Badanie przestrzeni sekwencji w celu identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących regulatorowe RNA

Protokół służy do mutagenezy saturacji miejsca wiązania białka. Jeśli miejsce wiązania białka nie jest znane, można je zidentyfikować za pomocą tego protokołu. Technika ta ma znaczenie w diagnostyce i terapii chorób.

Uważam, że jego pełny potencjał w naukach biomedycznych nie został jeszcze w pełni wykorzystany. Metoda ta może być szeroko stosowana do dowolnego białka lub reakcji, w której pożądane cząsteczki mogą zostać oddzielone od niepożądanych cząsteczek. Upewnij się, że biblioteka jest odpowiednio losowa i upewnij się, że podczas każdego etapu wiązania i separacji wzbogacenie pożądanych cząsteczek jest wysokie.

Składa się z kilku kroków i wielu szczegółów, które lepiej zademonstrować, niż wyjaśnić słowami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być zaznajomiony z tym, jak przygotować losową bibliotekę, zsyntetyzować początkową pulę RNA i przeprowadzić reakcję wiązania w celu oddzielenia pożądanych i niepożądanych cząsteczek, aby uzyskać wysokie powinowactwo i specyficzne spoiwa. Najpierw zsyntetyzuj starter do przodu i starter do tyłu przez syntezę chemiczną na syntezatorze DNA.

Zsyntetyzuj również losową matrycę oligonukleotydową biblioteki z 31 losowymi pozycjami. W probówce do PCR wymieszaj jednomikromolową matrycę biblioteki losowej DNA, jednomikromolowy starter do przodu zawierający promotor polimerazy RNA T7 i starter odwrotny, 20-milimolowy Tris przy pH ośmiu, 1,5-milimolowy chlorek magnezu, 50-milimolowy chlorek potasu, acetylowaną albuminę surowicy bydlęcej 1 mikrogramów na mililitr, dwie jednostki polimerazy Taq i 200 mikromolów dNTP każda. Skonfiguruj maszynę do PCR z pięcioma cyklami denaturacji, wyżarzania i wydłużania, a następnie jednym cyklem przedłużania, aby przyłączyć promotor do biblioteki DNA.

Skonfiguruj 100-mikrolitrową reakcję transkrypcyjną zawierającą bufor transkrypcyjny T7, jednomikromolową pulę losowej puli bibliotek DNA, pięciomilimolową DTT, dwumilimolową GTP, po jednym milimolowym ATP, CTP i UTP oraz dwie jednostki na mikrolitr polimerazy RNA T7. Teraz załóż osłonę ze szkła akrylowego i rękawiczki. Wprowadź radioaktywność, dodając 5 mikrolitrów lub mniej alfa-32P UTP do reakcji transkrypcji do autoradiografii.

Mieszaninę reakcyjną inkubować w probówce mikrowirówkowej przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby oczyścić RNA żelem, przygotuj 10% denaturujący żel poliakrylamidowy. Załaduj próbki do dołków żelu.

Wystaw żel na kliszę rentgenowską i zidentyfikuj położenie transkryptów na żelu i wytnij plasterek żelu. Umieść plasterek żelu w probówce wirówkowej i połam na mniejsze kawałki za pomocą końcówki homogenizatora. Dodaj bufor proteinazy K, aby zanurzyć kawałki żelu.

Pozostaw probówkę na nutatorze na co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie wirować w mikrowirówce o wysokiej prędkości przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć resztki żelu i odzyskać roztwór buforowy. Dodać równą objętość chloroformu fenolowego do probówki z supernatantem, wirem i wirówką.

Powtórzyć ekstrakcję z chloroformem fenolowym jeszcze raz, a następnie z chloroformem jeszcze raz. Następnie wymieszaj fazę wodną buforu proteinazy K z 1/10 objętości trójmolowego octanu sodu o pH 5,2, 10 mikrogramami tRNA lub 20 mikrogramami glikogenu i dwiema do trzech objętości etanolu przechowywanego w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Pozostaw probówkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na godzinę.

Wirować probówkę zawierającą roztwór przez pięć do 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w mikrowirówce. Ostrożnie wyrzuć supernatant i dodaj 70% etanolu, aby wypłukać osad RNA. Wiruj przez dwie do pięciu minut.

Ostrożnie zassać etanol i wysuszyć na powietrzu osad RNA. Następnie dodaj 50 mikrolitrów wody uzdatnionej DEPC, aby rozpuścić osad RNA. Pozostawić próbkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do przechowywania.

Aby związać białko i RNA w objętości reakcyjnej 100 mikrolitrów, najpierw przygotuj 10-milimolowy chlorowodorek Tris o pH 7,5 zawierający 50-milimolowy chlorek potasu, jednomilimolową DTT, 09 mikrogramów na mikrolitr albuminy surowicy bydlęcej, 5 jednostek na mikrolitr RNAsin, 15 mikrogramów na mikrolitr tRNA i jednomilimolowy EDTA. Następnie dodaj 30 mikrolitrów rekombinowanego białka PTB i 10 mikrolitrów RNA z odpowiedniej puli. Umieść probówki zawierające reakcje wiązania w bloku temperaturowym na około 30 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Następnie frakcjonuj związany RNA od niezwiązanego RNA przez cztery rundy selekcji i amplifikacji. Najpierw przefiltruj próbkę o pojemności 100 mikrolitrów w temperaturze pokojowej przez filtr nitrocelulozowy przymocowany do kolektora próżniowego. Kompleks RNA-białko pozostaje na filtrze.

