Name: Badanie przestrzeni sekwencji w celu identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących regulatorowe RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Poznaj protokół saturacyjnej mutagenezy do identyfikacji miejsc wiązania białek RNA. Ta metoda umożliwia odkrywanie nieznanych sekwencji wiążących z zastosowaniem w diagnostyce i terapii chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor dziękuje Narodowym Instytutom Zdrowia za wcześniejsze finansowanie.

UWAGA: Rysunek 1 przedstawia podsumowanie kluczowych kroków w iteracyjnym procesie selekcji-wzmocnienia (SELEX).
1. Generowanie losowego szablonu biblioteki
<ol>
	<li>Zsyntetyzuj starter do przodu 5'- GTAATACGACTCACTATAGGGTGATCAGATTCTGATCCA-3' i starter odwrotny 5'- GCGACGGATCCAAGCTTCA-3' przez syntezę chemiczną na syntezatorze DNA. 
	UWAGA: Startery i biblioteka losowa mogą być syntetyzowane komercyjnie.</li>
	<li>Zsyntetyzuj matrycę oligonukleotydu biblioteki losowej 5'- GGTGATCAGATTCTGATCCA(N1...N31)TGAAGCTTGGATCCGTCGC-3' przez syntezę chemiczną. Podczas syntezy należy użyć równomolowej mieszaniny czterech fosforamidynów dla 31 losowych pozycji pokazanych powyżej jako N. 
	UWAGA: Sekwencja szablonu biblioteki zawiera 31 losowych nukleotydów (od N1 do N31) oraz sekwencje flankujące do wiązania starterów do przodu i do tyłu. Starter do przodu zawiera sekwencję promotora polimerazy RNA T7 (podkreśloną) do transkrypcji in vitro i miejsce restrykcyjne Bcl1 (kursywą) do klonowania. Odwrotny starter zawiera miejsca enzymów restrykcyjnych BamH1 i HindIII (kursywą), aby ułatwić klonowanie.</li>
</ol>
2. Generowanie losowej puli bibliotek DNA
<ol>
	<li>Przyłącz promotor polimerazy T7 RNA do biblioteki za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) zawierającej 1 μM matrycę biblioteki losowej DNA, 1 μM każdego startera, 20 mM Tris (pH 8,0), 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,1 μg/μL acetylowanej albuminy surowicy bydlęcej, 2 jednostki polimerazy Taq i po 200 μM dNTP (deoksyguanozyna, deoksyadenozyna, deoksycytydyna i trifosforan deoksytymidyny).</li>
	<li>Zastosować pięć cykli denaturacji, wyżarzania i wydłużania (94 °C przez 1 min, 53 °C przez 1 minutę i 72 °C przez 1 min) PCR, a następnie jeden cykl przedłużania (72 °C przez 10 min).</li>
</ol>
3. Synteza puli 0 RNA
<ol>
	<li>Ustaw reakcję transkrypcyjną 100 μl12. Wymieszaj bufor transkrypcyjny T7, 1 μM puli losowej biblioteki DNA, 5 mM ditiotreitolu (DTT), 2 mM trifosforanu guanozyny (GTP), po 1 mM trifosforanu adenozyny (ATP), trifosforanu cytydyny (CTP) i trifosforanu urydyny (UTP) oraz 2 jednostki/μL polimerazy RNA T7. 
	UWAGA: RNA można transkrybować in vitro przy użyciu dostępnych na rynku zestawów z opcją polimerazy RNA T7 lub SP6.</li>
	<li>Inkubować powyższą mieszaninę reakcyjną w probówce do mikrowirówek przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Żel oczyszcza RNA w 10% denaturującym żelu poliakrylamidowym.</li>
	<li>Określić położenie transkryptów na żelu, barwiąc go błękitem metylenowym lub autoradiografię, włączając ślady radioaktywności (0,5 μl lub mniej α-32P UTP) w reakcji transkrypcji.
	<ol>
