników transkrypcyjnych i kształtów mikrowzorców 
Ssegmentowana mapa przestrzenna dla mESC hodowanych przez 48 h na (A) mikrowzory w kształcie dysku lub (B) pierścieniowate mikrowzory. Dla każdego kształtu mikrowzoru po lewej stronie przedstawiono mapę gęstości komórek, niezależnie od ich fenotypu, z niebieską skalą kolorystyczną. Następnie dla każdego markera (Tbra w górnym rzędzie i Id1 w dolnym rzędzie) podano trzy oddzielne mapy, od lewej do prawej: mapę gęstości wyłącznie komórek wykazujących ekspresję markera (analiza oparta na progu), mapę średniej intensywności markera (log2) oraz mapę odchylenia standardowego intensywności markera. Intensywności podano w arbitralnych jednostkach fluorescencji. Na każdej mapie kształt mikrowzoru zaznaczono biały kontur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59634/59634fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>typ macierzy zewnątrzkomórkowej</td>
			<td>Żelatyna</td>
			<td>Fibonektyna</td>
			<td>Macierz błony podstawnej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Stężenie</td>
			<td>stężenie macierzy pozakomórkowej (ECM)</td>
			<td>1 mg/ml</td>
			<td>20 μg/mL</td>
			<td>200 μg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stężenie poloksameru 407</td>
			<td>500 μg/mL</td>
			<td>400 μg/mL</td>
			<td>1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Przetestowano za pomocą</td>
			<td>mESC (mysie embrionalne komórki macierzyste)</td>
			<td>TAK</td>
			<td>TAK</td>
			<td>TAK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEpiSC</td>
			<td>NIE</td>
			<td>TAK</td>
			<td>TAK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywka bezsurowicza</td>
			<td>NIE</td>
			<td>TAK</td>
			<td>TAK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Testowane stężenia poloksameru 407 i ECM. Tabela ta przedstawia zestawienie stężeń ECM i poloksameru 407, które zostały przetestowane w naszym laboratorium. Dla każdej kombinacji ECM/poloksameru 407 wskazano typ komórek, dla których pomyślnie uzyskano wzorowanie, a także informację, czy hodowla zawierała surowicę. mESC = embrionalne komórki macierzyste myszy, mEpiSC = komórki macierzyste epiblastu myszy.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Procedura</td>
			<td>Obserwacja</td>
			<td>Możliwy problem</td>
			<td>Roztwór</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">Mikrowzorowanie</td>
			<td rowspan="3">Niska adhezja komórek</td>
			<td>niewłaściwy stosunek stężenia ECM/poloksameru 307</td>
			<td>Zwiększyć stosunek stężenia ECM do poloksameru 307</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas przywierania komórek zbyt krótki</td>
			<td>Zwiększyć czas inkubacji, aby zapewnić komórkom odpowiedni czas na prawidłowe przytwierdzenie się do wzorów (krok 3.4). W celu optymalizacji tego etapu pomocne może być sprawdzanie komórek pod mikroskopem, co pozwala wykryć zmianę morfologii wskazującą na rozpoczęcie procesu adhezji komórek.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Płukania zbyt intensywne (krok 3.6)</td>
			<td>Podczas wymiany pożywki należy unikać pipetowania jej bezpośrednio na chipy. Zamiast tego należy delikatnie nanieść pożywkę na ścianki studzienki.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Komórki przylegają pomiędzy wzorami</td>
			<td>niewłaściwy stosunek stężenia ECM do poloksameru 307</td>
