Name: Badanie funkcjonalne in vivo rzadkich wariantów ludzkich związanych z chorobą przy użyciu Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Odkryj metodę analizy rzadkich wariantów genetycznych związanych z chorobami przy użyciu Drosophila melanogaster. To podejście in vivo umożliwia szybką ocenę funkcji białek i wspiera diagnostykę chorób rzadkich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jose Salazarowi, Julii Wang i dr Karen Schulze za krytyczną lekturę manuskryptu. Dziękujemy doktorom Ning Liu i Xi Luo za funkcjonalną charakterystykę omawianych tutaj wariantów TBX2. Centrum Badań Przesiewowych Organizmów Modelowych Sieci Chorób Niezdiagnozowanych było wspierane przez Wspólny Fundusz Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) (U54 NS093793). H. T. C. był dodatkowo wspierany przez NIH [CNCDP-K12 i NINDS (1K12 NS098482)], American Academy of Neurology (grant Neuroscience Research), Burroughs Wellcome Fund (Nagroda za karierę dla naukowców medycznych), Towarzystwo Neurologii Dziecięcej i Fundację Neurologii Dziecięcej (grant PERF Elterman) oraz NIH Director's Early Independence Award (DP5 OD026426). M. F. W. był dodatkowo wspierany przez Fundację Simonsa (Nagroda SFARI: 368479). S. Y. był dodatkowo wspierany przez NIH (R01 DC014932), Fundację Simonsa (nagroda SFARI: 368479), Stowarzyszenie Alzheimera (grant na badania dla nowych badaczy: 15-364099), Naman Family Fund for Basic Research oraz Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine. Mikroskopia konfokalna w BCM jest częściowo wspierana przez grant NIH U54HD083092 do Centrum Badań nad Niepełnosprawnością Intelektualną i Rozwojową (IDDRC) Neurovisualization Core.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Badania eksperymentalne z wykorzystaniem Drosophila melanogaster zapewniają solidny system testowy do oceny konsekwencji wariantów ludzkich związanych z chorobą. Wynika to z obszernego zasobu wiedzy i różnorodnych narzędzi genetycznych, które zostały wygenerowane przez wielu badaczy w dziedzinie much w ciągu ostatniego stulecia89 . Jednak, podobnie jak w przypadku każdego innego systemu eksperymentalnego, ważne jest, aby zdawać sobie sprawę z istniejących zastrzeżeń i ograniczeń.
<p c...

