Przestrzenna i czasowa kontrola inicjacji czerniaka myszy ze zmutowanych komórek macierzystych melanocytów
7 czerwca 2019
Poniższa procedura opisuje metodę przestrzennej i czasowej kontroli inicjacji guza melanocytowego w skórze grzbietowej myszy, przy użyciu genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy. Protokół ten opisuje makroskopową i mikroskopową inicjację czerniaka skóry.
Czerniak jest powszechnie diagnozowany na całym świecie, z coraz częstszą częstością. Protokoły te pozwalają na dokładne kontrolowanie wczesnych etapów inicjacji czerniaka, co ułatwia badanie jego rozwoju. Kontrolując czas i miejsce aktywacji komórek macierzystych melanocytów, mamy możliwość dostrzeżenia zmian w populacji komórek macierzystych i inicjacji nowego szczepu czerniaka.
Procedurę zademonstrują Dahihm Kim i Luye An, absolwenci laboratorium. Dwa do trzech dni przed rozpoczęciem zabiegu użyj elektrycznego trymera, aby ogolić skórę grzbietową każdej znieczulonej siedmiotygodniowej myszy. W dniu eksperymentu za pomocą bawełnianego wacika nałóż cienką warstwę kremu do depilacji na odsłoniętą skórę.
Po równomiernym nałożeniu kremu użyj czystych bawełnianych wacików, aby usunąć krem, a następnie delikatnie przetrzyj wilgotną szmatką, aby usunąć resztki kremu. Następnie przywróć każdą mysz do jej klatki domowej z monitorowaniem aż do pełnego odzyskania sprawności. W przypadku naświetlania promieniowaniem UV-B należy przykryć skórę grzbietową materiałem ochronnym UV-B, tak aby odsłonięty był tylko pożądany obszar, a komorę UV przykryć pokrywą odporną na promieniowanie UV.
Następnie włącz lampę UV-B, aby naświetlić mysz przez odpowiedni okres czasu eksperymentalnego przed powrotem myszy do pustej klatki z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia. Aby wyizolować próbki skóry, użyj elektrycznego trymera, aby usunąć wszelkie włosy z grzbietowego obszaru skóry poddanych eutanazji napromieniowanych myszy i delikatnie wyszczotkuj odsłoniętą skórę niestrzępiącą się chusteczką, aby oczyścić obszar. Wykonaj małe nacięcie ostrymi nożyczkami tuż nad podstawą ogona i włóż duże, nożyczki do nacięcia, aby oddzielić podskórne tkanki łączne.
Za pomocą ostrych nożyczek ostrożnie przeciąć wzdłuż krawędzi obszaru skóry będącego przedmiotem zainteresowania, aby wyizolować próbkę tkanki i umieścić wyciętą tkankę skórną na czystym ręczniku papierowym. Następnie użyj kleszczyków, aby rozciągnąć skórę tak, aby przylegała do ręcznika i była napięta. Po zebraniu wszystkich próbek należy umieścić próbkę skóry i podkład z ręcznika papierowego w kawałku złożonej bibuły filtracyjnej bezpośrednio przylegającej do zagięcia, uważając, aby próbka była gładka i nie była pofałdowana ani pognieciona.
Zamknij boki bibuły filtracyjnej zszywkami i przytnij bibułę. Następnie całkowicie zanurz próbki w 10% neutralnej buforowanej formalinie na trzy do pięciu godzin w temperaturze pokojowej, a następnie umyj tkanki dwoma pięciominutowymi płukaniami w wodzie dejonizowanej. Po drugim przemyciu ostrożnie usunąć wszelkie pozostałości materiału z tkanek skóry i przyciąć krawędzie próbek tak, aby nie były postrzępione.
Następnie wykonaj trzy nacięcia strzałkowe w każdej próbce, tak aby szerokość pasków nie przekraczała pięciu milimetrów, i wykonaj cięcia poprzeczne, aby próbki nie miały więcej niż 20 milimetrów szerokości. Umieść formę kriogeniczną zawierającą optymalną temperaturę cięcia lub medium OCT w orientacji pionowej i umieść cztery do pięciu kawałków skóry na wierzchu OCT. Gdy wszystkie kawałki są na swoim miejscu, użyj dwóch par cienkich kleszczy, aby przysunąć długą krawędź każdego kawałka skóry do dna formy kriogenicznej, tak aby próbki były pionowe w OCT i prostopadłe do podstawy formy.
Następnie napełnij formę dodatkowym OCT do drugiej wargi i umieść formę na płaskiej powierzchni kawałka suchego lodu, używając kleszczyków do regulacji wszelkich kawałków skóry, które mogły się przesunąć podczas przenoszenia, gdy blok zaczyna zamarzać w razie potrzeby. Kiedy myszy są siedem tygodni po porodzie, ich skóra grzbietowa jest w telogenie. Podczas telogenu wiadomo, że mieszki włosowe i komórki macierzyste melanocytów znajdują się w stanie spoczynku, a skóra po goleniu nie powinna wykazywać znaczącego wzrostu włosów.
