Półilościowy test stabilności docelowej reagujący na powinowactwo do leków (DARTS) do badania interakcji Rapamycyna/mTOR

Stabilność docelowa reagująca na powinowactwo do leków (DARTS) to solidna metoda wykrywania nowych celów białkowych o małych cząsteczkach. Może być wykorzystany do weryfikacji znanych oddziaływań białek małocząsteczkowych oraz do znalezienia potencjalnych celów białkowych dla produktów naturalnych. W tym badaniu jeszcze bardziej zwiększamy możliwości analizy danych w eksperymencie DARTS, monitorując zmiany stabilności białek i szacując powinowactwo interakcji białko-ligand

Oddziaływania białko-ligand można wykreślić na podstawie dwóch krzywych, krzywej proteolitycznej i krzywej zależności od dawki. Wykorzystaliśmy interakcję mTOR-rapamycyna jako przykładowy przypadek ustanowienia naszego protokołu. Hoduj komórki 293T za pomocą DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą, dwumilimolową glutaminą i 1% antybiotykami.

Inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla. Gdy kultura osiągnie 80 do 90% konfluencji, umyj komórki dwukrotnie zimnym PBS. Użyj skrobaka do komórek, aby zebrać komórki do odpowiedniej ilości buforu do lizy zimnych komórek i przenieś komórki lizujące do 1.5-milimetrowej probówki.

Odwrócić, aby dobrze wymieszać bufor do lizy i komórki lizujące, a następnie inkubować probówkę na lodzie przez 10 minut. Odwirować probówkę o ciśnieniu 18 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś supernatant do nowej 1,5-mililitrowej probówki i przechowuj w chłodzie na lodzie.

Wykonać test BCA, aby w przybliżeniu określić stężenie białka w lizatach i obliczyć rozcieńczenie pronazy na podstawie stężenia białka. Najpierw przenieś lizat do dwóch 1,5-mililitrowych probówek po 99 mikrolitrów każda. Dodać jeden mikrolitr małocząsteczkowego roztworu podstawowego do każdej podwielokrotności lizatu i inkubować dwie probówki przez 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem.

Na lodzie ustalić seryjne rozcieńczenia świeżo rozmrożonego roztworu pronazy w 1x TNC. Po inkubacji z małą cząsteczką podzielić każdą podwielokrotność na 20 mikrolitrów próbek w pięciu probówkach. Aby zapewnić ten sam czas trawienia, w określonych odstępach czasu co 30 sekund dodaj odpowiednio dwa mikrolitry przygotowanych roztworów pronazy do próbek.

Dla jednej grupy kontrolnej dodaj dwa mikrolitry buforu TNC. Po pięciu do 20 minutach zatrzymaj trawienie sześciu probówek, dodając dwa mikrolitry zimnego koktajlu 20-krotnego inhibitora proteazy w odstępach 30-sekundowych. Dobrze wymieszaj i inkubuj na lodzie przez 10 minut.

Rozcieńczyć każdą próbkę sześcioma mikrolitrami 5x buforu ładującego SDS-PAGE i gotować próbki w łaźni wodnej w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut. Teraz, aby wykonać Western blot, załaduj równe ilości białka do studzienek żelu 8% SDS-PAGE wraz z odpowiednim markerem masy cząsteczkowej. Uruchom żel na 30 minut przy napięciu 80 woltów, a następnie dostosuj napięcie do 120 woltów i kontynuuj pracę przez jedną do dwóch godzin.

Sprawdź, czy mała cząsteczka może wiązać się bezpośrednio z potencjalnymi białkami docelowymi. W tym protokole inkubacja z małą cząsteczką potwierdziła ochronę przed proteolizą. Stwierdzono, że trzy prążki są chronione przez inkubację z rapamycyną nad kontrolą nośnika.

Western blot zilustrował obecność białka mTOR przy niskich proporcjach pronazy do białka oraz jego redukcję i utratę wraz ze wzrostem proporcji. Proteoliza mTOR przez pronazę była wyraźnie zahamowana przez obecność rapamycyny, a dodanie rapamycyny spowodowało oczywiste przesunięcie krzywej proteolitycznej. Rapamycyna w zależności od dawki zwiększała poziom mTOR, co sugeruje rosnącą stabilność mTOR po leczeniu rapamycyną.

Kwantyfikacja intensywności pasma białka docelowego sugerowała, że mTOR jest białkiem docelowym rapamycyny. Aby uzyskać najlepszy efekt krokowy, eksperyment ten może wymagać kilkukrotnego powtórzenia, aby uzyskać odpowiedni zakres proporcji pronazy do białka.