Name: Półilościowy test stabilności docelowej reagujący na powinowactwo do leków (DARTS) do badania interakcji Rapamycyna/mTOR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 s
Description: Poznaj metodę DARTS do badania stabilności białek i szacowania powinowactwa interakcji białko-ligand na przykładzie kompleksu mTOR-rapamycyna. Technika ta umożliwia identyfikację nowych celów białkowych dla małych cząsteczek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez granty badawcze NIH R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, oraz grant badawczy DOD W81XWH-16-1-0482.

1. Zbieraj i lizuj komórki
<ol>
	<li>Hoduj komórki 293T przy użyciu zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM glutaminy i 1% antybiotyków. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2, 
	UWAGA: Stan wzrostu komórek może wpływać na stabilność kolejnych eksperymentów.</li>
	<li>Rozszerzaj komórki w hodowli, aż osiągniesz 80-90% konfluencji.</li>
	<li>Zmieszaj 345 μl odczynnika do lizy komórek (patrz tabela materiałów) z 25 μl 20x koktajlu inhibitorów proteazy, 25 μl 1 M fluorku sodu, 50 μl 100 mM β-glicerofosforanu, 50 μl 50 mM pirofosforanu sodu i 5 μl 200 mM ortowanadanu sodu. Przechowywać bufor do lizy schłodzony na lodzie. 
	UWAGA: Inne do lizy z różnymi detergentami (np. Triton X-100 lub NP-40) mogą być używane z DARTS, o ile nie są denaturujące. Białka błonowe lub białka jądrowe można ekstrahować, dodając 0,4% Triton X-100 lub 0,4% NP-40 do lizatu komórkowego.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).</li>
	<li>Użyj skrobaka do komórek, aby zebrać komórki w odpowiedniej ilości buforu do lizy komórek i przenieś komórki do probówki o pojemności 1.5 ml. 
	UWAGA: Liczba komórek potrzebnych do każdego eksperymentu DARTS będzie się różnić w zależności od tego, ile białka można wyekstrahować z różnych linii komórkowych. Ogólnie rzecz biorąc, stężenie białka w zastosowanym lizacie wynosi od 4 do 4 μg/μl. Jedna 10-centymetrowa płytka z komórkami 293T przy zbiegu 85\u201290%, poddana lizie z 300 μl buforu do lizy, zwykle daje lizat o stężeniu białka ~5 μg/μL.</li>
	<li>Dobrze wymieszać bufor do lizy/komórki lizujące i inkubować probówkę na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 18 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać w stanie schłodzonym na lodzie.</li>
	<li>Wykonaj test BCA, aby w przybliżeniu określić stężenie białka w lizatach.</li>
</ol>
2. Inkubacja lizatów białkowych z małą cząsteczką
<ol>
	<li>Podziel 99 μl lizatów na dwie probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wykonaj początkowe stężenie wyjściowe 10 mM małej cząsteczki. Wykonując DARTS, można zacząć od wyższego stężenia małej cząsteczki (5–10x wartość EC50), aby zapewnić optymalne wiązanie.
	<ol>
		<li>Dodać 1 μl rozpuszczalnika, w którym mała cząsteczka jest rozpuszczalna, lub 1 μl małocząsteczkowych roztworów podstawowych do każdej podwielokrotności lizatu. Inkubować lizat komórkowy z roztworami przez 30–60 min w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na lodzie ustalić seryjne rozcieńczenia (1:200, 1:400, 1:800 i 1:1600) świeżo rozmrożonego roztworu pronazy w 1x TNC (Dla 1 ml 10x buforu TNC zmieszać 300 μl ultraczystej wody ze 100 μl 5 M chlorku sodu, 100 μl 1 M chlorku wapnia i 500 μl 1 M Tris-HCl, pH 8,0).</li>
	<li>Zbadaj szeroki zakres proporcji pronazy do białka (np. od 1:100 do 1:2000), aby zagwarantować obserwowalność stopniowego wpływu pronazy na cel (cele). 
	UWAGA: Aby obliczyć stężenie pronazy (przykład): 5 μg/μL stężenie białka x 20 μL próbki = 100 μg białka. Aby uzyskać stosunek pronazy do białka wynoszący 1:100, potrzebujemy 0,5 μg/μL (100 μg ÷ 100 ÷ 2 μL) roztworu pronazy. Eksperyment ten może wymagać kilkukrotnego powtórzenia, aby uzyskać odpowiedni zakres proporcji pronazy do białka.</li>
</ol>
3. Wykonaj proteolizę
UWAGA: W przypadku proteolizy, etapy są przeprowadzane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej
<ol>
	<li>Po inkubacji z małą cząsteczką podzielić każdą podwielokrotność na 20 μl próbki.</li>
	<li>Dodać 2 μl szeregu roztworów pronazy do każdej próbki w określonych odstępach czasu (co 30 s). Użyć równej objętości 1x buforu TNC, aby uzyskać niestrawioną próbkę kontrolną.</li>
