Test ELISA in vitro do oceny siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie
May 11th, 2020
Tutaj opisujemy pośrednie wychwytywanie immunologiczne metodą ELISA w celu określenia zawartości immunogennej glikoproteiny w szczepionkach przeciwko wściekliźnie. Ten test wykorzystuje neutralizujące przeciwciało monoklonalne (mAb-D1) rozpoznające trimery glikoproteiny. Jest to alternatywa dla testu NIH in vivo w celu śledzenia spójności siły działania szczepionki podczas produkcji.
W celu ograniczenia liczby testów na zwierzętach oraz ze względu na zmienność testu NH WHO zachęca do opracowania metod in vitro do oceny skuteczności szczepionki przeciwko wściekliźnie. Ten test ELISA wykazuje dobrą zgodność z klasycznym testem NH w rozpoznawaniu immunogennej formy glikoproteiny, wykazuje wysoką czułość i może być wykonany w ciągu zaledwie jednego dnia. Ocena skuteczności szczepionki przeciwko wściekliźnie in vitro metodą ELISA stanowi alternatywę dla testu NH in vivo.
Jest on promowany przez producentów i krajowe laboratoria kontrolne. Bardzo ważne jest, aby rozprowadzić wstępnie zwymiarowane objętości w dwóch egzemplarzach dla każdego rozcieńczenia i dobrze wysuszyć płytkę na papierze chłonnym po praniu, aby uniknąć Aby rozpocząć tę procedurę, załóż odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym jednorazowy płaszcz, rękawiczki, maskę i okulary. Zanieczyszczone materiały należy poddać obróbce, zanurzając je w roztworze 2,6% podchlorynu sodu na 30 minut w celu odkażenia.
Następnie należy ustawić 96-dołkową płytkę do testu immunologicznego i dodać 200 mikrolitrów przeciwciała monoklonalnego rozcieńczonego w buforze węglanowym do każdej studzienki. Przykryj płytkę folią samoprzylepną i inkubuj mikropłytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny w wilgotnym środowisku. Następnie ostrożnie odessać i przenieść zawartość studzienki do biorcy zawierającego roztwór 2,6% podchlorynu sodu.
Odwróć mikropłytkę i pozostaw do wyschnięcia na chłonnym papierze w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Najpierw dodaj 300 mikrolitrów buforu pasywacyjnego do każdej studzienki. Przykryj płytkę folią samoprzylepną i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.
Następnie przenieś zawartość studzienki do studni zawierającej roztwór 2,6% podchlorynu sodu. Aby umyć płytkę, dodaj 300 mikrolitrów buforu myjącego do każdej studzienki. Następnie ostrożnie odessać i przenieść zawartość studzienki do biorcy zawierającego roztwór 2,6% podchlorynu sodu.
Powtórz ten proces mycia jeszcze pięć razy, aby dokładnie umyć uczuloną płytkę. Następnie odwróć mikropłytkę i pozostaw do wyschnięcia na kawałku chłonnego papieru w temperaturze pokojowej na jedną minutę. Odpuścić szczepionkę wzorcową w jednym mililitrze wody destylowanej tak, aby końcowe stężenie glikoproteiny wirusa wścieklizny wynosiło 10 mikrogramów na mililitr.
Przygotować 10-krotne rozcieńczenie odtworzonej szczepionki referencyjnej w rozcieńczalniku, aby osiągnąć stężenie glikoproteiny wirusa wścieklizny wynoszące jeden mikrogram na mililitr. Następnie należy wykonać sześć seryjnych dwukrotnych rozcieńczeń tej szczepionki referencyjnej w rozcieńczalniku, jak opisano w tabeli pierwszej protokołu tekstowego. Rozprowadzić 200 mikrolitrów rozcieńczalnika w zduplikowanych studzienkach, aby służyły jako ślepa kontrola i 200 mikrolitrów na studzienkę dla każdego referencyjnego rozcieńczenia szczepionki w dwóch egzemplarzach.
Następnie należy przygotować 10-krotne rozcieńczenie badanej szczepionki w rozcieńczalniku i przygotować siedem dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń badanej szczepionki w rozcieńczalniku, jak przedstawiono w tabeli drugiej protokołu tekstowego. Rozprowadzić 200 mikrolitrów każdego badanego rozcieńczenia szczepionki po dwóch egzemplarzach do każdej studzienki mikropłytki. Przykryj mikropłytkę folią samoprzylepną i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.