		<li>Umieść plasterek żelu w probówce wirówkowej i połam na mniejsze kawałki, na przykład za pomocą końcówki homogenizatora. Dodaj bufor proteinazy K (PK) (100 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 12,5 mM EDTA, 1% dodecylosiarczan sodu), aby zanurzyć kawałki żelu. Pozostaw probówkę na nutatorze od 2 godzin do nocy w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirować w mikrowirówce o dużej prędkości (14 000 obr./min lub 16 873 x g) przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć resztki żelu i odzyskać roztwór buforowy.</li>
	<li>Dwukrotnie przemieszać próbkę z równą objętością chloroformu fenolowego i jeden raz z chloroformem.</li>
	<li>Wymieszać fazę wodną od góry z jedną dziesiątą objętości octanu sodu (3,0 M, pH 5,2), 10 μg tRNA lub 20 μg glikogenu i etanolem (2–3 objętości, przechowywane w temperaturze -20 °C). Pozostawić probówki w temperaturze -80 °C na 1 godzinę.</li>
	<li>Obracać probówki zawierające roztwór przez 5–10 minut w temperaturze 4 °C w mikrowirówce (14 000 obr./min lub 16 873 x g). Sklarowany osad należy ostrożnie wyrzucić. Opłucz osad RNA 70% etanolem i wiruj przez 2–5 minut. Ostrożnie zasysać etanol. Wysuszyć na powietrzu osad RNA.</li>
	<li>Rozpuścić osad RNA w 50 μl wody potraktowanej pirowęglanem dietylu (DEPC). Pozostawić próbkę w temperaturze -20 °C do przechowywania. 
	UWAGA: Oczyść RNA za pomocą dostępnych na rynku kolumn wirowych, które są obecnie częściej używane do usuwania nieinkorporowanej radioaktywności i służą jako szybka i wygodniejsza alternatywa dla oczyszczania RNA. 
	UWAGA: Używaj osłony ze szkła akrylowego, rękawic i innych środków ostrożności w celu ochrony przed radioaktywnością.</li>
</ol>
4. Reakcja wiązania białek i separacja związanego RNA
<ol>
	<li>Przeprowadzić wiązanie białka i RNA w 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 w objętości 100 μL, dodając następujące składniki do tych końcowych stężeń: 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0,09 μg/μL albuminy surowicy bydlęcej, 0,5 jednostki/μL RNasin, 0,15 μg/μL tRNA, 1 mM EDTA, i 30 μL o odpowiednim stężeniu białka rekombinowanego (PTB). Dodaj RNA z odpowiedniej puli. 
	UWAGA: Czynnik splicingu U2AF65 zazwyczaj wiąże się z miejscami splicingu szlaku polipirymidynowego / 3' modelowych intronów o powinowactwie wiązania (stała dysocjacji równowagowej lub Kd) około 1–10 nM. Dlatego w pierwszych dwóch rundach wiązania stosowano stężenie białka 10-krotnie wyższe niż K d dla U2AF65; dla białek SXL i PTB początkowe stężenie w tym zakresie było tylko naszym najlepszym przypuszczeniem. Zapewniło to, że pożądane gatunki RNA mogą się wiązać, chociaż sekwencje o niższym powinowactwie również potencjalnie się wiążą. W rundach 3 i 4 (transkrypcja, wiązanie i amplifikacja) stężenie białka zmniejszyło się trzykrotnie (krok 4.1). Miało to na celu sukcesywną eliminację gatunków RNA o niskim powinowactwie.</li>
	<li>Umieścić probówki zawierające reakcje wiązania na około 30 minut w temperaturze 25 °C w bloku temperatury (lub na lodzie).</li>
	<li>Frakcjonuj związany RNA od niezwiązanego RNA przez pierwsze 4 rundy selekcji-amplifikacji, wykonując następujące kroki.
	<ol>
		<li>Przefiltrować próbkę (100 μl) w temperaturze pokojowej przez filtr nitrocelulozowy podłączony do kolektora próżniowego. 