			<td>Zmniejszyć stosunek stężenia ECM do poloksameru 407</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas adhezji komórek zbyt długi</td>
			<td>Skrócić czas inkubacji (krok 3.4).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przemycia nieskuteczne (krok 3.6)</td>
			<td>Energiczne potrząsanie płytką jest zazwyczaj wystarczające do odseparowania nadmiaru komórek. W przypadku typów komórek, które wykazują silną adhezję do chipa, bezpośrednie pipetowanie na chip może poprawić wynik. Zwiększenie liczby przemyć również może pomóc, zwłaszcza w celu zapewnienia, że po tym kroku w medium nie pozostaną żadne wolne komórki.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Komórki nie odwzorowują ściśle kształtu wzorca</td>
			<td>Niezgodny typ komórek i geometria wzoru</td>
			<td>Zaprojektuj wiele geometrii/rozmiarów do umieszczenia na fotomasece, aby umożliwić przetestowanie i zidentyfikowanie optymalnego rozmiaru wzoru dla danego kształtu wzoru i typu komórek. Prosimy o zapoznanie się z sekcją „Limitations” (Ograniczenia) w dyskusji.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nieoptymalne fotoprintowanie – można to zdiagnozować, obserwując ostrość sygnału autofluorescencji. Granice wzorów powinny być ostre, tak jak przedstawiono na rys. 2. Jeśli krawędzie wzorów wydają się rozmyte, należy usprawnić etap fotoprintowania.</td>
			<td>Rozmyte krawędzie wzoru wskazują, że szkiełko plastikowe nie przylegało wystarczająco blisko do powierzchni maski podczas etapu naświetlania. Należy upewnić się, że elementy mocujące szkiełka do fotomaski są wyrównane oraz że podczas procedury naświetlania do zespołu przyłożono stały i wystarczający nacisk.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Barwienie</td>
			<td rowspan="2">Niejednorodne barwienie</td>
			<td>czas inkubacji przeciwciał zbyt krótki</td>
			<td>Wydłużyć czas inkubacji przeciwciał (do 24 h w temperaturze pokojowej)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kolonie spłaszczone podczas procedury montowania</td>
			<td>Zamocuj preparaty z mikrowzorcami w komorze, takiej jak chamlide lub cytoo-chambers, aby przeprowadzić zarówno immunobarwienie, jak i obrazowanie bez konieczności montowania komórek. Pozwoli to na lepsze zachowanie struktury 3D kolonii.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odrywanie kolonii podczas procedury barwienia</td>
			<td>Dewetting chipa</td>
			<td>Pozostaw odpowiednią ilość medium lub użyj dwóch pipet: jednej do usunięcia medium, a drugiej do dodania świeżego roztworu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kolonie pod mikroskopem wyglądają na ścięte</td>
			<td>kolonie zostały uszkodzone podczas montowania chipa na szkiełku mikroskopowym</td>
			<td>Należy zachować szczególną ostrożność podczas montowania chipów. Alternatywnie można montować szkiełka z mikrowzorcami w komorach, takich jak chamlide lub cytoochambers, aby przeprowadzić zarówno immunobarwienie, jak i obrazowanie bez konieczności montowania komórek. Pozwala to również na zachowanie ultrastruktury kolonii.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Przewodnik rozwiązywania problemów.Tabela ta przedstawia przegląd możliwych nieoptymalnych wyników. Wymieniono w niej również potencjalne źródła problemów wraz z zalecanymi rozwiązaniami.

Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje mikrowzorce wraz z obrazowaniem ilościowym, aby ujawnić organizację przestrzenną w kulturach ssaków. Technika ta jest łatwa do wdrożenia w standardowym laboratorium biologii komórki i oferuje elastyczny system do badania wzorców in vitro.

Mapowanie wyłaniającej się organizacji przestrzennej komórek ssaków za pomocą mikrowzorców i obrazowania ilościowego

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

Ta metoda umożliwia manipulowanie i ilościowe określanie, w jaki sposób komórki organizują się kolektywnie. Jest to ważne, ponieważ możemy modelować wzór in vitro i rozplątywać wskazówki ściśle sprzężone in vivo. Technika ta wymaga minimalnego specjalistycznego sprzętu, co pozwala na jej ustalenie w standardowym laboratorium biologicznym, i jest ilościowa, co umożliwia odkrycie zdarzeń związanych z wzorcami podwzrokowymi.Metodę tę można łatwo zastosować do dowolnego systemu komórkowego, w którym mogą pojawić się wzorce, oraz do odkrywania nielosowych wzorców różnicowania, proliferacji i konkurencji między komórkami. Główną zaletą tej metody jest systematyczna optymalizacja parametrów mikrowzorcowania dla nowych typów komórek. Na przykład rozmiar i kształt wzoru, typ matrycy i czas adhezji komórek.Zakładając rękawiczki, umieść kawałek filmu laboratoryjnego na dnie 10-centymetrowej kwadratowej szalki Petriego. Użyj 12-milimetrowego dziurkacza, aby wyciąć hydrofobowe szkiełka z tworzywa sztucznego, aby utworzyć szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 milimetrów, a następnie umieść szkiełka nakrywkowe na nowej szalce Petriego. Użyj pęsety, aby ostrożnie usunąć folię ochronną z szkiełek nakrywkowych.Umieść maskę fotograficzną na czystej i stabilnej powierzchni, chromowaną stroną do góry i dodaj dwumikrolitrową kroplę podwójnie destylowanej wody w miejscu żądanego wzoru chipa. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do kropli i umieść uchwyt na plastikowych szkiełkach. Ostrożnie przymocuj tę kanapkę za pomocą zacisków, aby plastikowe elementy stykały się z maską fotograficzną.Umieść zespół w lampie ultrafioletowej ozonu około dwóch centymetrów od źródła światła, aby uzyskać 10-minutowe oświetlenie. Pod koniec okresu oświetlenia chwyć kanapkę z maską fotograficzną na dole i ostrożnie zdejmij zaciski, utrzymując nacisk jedną ręką, aby zapobiec przesuwaniu się suwaków podczas demontażu kanapki. Gdy wszystkie zaciski zostaną usunięte, wyjmij uchwyt, uważając, aby wszystkie plastikowe kawałki nadal znajdowały się na masce i nie przykleiły się do uchwytu, a następnie dodaj podwójnie destylowaną wodę do wiórów, aby delikatnie odłączyć wióry od maski fotograficznej.Umieść wióry z fotowzorem w komorze osadzania matrycy, podświetlaną stroną do góry i dodaj 200 mikrolitrów roztworu powlekającego na każdy chip. Następnie dodaj do komory trzycentymetrową szalkę Petriego wypełnioną podwójnie destylowaną wodą, aby ograniczyć parowanie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. W celu wysiewu komórek embrionalnych na wióry, należy umyć wiórki dwoma co najmniej pięciominutowymi płukaniami w świeżym, sterylnym PBS na pranie, a następnie dozować jeden razy dziesięć do piątych komórek w 200 mikrolitrach odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych na każdy chip.Następnie zamknij komorę wysiewu. Inkubować przez godzinę, aby komórki przylgnęły do wiórów. Po przyczepieniu się komórek napełnij dołki płytki wielodołkowej 500 mikrolitrami ciepłego podłoża na dołek i użyj sterylnej pęsety, aby przenieść wióry do indywidualnych dołków na płytkę.Energicznie wstrząsnąć płytką w celu oderwania wszelkich nieprzylegających komórek i natychmiast zastąpić supernatant świeżym, ciepłym podłożem. Następnie sprawdź pod mikroskopem, czy widoczny jest wzór. 48 godzin po ich posiewie komórki powinny uformować gęste kolonie, które rygorystycznie podążają za kształtem wzorów.Pozostawiając wióry na płytce, usuń wszystko, z wyjątkiem wystarczającej ilości pożywki, aby zapobiec wyschnięciu frytek, i dodaj co najmniej 500 mikrolitrów paraformaldehydu lub roztworu utrwalającego na bazie PFA na dołek. Po dziesięciu minutach krótko przemyć studzienki trzykrotnie roztworem myjącym, a następnie raz przepłukać 50-milimolowym chlorkiem amonu rozcieńczonym w roztworze myjącym, aby ugasić resztkową aktywność sieciowania PFA. Po ostatnim przemyciu próbki należy traktować roztworem blokującym przez co najmniej 30 minut.W celu barwienia