	<li>Po 5\u201220 min należy przerwać trawienie poprzez dodanie 2 μl zimnego koktajlu 20x inhibitora proteazy co 30 s. Dobrze wymieszać i inkubować na lodzie przez 10 min.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbki odpowiednią objętością 5 razy więcej buforu ładującego SDS-PAGE i gotować w temperaturze 95 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Przeprowadzić następną część doświadczenia lub przechowywać próbkę białka w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja i analiza
<ol>
	<li>Po DARTS wykonaj barwienie Coomassie na niebiesko zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem22.</li>
	<li>Poplamione prążki białkowe powinny być bardzo wyraźne po odbarwieniu. Odlej zużyty roztwór odbarwiający i dodaj świeży 1% roztwór kwasu octowego, aby pokryć żel. Umieść żel pod światłem, aby obserwować prążki ze znacznymi różnicami między grupami z (grupa próbki) lub bez (grupa kontrolna) małą cząsteczką.</li>
	<li>Odetnij dwie odpowiednie pasma z żelu za pomocą sterylnego narzędzia i natychmiast wykonaj LC-MS/MS. 
	UWAGA: LC-MS/MS należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, ponieważ białka w żelu będą ulegać ciągłej degradacji.</li>
	<li>Trawić prążki, ekstrahować peptydy i przeprowadzać analizę LC-MS/MS23.
	<ol>
		<li>Aby przeanalizować dane LC-MS/MS, najpierw zidentyfikuj wszystkie białka w poszczególnych pasmach. Po drugie, użyj dopasowania widma peptydów (PSM), aby przedstawić obfitość każdego białka. 
		UWAGA: PSM podaje całkowitą liczbę zidentyfikowanych sekwencji peptydowych dla białka, w tym tych zidentyfikowanych nadmiarowo. Ogólnie rzecz biorąc, to, jak często peptyd jest identyfikowany/sekwencjonowany, można wykorzystać jako przybliżone oszacowanie, jak obfite jest białko w próbce. Białka wzbogacone w grupie próbki w porównaniu z grupą kontrolną są białkami będącymi przedmiotem zainteresowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozyskać pierwszorzędowe przeciwciała wybranych białek. Wykonaj western blot, aby sprawdzić, czy mała cząsteczka może związać się bezpośrednio z potencjalnymi białkami docelowymi24.
	<ol>
		<li>Załaduj równe ilości białka do studzienek 8% żelu SDS-PAGE wraz z odpowiednim markerem masy cząsteczkowej. Uruchom żel na 30 minut przy napięciu 80 V, następnie ustaw napięcie na 120 V i kontynuuj pracę przez 1–22 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ ilościowo różne docelowe prążki białkowe za pomocą oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazu (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przeanalizuj dane i narysuj krzywe.
	<ol>
		<li>Wyznaczanie krzywej proteolitycznej dla białka docelowego
		<ol>
			<li>Stosunek pronazy do białka jest zmienny podczas wykonywania proteolizy. Normalizuj dane z analizy obrazu, przypisując wartości intensywności pasma odpowiadające niestrawionym pasmom do 100%.</li>
			<li>Użyj analizy regresji nieliniowej w oprogramowaniu do analizy statystycznej i rysowania, aby wykreślić krzywą znormalizowanych danych dla względnej intensywności pasma i stosunku pronazy do białka.</li>
			<li>Najpierw otwórz oprogramowanie, wybierz typ tabeli i wykresu jako XY i pozwól na 3 replikowane wartości w podkolumnach obok siebie. Następnie wprowadź odpowiednie dane w miejscu poniżej x i y. W polu x wprowadź liczby 0, 1, 2, 3, 4, 5 (jako symbole zastępcze odpowiadające stosunkom pronazy do białka).</li>
			<li>W kolumnie y wprowadź znormalizowane dane dla względnych intensywności pasma. Wykonaj "Regresję nieliniową" i zaimplementuj "Dawka-odpowiedź-Stymulacja" za pomocą równania "Log (agonista) kontra odpowiedź - Zmienne nachylenie (cztery parametry)".</li>
			<li>Przekonwertuj adnotacje osi X na krzywej na odpowiednie proporcje pronazy do białka.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyznaczanie krzywej zależności dawka dla białka docelowego 
		UWAGA: W przypadku analizy zależności od dawki, molowość małej cząsteczki jest różna w różnych próbkach. Stabilny stosunek pronazy do białka powinien być oparty na analizie danych dotyczących proteolizy. Stosunek pronazy do białka, który wykazał maksymalną różnicę w intensywności białka docelowego podczas krzywej proteolitycznej, powinien być wykorzystany w eksperymencie zależności od dawki.
		<ol>
