Name: Test ELISA in vitro do oceny siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metodę ELISA do oceny siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie in vitro. Ta technika wykorzystuje przeciwciało monoklonalne mAb-D1 i stanowi alternatywę dla testu NIH na zwierzętach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Sylvie Morgeaux i Dr. Jean-Michel Chapsal muszą być docenieni za ich kluczowy udział w ustanowieniu testu ELISA na partiach szczepionek oraz w organizowaniu międzynarodowych warsztatów i wspólnych badań. Dziękujemy Sabrinie Kali za krytyczną lekturę manuskryptu. Dr Pierre Perrin był odpowiedzialny za izolację i charakterystykę mAb-D1. Prace te były głównie wspierane przez fundusze Instytutu Pasteura.

1. Środki ostrożności
UWAGA: Ta metoda ma zastosowanie zarówno do żywej szczepionki RABB, jak i inaktywowanej.
<ol>
	<li>Stosuj dobrą praktykę laboratoryjną i procedury bezpieczeństwa.</li>
	<li>Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), w tym jednorazowy płaszcz, rękawice, maskę, okulary itp.</li>
	<li>Podczas miareczkowania żywego wirusa należy użyć komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
	<ol>
		<li>Każdy materiał mający kontakt z próbkami (odczynniki, roztwory myjące itp.) należy traktować jako materiał zakaźny.</li>
		<li>Zanieczyszczony materiał należy poddać obróbce, zanurzając go w roztworze wybielacza (2,5% podchlorynu sodu) na 30 minut w celu odkażenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Z chemikaliami należy obchodzić się zgodnie z Dobrą Praktyką Laboratoryjną.</li>
</ol>
2. Przygotowanie
<ol>
	<li>Tam, gdzie to możliwe, należy używać odczynników klasy analitycznej.</li>
	<li>Przygotować świeże roztwory buforu powlekającego/buforu węglanowego, buforu pasywacyjnego, rozcieńczalnika i buforu cytrynianowego (tabela 1), przefiltrować przez filtry 0,45 lub 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez jeden dzień przed użyciem w celu zachowania ich czystości analitycznej.</li>
	<li>Pozwól, aby odczynniki osiągnęły temperaturę pokojową (+18 °C do +25 °C) 30 minut przed użyciem i homogenizuj przez delikatne mieszanie przed użyciem.</li>
</ol>
3. Uczulenie na mikropłytkę
UWAGA: Użyj 96-dołkowych płytek do testów immunologicznych z adsorpcją, które są zoptymalizowane do wiązania dużych ilości immunoglobulin (np. zobacz Tabelę Materiałów).
<ol>
	<li>Do każdej studzienki dodać 200 μl przeciwciała monoklonalnego (mAb-D1) rozcieńczonego w buforze węglanowym. 
	UWAGA: Eksperymentalnie określono optymalne stężenie około 1 μg/ml, które odpowiada w przybliżeniu rozcieńczeniu 1/2000 oczyszczonego mAb-D1. To zalecane stężenie jest wskazane dla każdej partii mAb-D1 i musi być okresowo weryfikowane z kontrolą dodatnią.</li>
	<li>Przykryć płytkę folią przylepną i inkubować mikropłytkę przez 3 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze.</li>
	<li>Ostrożnie odessać i przenieść zawartość studzienki do pojemnika zawierającego 2,5% roztwór podchlorynu sodu.</li>
	<li>Odwróć mikropłytkę i pozostaw do wyschnięcia na bibule adsorbującej w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
</ol>
4. Pasywacja mikropłytek
<ol>
	<li>Do każdej studzienki dodać 300 μl buforu pasywacyjnego.</li>
	<li>Przykryć płytkę folią klejącą i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Ostrożnie odessać i przenieść zawartość studzienki do pojemnika zawierającego 2,5% roztwór podchlorynu sodu.</li>
	<li>Odwróć mikropłytkę i pozostaw do wyschnięcia na bibule adsorbcyjnej w temperaturze pokojowej przez 1 min. 
	UWAGA: Mikropłytka może być natychmiast użyta lub przechowywana szczelnie zamknięta w temperaturze -20 °C do 3 miesięcy.</li>
</ol>
5. Test ELISA
UWAGA: Do ustalenia krzywej kontrolnej szczepionki referencyjnej, Krok 5.3 nie jest wymagany; do miareczkowania testowanej szczepionki konieczne są wszystkie kroki od 5.1 do 5.6.
<ol>
	<li>Mycie mikropłytki uczulonej
	<ol>
		<li>Do każdej studzienki dodać 300 μl buforu do mycia.</li>
		<li>Ostrożnie odessać i przenieść zawartość studzienki do pojemnika zawierającego 2,5% roztwór podchlorynu sodu.</li>
		<li>Powtórz kroki 5.1.1 i 5.1.2 jeszcze pięć razy, aby dokładnie umyć uczuloną płytkę.</li>
		<li>Odwróć mikropłytkę i pozostaw do wyschnięcia na bibule adsorbującej w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczenia szczepionki referencyjnej dla krzywej kontrolnej
	<ol>
		<li>Odtworzyć szczepionkę wzorcową (antygen walidacyjny partia 09) w 1 ml wody destylowanej odpowiadającej stężeniu 10 μg/ml glikoproteiny wirusa wścieklizny.</li>
		<li>Przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenie odtworzonej szczepionki wzorcowej w rozcieńczalniku, aby osiągnąć 1 μg/ml glikoproteiny wirusa wścieklizny.</li>