		UWAGA: Kompleks RNA-białko, ale nie niezwiązany RNA, pozostaje na filtrze.</li>
		<li>Posiekaj filtr z zatrzymanym RNA na fragmenty za pomocą sterylnej żyletki; włóż je do probówki wirówkowej. Odzyskać RNA poprzez delikatne bębnowanie probówki przez co najmniej 3 godziny (lub noc) z kawałkami filtra zanurzonymi w buforze proteinazy K (PK).</li>
		<li>Odbiałczić próbkę RNA poprzez wirowanie jej w obecności równej objętości chloroformu fenolowego (1:1), a następnie chloroformu. Za każdym razem odzyskuje się fazę wodną, odwirowując próbkę z dużą prędkością przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wymieszać go z octanem sodu (0,1 objętości 3,0 M, pH 5,2) i etanolem (2-3 objętości absolutnego etanolu, 200 proof). Pozostawić probówkę w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 30 minut, odwirować ją na wysokich obrotach przez 10 minut, a następnie, postępując zgodnie z etapem mycia i suszenia (krok 3.8), rozpuścić RNA w wodzie uzdatnionej DEPC. Kroki te opisano powyżej (kroki od 3.6 do 3.9).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oddziel frakcje RNA związane z białkiem od frakcji niezwiązanych przez ostatnie 2 rundy (rundy 5 i 6; transkrypcja, wiązanie i amplifikacja) w następujący sposób. Zmniejszyć stężenie białka w reakcji wiązania (krok 4.1) trzykrotnie, aby uzyskać dodatkowe ciśnienie selekcyjne w celu wzbogacenia sekwencji wiążących o wysokim powinowactwie i preferencyjnego usunięcia sekwencji o niskim powinowactwie.
	<ol>
		<li>Wstępnie wylać natywny żel poliakryloamidowy (5% o stosunku 60:1 akryloamid do bis-akryloamidu) w 0,5-krotnym buforze TBE (Tris-Boran-EDTA) przed rozpoczęciem powyższej reakcji wiązania RNA: białko (krok 4.1). Elektroforezę tego żelu w chłodni (4 °C) stosując 250 V przez 15 min.</li>
		<li>Odpipetować powyższe reakcje wiązania RNA:białko (krok 4.1) do różnych studzienek tego żelu. 
		UWAGA: Białko jest przechowywane w temperaturze -80 °C i rozcieńczane przed użyciem w 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowym (HEPES), pH 8,0, 20% glicerolu, 0,2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 0,05% NP-40 i 1 mM ditiotreitolu (DTT). Dodanie 0,5–1,0 mM inhibitora proteazy fluorku fenylometanu sulfonylu (PMSF) jest opcjonalne. W reakcji wiązania bufor ten wnosi około 6% glicerolu, co umożliwia bezpośrednie ładowanie próbek do studzienek bez konieczności mieszania ich z oddzielnym buforem ładującym żel.</li>
		<li>Frakcjonować związany RNA od niezwiązanego RNA za pomocą elektroforezy żelowej w chłodnym pomieszczeniu (4 °C) pod napięciem 250 V przez 1 do 2 godzin. Proces ten jest również znany jako test przesunięcia ruchliwości żelu. 
		UWAGA: Czas trwania elektroforezy różni się w zależności od cech RNA i białka użytego do wiązania.</li>
		<li>Wystaw żel na kliszę rentgenowską i zidentyfikuj lokalizację związanego RNA za pomocą autoradiografii. Wytnij plasterek żelu ze związanym RNA i włóż go do probówki.</li>
		<li>Inkubować rozdrobniony plasterek żelu w buforze PK używanym do elucji przez 3 godziny lub przez noc.</li>
		<li>Powtórz kroki od 3.5 do 3.9 opisane powyżej. Krótko mówiąc, energicznie zwiruj wymytą próbkę RNA, najpierw chloroformem fenolowym, a następnie chloroformem.</li>