			<li>Określ ilościowo różne docelowe prążki białkowe za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Podobnie jak w przypadku generowania krzywej zależności od dawki, należy znormalizować dane z analizy obrazu, przypisując wartości intensywności pasma odpowiadające najmniej strawionemu paśmie do 100%.</li>
			<li>Zastosuj analizę regresji nieliniowej w oprogramowaniu do analizy statystycznej i rysowania do znormalizowanych danych. Najpierw otwórz oprogramowanie, wybierz typ tabeli i wykresu jako XY i wprowadź 3 replikowane wartości w podkolumnach obok siebie.</li>
			<li>Następnie wprowadź odpowiednie dane w miejscu poniżej x i y. Dla zmiennej "x" wprowadź różne stężenia małej cząsteczki; "y" obejmuje odpowiednie znormalizowane dane dotyczące względnego natężenia pasma.</li>
			<li>Przekształć wartości x przy użyciu X = Log(X). Na koniec zastosuj regresję nieliniową i zaimplementuj stymulację dawka-odpowiedź za pomocą równania "Log (agonista) kontra odpowiedź - Zmienne nachylenie (cztery parametry)".</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rask-Andersen, M., Masuram, S., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+druggable+genome%3A+Evaluation+of+drug+targets+in+clinical+trials+suggests+major+shifts+in+molecular+class+and+indication%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The druggable genome: Evaluation of drug targets in clinical trials suggests major shifts in molecular class and indication.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 9-26 (2014).</li>
<li>O'Connor, C. J., Laraia, L., Spring, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Chemical genetics.</a> Chemical Society Reviews. 40 (8), 4332-4345 (2011).</li>
<li>McFedries, A., Schwaid, A., Saghatelian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+elucidation+of+protein-small+molecule+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods for the elucidation of protein-small molecule interactions.</a> Chemistry & Biology. 20 (5), 667-673 (2013).</li>
<li>Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T., Uesugi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+target+isolation+for+novices%3A+affinity-based+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies.</a> Chemistry & Biology. 17 (6), 616-623 (2010).</li>
<li>Sleno, L., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+methods+for+drug+target+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteomic methods for drug target discovery.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 12 (1), 46-54 (2008).</li>
<li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+%28DARTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).</li>
<li>Strickland, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+analysis+of+protein-ligand+binding+interactions+in+complex+biological+mixtures+using+the+stability+of+proteins+from+rates+of+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation.</a> Nature Protocols. 8 (1), 148-161 (2013).</li>
<li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li>
<li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li>
<li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+cancer+drugs+in+living+cells+by+thermal+profiling+of+the+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome.</a> Science. 346 (6205), 1255784(2014).</li>
<li>Chang, J., Kim, Y., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+identification+and+validation+of+protein+targets+of+natural+products+without+chemical+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Reports%22%5BJournal%5D)">Advances in identification and validation of protein targets of natural products without chemical modification.</a> Natural Product Reports. 33 (5), 719-730 (2016).</li>
<li>Pai, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+affinity+responsive+target+stability+%28DARTS%29+for+small-molecule+target+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Drug affinity responsive target stability (DARTS) for small-molecule target identification.</a> Methods in Molecular Biology. 1263, 287-298 (2015).</li>
<li>Lomenick, B., Jung, G., Wohlschlegel, J. A., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+%28DARTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 163-180 (2011).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+therapeutic+targeting+of+human+cancer+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Precision therapeutic targeting of human cancer cell motility.</a> Nature Communications. 9 (1), 2454(2018).</li>