		<li>Przygotować 6 seryjnych dwukrotnych rozcieńczeń tej szczepionki wzorcowej w rozcieńczalniku, jak wskazano w Tabeli 1.</li>
		<li>Rozprowadzić 200 μl rozcieńczalnika w dwóch egzemplarzach (studzienki 1H/2H), aby służyły jako ślepa próba.</li>
		<li>Rozprowadzić 200 μl na studzienkę każdego rozcieńczenia szczepionki referencyjnej w dwóch egzemplarzach (studzienki G1/G2 do A1/A2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczenia badanej szczepionki w celu jej miareczkowania
	<ol>
		<li>Przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenie badanej szczepionki w rozcieńczalniku.</li>
		<li>Przygotować 7 dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń badanej szczepionki w rozcieńczalniku, jak wskazano w Tabeli 2.</li>
		<li>Rozprowadzić 200 μl na studzienkę każdego badanego rozcieńczenia szczepionki w dwóch egzemplarzach (studzienki H3/H4 do A3/A4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja/Mycie płytki ELISA
	<ol>
		<li>Przykryć mikropłytkę folią klejącą i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Usunąć folię, ostrożnie odessać i przenieść zawartość każdej studzienki do biornika zawierającego 2,5% roztwór podchlorynu sodu.</li>
		<li>Do każdej studzienki dodaj 300 μl buforu do mycia.</li>
		<li>Ostrożnie odessać i przenieść zawartość każdej studzienki do biorcy zawierającego 2,5% roztwór podchlorynu sodu.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 5.4.3 i 5.4.4 pięć razy w celu usunięcia niezwiązanego antygenu i zachowania trimerów białka G związanych z powlekanym przeciwciałem (mAb D1).</li>
		<li>Odwróć mikropłytkę i pozostaw do wyschnięcia na bibule adsorbującej w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wiązanie mAb-D1 sprzężonego z peroksydazą
	<ol>
		<li>Rozprowadzić 200 μl na studzienkę zalecanego rozcieńczenia (1/2000) mAb-D1 znakowanego peroksydazą w rozcieńczalniku (przybliżone stężenie 1 μg/ml). Zalecane stężenie jest wskazane dla każdej partii mAb-D1 i musi być okresowo weryfikowane z kontrolą dodatnią.</li>
		<li>Przykryć mikropłytkę folią klejącą i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Usunąć folię, ostrożnie odessać i przenieść zawartość każdej studzienki do biornika zawierającego 2,5% roztwór podchlorynu sodu.</li>
		<li>Dodać do każdej studzienki 300 μl buforu do płukania.</li>
		<li>Ostrożnie odessać i przenieść zawartość każdej studzienki do biorcy zawierającego 2,5% roztwór podchlorynu sodu.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 5.5.4 i 5.5.5 pięć razy, aby usunąć niezwiązane przeciwciało znakowane peroksydazą (mAb D1).</li>
		<li>Odwróć mikropłytkę i pozostaw do wyschnięcia na bibule adsorbującej w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rewelacja przy użyciu substratu-chromogenu
	<ol>
		<li>Rozprowadzić 200 μl na studzienkę roztworu substratu chromogenu.</li>
		<li>Uszczelnić mikropłytkę folią i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Rozwija się żółto-pomarańczowy kolor, którego intensywność jest proporcjonalna do ilości związanego przeciwciała znakowanego peroksydazą (mAb D1).</li>
		<li>Zatrzymać reakcję, dodając 50 μl roztworu zatrzymującego na studzienkę.</li>
		<li>Ostrożnie wytrzeć spód mikropłytki i umieścić ją w spektrofotometrze w celu określenia gęstości optycznej (OD) przy 492 nm wszystkich użytych studzienek: kontroli ujemnej (ślepa), szczepionki referencyjnej i badanej szczepionki.</li>
		<li>Zbieraj dane OD w formacie pliku .xls lub .xlsx do analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Narysować krzywą odniesienia szczepionki, zawartość glikoproteiny trimerycznej, w funkcji gęstości optycznej (492 nm)
	<ol>
		<li>Obliczyć średni OD przy długości fali 492 nm dla każdego duplikatu w różnych rozcieńczeniach szczepionki wzorcowej (baseniki G1/G2 do A1/A2 w tabeli 2)</li>
		<li>Odjąć średnią OD ślepej próby (studzienek, H1/H2 w tabeli 2) od każdej obliczonej średniej OD.</li>
		<li>Wykreślić wynikowe wartości OD na osi pionowej (skala liniowa) i odpowiadające im stężenie w trimerach glikoproteiny (ng / ml) na osi poziomej (skala logarytmiczna).</li>
		<li>Narysuj krzywą odniesienia, łącząc punkty (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Epitop rozpoznawany przez mAb-D1 znajduje się w miejscu antygenowym III glikoproteiny RABB, która jest nie tylko immunodominująca w indukcji VNAb, ale także bierze udział w neurowirulencji, patogenności40,41 i rozpoznawaniu receptorów42. Istnieje inne ważne miejsce antygenowe wzdłuż glikoproteiny, miejsce II43, przeciwko któremu wyizolowano kilka MAb, takich jak mAb-WI-111235. Można je równie...

