Badanie funkcjonalne in vivo rzadkich wariantów ludzkich związanych z chorobą przy użyciu Drosophila

Protokół ten pozwala nam określić, czy warianty missense w ludzkich genach, które są związane z chorobami, wpływają na funkcję białek. Jest to trudne do osiągnięcia obliczeniowo nawet przy użyciu najnowocześniejszych algorytmów. Technika ta umożliwia szybką analizę wariantów missense w białkach ludzkich przy użyciu systemu Drosophila melanogaster in vivo, który jest szybszy i bardziej opłacalny niż modelowe organizmy kręgowców.

Wykazanie, że określony wariant wpływa na funkcję białka, bezpośrednio przyczynia się do diagnozowania chorób rzadkich i służy jako punkt wyjścia do analizy mechanizmów choroby i potencjalnych terapii. Protokół ten jest szczególnie przydatny podczas badania wariantów związanych z rzadkimi chorobami, ale można go zastosować do bardziej powszechnych chorób, takich jak autyzm i rak. Identyfikacja powtarzalnych fenotypów u muszek, które odzwierciedlają funkcję białek, może być wyzwaniem.

Fenotypy mogą się różnić w zależności od genu i mogą być subtelne. Badania funkcjonalne wariantów białek ludzkich z wykorzystaniem Drosophila można przeprowadzić w oparciu o eksperymenty ratunkowe lub badania nadekspresji. Przed rozpoczęciem procedury należy zebrać informacje na temat interesującego nas genu ludzkiego i jego ortologów organizmu modelowego.

Aby przetestować funkcję wariantu poprzez nadekspresję referencyjnych i wariantowych białek ludzkich w układzie wzrokowym muchy, wygeneruj transgeniczne muchy, które wyrażają referencyjne lub wariantowe ludzkie cDNA będące przedmiotem zainteresowania pod kontrolą sekwencji aktywującej Gal4 lub systemu UAS. Aby wybrać określoną linię Gal4 do ekspresji ludzkich białek w określonej tkance muchy, skrzyżuj od trzech do pięciu dziewiczych samic z linii Gal4 z trzema do pięciu samców z każdej z transgenicznych linii ludzkiego cDNA UAS w pojedynczych fiolkach lub w duplikatach. Przenoś krzyżówki co dwa do trzech dni, aby uzyskać jak najwięcej zwierząt z jednej krzyżówki i zbadaj zamknięte zwierzę pod mikroskopem preparacyjnym, aby zidentyfikować wszelkie różnice między szczepami referencyjnymi i wariantowymi.

Jeśli występuje widoczna wada, zobrazuj muchy, aby udokumentować fenotypy. Aby wygenerować muchy w celu zbadania wad funkcjonalnych w układzie wzrokowym, skrzyżuj dziewicze samice z linii rodopsyny 1 Gal4 z samcami z referencyjnymi lub wariantowymi transgenami ludzkiego cDNA UAS w celu ekspresji ludzkich białek będących przedmiotem zainteresowania w fotoreceptorach R1 do R6 w siatkówce muchy. Gdy muchy zaczną się zamykać, zbierz potomstwo do świeżych fiolek i umieść fiolki z powrotem w inkubatorze ustawionym na odpowiednią temperaturę eksperymentalną na dodatkowe trzy dni, aby umożliwić dojrzewanie układu wzrokowego.

Pod koniec inkubacji unieruchamić muszki odpowiednią metodą znieczulenia i delikatnie przykleić jedną stronę każdej muchy do szklanego szkiełka mikroskopowego. Po ustawieniu urządzenia do elektroretinogramu umieść szklaną kapilę o średnicy 1,2 milimetra w ściągaczu igłowym i rozbij rurkę kapilarną, aby uzyskać dwie ostre, puste w środku stożkowe elektrody o średnicy mniejszej niż 0,5 milimetra. Napełnij kapilary 100-milimolowym roztworem soli fizjologicznej, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza i nasuń szklane kapilary na elektrody ze srebrnego drutu.

Zacisnąć naczynia włosowate na miejscu i przyzwyczajć muszki do całkowitej ciemności przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec habituacji umieścić szkiełko z muchami na aparacie rejestrującym i przesunąć mikromanipulatory przenoszące elektrody referencyjne i rejestrujące w pobliże interesującej nas muchy. Obserwując końcówkę elektrody, ostrożnie umieść elektrodę referencyjną w klatce piersiowej muchy penetrującej naskórek i umieść elektrodę rejestrującą na powierzchni oka.

Aby nagrania elektroretinogramu zakończyły się sukcesem, należy zwrócić uwagę na odpowiedni nacisk na elektrodę rejestrującą, tak aby spowodowała ona powstanie małego wgłębienia bez penetracji oka. Po umieszczeniu elektrod wyłącz światło główne na trzy minuty, aby ponownie zaaklimatyzować muchy w ciemnym otoczeniu. Pod koniec okresu ponownej aklimatyzacji otwieraj i zamykaj migawkę raz na sekundę przez 20 sekund, rejestrując elektroretinogramy z co najmniej 15 much na szkiełko na genotyp na stan przy użyciu tych samych elektrod.

Gdy zapisy z muchy referencyjnej i wariantowej są kompletne, porównaj zapisy elektroretinogramu z wzorca, wariantu i kontroli, aby ocenić różnice. Następnie oceń dane z elektroretinogramu pod kątem zmian w stanach nieustalonych, depolaryzacji, stanach nieustalonych i repolaryzacji. W tym reprezentatywnym eksperymencie przeprowadzono badania oparte na nadekspresji TBX2, ponieważ ludzki referencyjny TBX2 nie był w stanie funkcjonalnie zastąpić ortologicznego genu muchy, co uniemożliwiło strategie oparte na ratowaniu.

Gdy referencyjna ludzka TBX2 uległa nadekspresji w rozwijającym się oku i częściach mózgu przy użyciu bezokiego Gal4, nadekspresja powoduje około 85% śmiertelność i znaczne zmniejszenie rozmiaru oka. W przeciwieństwie do tego, wariant transgenu jest słabszy w powodowaniu śmiertelności i indukuje fenotyp małego oka przy użyciu tego samego czynnika w identycznych warunkach eksperymentalnych, co sugeruje, że wariant wpływa na funkcję białka. Ponadto, gdy referencyjna ludzka TBX2 ulega nadekspresji w fotoreceptorach przy użyciu rodopsyny Gal4, nadekspresja powoduje znaczącą zmianę w śladzie elektroretinogramu.

Ten fenotyp jest łagodniejszy, gdy wariant białka ulega ekspresji, co stanowi kolejny dowód na to, że wariant będący przedmiotem zainteresowania wpływa na funkcję białka in vivo. Ważne jest, aby pamiętać, że każdy gen jest unikalny, więc nie ma jednego eksperymentu, który mógłby ocenić wpływ wszystkich wariantów związanych z chorobą. Oprócz pracy z ludzkimi cDNA, można również określić, czy wariant ma konsekwencje funkcjonalne, wprowadzając analogiczne warianty do ewolucyjnie konserwatywnych reszt genu ortologicznej muchy.

Korzystając z tej metody, przyczyniliśmy się do wielu badań nad odkrywaniem genów chorób u ludzi we współpracy z Siecią Chorób Niezdiagnozowanych i innymi grupami.