<li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+autophagy+enhancer+as+a+therapeutic+agent+against+metabolic+syndrome+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A novel autophagy enhancer as a therapeutic agent against metabolic syndrome and diabetes.</a> Nature Communications. 9 (1), 1438(2018).</li>
<li>Schulte, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+blockade+of+ASCT2-dependent+glutamine+transport+leads+to+antitumor+efficacy+in+preclinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pharmacological blockade of ASCT2-dependent glutamine transport leads to antitumor efficacy in preclinical models.</a> Nature Medicine. 24 (2), 194-202 (2018).</li>
<li>Skrott, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol-abuse+drug+disulfiram+targets+cancer+via+p97+segregase+adaptor+NPL4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alcohol-abuse drug disulfiram targets cancer via p97 segregase adaptor NPL4.</a> Nature. 552 (7684), 194-199 (2017).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosidin2+targets+conserved+exocyst+complex+subunit+EXO70+to+inhibit+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Endosidin2 targets conserved exocyst complex subunit EXO70 to inhibit exocytosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 41-50 (2016).</li>
<li>Chin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolite+alpha-ketoglutarate+extends+lifespan+by+inhibiting+ATP+synthase+and+TOR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The metabolite alpha-ketoglutarate extends lifespan by inhibiting ATP synthase and TOR.</a> Nature. 510 (7505), 397-401 (2014).</li>
<li>Robinson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screen+identifies+disulfiram+as+a+potential+therapeutic+for+triple-negative+breast+cancer+cells%3A+interaction+with+IQ+motif-containing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">High-throughput screen identifies disulfiram as a potential therapeutic for triple-negative breast cancer cells: interaction with IQ motif-containing factors.</a> Cell Cycle. 12 (18), 3013-3024 (2013).</li>
<li>Aghajan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetics+screen+for+enhancers+of+rapamycin+identifies+a+specific+inhibitor+of+an+SCF+family+E3+ubiquitin+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Chemical genetics screen for enhancers of rapamycin identifies a specific inhibitor of an SCF family E3 ubiquitin ligase.</a> Nature Biotechnology. 28 (7), 738-742 (2010).</li>
<li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coomassie+blue+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Coomassie blue staining.</a> Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).</li>
<li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+and+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry and protein analysis.</a> Science. 312 (5771), 212-217 (2006).</li>
<li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li>
<li>Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+structures+of+the+human+immunophilin+FKBP-12+complexes+with+FK506+and+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).</li>
<li>Lomenick, B., Olsen, R. W., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+direct+protein+targets+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of direct protein targets of small molecules.</a> ACS Chemical Biology. 6 (1), 34-46 (2011).</li>
<li>Park, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Multiple+Cryptococcal+Fungicidal+Drug+Targets+by+Combined+Gene+Dosing+and+Drug+Affinity+Responsive+Target+Stability+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Identification of Multiple Cryptococcal Fungicidal Drug Targets by Combined Gene Dosing and Drug Affinity Responsive Target Stability Screening.</a> MBio. 7 (4), (2016).</li>
<li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+promotes+beta-catenin+citrullination+and+inhibits+Wnt+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small molecule promotes beta-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 94-101 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