Pacjenci z rzadkimi chorobami często przechodzą żmudną podróż zwaną "odyseją diagnostyczną", aby uzyskać dokładną diagnozę1. Uważa się, że większość chorób rzadkich ma silne podłoże genetyczne, co sprawia, że analizy genetyczne/genomiczne są krytycznymi elementami badań klinicznych. Oprócz sekwencjonowania panelu genów kandydujących i analizy zmienności liczby kopii w oparciu o mikromacierze chromosomowe, technologie sekwencjonowania całego eksomu (WES) i całego genomu (WGS) stały się w ciągu ostatniej dekady coraz cenniejszymi narzędziami2,3. Obecnie wskaźnik diagnostyczny identyfikacji znanego wariantu patogennego w WES i WGS wynosi ~25% (wyższy w przypadkach pediatrycznych)4,5. W większości przypadków, które pozostają niezdiagnozowane po klinicznym WES/WGS, częstym problemem jest to, że istnieje wiele genów kandydujących i wariantów. Sekwencjonowanie nowej generacji często identyfikuje nowe lub ultrarzadkie warianty wielu genów, a interpretacja, czy te warianty przyczyniają się do fenotypów choroby, jest wyzwaniem. Na przykład, chociaż uważa się, że większość nonsensownych lub przesuniętych mutacji w genach to allele utraty funkcji (LOF) z powodu rozpadu kodowanego transkryptu, mutacje skracające znalezione w ostatnich eksonach unikają tego procesu i mogą funkcjonować jako allele łagodne lub allele wzmocnienia funkcji (GOF)6.
Ponadto, przewidywanie skutków allelu missense jest trudnym zadaniem, ponieważ może prowadzić do wielu różnych scenariuszy genetycznych, jak po raz pierwszy opisane przez Hermana Mullera w latach 30. (tj. amorf, hipomorf, hipermorf, antymorf, neomorf lub izomorf)7. Opracowano liczne programy i metodologie in silico w celu przewidywania patogenności wariantów missense w oparciu o zachowanie ewolucyjne, rodzaj zmiany aminokwasów, pozycję w domenie funkcjonalnej, częstość alleli w populacji ogólnej i inne parametry8. Programy te nie są jednak kompleksowym rozwiązaniem skomplikowanego problemu interpretacji wariantów. Co ciekawe, niedawne badanie wykazało, że pięć szeroko stosowanych algorytmów przewidywania patogenności wariantów (Polyphen9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, Mutation Taster) zgadzają się co do patogenności ~80% czasu8. Warto zauważyć, że nawet jeśli wszystkie algorytmy są zgodne, zwracają nieprawidłową prognozę chorobotwórczości w 11% przypadków. Prowadzi to nie tylko do błędnej interpretacji klinicznej, ale także może zniechęcić badaczy do śledzenia nowych wariantów poprzez fałszywe umieszczanie ich jako łagodnych. Jednym ze sposobów uzupełnienia obecnych ograniczeń modelowania in silico jest dostarczenie danych eksperymentalnych, które pokazują wpływ funkcji wariantowej in vitro, ex vivo (np. hodowane komórki, organoidy) lub in vivo.
Badania funkcjonalne in vivo wariantów związanych z rzadkimi chorobami w MO mają unikalne mocne strony13 i zostały przyjęte przez wiele inicjatyw badawczych dotyczących chorób rzadkich na całym świecie, w tym Sieć Chorób Niezdiagnozowanych (UDN) w Stanach Zjednoczonych oraz Sieci Modeli i Mechanizmów Chorób Rzadkich (RDMM) w Kanadzie, Japonii, Europie i Australii14. Oprócz tych skoordynowanych wysiłków mających na celu włączenie badaczy MO do procesu diagnozowania chorób rzadkich i badań mechanistycznych na skalę krajową, szereg indywidualnych badań zespołowych między badaczami klinicznymi i MO doprowadziło do odkrycia i scharakteryzowania wielu nowych genów i wariantów powodujących choroby u ludzi82,83,84.
W UDN, scentralizowane Centrum Badań Przesiewowych Organizmów Modelowych (MOSC) otrzymuje zgłoszenia genów i wariantów kandydujących wraz z opisem stanu pacjenta i ocenia, czy wariant może być patogenny, korzystając z narzędzi informatycznych i eksperymentów in vivo. W fazie I (2015-2018) UDN MOSC składał się z Drosophila Core [Baylor College of Medicine (BCM)] i Zebrafish Core (University of Oregon), które współpracowały w celu oceny przypadków. Wykorzystując analizę informatyczną i szereg różnych strategii eksperymentalnych u Drosophila i danio pręgowanego, MOSC przyczyniło się do tej pory do diagnozy 132 pacjentów, identyfikacji 31 nowych syndromów55, odkrycia kilku nowych genów chorób ludzkich (np. EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) i fenotypowa ekspansja znanych genów chorobowych (np. CACNA1A21, ACOX122).
Oprócz projektów w ramach UDN, badacze MOSC Drosophila Core przyczynili się do odkrycia nowych genów chorobowych we współpracy z Centers for Mendlian Genomics i innymi inicjatywami (np. ANKLE223, TM2D324, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) przy użyciu tego samego zestawu strategii informatycznych i genetycznych opracowanych dla UDN. Biorąc pod uwagę znaczenie badań MO dotyczących diagnozowania chorób rzadkich, MOSC został rozszerzony o rdzeń C. elegans i drugi rdzeń danio pręgowanego (oba na Uniwersytecie Waszyngtońskim w St. Louis) dla fazy II (2018-2022) UDN.
Ten manuskrypt opisuje protokół badania funkcjonalnego in vivo, który jest aktywnie wykorzystywany w UDN MOSC Drosophila Core do określenia, czy warianty missense mają funkcjonalne konsekwencje dla białka będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu transgenicznych muszek, które wyrażają ludzkie białka. Celem tego protokołu jest pomoc badaczom MO we współpracy z klinicznymi grupami badawczymi w celu dostarczenia eksperymentalnych dowodów na to, że wariant kandydujący w genie będącym przedmiotem zainteresowania ma konsekwencje funkcjonalne, ułatwiając w ten sposób diagnozę kliniczną. Protokół ten jest najbardziej przydatny w scenariuszu, w którym badacz Drosophila kontaktuje się z badaczem klinicznym, który ma pacjenta z rzadką chorobą z określonym wariantem kandydującym w genie będącym przedmiotem zainteresowania.
Ten protokół można podzielić na trzy elementy: (1) zbieranie informacji w celu oceny prawdopodobieństwa, że interesujący wariant jest odpowiedzialny za fenotyp pacjenta i wykonalność badania funkcjonalnego na Drosophila, (2) gromadzenie istniejących narzędzi genetycznych i ustalanie nowych, oraz (3) przeprowadzanie badań funkcjonalnych in vivo. Trzeci element można dalej podzielić na dwa podelementy w zależności od tego, jak można ocenić funkcję wariantu będącego przedmiotem zainteresowania (eksperyment ratunkowy lub strategie oparte na nadekspresji). Ważne jest, aby pamiętać, że protokół ten może być dostosowany i zoptymalizowany do wielu scenariuszy poza badaniami nad rzadkimi chorobami monogenowymi (np. powszechne choroby, interakcje gen-środowisko oraz farmakologiczne/genetyczne badania przesiewowe w celu identyfikacji celów terapeutycznych). Możliwość określenia funkcjonalności i patogenności wariantów nie tylko przyniesie korzyści pacjentowi, który jest przedmiotem zainteresowania, zapewniając dokładną diagnozę molekularną, ale będzie miała również szerszy wpływ zarówno na translacyjne, jak i podstawowe badania naukowe.