Następnie usuń folię. Ostrożnie odessać i przenieść zawartość każdej studzienki do pojemnika zawierającego 2,7% roztwór podchlorynu sodu. Aby umyć płytkę, dodaj 300 mikrolitrów buforu płuczącego do każdej studzienki, ostrożnie odessaj i przenieś zawartość każdej studzienki do pojemnika zawierającego 2,6% roztwór podchlorynu sodu.
Powtórz proces mycia jeszcze pięć razy, aby usunąć niezwiązany antygen i zachować trimery białka G związane z powlekanym przeciwciałem. Umytą mikropłytkę odwróć do góry dnem i pozostaw do wyschnięcia na kawałku chłonnego papieru w temperaturze pokojowej na jedną minutę. Następnie rozprowadzić 200 mikrolitrów zalecanego rozcieńczenia przeciwciała monoklonalnego D1 znakowanego peroksydazą w rozcieńczalniku do każdej studzienki.
Przykryj mikropłytkę folią samoprzylepną i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie usuń folię, ostrożnie odessaj i przenieś zawartość każdej studzienki do biorcy zawierającego 2,6% roztwór podchlorynu sodu. Aby umyć mikropłytkę, dodaj 300 mikrolitrów buforu myjącego do każdej studzienki.
Ostrożnie odessać i przenieść zawartość każdej studzienki do biorcy zawierającego 2,6% roztwór podchlorynu sodu. Powtórz ten proces mycia jeszcze pięć razy, aby usunąć niezwiązane przeciwciało znakowane peroksydazą. Umytą mikropłytkę odwróć do góry dnem i pozostaw do wyschnięcia na kawałku chłonnego papieru w temperaturze pokojowej na jedną minutę.
Następnie rozprowadź 200 mikrolitrów roztworu substratu-chromogenu do każdej studzienki. Uszczelnić mikropłytkę folią i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut. Następnie dodaj 50 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcję.
Ostrożnie wytrzyj spód mikropłytki i umieść ją w spektrofotometrze. Określ gęstość optyczną przy 492 nanometrach dla wszystkich użytych studzienek. Zbierz te dane w pliku arkusza kalkulacyjnego do analizy.
Następnie należy utworzyć wykresy zarówno dla referencyjnej krzywej szczepionki, jak i wartości gęstości optycznej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W tym badaniu test ELISA in vitro służy do oceny siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie. Reprezentatywne wartości gęstości optycznej z typowego eksperymentu są pokazane tutaj.
Wartości te są wykorzystywane do narysowania krzywej referencyjnej szczepionki poprzez wykreślenie średniej gęstości optycznej dla różnych rozcieńczeń szczepionki referencyjnej na osi pionowej i stężenia glikoproteiny na osi poziomej. Zawartość glikoproteiny w badanej szczepionce jest następnie szacowana za pomocą tej krzywej. Ocena jest precyzyjna dla rozcieńczeń, które mają średnią wartość gęstości optycznej w obszarze wkładki referencyjnej krzywej szczepionki.
Biorąc pod uwagę rozcieńczenie od jednego do 40, rzut pionowy OD 1534 na oś x odpowiada 500 nanogramom na mililitr. Tak więc testowaną szczepionkę szacuje się na 20 mikrogramów na mililitr glikoproteiny. Po ustaleniu siły działania in vitro konieczne jest porównanie badanej szczepionki z sześcioma referencyjnymi normami międzynarodowymi WHO skalibrowanymi w jednostkach międzynarodowych.
Ta sama metoda może być stosowana w przypadku innych przeciwciał w celu zwiększenia wykrywalności większej liczby szczepów szczepionkowych, w tym tych stosowanych w szczepionkach weterynaryjnych, które są klasycznie bardziej zróżnicowane. Przeciwciała mogą być również stosowane w zawodach o miareczkowanie przeciwciał przeciwko wściekliźnie w surowicy koni lub ludzi. Należy zachować środki ostrożności w przypadku szczepionek, które nie są inaktywowane lub szczepionek zawierających wirusy.
Pamiętaj, aby używać środków ochrony osobistej, nosić rękawice i wszystko odpowiednio odkazić. Należy również uważać na tabletki, ponieważ są rakotwórcze i z kwaśnym roztworem podchlorynu sodu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje pośrednią metodę immunokaptacji sandwich ELISA do określania zawartości immunogennych glikoprotein w szczepionkach przeciwko wściekliźnie. Test wykorzystuje neutralizujące przeciwciało monoklonalne (mAb-D1), które rozpoznaje trimery glikoprotein, zapewniając alternatywę dla in vivo testu NIH do oceny siły szczepionki.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Vaccinologia
- Metody testów in vitro
Tło
- WHO zachęca do rozwoju podejść in vitro w celu ograniczenia testów na zwierzętach.