DARTS pozwala na identyfikację celów małocząsteczkowych poprzez wykorzystanie ochronnego działania wiązania białek przed degradacją. DARTS nie wymaga żadnej modyfikacji chemicznej ani unieruchomienia małej cząsteczki26. Pozwala to na wykorzystanie małych cząsteczek do określenia ich bezpośrednich celów białkowych. Standardowe kryteria oceny dla klasycznej metody DARTS obejmują barwienie żelem, spektrometrię mas i western blot12,13. Klasycz...

Identyfikacja małych cząsteczek docelowych białek jest niezbędna do mechanistycznego zrozumienia i rozwoju potencjalnych leków terapeutycznych1,2,3. Chromatografia powinowactwa, jako klasyczna metoda identyfikacji docelowych białek małych cząsteczek, przyniosła dobre wyniki4,5. Metoda ta ma jednak ograniczenia, ponieważ chemiczna modyfikacja małych cząsteczek często skutkuje zmniejszoną lub zmienioną specyficznością wiązania lub powinowactwem. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano ostatnio i zastosowano kilka nowych strategii w celu identyfikacji celów małych cząsteczek bez chemicznej modyfikacji małych cząsteczek. Te bezpośrednie metody identyfikacji docelowej małych cząsteczek bez znaczników obejmują stabilność docelową reagującą na powinowactwo do leku (DARTS)6, stabilność białek na podstawie szybkości utleniania (SPROX)7, komórkowy test przesunięcia termicznego (CETSA)8,9 oraz termiczne profilowanie proteomu (TPP)10. Metody te są bardzo korzystne, ponieważ wykorzystują naturalne, niemodyfikowane małe cząsteczki i opierają się tylko na bezpośrednich oddziaływaniach wiążących w celu znalezienia docelowych białek11.
Wśród tych nowych metod, DARTS jest stosunkowo prostą metodologią, która może być łatwo przyjęta przez większość laboratoriów12,13. DARTS opiera się na koncepcji, że białka związane z ligandami wykazują zmodyfikowaną podatność na degradację enzymatyczną w porównaniu z białkami niezwiązanymi. Nowe białko docelowe można wykryć poprzez badanie zmienionego prążka w żelu SDS-PAGE za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS/MS). Podejście to zostało z powodzeniem wdrożone do identyfikacji nieznanych wcześniej celów produktów naturalnych i leków14,15,16,17,18,19. Jest również skuteczny jako środek do badania przesiewowego lub walidacji wiązania związków z określonym białkiem20,21. W tym badaniu przedstawiamy ulepszenie eksperymentu poprzez monitorowanie zmian stabilności białek z małymi cząsteczkami i identyfikację powinowactwa wiązania białko-ligand. Jako przykładu posłużymy się interakcją mTOR-rapamycyna, aby zademonstrować nasze podejście.