Od ponad 50 lat, test 1 jest używany jako złoty standard metody oceny skuteczności szczepionki przeciwko wściekliźnie przed wydaniem partii. Test ten polega na dootrzewnowym uodparnieniu grup myszy szczepionką, która ma być testowana, a następnie prowokacji wewnątrzmózgowej (IC) 14 dni później szczepem wirusa wścieklizny (RABV) Challenge Virus Standard. Siła działania jest oceniana na podstawie odsetka myszy, które przeżyły prowokację IC. Chociaż WHO2 i European Pharmacopeia3 nadal wymagają testu NIH do oceny siły działania szczepionki, test ten napotyka kilka przeszkód: wyniki są bardzo zmienne4; zakaźny RABV jest używany podczas wyzwania, co wymaga zarówno umiejętności technicznych, jak i ścisłych środków bezpieczeństwa biologicznego; Wykorzystuje się dużą liczbę zwierząt, a powaga wyzwania budzi poważne obawy etyczne5. Opracowano mniej dotkliwą odmianę tego testu: dwa tygodnie po szczepieniu dootrzewnowym myszy nie są prowokowane IC, ale wykrwawiane i badane na obecność specyficznych przeciwciał neutralizujących RABV (VNAb) w ich surowicy za pomocą testu neutralizacji in vitro. Jednak ten test nadal wymaga poświęcenia dużej liczby myszy laboratoryjnych, chociaż jest już używany w szczepionkach weterynaryjnych6,7 i był brany pod uwagę w przypadku szczepionek dla ludzi8.
Na dzień dzisiejszy, zarówno International9, jak i European10 rekomendacje zachęcają producentów i Krajowe Laboratoria Kontrolne (Oficjalne Laboratoria Kontroli Leków - OMCLs) do wdrożenia Zastępstwa, Redukcji i Udoskonalenia laboratoryjnych testów na zwierzętach, określanych jako strategia 3R. Dyrektywa europejska 2010/63/UE (obowiązująca od 2013/01/01) dotycząca ochrony i dobrostanu zwierząt również zaostrzyła ograniczenia dla producentów szczepionek i laboratoriów zajmujących się kontrolą jakości szczepionek przeciwko wściekliźnie, a także badaniami nad wścieklizną11. W związku z tym opracowanie, walidacja i stosowanie alternatywnych podejść in vitro stało się obecnie priorytetem. Są one nie tylko etycznie uzasadnione, ale mogą również obniżyć koszty testowania wsadowego i skrócić czas oczekiwania na wyniki do godzin zamiast tygodni3.
Na powierzchni cząstki RABV glikoproteina przyjmuje formę trimeryczną12,13,14,15,16. W szczepionce przeciwko wściekliźnie ta natywna forma trimeryczna stanowi główną indukującą immunogen VNAbs17, podczas gdy monomeryczne, rozpuszczalne lub zdenaturowane glikoproteiny są słabo immunogenne18,19. Tak więc zachowanie trimerów glikoproteiny w całym procesie produkcji szczepionki jest dobrym wskaźnikiem dla zachowania optymalnego potencjału immunogennego. Kilka metod immunochemicznych, takich jak test wiązania przeciwciał20,21, test pojedynczej radialnej immunodyfuzji (SRD)22 i test ELISA23,24,25,26,27 są zalecane przez WHO Technical Report Series2 oraz europejska monografia3 w celu ilościowego określenia zawartości antygenu w szczepionkach przeciwko wściekliźnie. Są one wykorzystywane przez producentów do monitorowania spójności produkcji szczepionek oraz przez OMCL do oceny spójnego składu partii szczepionek dla ludzi28, nawet jeśli test NIH jest nadal brany pod uwagę przy ustalaniu siły działania.
Jednak wszystkie te metody immunochemiczne nie są równoważne. Test SRD wymaga wstępnej obróbki, która może zmienić trimery zakotwiczone w błonie i doprowadzić do powstania rozpuszczalnej lub zdenaturowanej formy glikoproteiny22,29. W związku z tym SRD nie jest zbyt skuteczny w rozróżnianiu między immunogennymi i nieimmunogennymi glikoproteinami, co skutkuje niedoskonałą oceną immunogenności partii szczepionki. Natomiast test ELISA jest bardziej czuły22, zachowuje natywną strukturę glikoproteiny i jest bardziej odpowiedni do określenia zawartości natywnie pofałdowanych trimerów glikoproteiny. W teście ELISA można wykorzystać poliklonalne lub mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko glikoproteinie królików, oczyszczone lub skoncentrowane siarczanem amonu. Badania wykazały dobrą zgodność między testem NIH a zawartością antygenu ocenianą za pomocą testu ELISA w szczepionkach i wykazały, że metody ELISA są odpowiednie do testu siły działania in vitro. To przemawia za tym, że testy ELISA mogą przynajmniej uzupełniać lub nawet zastępować test NIH4,26,27,30,31,32,33. Obecnie Farmakopea Europejska zaleca stosowanie zwalidowanych testów serologicznych lub immunochemicznych jako alternatywy dla testu NIH3. Całkowite unikanie wykorzystywania zwierząt do celów szczepionki stało się realistyczną perspektywą.
Metoda przedstawiona poniżej opiera się na pośrednim testowaniu immunologicznym metodą ELISA przy użyciu mysiego klonu przeciwciała monoklonalnego (mAb-D1), które rozpoznaje miejsca antygenowe III (aa 330 do 338) trimerycznej glikoproteiny RABB15,34. Metoda ta została początkowo opracowana w Instytucie Pasteura26,30, a następnie zoptymalizowana i zwalidowana przez laboratorium Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM), tj. francuskie OMCL4,33. mAb-D1 służy zarówno do uwrażliwiania płytki, jak i następnie do wykrywania wychwyconego antygenu. Pozwala to na specyficzną kwantyfikację trimerów glikoproteiny, tj. immunogennego antygenu RABV. MAb-D1 używany do wykrywania jest znakowany peroksydazą, która ujawnia się w obecności substratu i chromogenu. Porównanie absorbancji zmierzonej dla badanej szczepionki i szczepionki referencyjnej pozwala na określenie zawartości glikoproteiny immunogennej. Warto zauważyć, że ten sam rodzaj testu może być stosowany do różnych mAb rozpoznających różne miejsca antygenowe glikoproteiny RABB<klasa sup = "xref">35. Metoda otrzymywania i oczyszczania lub zagęszczania poliklonalnymi immunoglobulinami króliczymi G (IgG) lub monoklonalnymi globulinami króliczymi z siarczanem amonu lub monoklonalnymi globulinami myszy została obszernie opisana wcześniej36 wraz z metodą koniugacji przeciwciał z peroksydazą37.