		<li>Zmieszać octan sodu i etanol z fazą wodną po ekstrakcji chloroformem. Po inkubacji w zamrażarce o temperaturze -80 °C wirować w temperaturze 4 °C przez 5–10 minut, aby zebrać osad RNA. Umyj osad RNA etanolem i wysusz go na powietrzu, pozostawiając otwartą pokrywę probówki. Rozpuść RNA w wodzie uzdatnionej DEPC. 
		UWAGA: Przejście na test przesunięcia ruchliwości żelu do frakcjonowania pozwala na eliminację niepożądanych gatunków RNA, które mogły zostać wzbogacone w celu związania, na przykład, z filtrem nitrocelulozowym (lub dowolną matrycą) używaną w początkowych rundach do frakcjonowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Odwrotna transkrypcja i amplifikacja PCR
<ol>
	<li>Zsyntetyzować cDNA z rozpuszczonego RNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy i odwrotnego startera przez inkubację 20 μl reakcji (2 μl 10x buforu RT, 2 μl odwrotnej transkryptazy AMV, 1 μM odwrotnego starterazy, 10 μL RNA, opcjonalnie inhibitor RNazy) w temperaturze 42 °C przez 60 min.</li>
	<li>Amplifikuj cDNA za pomocą 20–25 cykli PCR, jak opisano w kroku 2.1.</li>
</ol>
6. Transkrypcja i wiązanie białek
<ol>
	<li>Powtórzyć proces syntezy RNA, wiązania białek, oddzielenia frakcji związanej z białkiem i niezwiązanej, jak opisano w sekcji 3–5 powyżej.</li>
</ol>
7. Analiza oddziaływań RNA-białko
<ol>
	<li>Użyj testu przesunięcia ruchliwości żelu (krok 4.4) lub testu wiązania filtra (krok 4.3), aby określić powinowactwo i swoistość wiązania dla wybranych pul lub poszczególnych sekwencji w każdej puli (patrz krok 8.3).</li>
	<li>Użyj autoradiografii lub imagera luminoforowego, aby wykryć i określić ilościowo prążki we frakcji związanej i frakcji niezwiązanej.</li>
</ol>
8. Klonowanie i sekwencjonowanie
<ol>
	<li>Trawić końcowy produkt DNA PCR za pomocą enzymów restrykcyjnych Bcl1 i HindIII przez 1-2 godziny, podwiązywać odpowiednio strawionym pGEM3 lub innymi plazmidami przenoszącymi miejsca restrykcyjne od 2 godzin do nocy, przekształcać produkt ligacji w kompetentne komórki bakteryjne przez szok termiczny lub elektroporację przy użyciu standardowych procedur biologii molekularnej13.</li>
	<li>Hodować bakterie przez noc, posiewając przekształcone komórki na płytkach agarowych z pożywką Luria-Bertani (LB) i ampicyliną (50 μg/ml) w temperaturze 37 °C. Zebrać kolonie do zaszczepienia probówek hodowlanych zawierających płynną pożywkę LB ampicyliną i hodować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przez noc. Oczyść plazmidowe DNA zawierające insercje DNA przy użyciu standardowego protokołu izolacji plazmidu13. 
	UWAGA: Dostępne są komercyjne zestawy do oczyszczania plazmidu.</li>
	<li>Sekwencjonuj plazmidy za pomocą wstawek DNA przy użyciu protokołu sekwencjonowania zakończenia łańcucha dideoxy, postępując zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi sekwencjonowania14. 
	UWAGA: Sekwencjonowanie można wykonać we własnym zakresie lub komercyjnie.</li>
</ol>
9. Wyrównanie sekwencji
<ol>
	<li>Dopasuj sekwencje i uzyskaj konsensus w miejscu (miejscach) powiązania, korzystając z dostępnych online narzędzi do wyrównywania 
	(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/).</li>
</ol>