Za pomocą sterylnej żyletki posiekaj filtr na fragmenty i włóż je do probówki wirówkowej. Zanurz fragmenty filtra w buforze proteinazy K i umieść je na bębnie na co najmniej trzy godziny lub na noc, aby odzyskać RNA. Aby odbiałizować próbkę RNA, dodaj równą objętość fenolu-chloroformu, odwiruj, a następnie wiruj z dużą prędkością przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Uzyskać fazę wodną i ponownie ekstrahować chloroformem. Następnie wymieszać supernatant z 1/10 objętości trójmolowego octanu sodu o pH 5,2 i dwiema do trzech objętości absolutnego alkoholu etylowego. Pozostaw probówkę w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na 30 minut, a następnie odwiruj ją z dużą prędkością przez 10 minut.

Powtórz etapy mycia i suszenia z 70% etanolem i rozpuścij RNA w wodzie uzdatnionej DEPC. Po pierwszej rundzie testu wiązania filtra przeprowadź trzy kolejne rundy. Następnie wykonaj dwie rundy transkrypcji, wiązania i amplifikacji, aby oddzielić frakcje RNA związane z białkiem od frakcji niezwiązanych.

Prefabrykowany natywny 5% żel poliakryloamidowy o stosunku akrylamid-bis-akryloamid 60 do jednego w buforze 5x TBE. Następnie ustaw reakcję wiązania RNA-białko. Umieść żel w urządzeniu do elektroforezy wypełnionym 5x buforem TBE w chłodnym pomieszczeniu w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zastosuj napięcie 250 V przez 15 minut i pipetuj reakcję wiązania do różnych studzienek. Następnie dalej frakcjonuj związany RNA od niezwiązanego RNA, uruchamiając elektroforezę przy napięciu 250 woltów przez jedną do dwóch godzin. Następnie naświetl żel na kliszy rentgenowskiej i zidentyfikuj lokalizację związanego RNA za pomocą autoradiografii.

Wytnij plasterek żelu ze związanym RNA i włóż go do probówki. Zmiażdż plasterek żelu i inkubuj w buforze proteinazy K przez trzy godziny lub przez noc. Powtórzyć ekstrakcję za pomocą fenolu-chloroformu i chloroformu, jak opisano wcześniej.

Zsyntetyzuj cDNA z rozpuszczonego RNA. Przygotuj 20 mikrolitrów reakcji, w tym dwa mikrolitry buforu 10x RT, dwa mikrolitry odwrotnej transkryptazy AMV, jeden mikrolitr odwróconego startera, pięć mikrolitrów wody i 10 mikrolitrów rozpuszczonego RNA. Inkubować w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 60 minut.

Amplifikuj cDNA za pomocą 20 do 25 cykli PCR, jak opisano wcześniej. Powtórz proces syntezy RNA, wiązania białek i oddzielania frakcji związanych z białkiem i niezwiązanych. Aby przeanalizować wiązanie białka, użyj testu przesunięcia ruchliwości żelu lub testu wiązania filtra, aby określić powinowactwo i swoistość wiązania dla wybranych pul lub poszczególnych sekwencji w każdej puli.

Użyj autoradiografii lub imagera luminoforowego, aby wykryć i określić ilościowo prążki we frakcji związanej i frakcji niezwiązanej. Kontynuuj protokół z klonowaniem i wyrównaniem sekwencji. W tym badaniu osiągnięto udaną selekcję-amplifikację.

Białko wiążące szlak polipirymidynowy u ssaków o 300-krotnie wyższym stężeniu białka wykazuje ledwo wykrywalne wiązanie z sekwencją zerową puli, ale wysokie powinowactwo do wybranej puli sekwencji. Selekcja-amplifikacja z powodzeniem zidentyfikowana na białkach wiążących RNA z preferowanym lub uzgodnionym miejscem wiązania. Dodanie rekombinowanego PTB, który wiąże się z miejscem splicingu trójelementowego w górę, prowadzi do aktywacji alternatywnego lub dalszego miejsca splicingu trójelementowego.

Natomiast dodanie rekombinowanego hnRNP C prowadzi do represji obu miejsc splicingu trójelementowego. Dodanie rekombinowanego ogólnego czynnika splicingu U2AF65 odwróciło represję miejsca splicingu za pośrednictwem trzech pierwszych miejsc splicingu hnRNP C. Ważne jest, aby pamiętać, że dobra losowa biblioteka i odpowiednie warunki wiązania, które zapewniają wysokie wzbogacenie fałdowania na każdym etapie wiązania, są niezbędne do osiągnięcia sukcesu.

Odpowiednie testy funkcjonalne i testy in vivo mogą być wykorzystane do walidacji wyników tego podejścia. W dziedzinie ekspresji genów badano funkcje wielu białek przy użyciu tej techniki. Ważne jest, aby używać rękawic i radioaktywnej uszczelki w celu ochrony podczas pracy z poliakrylamidem i radioaktywnością.