<table><tbody><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10445753</td><td>do miareczkowania żywego wirusa</td></tr><tr><td>Przezroczyste płaskodenne immunoniesterylne płytki 96-dołkowe, 400 i mikro; L, MAXISORP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>439454</td><td>dobry do wiązania z załadowanym przeciwciałem</td></tr><tr><td>Wyposaż Labo Polipropylenowy laboratoryjny dygestorium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12576606</td><td>do przygotowania kwasu siarkowego</td></tr><tr><td>Płytka immunologiczna Strong Adsorpcja MAXISORP Flat Bottom Well, F96</td><td>Dutscher</td><td>55303</td><td>dobry do wiązania z załadowanym przeciwciałem</td></tr><tr><td>Mikropłytki uszczelniające Taśma (100 arkuszy)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek&nbsp; czytnik jednomodowy Sunrise</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka-inkubator do mikropłytek</td><td>Dutscher</td><td>441504</td><td></td></tr><tr><td>Myjka do mikropłytek Wellwash ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>5165000</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa (30-300 &mikro; L) 12-kanałowe</td> pipety <td>jednokanałowe ThermoFisher Scientific</td><td>4661180N</td><td></td></tr><tr><td>(Zestaw 2: Pipety Finnpipettes F2 0,2-2 i mu; L mikro, 2-20 &mu; L, 20-200 &mu; L & 100-1000 &mu; L)</td> <td>4700880</td><td></td> <td>Naukowy ThermoFisher</td></tr></tbody></table>