- Różnorodność w teście NIH skłoniła do poszukiwania bardziej konsekwentnych alternatyw.
- Ten test ELISA wykazuje dobrą zgodność z klasycznymi testami NH.
- Wysoka czułość i szybkie wykonanie w ciągu jednego dnia to kluczowe zalety tej metody.
Cel badania
- Ocena siły szczepionki przeciwko wściekliźnie za pomocą metody ELISA in vitro.
- Zapewnienie wiarygodnej alternatywy dla in vivo testu NIH.
- Promowanie stosowania tej metody wśród producentów i krajowych laboratoriów kontrolnych.
Zastosowane metody
- Pośrednia technika immunokaptacji sandwich ELISA.
- Zastosowanie neutralizującego przeciwciała monoklonalnego (mAb-D1).
- Przygotowanie objętości wstępnie ustalonych w dwóch egzemplarzach dla każdej rozcieńczonej próbki.
- Procedury dezaktywacji do obsługi zanieczyszczonego materiału.
Główne wyniki
- Test ELISA wykazuje wysoką czułość w rozpoznawaniu immunogennej formy glikoproteiny.
- Wyniki są zgodne z wynikami uzyskanymi z klasycznych testów NH.
- Metoda może zostać zakończona w ciągu jednego dnia, co zwiększa wydajność.
- Promowana jako wykonalna alternatywa przez producentów i laboratoria kontrolne.
Wnioski
- Metoda ELISA jest obiecującą alternatywą do oceny siły szczepionki przeciwko wściekliźnie.
- Jest zgodna z zaleceniami WHO dotyczącymi ograniczenia testów na zwierzętach.
- Dalsze przyjęcie mogłoby uporządkować oceny siły szczepionki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This in vitro ELISA method provides a reliable, animal-free alternative for assessing rabies vaccine potency, addressing industry pressure to adopt 3Rs principles. By delivering quantitative, reproducible measurements of immunogenic glycoprotein content within one day, it supports faster go/no-go decisions in vaccine development and manufacturing. The method’s concordance with the NIH test enables seamless integration into existing quality control workflows while reducing variability and ethical concerns associated with in vivo testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Confirms the presence of natively folded, immunogenic glycoprotein trimers critical for inducing viral neutralizing antibodies.
- Operational Value: Uses mAb-D1 to specifically detect conformational epitopes, enabling discrimination between functional and denatured antigen forms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative optical density data that correlates directly with glycoprotein concentration across serial dilutions.
- Operational Value: Employs duplicate pre-sized volumes and standardized washing steps to ensure assay reproducibility and minimize technical variability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables cross-strain applicability by allowing substitution of antibodies to detect variable glycoprotein epitopes in veterinary vaccine strains.
- Operational Value: Supports competitive antibody titration formats for measuring antirabies antibodies in serum, expanding utility beyond potency testing.
Pipeline & Workflow Integration
The ELISA assay fits within the vaccine development continuum from early antigen expression analysis through final lot release, providing a mechanistic bridge between molecular integrity and functional immunogenicity.
- Discovery Biology: Validates that vaccine constructs produce correctly folded glycoprotein trimers, supporting target confirmation and lead selection.
- Screening: Delivers standardized, high-sensitivity readouts suitable for evaluating expression systems and process conditions affecting antigen quality.
- Analytics: Produces interpolated glycoprotein concentrations via reference curves, enabling lot-to-lot comparison and release specification setting.
- Translational Research: Facilitates alignment with WHO international standards, supporting global regulatory comparability and technology transfer.
- Enterprise Reuse: Requires only plate reader and standard reagents, allowing broad deployment across manufacturing sites and QC laboratories.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking vaccine potency directly to the concentration of native, trimeric glycoprotein.
- Operational Value: Eliminates animal use, decreases testing timelines from weeks to one day, and enhances throughput for batch release.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by lowering costs associated with NIH test maintenance, animal housing, and ethical oversight.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of vaccine candidates through early, predictive assessment of immunogenic antigen yield.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ELISA technique, antibody handling, and biosafety protocols for working with rabies virus antigens.
- Depends on access to spectrophotometer, incubator, and precise liquid handling equipment for duplicate dilutions and washing steps.
- Necessitates standardization of passivation, washing, and drying procedures to prevent false signals from incomplete antigen immobilization or antibody carryover.
- Must account for variability in glycoprotein conformation across vaccine strains, necessitating antibody validation for each target.
- Inapplicable to vaccines containing live virus or incomplete inactivation due to safety risks and potential false-positive signals.