<ol><li>Pribnow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+an+RNA+polymerase+binding+site+at+an+early+T7+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).</li>
<li>Breathnach, R., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+expression+of+eucaryotic+split+genes+coding+for+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).</li>
<li>Wickens, M., Stephenson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+conserved+AAUAAA+sequence%3A+four+AAUAAA+point+mutants+prevent+messenger+RNA+3%27+end+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3' end formation.</a> Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+5%27-noncoding+sequences+from+699+vertebrate+messenger+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).</li>
<li>Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAcompete+methodology+and+application+to+determine+sequence+preferences+of+unconventional+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins.</a> Methods. 118, 3-15 (2017).</li>
<li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+massively+parallel+SELEX+for+characterization+of+human+transcription+factor+binding+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities.</a> Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li>
<li>Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+analysis+of+the+contribution+of+primer+sequences+to+aptamer+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Evolution%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures.</a> Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).</li>
<li>Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+molecular+discrimination+by+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution molecular discrimination by RNA.</a> Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).</li>
<li>Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+binding+specificities+and+functions+of+higher+eukaryotic+polypyrimidine+tract-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins.</a> Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).</li>
<li>Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+small+RNAs+using+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase.</a> Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%22">Molecular Cloning</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+polypyrimidine+tract-binding+protein+is+necessary+for+spermatid+individualization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).</li>
<li>Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+RNA+recognition+motif+3+of+U2+snRNA+auxiliary+factor+%28U2AF%2865%29%29+is+essential+in+vivo+but+dispensable+for+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro.</a> RNA. 10 (65), 240-253 (2004).</li>
<li>Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determinants+of+RNA-binding+specificity+of+the+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+C+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins.</a> J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).</li>
<li>Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+Sex-lethal+antagonizes+the+splicing+factor+U2AF+to+regulate+alternative+splicing+of+transformer+pre-mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA.</a> Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).</li>
<li>Wilson, C., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+fluorophore-specific+DNA+aptamer+with+weak+redox+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity.</a> Chemistry & Biology. 5 (11), 609-617 (1998).</li>
<li>Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflections+of+a+Darwinian+Engineer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Evolution%22%5BJournal%5D)">Reflections of a Darwinian Engineer.</a> Journal of Molecular Evolution. 81 (5-6), 146-149 (2015).</li>
<li>McKeague, M., Derosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+for+small+molecule+aptamer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities for small molecule aptamer development.</a> Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913(2012).</li>
<li>Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Bind-n-Seq%3A+quantitative+assessment+of+the+sequence+and+structural+binding+specificity+of+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins.</a> Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).</li>
<li>Szeto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAPID-SELEX+for+RNA+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">RAPID-SELEX for RNA aptamers.</a> PLoS One. 8 (12), e82667(2013).</li>
<li>Rohloff, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+Acid+Ligands+With+Protein-like+Side+Chains%3A+Modified+Aptamers+and+Their+Use+as+Diagnostic+and+Therapeutic+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, e201(2014).</li>
<li>Gold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer-based+multiplexed+proteomic+technology+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery.</a> PLoS One. 5 (12), e15004(2010).</li>
<li>Zhuo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+SELEX+Technology+and+Aptamer+Applications+in+Biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).</li>
<li>Blind, M., Blank, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+Selection+Technology+and+Recent+Advances.+Molecular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy.</a> Nucleic Acids. 4, e223(2015).</li>
<li>Jijakli, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+selection+world%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The in vitro selection world.</a> Methods. 106, 3-13 (2016).</li>
</ol>