test elisa in vitro do oceny siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

Rosnąca globalna troska o dobrostan zwierząt zachęca producentów i Krajowe Laboratoria Kontrolne (OMCL) do przestrzegania strategii 3R dotyczącej zastąpienia, redukcji i udoskonalenia laboratoryjnych testów na zwierzętach. Opracowanie metod in vitro jest zalecane przez WHO i na poziomie europejskim jako alternatywa dla testu NIH do oceny siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie. Na powierzchni cząsteczki wirusa wścieklizny (RABV) trimery glikoproteiny stanowią główny immunogen indukujący przeciwciała neutralizujące wirusa (VNAb). Test ELISA, w którym neutralizujące przeciwciała monoklonalne (mAb-D1) rozpoznają trimeryczną formę glikoproteiny, został opracowany w celu określenia zawartości natywnej sfałdowanej glikoproteiny trimerycznej wraz z produkcją partii szczepionek. Ten test siły działania in vitro wykazał dobrą zgodność z testem NIH i został uznany za odpowiedni w badaniach zespołowych przeprowadzonych przez producentów szczepionek RABV i OMCL. Unikanie wykorzystywania zwierząt jest osiągalnym celem w najbliższej przyszłości.
Przedstawiona metoda opiera się na pośrednim wychwytywaniu immunologii kanapkowej ELISA za pomocą mAb-D1, który rozpoznaje miejsca antygenowe III (aa 330 do 338) trimerycznej glikoproteiny RABB, tj. immunogennego antygenu RABB. mAb-D1 jest używany zarówno do powlekania, jak i wykrywania trimerów glikoprotein obecnych w partii szczepionki. Ponieważ epitop jest rozpoznawany ze względu na jego właściwości konformacyjne, potencjalnie zdenaturowana glikoproteina (mniej immunogenna) nie może zostać wychwycona i wykryta przez mAb-D1. Szczepionka, która ma być poddana badaniu, inkubuje się w płytce uczulonej na mAb-D1. Związane trimeryczne glikoproteiny RABV identyfikuje się przez ponowne dodanie mAb-D1, znakuje się peroksydazą, a następnie ujawnia w obecności substratu i chromogenu. Porównanie absorbancji zmierzonej dla badanej szczepionki i szczepionki referencyjnej pozwala na określenie zawartości glikoproteiny immunogennej.

W poniższym przykładzie zastosowano referencyjną partię szczepionki Lot 09, składającą się z oczyszczonych, inaktywowanych cząstek wirusa wścieklizny (szczep PV). Zawartość trimerów glikoproteiny (10 µg/mL) została ustalona po oznaczeniu całkowitej ilości białek wirusowych (test BCA) oraz ocenie procentowego udziału glikoproteiny za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS. Alternatywnie można zastosować skalibrowaną szczepionkę referencyjną, np. 6th International Sta...

Tutaj opisujemy pośrednie wychwytywanie immunologiczne metodą ELISA w celu określenia zawartości immunogennej glikoproteiny w szczepionkach przeciwko wściekliźnie. Ten test wykorzystuje neutralizujące przeciwciało monoklonalne (mAb-D1) rozpoznające trimery glikoproteiny. Jest to alternatywa dla testu NIH in vivo w celu śledzenia spójności siły działania szczepionki podczas produkcji.