<table><tbody><tr><td>100X Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>Rozcieńczony do 20X z ultraczystą wodą</td></tr><tr><td>Linia komórkowa 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Pożywka DMEM z 10% kwasem octowym FBS</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Thermo Fisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>Thermo Fisher</td><td>179693</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Roztwór barwiący</td><td>Bio-Rad</td><td>1610436</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>Oprogramowanie GraphPad</td><td>w wersji 6.0</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>Wersja 1.52</td><td>Oprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazów</td></tr><tr><td>M-PER Odczynnik do lizy komórek</td><td>Thermo Fisher</td><td>78501</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Corning</td><td>R21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche</td><td>PRON-RO</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>Ortowanadan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosforan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221368</td><td></td></tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>dostosować do pH 8,0</td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosforan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

półilościowy test stabilności docelowej reagujący na powinowactwo do leków (darts) do badania interakcji rapamycyna/mtor

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) to solidna metoda wykrywania nowych celów dla białek małocząsteczkowych. Może być wykorzystany do weryfikacji znanych oddziaływań małych cząsteczek z białkami oraz do znalezienia potencjalnych celów białkowych dla produktów naturalnych. W porównaniu z innymi metodami, DARTS wykorzystuje natywne, niemodyfikowane, małe cząsteczki i jest prosty i łatwy w obsłudze. W tym badaniu jeszcze bardziej zwiększyliśmy możliwości analizy danych w eksperymencie DARTS, monitorując zmiany stabilności białek i szacując powinowactwo interakcji białko-ligand. Oddziaływania białko-ligand można wykreślić na dwóch krzywych: krzywej proteolitycznej i krzywej zależności od dawki. Wykorzystaliśmy interakcję mTOR-rapamycyna jako przykładowy przypadek ustanowienia naszego protokołu. Na podstawie krzywej proteolitycznej widzieliśmy, że proteoliza mTOR przez pronazę była hamowana przez obecność rapamycyny. Krzywa zależności od dawki pozwoliła na oszacowanie powinowactwa wiązania rapamycyny i mTOR. Metoda ta może być potężną i prostą metodą dokładnej identyfikacji nowych białek docelowych i optymalizacji zaangażowania celów lekowych.

Schemat doświadczenia przedstawiono na Rysunku 1. Wynik barwienia błękitem Coomassie pokazano na Rysunku 2. Inkubacja z małocząsteczkowym związkiem zapewnia ochronę przed proteolizą. Odnaleziono trzy prążki, które wydają się być chronione przed proteolizą dzięki inkubacji z rapamycyną w porównaniu z kontrolą z nośnikiem. Oczekiwane wyniki eksperymentu z krzywą proteolizy przedstawiono na Rysunku 3. W ramach dowodu koncepcji zbadaliś...

W tym badaniu zwiększyliśmy możliwości analizy danych w eksperymencie DARTS, monitorując zmiany w stabilności białek i szacując powinowactwo interakcji białko-ligand. Oddziaływania można wykreślić na dwie krzywe: krzywą proteolityczną i krzywą zależności od dawki. Jako przykładowy przypadek posłużyliśmy się oddziaływaniem mTOR-rapamycyna.

Półilościowy test stabilności docelowej reagujący na powinowactwo do leków (DARTS) do badania interakcji Rapamycyna/mTOR

Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) is a robust method for detection of novel small molecule protein targets. It can be used to verify known ...