immunologicznego kultur chipów, przenieś chipy do komory barwienia komórką do góry i natychmiast dodaj 100 mikrolitrów podstawowego roztworu przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania do każdego chipa. Po jednej godzinie na platformie obrotowej w temperaturze pokojowej umyć frytki trzykrotnie roztworem myjącym, jak pokazano, i inkubować wióry z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez jedną godzinę na platformie obrotowej. Pod koniec wtórnej inkubacji przeciwciał umyć chipy trzykrotnie w roztworze myjącym i zamontować chip na szkiełku mikroskopowym z 20 mikrolitrami dowolnego standardowego podłoża montażowego.Aby zobrazować chipy, najpierw dostosuj prędkość skanowania, rozdzielczość obrazu, uśrednianie klatek i wzmocnienia detektora, aby określić optimum między jakością obrazu a czasem obrazowania. Następnie uzyskaj obrazy każdego chipa. Po uzyskaniu wszystkich obrazów zainstaluj i uruchom PickCells zgodnie z dokumentacją dostępną online, utwórz nowy eksperyment i zaimportuj obrazy do programu.Użyj modułu Nessys do segmentacji jąder na podstawie sygnału obwiedni jądrowej. Użyj podstawowego modułu segmentacji, aby zidentyfikować sygnał autofluorescencji wzorca. Następnie kliknij Zakończ"i poczekaj, aż wszystkie obrazy zostaną przetworzone.Aby utworzyć obiekty jądrowe i obliczyć podstawowe cechy obiektu, uruchom moduł Wewnętrzne cechy z paska zadań i zamknij panele Ellipsoid Fitter i Surface Extractor, aby otwarty był tylko panel Podstawowe funkcje. Wybierz jądro"jako Typ obiektu i wybierz podany prefiks podany dla podzielonych na segmenty obrazów. Następnie kliknij Oblicz"i poczekaj, aż wszystkie obrazy zostaną przetworzone.Na tym etapie dodatkowe cechy muszą zostać zapisane w jądrach przed wyeksportowaniem danych do naszej analizy. Na przykład, aby zapisać nazwę obrazu, do którego należy każde jądro, jako atrybut jądra, kliknij Dane"i Nowy atrybut"i wybierz jądro"w wyskakującym oknie dialogowym. Kliknij OK"wybierz Zbieraj dane z innych obiektów połączonych z węzłem"i kliknij Dalej"W lewym panelu wybierz Obraz" i kliknij dwukrotnie znak zapytania, aby ustawić węzeł obrazu jako cel ścieżki.Rozwiń okienko Operacja redukcji i wybierz pozycję Pobierz jeden"Rozwiń okienko Dostępne atrybuty i wybierz atrybut Nazwa. Następnie kliknij Zmień"i Dalej"Wprowadź nazwę obrazu, naciśnij Tab i kliknij Zakończ"Następnie wyeksportuj dane do pliku wartości rozdzielanych tabulatorami. Na potrzeby naszej analizy zapętl wyeksportowane dane do folderu danych w folderze R-Script.Otwórz nasze studio"i otwórz szablon mapy z koszem R-Script"Następnie ustaw katalog roboczy na lokalizację pliku źródłowego i uruchom skrypt, aby wygenerować mapy gęstości. Po upływie jednej godziny od wysiewu komórek poszczególne wzorce kultur komórkowych mogą nie być w pełni zlewne, ponieważ komórki namnażają się w czasie. Jednak wzory zostaną w pełni skolonizowane, a na zewnątrz powierzchni kleju znajdzie się tylko bardzo niewiele komórek.Wzór, który nie jest wyraźny do dwóch godzin po wysiewie, wskazuje na niepowodzenie procedury. Przestrzenne uwięzienie embrionalnych komórek macierzystych myszy na dużych dyskach lub mikrowzorach pierścieniowych kieruje wzorcowaniem subpopulacji komórek wykazujących ekspresję mezodermalnego markera brachyury. Na przykład, gdy embrionalne komórki macierzyste myszy są hodowane na mikrowzorach o dużym dysku, komórki brachyury-dodatnie są preferencyjnie ograniczone do obrzeży wzorca, gdzie lokalna gęstość komórek jest najniższa.Ten wzorzec jest potwierdzony przez mapę intensywności brachyury mózgu. Dane te pokazują, że metoda może ujawnić informacje subwizualne, ponieważ inspekcja jednej kolonii nie jest wystarczająca do zidentyfikowania jakiejkolwiek formy organizacji przestrzennej w wyrażaniu markerów zainteresowania. Wyjaśnia to w szczególności istotna zmienność między koloniami.Technika ta pokazuje również, że nie istnieje wykrywalny wzorzec dla inhibitora wiązania DNA, co może wskazywać, że wzorzec T nie jest napędzany przez sygnalizację morfogenetyczną białka kości w tym kontekście. Zawsze pamiętaj, która strona szkiełka nakrywkowego została usunięta i pokryta, a także upewnij się, że komórki prawidłowo przylegają przed zmyciem nadmiaru komórek. Metoda ta pozwala na badanie sygnałów środowiskowych ważnych w kierowaniu samoorganizacją komórek, a także może informować o modelach matematycznych, które pomagają nam lepiej radzić sobie z podstawowymi wzorcami.