Test ELISA in vitro do oceny siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

W celu ograniczenia liczby testów na zwierzętach oraz ze względu na zmienność testu NH WHO zachęca do opracowania metod in vitro do oceny skuteczności szczepionki przeciwko wściekliźnie. Ten test ELISA wykazuje dobrą zgodność z klasycznym testem NH w rozpoznawaniu immunogennej formy glikoproteiny, wykazuje wysoką czułość i może być wykonany w ciągu zaledwie jednego dnia. Ocena skuteczności szczepionki przeciwko wściekliźnie in vitro metodą ELISA stanowi alternatywę dla testu NH in vivo.Jest on promowany przez producentów i krajowe laboratoria kontrolne. Bardzo ważne jest, aby rozprowadzić wstępnie zwymiarowane objętości w dwóch egzemplarzach dla każdego rozcieńczenia i dobrze wysuszyć płytkę na papierze chłonnym po praniu, aby uniknąć Aby rozpocząć tę procedurę, załóż odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym jednorazowy płaszcz, rękawiczki, maskę i okulary. Zanieczyszczone materiały należy poddać obróbce, zanurzając je w roztworze 2,6% podchlorynu sodu na 30 minut w celu odkażenia.Następnie należy ustawić 96-dołkową płytkę do testu immunologicznego i dodać 200 mikrolitrów przeciwciała monoklonalnego rozcieńczonego w buforze węglanowym do każdej studzienki. Przykryj płytkę folią samoprzylepną i inkubuj mikropłytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny w wilgotnym środowisku. Następnie ostrożnie odessać i przenieść zawartość studzienki do biorcy zawierającego roztwór 2,6% podchlorynu sodu.Odwróć mikropłytkę i pozostaw do wyschnięcia na chłonnym papierze w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Najpierw dodaj 300 mikrolitrów buforu pasywacyjnego do każdej studzienki. Przykryj płytkę folią samoprzylepną i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.Następnie przenieś zawartość studzienki do studni zawierającej roztwór 2,6% podchlorynu sodu. Aby umyć płytkę, dodaj 300 mikrolitrów buforu myjącego do każdej studzienki. Następnie ostrożnie odessać i przenieść zawartość studzienki do biorcy zawierającego roztwór 2,6% podchlorynu sodu.Powtórz ten proces mycia jeszcze pięć razy, aby dokładnie umyć uczuloną płytkę. Następnie odwróć mikropłytkę i pozostaw do wyschnięcia na kawałku chłonnego papieru w temperaturze pokojowej na jedną minutę. Odpuścić szczepionkę wzorcową w jednym mililitrze wody destylowanej tak, aby końcowe stężenie glikoproteiny wirusa wścieklizny wynosiło 10 mikrogramów na mililitr.Przygotować 10-krotne rozcieńczenie odtworzonej szczepionki referencyjnej w rozcieńczalniku, aby osiągnąć stężenie glikoproteiny wirusa wścieklizny wynoszące jeden mikrogram na mililitr. Następnie należy wykonać sześć seryjnych dwukrotnych rozcieńczeń tej szczepionki referencyjnej w rozcieńczalniku, jak opisano w tabeli pierwszej protokołu tekstowego. Rozprowadzić 200 mikrolitrów rozcieńczalnika w zduplikowanych studzienkach, aby służyły jako ślepa kontrola i 200 mikrolitrów na studzienkę dla każdego referencyjnego rozcieńczenia szczepionki w dwóch egzemplarzach.Następnie należy przygotować 10-krotne rozcieńczenie badanej szczepionki w rozcieńczalniku i przygotować siedem dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń badanej szczepionki w rozcieńczalniku, jak przedstawiono w tabeli drugiej protokołu tekstowego. Rozprowadzić 200 mikrolitrów każdego badanego rozcieńczenia szczepionki po dwóch egzemplarzach do każdej studzienki mikropłytki. Przykryj mikropłytkę folią samoprzylepną i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.Następnie usuń folię. Ostrożnie odessać i przenieść zawartość każdej studzienki do pojemnika zawierającego 2,7% roztwór podchlorynu sodu. Aby umyć płytkę, dodaj 300 mikrolitrów buforu płuczącego do każdej studzienki, ostrożnie odessaj i przenieś zawartość każdej studzienki do pojemnika zawierającego 2,6% roztwór podchlorynu sodu.Powtórz proces mycia jeszcze pięć razy, aby usunąć niezwiązany antygen i zachować trimery białka G związane z powlekanym przeciwciałem. Umytą mikropłytkę odwróć do góry dnem i pozostaw do wyschnięcia na kawałku chłonnego papieru w temperaturze pokojowej na jedną minutę. Następnie rozprowadzić 200 mikrolitrów zalecanego rozcieńczenia przeciwciała monoklonalnego D1 znakowanego peroksydazą w rozcieńczalniku do każdej studzienki.Przykryj mikropłytkę folią samoprzylepną i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie usuń folię, ostrożnie odessaj i przenieś zawartość każdej studzienki do biorcy zawierającego 2,6% roztwór podchlorynu sodu. Aby umyć mikropłytkę, dodaj 300 mikrolitrów buforu myjącego do każdej studzienki.Ostrożnie odessać i przenieść zawartość każdej studzienki do biorcy zawierającego 2,6% roztwór podchlorynu sodu. Powtórz ten proces mycia jeszcze pięć razy, aby usunąć niezwiązane przeciwciało znakowane peroksydazą. Umytą mikropłytkę odwróć do góry dnem i pozostaw do wyschnięcia na kawałku chłonnego papieru w temperaturze pokojowej na jedną minutę.Następnie rozprowadź 200 mikrolitrów roztworu substratu-chromogenu do każdej studzienki. Uszczelnić mikropłytkę folią i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut. Następnie dodaj 50 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcję.Ostrożnie wytrzyj spód mikropłytki i umieść ją w spektrofotometrze. Określ gęstość optyczną przy 492 nanometrach dla wszystkich użytych studzienek. Zbierz te dane w pliku arkusza kalkulacyjnego do analizy.Następnie należy utworzyć wykresy zarówno dla referencyjnej krzywej szczepionki, jak i wartości gęstości optycznej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W tym badaniu test ELISA in vitro służy do oceny siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie. Reprezentatywne wartości gęstości optycznej z typowego eksperymentu są pokazane tutaj.Wartości te są wykorzystywane do narysowania krzywej referencyjnej szczepionki poprzez wykreślenie średniej gęstości optycznej dla różnych rozcieńczeń szczepionki referencyjnej na osi pionowej i stężenia glikoproteiny na osi poziomej. Zawartość glikoproteiny w badanej szczepionce jest następnie szacowana za pomocą tej krzywej. Ocena jest precyzyjna dla rozcieńczeń, które mają średnią wartość gęstości optycznej w obszarze wkładki referencyjnej krzywej szczepionki.Biorąc pod uwagę rozcieńczenie od jednego do 40, rzut pionowy OD 1534 na oś x odpowiada 500 nanogramom na mililitr. Tak więc testowaną szczepionkę szacuje się na 20 mikrogramów na mililitr glikoproteiny. Po ustaleniu siły działania in vitro konieczne jest porównanie badanej szczepionki z sześcioma referencyjnymi normami międzynarodowymi WHO skalibrowanymi w jednostkach międzynarodowych.Ta sama metoda może być stosowana w przypadku innych przeciwciał w celu zwiększenia wykrywalności większej liczby szczepów szczepionkowych, w tym tych stosowanych w szczepionkach weterynaryjnych, które są klasycznie bardziej zróżnicowane. Przeciwciała mogą być również stosowane w zawodach o miareczkowanie przeciwciał przeciwko wściekliźnie w surowicy koni lub ludzi. Należy zachować środki ostrożności w przypadku szczepionek, które nie są inaktywowane lub szczepionek zawierających wirusy.Pamiętaj, aby używać środków ochrony osobistej, nosić rękawice i wszystko odpowiednio odkazić. Należy również uważać na tabletki, ponieważ są rakotwórcze i z kwaśnym roztworem podchlorynu sodu.