Stabilność docelowa reagująca na powinowactwo do leków (DARTS) to solidna metoda wykrywania nowych celów białkowych o małych cząsteczkach. Może być wykorzystany do weryfikacji znanych oddziaływań białek małocząsteczkowych oraz do znalezienia potencjalnych celów białkowych dla produktów naturalnych. W tym badaniu jeszcze bardziej zwiększamy możliwości analizy danych w eksperymencie DARTS, monitorując zmiany stabilności białek i szacując powinowactwo interakcji białko-ligand.Oddziaływania białko-ligand można wykreślić na podstawie dwóch krzywych, krzywej proteolitycznej i krzywej zależności od dawki. Wykorzystaliśmy interakcję mTOR-rapamycyna jako przykładowy przypadek ustanowienia naszego protokołu. Hoduj komórki 293T za pomocą DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą, dwumilimolową glutaminą i 1% antybiotykami.Inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla. Gdy kultura osiągnie 80 do 90% konfluencji, umyj komórki dwukrotnie zimnym PBS. Użyj skrobaka do komórek, aby zebrać komórki do odpowiedniej ilości buforu do lizy zimnych komórek i przenieś komórki lizujące do 1.5-milimetrowej probówki.Odwrócić, aby dobrze wymieszać bufor do lizy i komórki lizujące, a następnie inkubować probówkę na lodzie przez 10 minut. Odwirować probówkę o ciśnieniu 18 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki i przechowuj w chłodzie na lodzie.Wykonać test BCA, aby w przybliżeniu określić stężenie białka w lizatach i obliczyć rozcieńczenie pronazy na podstawie stężenia białka. Najpierw przenieś lizat do dwóch 1,5-mililitrowych probówek po 99 mikrolitrów każda. Dodać jeden mikrolitr małocząsteczkowego roztworu podstawowego do każdej podwielokrotności lizatu i inkubować dwie probówki przez 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem.Na lodzie ustalić seryjne rozcieńczenia świeżo rozmrożonego roztworu pronazy w 1x TNC. Po inkubacji z małą cząsteczką podzielić każdą podwielokrotność na 20 mikrolitrów próbek w pięciu probówkach. Aby zapewnić ten sam czas trawienia, w określonych odstępach czasu co 30 sekund dodaj odpowiednio dwa mikrolitry przygotowanych roztworów pronazy do próbek.Dla jednej grupy kontrolnej dodaj dwa mikrolitry buforu TNC. Po pięciu do 20 minutach zatrzymaj trawienie sześciu probówek, dodając dwa mikrolitry zimnego koktajlu 20-krotnego inhibitora proteazy w odstępach 30-sekundowych. Dobrze wymieszaj i inkubuj na lodzie przez 10 minut.Rozcieńczyć każdą próbkę sześcioma mikrolitrami 5x buforu ładującego SDS-PAGE i gotować próbki w łaźni wodnej w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut. Teraz, aby wykonać Western blot, załaduj równe ilości białka do studzienek żelu 8% SDS-PAGE wraz z odpowiednim markerem masy cząsteczkowej. Uruchom żel na 30 minut przy napięciu 80 woltów, a następnie dostosuj napięcie do 120 woltów i kontynuuj pracę przez jedną do dwóch godzin.Sprawdź, czy mała cząsteczka może wiązać się bezpośrednio z potencjalnymi białkami docelowymi. W tym protokole inkubacja z małą cząsteczką potwierdziła ochronę przed proteolizą. Stwierdzono, że trzy prążki są chronione przez inkubację z rapamycyną nad kontrolą nośnika.Western blot zilustrował obecność białka mTOR przy niskich proporcjach pronazy do białka oraz jego redukcję i utratę wraz ze wzrostem proporcji. Proteoliza mTOR przez pronazę była wyraźnie zahamowana przez obecność rapamycyny, a dodanie rapamycyny spowodowało oczywiste przesunięcie krzywej proteolitycznej. Rapamycyna w zależności od dawki zwiększała poziom mTOR, co sugeruje rosnącą stabilność mTOR po leczeniu rapamycyną.Kwantyfikacja intensywności pasma białka docelowego sugerowała, że mTOR jest białkiem docelowym rapamycyny. Aby uzyskać najlepszy efekt krokowy, eksperyment ten może wymagać kilkukrotnego powtórzenia, aby uzyskać odpowiedni zakres proporcji pronazy do białka.

a-semi-quantitative-drug-affinity-responsive-target-stability-darts

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano metodę czasowo-przestrzennej kontroli aktywności małych GTPaz za pomocą światła. Metoda ta opiera się na indukowanej rapamycyną heterodimeryzacji FKBP-FRB oraz systemach fotoklatkowania. Optymalizacja naświetlania umożliwia czasowo-przestrzenną kontrolę aktywacji małych GTPaz na poziomie subkomórkowym.