Autor oświadcza, że nie ma konkurencyjnych interesów finansowych.

Białka wiążące kwasy nukleinowe są ważnymi regulatorami rozwoju zwierząt i roślin. Kluczowym wymogiem dla procedury SELEX jest opracowanie testu, który może być używany do oddzielania frakcji RNA związanych z białkami i niezwiązanych. Zasadniczo test ten może być testem wiązania in vitro, takim jak test wiązania filtra, test przesunięcia ruchliwości żelu lub test wiązania matrycy19 dla białek rekombinowanych, oczyszczonych białek lub kompleksów białkowych. Test może być również testem enzymatyczny...

W biologii komórki, regulacja genów odgrywa kluczową rolę. Na jednym lub wielu etapach szlaku ekspresji genów geny mają potencjał do regulacji. Etapy te obejmują transkrypcję (inicjację, elongację i zakończenie), a także splicing, poliadenylację lub tworzenie końca 3', eksport RNA, translację mRNA oraz rozpad/lokalizację pierwotnych transkryptów. Na tych etapach białka wiążące kwasy nukleinowe modulują regulację genów. Identyfikacja miejsc wiązania takich białek jest ważnym aspektem badania kontroli genów. Analiza mutacji i porównanie sekwencji filogenetycznych zostały wykorzystane do odkrycia sekwencji regulatorowych lub miejsc wiązania białek w kwasach nukleinowych, takich jak promotory, miejsca splicingu, elementy poliadenylacji i sygnały translacyjne1,2,3,4.
Splicing pre-mRNA jest integralnym etapem podczas ekspresji i regulacji genów. Większość genów ssaków, w tym genów u ludzi, ma introny. Duża część tych transkryptów jest alternatywnie splicjonowana, wytwarzając wiele izoform mRNA i białek z tego samego genu lub pierwotnego transkryptu. Izoformy te pełnią specyficzne dla komórki i rozwojowe role w biologii komórki. Miejsce splicingu 5', punkt rozgałęzienia i miejsce splicingu traktu pirymidynowego/3' są krytycznymi sygnałami splicingu, które podlegają regulacji. W regulacji ujemnej miejsce splicingu jest tłumione, podczas gdy w regulacji dodatniej aktywowane jest słabe miejsce splicingu. Kombinacja tych zdarzeń prowadzi do powstania mnóstwa funkcjonalnie odrębnych izoform. Białka wiążące RNA odgrywają kluczową rolę w tych alternatywnych zdarzeniach splicingu.
Znane są liczne białka, których miejsca wiązania lub cele RNA pozostają do zidentyfikowania5, 6. Łączenie białek regulatorowych z ich dalszymi celami biologicznymi lub sekwencjami jest często złożonym procesem. W przypadku takich białek identyfikacja ich docelowego RNA lub miejsca wiązania jest ważnym krokiem w definiowaniu ich funkcji biologicznych. Po zidentyfikowaniu miejsca wiązania można je dalej scharakteryzować za pomocą standardowych analiz molekularnych i biochemicznych.
Opisane tutaj podejście ma dwie zalety. Po pierwsze, może zidentyfikować nieznane wcześniej miejsce wiązania białka będącego przedmiotem zainteresowania. Po drugie, dodatkową zaletą tego podejścia jest to, że jednocześnie umożliwia ono mutagenezę saturacji, która w przeciwnym razie byłaby pracochłonna w celu uzyskania porównywalnych informacji na temat wymagań sekwencji w miejscu wiązania. W ten sposób oferuje szybsze, łatwiejsze i mniej kosztowne narzędzie do identyfikacji miejsc wiązania białek w RNA. Pierwotnie, podejście to (SELEX lub Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) zostało wykorzystane do scharakteryzowania miejsca wiązania polimerazy DNA T4 bakteriofaga (białko genu 43), które pokrywa się z miejscem wiązania rybosomu we własnym mRNA. Miejsce wiązania zawiera sekwencję pętli 8-zasadowej, reprezentującą 65 536 losowych wariantów do analizy7. Po drugie, podejście to zostało również niezależnie zastosowane, aby pokazać, że określone miejsca wiązania lub aptamery dla różnych barwników można wybrać z puli około 1013 sekwencji8. W rzeczywistości podejście to było szeroko stosowane w wielu różnych kontekstach do identyfikacji aptamerów (sekwencji RNA lub DNA) do wiązania wielu ligandów, takich jak białka, małe cząsteczki i komórki, oraz do katalizy9. Na przykład aptamer może rozróżniać dwie pochodne ksantyny, kofeinę i teofilinę, które różnią się obecnością jednej grupy metylowej w caffeine10. Szeroko zastosowaliśmy to podejście (SELEX lub iteracyjny selekcjalno-amplifikacyjny) do zbadania, jak białka wiążące RNA funkcjonują w regulacji splicingu lub splicingu11, co będzie podstawą poniższej dyskusji.
Losowa biblioteka: Użyliśmy losowej biblioteki 31 nukleotydów. Rozważania dotyczące długości biblioteki losowej były luźno oparte na idei, że ogólny czynnik splicingu U2AF65 wiąże się z sekwencją między sekwencją punktu rozgałęzienia a miejscem splicingu 3'. Średnio odstęp między tymi sygnałami splicingowymi w metazoanach mieści się w zakresie od 20 do 40 nukleotydów. Wiadomo, że inne białko śmiertelne dla płci wiąże się ze słabo scharakteryzowaną sekwencją regulatorową w pobliżu miejsca splicingu 3' docelowego pre-mRNA, transformatora. W związku z tym wybraliśmy losowy region 31 nukleotydów, otoczony miejscami wiązania starterów z miejscami enzymu restrykcyjnego, aby umożliwić amplifikację PCR i przyłączenie promotora polimerazy RNA T7 do transkrypcji in vitro. Teoretyczny rozmiar lub złożoność biblioteki wynosiła 431 lub w przybliżeniu 1018. Wykorzystaliśmy niewielki ułamek tej biblioteki do przygotowania naszej losowej puli RNA (~1012-10 15) do eksperymentów opisanych poniżej.