<table><tbody><tr><td>Drosophila Zapasy do transgenezy UAS-ludzkiego cDNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szczepy iniekcyjne do transgenezy (D. melanogaster)</td><td>BDSC</td><td>#24871</td><td>Specyficzny odczynnik: VK33 (3. chromosom) Linia iniekcyjna</td></tr><tr><td>Szczepy iniekcyjne do transgenezy (D. melanogaster)</td><td>BDSC</td><td>#24872</td><td>Specyficzny odczynnik: VK37 (2. chromosom) Linia iniekcyjna</td></tr> <tr><td>Plasmid DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wektor klonowania</td><td>Thermo Fisher</td><td>#12536-017</td><td>Specyficzny odczynnik: pDONR221</td></tr><tr><td>Drosophila wektor transgenezy</td><td>Prezent od dr Johannesa Bischofa i Konrada Baslera (Bischof i wsp., 2013 PNAS)</td><td></td><td>Specyficzny odczynnik: pGW-HA.attB</td></tr><tr><td>Zestawy i odczynniki do biologii molekularnej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A2790</td><td>Odczynnik specyficzny: Agaroza (klasa biologii molekularnej)</td></tr><tr><td>Chemicznie kompetentne komórki (E. coli)</td><td>Thermo Fisher</td><td>#18265017</td><td>Specyficzny odczynnik: DH5 i alfa;</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu DNA</td><td>Thermo Fisher</td><td>#K210012</td><td>Specyficzny odczynnik: Zestaw do ekstrakcji żelu PureLink Zestaw</td></tr><tr><td>do izolacji i oczyszczania DNA</td><td>Qiagen</td><td>#27104</td><td>Specyficzny odczynnik: QIAprep Spin Miniprep</td></tr><tr><td>Kit Polimeraza o wysokiej wierności Specyficzny</td><td>dla NEB</td><td>#M0491</td><td>Odczynnik: Q5 Zestaw polimerazy</td></tr> System <tr><td>klonowania za pośrednictwem rekombinazy</td><td>Thermo Fisher</td><td>#11789020</td><td>Specyficzny odczynnik: Zestaw klonazy Gateway BP System</td></tr><tr><td>klonowania za pośrednictwem rekombinazy</td><td>Thermo Fisher</td><td>#11791100</td><td>Specyficzny odczynnik: Zestaw enzymów Gateway LR Clonase II</td></tr><tr><td>Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce</td><td>Agilent</td> <td># 200523</td><td>Specyficzny odczynnik: Quick Change II Zestaw do mutagenezy</td></tr><tr><td>Electroretinogram Sprzęt związany z rigiem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ERG Analiza</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Nie dotyczy</td><td>Specyficzny odczynnik: Pakiet oprogramowania do transmisji danych Axon pCLAMP 10 Gromadzenie</td></tr><tr><td>danych ERG</td><td>Odczynnik specyficzny dla LabX</td><td>#R150358</td><td>: ISO-DAM Izolowany wzmacniacz</td></tr><tr><td>biologiczny Stymulator ERG</td><td>Astro-Med</td><td>#S48</td><td>Specyficzny odczynnik: Stymulator impulsów kwadratowych</td></tr></tbody></table>