in-vitro-elisa-test-to-evaluate-rabies-vaccine-potency

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje barwienie immunohistochemiczne do wykrywania antygenu wirusa wścieklizny w zakażonej tkance mózgowej myszy. Proces ten obejmuje deparatynizację i leczenie alkoholem, a następnie leczenie proteolityczne w celu zwiększenia dostępności antygenu. Barwienie immunohistochemiczne ujawnia czerwone osady, potwierdzające obecność antygenów wścieklizny w skrawku tkankowym.

Barwienie immunohistochemiczne do wykrywania antygenów wirusa wścieklizny

Ten film prezentuje pośredni test immunoenzymatyczny lub test immunoenzymatyczny ELISA, przeznaczony do oceny poziomów immunogennej glikoproteiny w szczepionkach. Płytka testowa, zawierająca przeciwciała specyficzne dla glikoproteiny, jest inkubowana z seryjnie rozcieńczanymi próbkami szczepionki, w tym szczepionkami referencyjnymi i testowymi, a następnie przeprowadza się test immunologiczny w celu ilościowego określenia zawartości glikoproteiny w badanej szczepionce.

Za pomocą testu ELISA typu kanapkowego w celu określenia zawartości glikoproteiny immunogennej w szczepionce

To badanie opisuje wysokoprzepustowy, oparty na obrazowaniu test mikroneutralizacji w celu określenia miana przeciwciał neutralizujących specyficznych dla syncytialnego wirusa oddechowego (RSV). Ten format testu został przetestowany na różnych typach próbek.