mapping-emergent-spatial-organization-mammalian-cells-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Adhezyjne mikrowzory normalizujące architekturę komórkową mogą być wykorzystane do zwiększenia czułości w wykrywaniu efektów działania leków, poprawy powtarzalności oraz uproszczenia zautomatyzowanego pozyskiwania i analizy obrazów. Taka technologia przyniesie korzyści w testach przesiewowych leków/siRNA, które są przeprowadzane na konwencjonalnych podłożach do hodowli komórkowej i w konsekwencji obarczone są nadmierną zmiennością międzykomórkową.

Udoskonalona wizualizacja i analiza ilościowa efektów działania leków z wykorzystaniem komórek rozmieszczonych w mikrowzorach

Tutaj prezentujemy protokół dla nanolitografii sond skanujących na dużym obszarze, który jest możliwy dzięki iteracyjnemu dostosowaniu układów sond, a także wykorzystaniu wzorów litograficznych do badań interakcji komórka-powierzchnia.

Nanolitografia sondy skanującej o dużym obszarze ułatwiona dzięki automatycznemu wyrównaniu i zastosowaniu do wytwarzania substratów do badań nad kulturami komórkowymi

Tutaj opisujemy procedurę oczyszczania tkanek, znakowania fluorescencyjnego i wielkoskalowego obrazowania tkanki mózgowej myszy, która umożliwia wizualizację trójwymiarowej organizacji typów komórek w korze nowej.

Wielkoskalowe trójwymiarowe obrazowanie organizacji komórkowej w korze nowej myszy

Obrazowanie na żywo lizosomalnej egzocytozy na mikrowzorcach komórek pozwala na przestrzenną kwantyfikację tego procesu. Normalizacja morfologii za pomocą mikrowzorców jest znakomitym narzędziem do odkrywania ogólnych zasad dotyczących przestrzennego rozkładu procesów komórkowych.

Kwantyfikacja parametrów czasoprzestrzennych egzocytozy komórkowej w komórkach z mikrowzorami

Tutaj prezentujemy łatwy w użyciu test do analizy migracji glejaka (GBM) na neuronach o wzorcach. Opracowaliśmy makro w oprogramowaniu FiJi do łatwego ilościowego określania migracji komórek GBM na neuronach i zaobserwowaliśmy, że neurony modyfikują zdolność inwazyjną komórek GBM.

Wspólna hodowla komórek macierzystych podobnych do glejaka na neuronach wzorcowych w celu zbadania migracji i interakcji komórkowych

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia zautomatyzowane wytwarzanie mikrowzorów, które standaryzują kształt komórki, do badania struktur cytoszkieletu w komórkach ssaków. Ta przyjazna dla użytkownika technika może być skonfigurowana z dostępnymi na rynku systemami obrazowania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu niedostępnego dla standardowych laboratoriów biologii komórki.

Kontrola geometrii komórki za pomocą mikromodelowania wspomaganego laserem w podczerwieni

Celem tego protokołu jest skierowanie adhezji i wzrostu komórek do docelowych obszarów siatek do mikroskopii krioelektronowej. Osiąga się to poprzez nałożenie warstwy przeciwporostowej, która jest ablowana w określonych przez użytkownika wzorach, a następnie osadzanie się białek macierzy zewnątrzkomórkowej w obszarach wzorzystych przed wysiewem komórek.

Mikrowzorce Transmisyjne siatki mikroskopii elektronowej do bezpośredniego pozycjonowania komórek w przepływach pracy kriotomografii elektronowej całej komórki

Prezentujemy technologię, która wykorzystuje wspomagany kapilarność montaż w platformie mikroprzepływowej do modelowania mikroobiektów zawieszonych w cieczy, takich jak bakterie i koloidy, w określone tablice na podłożu z polidimetylosiloksanu.

Modelowanie mikroorganizmów i mikrocząstek poprzez sekwencyjny montaż wspomagany kapilarnością

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

Ten protokół opisuje metody przeprowadzania rezonansu magnetycznego, oczyszczania i znakowania immunologicznego nienaruszonych mózgów myszy za pomocą iDISCO+, a następnie szczegółowy opis obrazowania za pomocą mikroskopii świetlnej i dalszych analiz za pomocą NuMorph.

Obrazowanie i analiza pojedynczych komórek całego mózgu nienaruszonych mózgów noworodków myszy za pomocą rezonansu magnetycznego, oczyszczania tkanek i mikroskopii świetlnej

Poznaj metodę mikrowzorcowania i obrazowania ilościowego do badania organizacji przestrzennej komórek ssaków in vitro. Technika umożliwia modelowanie wzorców komórkowych i odkrywanie zjawisk niewidocznych gołym okiem.

Mapowanie wyłaniającej się organizacji przestrzennej komórek ssaków za pomocą mikrowzorców i obrazowania ilościowego

Przeglądaj więcej filmów