<table><tbody><tr><td>Sprzęt do elektroforezy żelowej</td><td>Standardowe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>standardowe płytki szklane</td><td>Standardowe</td><td></td><td></td>standardowe</tr><tr><td>nitrocelulozy</td><td>Milipory</td><td>HAWP</td><td></td></tr><tr><td>Nitroceluloza</td><td>Schleicher & Schuell</td><td>PROTRAN</td><td></td></tr><tr><td>roztwory żelu poliakrylamidowego</td><td>Standardowa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>standardowa proteinaza K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany preparat</td><td>laboratoryjny</td> PTB <td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Odwrotna transkryptaza</td><td>NEB</td><td>M0277S</td> Kolektor próżniowy <td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>XX1002500</td><td>Millipore 25mm Szklany mikroanalityczny filtr próżniowy</td></tr><tr><td>Kolektor próżniowy</td><td>Millipore</td><td>XX2702552</td><td>1225 Pobieranie próbek Kolektor próżniowy</td></tr><tr><td>Filmy rentgenowskie</td><td>Standard</td><td>standardowy</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie przestrzeni sekwencji w celu identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących regulatorowe rna

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Regulacja genów odgrywa ważną rolę we wszystkich komórkach. Etapy transkrypcyjne, potranskrypcyjne (lub przetwarzania RNA), translacyjne i potranslacyjne służą do regulacji określonych genów. Specyficzne dla sekwencji białka wiążące kwasy nukleinowe celują w określone sekwencje w celu kontrolowania przestrzennej lub czasowej ekspresji genów. Miejsca wiązania w kwasach nukleinowych są zwykle charakteryzowane przez analizę mutacyjną. Jednak wiele interesujących białek nie ma znanego miejsca wiązania dla takiej charakterystyki. W tym miejscu opisujemy podejście do identyfikacji nieznanych wcześniej miejsc wiązania białek wiążących RNA. Polega na iteracyjnej selekcji i amplifikacji sekwencji, zaczynając od losowej puli sekwencji. Po kilku rundach tych etapów - transkrypcji, wiązania i amplifikacji - wzbogacone sekwencje są sekwencjonowane w celu zidentyfikowania preferowanego miejsca wiązania. Powodzenie tego podejścia jest monitorowane za pomocą testów wiązania in vitro. Następnie można zastosować testy funkcjonalne in vitro i in vivo w celu oceny biologicznego znaczenia wybranych sekwencji. Podejście to pozwala na identyfikację i scharakteryzowanie wcześniej nieznanego miejsca (miejsc) wiązania dla dowolnego białka wiążącego RNA, dla którego istnieje test oddzielania RNA związanych z białkiem i niezwiązanych.

Poniższe obserwacje potwierdzają skuteczność procesu selekcji i amplifikacji (SELEX). Po pierwsze, przeanalizowano wiązanie puli 0 oraz wybranych sekwencji z białkiem wykorzystanym w iteracyjnym podejściu selekcji i amplifikacji. Rycina 2 pokazuje, że ssacze białko wiążące trakt polipirymidynowy (PTB) wykazuje ledwo wykrywalne wiązanie z sekwencją puli 0, ale wysoką powinowactwo do puli sekwencji wybranych. Wiązanie z pulą 0 było ledwo wykrywalne, mimo zastos...

Specyficzność sekwencji jest kluczowa dla regulacji genów. Białka regulatorowe, które rozpoznają określone sekwencje, są ważne dla regulacji genów. Zdefiniowanie funkcjonalnych miejsc wiązania dla takich białek jest trudnym problemem biologicznym. Iteracyjne podejście do identyfikacji miejsca wiązania białka wiążącego RNA jest opisane tutaj i ma zastosowanie do wszystkich białek wiążących RNA.

Badanie przestrzeni sekwencji w celu identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących regulatorowe RNA

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

Protokół służy do mutagenezy saturacji miejsca wiązania białka. Jeśli miejsce wiązania białka nie jest znane, można je zidentyfikować za pomocą tego protokołu. Technika ta ma znaczenie w diagnostyce i terapii chorób.Uważam, że jego pełny potencjał w naukach biomedycznych nie został jeszcze w pełni wykorzystany. Metoda ta może być szeroko stosowana do dowolnego białka lub reakcji, w której pożądane cząsteczki mogą zostać oddzielone od niepożądanych cząsteczek. Upewnij się, że biblioteka jest odpowiednio losowa i upewnij się, że podczas każdego etapu wiązania i separacji wzbogacenie pożądanych cząsteczek jest wysokie.Składa się z kilku kroków i wielu szczegółów, które lepiej zademonstrować, niż wyjaśnić słowami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być zaznajomiony z tym, jak przygotować losową bibliotekę, zsyntetyzować początkową pulę RNA i przeprowadzić reakcję wiązania w celu oddzielenia pożądanych i niepożądanych cząsteczek, aby uzyskać wysokie powinowactwo i specyficzne spoiwa. Najpierw zsyntetyzuj starter do przodu i starter do tyłu przez syntezę chemiczną na syntezatorze DNA.Zsyntetyzuj również losową matrycę oligonukleotydową biblioteki z 31 losowymi pozycjami. W probówce do P