badanie funkcjonalne in vivo rzadkich wariantów ludzkich związanych z chorobą przy użyciu drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Postępy w technologii sekwencjonowania sprawiły, że zestawy danych całego genomu i całego egzomu stały się bardziej dostępne zarówno dla diagnozy klinicznej, jak i najnowocześniejszych badań nad genetyką człowieka. Chociaż opracowano szereg algorytmów in silico w celu przewidywania patogenności wariantów zidentyfikowanych w tych zestawach danych, badania funkcjonalne mają kluczowe znaczenie dla określenia, w jaki sposób określone warianty genomowe wpływają na funkcję białek, zwłaszcza w przypadku wariantów missense. W Sieci Chorób Niezdiagnozowanych (UDN) i innych konsorcjach badawczych zajmujących się chorobami rzadkimi, organizmy modelowe (MO), w tym Drosophila, C. elegans, danio pręgowany i myszy, są aktywnie wykorzystywane do oceny funkcji przypuszczalnych wariantów powodujących chorobę u ludzi. Protokół ten opisuje metodę oceny funkcjonalnej rzadkich wariantów ludzkich stosowaną w Centrum Badań Przesiewowych Organizmów Modelowych Drosophila Core UDN. Przepływ pracy rozpoczyna się od zebrania informacji o ludziach i MO z wielu publicznych baz danych, wykorzystania zasobów internetowych MARRVEL do oceny, czy wariant może przyczynić się do stanu pacjenta, a także do zaprojektowania skutecznych eksperymentów w oparciu o dostępną wiedzę i zasoby. Następnie generowane są narzędzia genetyczne (np. linie T2A-GAL4 i UAS-ludzkie cDNA) do oceny funkcji interesujących wariantów u Drosophila. Po opracowaniu tych odczynników można przeprowadzić dwutorowe testy funkcjonalne oparte na eksperymentach ratunkowych i nadekspresji w celu oceny funkcji wariantu. W gałęzi ratowniczej endogenne geny much są "humanizowane" poprzez zastąpienie ortologicznego genu Drosophila referencyjnymi lub wariantowymi ludzkimi transgenami. W gałęzi nadekspresji białka referencyjne i wariantowe ludzkie są egzogennie napędzane w różnych tkankach. W obu przypadkach każdy możliwy do oceny fenotyp (np. śmiertelność, morfologia oka, elektrofizjologia) może być użyty jako odczyt, niezależnie od choroby będącej przedmiotem zainteresowania. Różnice zaobserwowane między allelami referencyjnymi i wariantowymi sugerują efekt specyficzny dla wariantu, a tym samym prawdopodobną chorobotwórczości. Protokół ten umożliwia szybką ocenę in vivo przypuszczalnych wariantów genów powodujących chorobę u ludzi o znanych i nieznanych funkcjach.