Przestrzenno-czasowa manipulacja aktywnością małych GTPaz na poziomie subkomórkowym i w skali sekund w żywych komórkach

Przedstawiono protokół badań przesiewowych leków małocząsteczkowych oparty na syntezie in-situ ultramałych fluorescencyjnych nanoklastrów złota (Au NCs) przy użyciu białka obciążonego lekiem jako matrycy. Metoda ta jest prosta do określenia powinowactwa wiązania leków z białkiem docelowym za pomocą widzialnego sygnału fluorescencyjnego emitowanego z matrycami białkowymi Au NC.

Szybka i ilościowa metoda fluorymetryczna do badań przesiewowych leków małocząsteczkowych ukierunkowanych na białka

W tym artykule przedstawiliśmy zestaw praktycznych i wykonalnych metod charakteryzowania mutantów kinaz rodziny RAF związanych z chorobą, które obejmują test kinazy in vitro, test koaktywacji RAF i komplementarny test rozszczepionej lucyferazy.

Scharakteryzować związane z chorobą mutanty kinaz z rodziny RAF przy użyciu zestawu praktycznych i wykonalnych metod

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru interakcji eIF4E-eIF4G w żywych komórkach, który umożliwiłby użytkownikowi ocenę wywołanych przez lek zaburzeń dynamiki kompleksu eIF4F w formatach przesiewowych.

Monitorowanie montażu eIF4F poprzez pomiar interakcji eIF4E-eIF4G w aktywnych komórkach

Możliwość oceny zaangażowania inhibitorów kandydatów w komórkach nienaruszonych jest kluczowa dla odkrywania leków. Protokół ten opisuje 384-dołkowy test termiczny przesunięcia komórkowego, który niezawodnie wykrywa zaangażowanie inhibitorów celujących w dziki typ SHP2 lub jego warianty onkogenne.

Ocena zaangażowania komórek w cele przez inhibitory fosfatazy SHP2 (PTPN11)

Protokoły testów opartych na komórkach rezonansu rezonansu Förstera z rozdzielczością czasową są opisane dla prostej, specyficznej, czułej i solidnej kwantyfikacji endogennych fosforylowanych białek przetwornika sygnału i aktywatora transkrypcji (STAT) 1/3/4/5/6 w lizatach komórkowych w formacie 384-dołkowym.

Czasowo-rozdzielcze rezonansowe testy transferu energii Förstera do pomiaru endogennych fosforylowanych białek STAT w komórkach ludzkich

Ten protokół opisuje projektowanie, tworzenie i stosowanie fosfataz regulowanych rapamycyną. Metoda ta zapewnia wysoką swoistość i ścisłą kontrolę czasową aktywacji fosfatazy w żywych komórkach.

Rozwój i zastosowanie fosfataz tyrozynowych regulowanych rapamycyną

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Interakcja między kanałami HCN a ich podjednostką pomocniczą została zidentyfikowana jako cel terapeutyczny w dużym zaburzeniu depresyjnym. W tym artykule przedstawiono opartą na polaryzacji fluorescencyjnej metodę identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów tej interakcji białko-białko.

Metoda identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów oddziaływania białko-białko między HCN1 i TRIP8b

Różnicowa kalorymetria skaningowa mierzy temperaturę(y) przemiany termicznej i całkowitą energię cieplną potrzebną do denaturacji białka. Uzyskane wyniki służą do oceny stabilności termicznej antygenów białkowych w formulacjach szczepionek.

Różnicowa kalorymetria skaningowa – metoda oceny stabilności termicznej i konformacji antygenu białkowego

Poznaj metodę DARTS do badania stabilności białek i szacowania powinowactwa interakcji białko-ligand na przykładzie kompleksu mTOR-rapamycyna. Technika ta umożliwia identyfikację nowych celów białkowych dla małych cząsteczek.

Półilościowy test stabilności docelowej reagujący na powinowactwo do leków (DARTS) do badania interakcji Rapamycyna/mTOR

Przeglądaj więcej filmów