Ulepszony i wysokoprzepustowy test mikroneutralizacji syncytialnego wirusa oddechowego (RSV)

Bezpośredni szybki test immunohistochemiczny (DRIT) stanowi uznaną przez Światową Organizację Zdrowia Zwierząt i Światową Organizację Zdrowia (OIE/WHO) alternatywę dla testu na przeciwciała fluorescencyjne (DFA) do diagnozowania wścieklizny. Test ten pozwala na zastosowania w terenie, które można wykonać w ciągu około 1 godziny po pobraniu wycisków mózgu za pomocą mikroskopii świetlnej.

Wzmocniony nadzór nad wścieklizną za pomocą bezpośredniego szybkiego testu immunohistochemicznego

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w pan-lyssavirus została opracowana w celu wykrywania wszystkich znanych lyssawirusów. Walidacja z wykorzystaniem próbek mózgu różnych gatunków zwierząt pod kątem wścieklizny wykazała, że metoda ta ma czułość i swoistość równoważną złotemu standardowi testu na przeciwciała fluorescencyjne i może być stosowana do rutynowej diagnostyki wścieklizny.

Ocena uniwersalnej zagnieżdżonej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w celu wykrycia lyssawirusów

Przedstawiamy kompletny protokół do pośmiertnej diagnozy wścieklizny zwierząt w warunkach polowych przy użyciu szybkiego immunochromatograficznego testu diagnostycznego (RIDT), od pobrania próbki z biopsji mózgu do ostatecznej interpretacji. Opisujemy również dalsze zastosowania urządzenia do analizy molekularnej i genotypowania wirusów.

Terenowy pośmiertny szybki immunochromatograficzny test diagnostyczny wścieklizny do zastosowań o ograniczonych zasobach z dalszymi zastosowaniami molekularnymi

Tutaj prezentujemy protokół testu immunohistochemicznego do wykrywania antygenu wirusa wścieklizny jako alternatywny test diagnostyczny dla tkanek utrwalonych w formalinie.

Test immunohistochemiczny do wykrywania antygenu wirusa Lyssa z tkanek utrwalonych formaliną

Ten protokół przedstawia oparte na qRT-PCR podejście do określania liczby kopii genu nukleoproteiny (N) wirusa wścieklizny w różnych strukturach anatomicznych mózgu bydlęcego za pomocą transkrypcji in vitro.

Kwantyfikacja wirusa wścieklizny w różnych strukturach mózgu bydła

Ta metoda opisuje enkapsulację antygenu wścieklizny w biodegradowalne mikrocząstki polimerowe o właściwościach strukturalnych i materiałowych, które umożliwiają pulsacyjne uwalnianie po określonym opóźnieniu. Test immunoenzymatyczny (ELISA) oceny antygenu pobranego z rdzenia cząstki potwierdza obecność nienaruszonej glikoproteiny wirusa wścieklizny trimerycznej w wyniku wytwarzania cząstek.

Wytwarzanie pulsacyjnych mikrocząstek polimerowych zamykających antygen wścieklizny

Celem tego manuskryptu jest zbadanie zastosowania testu na pośrednie przeciwciała fluorescencyjne przeciwko wściekliźnie do wykrywania przeciwciał IgG i IgM specyficznych dla wścieklizny.

Wykrywanie przeciwciał IgG i IgM przeciwko wściekliźnie za pomocą pośredniego testu fluorescencyjnego na przeciwciała przeciwko wściekliźnie

Protokół ten demonstruje test reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy (RT-PCR) pan-lizawirusa LN34 w czasie rzeczywistym od pobierania tkanek do interpretacji wyników, w tym aktualizacje sekwencji primerów i formuł poprawiających wydajność testu dla niektórych lizawirusów i zalegowców niezwiązanych z wścieklizną. Demonstrujemy także konfigurację testu dla multipleksowanego formatu LN34 z pojedynczym dołkiem (LN34M).

Diagnostyka pośmiertna wścieklizny u zwierząt za pomocą zaktualizowanego, multipleksowanego testu LN34 w czasie rzeczywistym reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy

Poznaj metodę ELISA do oceny siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie in vitro. Ta technika wykorzystuje przeciwciało monoklonalne mAb-D1 i stanowi alternatywę dla testu NIH na zwierzętach.

Test ELISA in vitro do oceny siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie

Przeglądaj więcej filmów