exploring-sequence-space-to-identify-binding-sites-for-regulatory-rna

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Transkrypty RNA podlegają rozległej regulacji potranskrypcyjnej, w której pośredniczy wiele trans-działających białek wiążących RNA (RBP). W tym miejscu przedstawiamy uogólnioną metodę precyzyjnej identyfikacji w skali całego transkryptomu miejsc wiązania RNA RBP.

PAR-CliP - metoda identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących RNA w całym transkryptomie

W tym filmie opisujemy systematyczną ewolucję ligandów metodą wykładniczego wzbogacania (SELEX) w celu identyfikacji specyficznych sekwencji wiążących RNA dla docelowego białka. Białko jest inkubowane z dużą pulą randomizowanych sekwencji RNA, a sekwencje RNA wiążące białka są izolowane, amplifikowane PCR i sekwencjonowane w celu zidentyfikowania ich miejsc wiązania białek.

Test wiązania in vitro oparty na SELEX w celu identyfikacji interakcji RNA-białko

Protokół pull-down RNA jest tutaj zoptymalizowany do wykrywania interakcji między białkami wiążącymi RNA (RBP) a niekodującymi i kodującymi RNA. Fragment RNA z receptora androgenowego (AR) został wykorzystany jako przykład, aby zademonstrować, jak odzyskać jego RBP z listanu pierwotnych brązowych adipocytów.

Wykrywanie białek wiążących RNA metodą in vitro RNA pull-down w hodowli adipocytów

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Opisujemy protokół do identyfikacji białek wiążących RNA i mapowania ich regionów wiążących RNA w żywych komórkach za pomocą fotosieciowania za pośrednictwem UV i spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas

Białka, które wiążą określone sekwencje RNA, odgrywają kluczową rolę w ekspresji genów. Szczegółowa charakterystyka tych miejsc wiązania ma kluczowe znaczenie dla naszego zrozumienia regulacji genów. W tym miejscu opisano jednoetapowe podejście do mutagenezy saturacji miejsc wiązania białek w RNA. Podejście to jest istotne dla wszystkich miejsc wiązania białek w RNA.

Nowe podejście do mutagenezy saturacji: jednoetapowa charakterystyka miejsc wiązania białek regulatorowych w RNA przy użyciu fosforotionianów

W tej metodzie, określamy ilościowo powinowactwo wiązania białek wiążących RNA (RBP) do pokrewnych i niepokrewnych miejsc wiązania za pomocą prostego, żywego, reporterowego testu w komórkach bakteryjnych. Test opiera się na represji genu reporterowego.

Test do ilościowego określania wiązania białka-RNA u bakterii

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych miejsc wiązania RNA lub "śladów" kompleksów RNA:białko (RNP) z komórek ssaków. Podejście to obejmuje dwie immunoprecypitacje podjednostek RNP i dlatego nazywa się immunoprecypitacją RNA w tandemie (RIPiT).

Identyfikacja śladów RNA:Kompleksy białkowe poprzez immunoprecypitację RNA w tandemie, a następnie sekwencjonowanie (RIPiT-Seq)

Technologia MAPS została opracowana w celu zbadania celu określonego regulatorowego RNA in vivo. Interesujący sRNA jest znakowany aptamerem MS2, który umożliwia wspólne oczyszczanie partnerów RNA i ich identyfikację za pomocą sekwencjonowania RNA. Ten zmodyfikowany protokół jest szczególnie odpowiedni dla bakterii Gram-dodatnich.

Oczyszczanie powinowactwa MS2 w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA u bakterii Gram-dodatnich

Poznaj protokół saturacyjnej mutagenezy do identyfikacji miejsc wiązania białek RNA. Ta metoda umożliwia odkrywanie nieznanych sekwencji wiążących z zastosowaniem w diagnostyce i terapii chorób.

Badanie przestrzeni sekwencji w celu identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących regulatorowe RNA

Przeglądaj więcej filmów