Funkcjonalne badanie wariantu missense de novo w EBF3 powiązanego z fenotypami neurorozwojowymi 
U 7-letniego chłopca z fenotypami neurorozwojowymi, w tym hipotonią, ataksją, globalnym opóźnieniem rozwoju i zaburzeniami mowy ekspresyjnej, lekarze i genetycy z National Institutes of Health Undiagnosed Diseases Project (UDP) zidentyfikowali wariant missense de novo (p.R163Q) w EBF3 (Early B-Cell Factor 3)15, gen kodujący czynnik transkrypcyjny z rodziny...

Celem tego protokołu jest przedstawienie projektu i wydajności eksperymentów in vivo na Drosophila melanogaster w celu oceny funkcjonalnych konsekwencji rzadkich wariantów genów związanych z chorobami ludzkimi.

Badanie funkcjonalne in vivo rzadkich wariantów ludzkich związanych z chorobą przy użyciu Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Protokół ten pozwala nam określić, czy warianty missense w ludzkich genach, które są związane z chorobami, wpływają na funkcję białek. Jest to trudne do osiągnięcia obliczeniowo nawet przy użyciu najnowocześniejszych algorytmów. Technika ta umożliwia szybką analizę wariantów missense w białkach ludzkich przy użyciu systemu Drosophila melanogaster in vivo, który jest szybszy i bardziej opłacalny niż modelowe organizmy kręgowców.Wykazanie, że określony wariant wpływa na funkcję białka, bezpośrednio przyczynia się do diagnozowania chorób rzadkich i służy jako punkt wyjścia do analizy mechanizmów choroby i potencjalnych terapii. Protokół ten jest szczególnie przydatny podczas badania wariantów związanych z rzadkimi chorobami, ale można go zastosować do bardziej powszechnych chorób, takich jak autyzm i rak. Identyfikacja powtarzalnych fenotypów u muszek, które odzwierciedlają funkcję białek, może być wyzwaniem.Fenotypy mogą się różnić w zależności od genu i mogą być subtelne. Badania funkcjonalne wariantów białek ludzkich z wykorzystaniem Drosophila można przeprowadzić w oparciu o eksperymenty ratunkowe lub badania nadekspresji. Przed rozpoczęciem procedury należy zebrać informacje na temat interesującego nas genu ludzkiego i jego ortologów organizmu modelowego.Aby przetestować funkcję wariantu poprzez nadekspresję referencyjnych i wariantowych białek ludzkich w układzie wzrokowym muchy, wygeneruj transgeniczne muchy, które wyrażają referencyjne lub wariantowe ludzkie cDNA będące przedmiotem zainteresowania pod kontrolą sekwencji aktywującej Gal4 lub systemu UAS. Aby wybrać określoną linię Gal4 do ekspresji ludzkich białek w określonej tkance muchy, skrzyżuj od trzech do pięciu dziewiczych samic z linii Gal4 z trzema do pięciu samców z każdej z transgenicznych linii ludzkiego cDNA UAS w pojedynczych fiolkach lub w duplikatach. Przenoś krzyżówki co dwa do trzech dni, aby uzyskać jak najwięcej zwierząt z jednej krzyżówki i zbadaj zamknięte zwierzę pod mikroskopem preparacyjnym, aby zidentyfikować wszelkie różnice między szczepami referencyjnymi i wariantowymi.Jeśli występuje widoczna wada, zobrazuj muchy, aby udokumentować fenotypy. Aby wygenerować muchy w celu zbadania wad funkcjonalnych w układzie wzrokowym, skrzyżuj dziewicze samice z linii rodopsyny 1 Gal4 z samcami z referencyjnymi lub wariantowymi transgenami ludzkiego cDNA UAS w celu ekspresji ludzkich białek będących przedmiotem zainteresowania w fotoreceptorach R1 do R6 w siatkówce muchy. Gdy muchy zaczną się zamykać, zbierz potomstwo do świeżych fiolek i umieść fiolki z powrotem w inkubatorze ustawionym na odpowiednią temperaturę eksperymentalną na dodatkowe trzy dni, aby umożliwić dojrzewanie układu wzrokowego.Pod koniec inkubacji unieruchamić muszki odpowiednią metodą znieczulenia i delikatnie przykleić jedną stronę każdej muchy do szklanego szkiełka mikroskopowego. Po ustawieniu urządzenia do elektroretinogramu umieść szklaną kapilę o średnicy 1,2 milimetra w ściągaczu igłowym i rozbij rurkę kapilarną, aby uzyskać dwie ostre, puste w środku stożkowe elektrody o średnicy mniejszej niż 0,5 milimetra. Napełnij kapilary 100-milimolowym roztworem soli fizjologicznej, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza i nasuń szklane kapilary na elektrody ze srebrnego drutu.Zacisnąć naczynia włosowate na miejscu i przyzwyczajć muszki do całkowitej ciemności przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec habituacji umieścić szkiełko z muchami na aparacie rejestrującym i przesunąć mikromanipulatory przenoszące elektrody referencyjne i rejestrujące w pobliże interesującej nas muchy. Obserwując końcówkę elektrody, ostrożnie umieść elektrodę referencyjną w klatce piersiowej muchy penetrującej naskórek i umieść elektrodę rejestrującą na powierzchni oka.Aby nagrania elektroretinogramu zakończyły się sukcesem, należy zwrócić uwagę na odpowiedni nacisk na elektrodę rejestrującą, tak aby spowodowała ona powstanie małego wgłębienia bez penetracji oka. Po umieszczeniu elektrod wyłącz światło główne na trzy minuty, aby ponownie zaaklimatyzować muchy w ciemnym otoczeniu. Pod koniec okresu ponownej aklimatyzacji otwieraj i zamykaj migawkę raz na sekundę przez 20 sekund, rejestrując elektroretinogramy z co najmniej 15 much na szkiełko na genotyp na stan przy użyciu tych samych elektrod.Gdy zapisy z muchy referencyjnej i wariantowej są kompletne, porównaj zapisy elektroretinogramu z wzorca, wariantu i kontroli, aby ocenić różnice. Następnie oceń dane z elektroretinogramu pod kątem zmian w stanach nieustalonych, depolaryzacji, stanach nieustalonych i repolaryzacji. W tym reprezentatywnym eksperymencie przeprowadzono badania oparte na nadekspresji TBX2, ponieważ ludzki referencyjny TBX2 nie był w stanie funkcjonalnie zastąpić ortologicznego genu muchy, co uniemożliwiło strategie oparte na ratowaniu.Gdy referencyjna ludzka TBX2 uległa nadekspresji w rozwijającym się oku i częściach mózgu przy użyciu bezokiego Gal4, nadekspresja powoduje około 85% śmiertelność i znaczne zmniejszenie rozmiaru oka. W przeciwieństwie do tego, wariant transgenu jest słabszy w powodowaniu śmiertelności i indukuje fenotyp małego oka przy użyciu tego samego czynnika w identycznych warunkach eksperymentalnych, co sugeruje, że wariant wpływa na funkcję białka. Ponadto, gdy referencyjna ludzka TBX2 ulega nadekspresji w fotoreceptorach przy użyciu rodopsyny Gal4, nadekspresja powoduje znaczącą zmianę w śladzie elektroretinogramu.Ten fenotyp jest łagodniejszy, gdy wariant białka ulega ekspresji, co stanowi kolejny dowód na to, że wariant będący przedmiotem zainteresowania wpływa na funkcję białka in vivo. Ważne jest, aby pamiętać, że każdy gen jest unikalny, więc nie ma jednego eksperymentu, który mógłby ocenić wpływ wszystkich wariantów związanych z chorobą. Oprócz pracy z ludzkimi cDNA, można również określić, czy wariant ma konsekwencje funkcjonalne, wprowadzając analogiczne warianty do ewolucyjnie konserwatywnych reszt genu ortologicznej muchy.Korzystając z tej metody, przyczyniliśmy się do wielu badań nad odkrywaniem genów chorób u ludzi we współpracy z Siecią Chorób Niezdiagnozowanych i innymi grupami.

in-vivo-functional-study-disease-associated-rare-human-variants-using

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Niniejszy protokół opisuje sekcję larw Drosophila in vivo w celu obrazowania ruchu pęcherzyków aksonalnych znakowanych białkiem GFP wzdłuż szyn mikrotubularnych.

In vivo wizualizacja pęcherzyków synaptycznych w aksonach segmentowych larw Drosophila

Opisujemy tutaj procedury ekstrakcji i oczyszczania mRNA i metabolitów z głów Drosophila. Stosujemy te techniki, aby lepiej zrozumieć perturbacje komórkowe leżące u podstaw degeneracji neuronów. Metodologie te można łatwo skalować i dostosowywać do innych projektów "omicznych".

Oczyszczanie transkryptów i metabolitów z głów Drosophila

Tutaj prezentujemy systematyczne podejście do opracowywania fizjologicznie istotnych, czułych i specyficznych testów in vivo do interpretacji zmienności w ludzkiej patologii. Przejściowa manipulacja genetyczna poprzez mikrowstrzyknięcie WT i zmutowanych ludzkich oligonukleotydów antysensownych mRNA i morfoliny (MO) wykorzystuje podatność rozwijającego się zarodka danio pręgowanego do szybkiego oznaczania mutacji patogennych, zwłaszcza, ale nie wyłącznie, w kontekście zaburzeń rozwojowych...

In vivo (in vivo) Modelowanie chorobliwego genomu ludzkiego przy użyciu Danio rerio

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający efektywny dostęp i analizę wielu baz danych organizmów ludzkich i modelowych. Protokół ten demonstruje wykorzystanie MARRVEL do analizy potencjalnych wariantów wywołujących chorobę zidentyfikowanych w wyniku sekwencjonowania nowej generacji.

Poruszanie się po MARRVEL, narzędziu internetowym, które integruje informacje z genomiki człowieka i genetyki organizmów modelowych

Prezentujemy protokół wykorzystujący zaawansowane podejście genetyczne do badań przesiewowych w kierunku mutantów wykazujących neurodegenerację u Drosophila melanogaster. Obejmuje on test wspinaczkowy, analizę histologiczną, mapowanie genów i sekwencjonowanie DNA, aby ostatecznie zidentyfikować nowe geny związane z procesem neuroprotekcji.

Genetyczne badania przesiewowe in vivo w celu identyfikacji nowych genów neuroprotekcyjnych u Drosophila melanogaster

System oczu Drosophila jest użytecznym narzędziem do badania różnych procesów biologicznych, szczególnie chorób neurodegeneracyjnych u ludzi. Jednak ręczna kwantyfikacja fenotypów szorstkiego oka może być stronnicza i niewiarygodna. Tutaj opisujemy metodę, za pomocą której ilastik i Flynotyper są używane do ilościowego określania fenotypu oka w bezstronny sposób.

Kwantyfikacja fenotypów oczu Drosophila melanogaster: podejście obliczeniowe integrujące ilastik i Flynotyper

Ten protokół opisuje, jak ocenić ekspresję dużej liczby genów na poziomie klonalnym. Jednokomórkowy RT-qPCR daje wysoce wiarygodne wyniki z dużą czułością dla setek próbek i genów.

Ekspresja genów w pojedynczej komórce za pomocą multipleksu RT-qPCR w celu scharakteryzowania heterogeniczności rzadkich populacji limfoidalnych

Odkryj metodę analizy rzadkich wariantów genetycznych związanych z chorobami przy użyciu Drosophila melanogaster. To podejście in vivo umożliwia szybką ocenę funkcji białek i wspiera diagnostykę chorób rzadkich.

Badanie funkcjonalne in vivo rzadkich wariantów ludzkich związanych z chorobą przy użyciu Drosophila

Przeglądaj więcej filmów