Depilacja chemiczna może jednak wywołać aktywację komórek macierzystych mieszków włosowych, wywołując znaczny wzrost włosów w obszarze zainteresowania. Ponieważ depilacja chemiczna może znacząco wywołać aktywację zarówno komórek macierzystych mieszków włosowych, jak i melanocytów, komórki macierzyste melanocytów podatne na czerniaka w stanie aktywnym mogą tworzyć guzy, a mikroskopijną inicjację czerniaka można zaobserwować w ciągu dwóch tygodni od depilacji chemicznej. Promieniowanie UV-B może również indukować inicjację guza ze spoczynkowych, podatnych na nowotwór komórek macierzystych melanocytów.
Co ważne, UV-B indukuje bezpośrednią translokację komórek macierzystych melanocytów z ich niszy pęcherzykowych komórek macierzystych do naskórka międzymieszkowego. Ponadto promieniowanie UV-B może indukować powstawanie czerniaka skóry pochodzącego z komórek macierzystych melanocytów w całym naskórku międzymieszkowym. Podobnie jak w przypadku skóry grzbietowej, inicjację czerniaka wywołaną promieniowaniem UV-B można zaobserwować w innych obszarach skóry, takich jak skóra uszu.
Rzeczywiście, w porównaniu ze skórą ucha kontrolną, pokrytą tkaniną odporną na promieniowanie UV, skóra uszu wystawiona na działanie promieniowania UV-B wykazuje wyższą pigmentację ze względu na większe obciążenie inicjacją czerniaka. Różne dawki UV-B mogą mieć różny wpływ na skórę myszy i aktywność melanocytów. Dlatego ważne jest, aby określić i zoptymalizować dawkę promieniowania przed rozpoczęciem eksperymentu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę przestrzennej i czasowej kontroli inicjacji guzów melanocyticznych na grzbietowej skórze myszy przy użyciu genetycznie zmodyfikowanego modelu mysiego. Protokół ułatwia badania rozwoju czerniaka poprzez kontrolę aktywacji komórek macierzystych melanocytów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad czerniakiem
- Genetycznie zmodyfikowane modele myszy
- Aktywacja komórek macierzystych
Tło
- Czerniak jest coraz częściej diagnozowany na całym świecie.
- Rozumienie wczesnej inicjacji czerniaka jest kluczowe dla opracowania terapii.
- Kontrola czasu i lokalizacji aktywacji komórek macierzystych pomaga w badaniach.
- To badanie stosuje nowatorskie podejście do obserwacji zmian w populacjach komórek macierzystych.
Cel badania
- Aby zapewnić szczegółowy protokół inicjacji czerniaka u myszy.
- Aby zbadać dynamikę komórek macierzystych melanocytów podczas inicjacji guza.
- Aby zwiększyć zrozumienie mechanizmów rozwoju czerniaka.
Stosowane metody
- Golenie grzbietowej skóry znieczulonych myszy.
- Naładowanie kremu depilującego w celu ekspozycji skóry.
- Monitorowanie aktywacji komórek macierzystych melanocytów.
- Wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanego modelu mysiego dla precyzyjnej kontroli.
Główne wyniki
- Udane inicjowanie czerniaka w kontrolowanych warunkach.
- Obserwacja zmian w populacji komórek macierzystych.
- Demonstracja procedury przez studentów magisterskich.
- Ułatwienie dalszych badań nad rozwojem czerniaka.
Wnioski
- Metoda pozwala na szczegółowe badania nad inicjacją czerniaka.
- Kontrola nad aktywacją komórek macierzystych jest kluczowa dla badań.
- To podejście może prowadzić do nowych wglądów w biologię czerniaka.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Spatial and temporal control of melanoma initiation in murine models enables precise interrogation of early oncogenic events in melanocyte stem cells. This capability supports mechanistic de-risking and target validation at the earliest inflection point in melanoma discovery. The approach enhances predictive confidence for translational research and portfolio triage in oncology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables controlled induction of oncogenic transformation in melanocyte stem cells for hypothesis-driven studies.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating the effects of specific genetic and environmental triggers.
- Supports functional target validation by linking stem cell activation states to tumor initiation outcomes.
- Provides a platform for evaluating early intervention strategies in melanoma prevention.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible in vivo systems for downstream screening of preventative or therapeutic agents.
- Standardizes biological activation states, improving assay comparability and quantitative output reliability.
- Enables scalability for compound evaluation by synchronizing tumor initiation events across cohorts.
- Supports development of robust readouts for early-stage melanoma biomarkers.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant initiation mechanisms observed in human melanoma.
- Facilitates continuity from discovery through preclinical validation by modeling early tumorigenic events.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on mechanistic insights into tumor initiation.
- Supports identification of translational biomarkers linked to stem cell activation and melanoma onset.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and preclinical research, bridging target validation and lead identification for melanoma therapeutics.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing on the role of stem cell activation in melanoma initiation.
- Screening: Delivers standardized, reproducible models for quantitative assessment of intervention efficacy.
- Analytics: Enables measurement of tumor initiation frequency, pigmentation changes, and spatial distribution of lesions.
- Translational Research: Connects early mechanistic events to potential clinical biomarkers and intervention points.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable in vivo system for diverse mechanistic and therapeutic studies in melanoma research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in melanoma initiation studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of in vivo tumor initiation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling early biological risk assessment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of melanoma prevention and intervention programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine handling, stem cell biology, and in vivo tumor modeling.
- Demands access to UV-B irradiation equipment and precise dosing protocols for reproducibility.
- Necessitates cross-team standardization of depilation and irradiation procedures for data comparability.
- Adaptation to other skin regions or genetic backgrounds may require protocol optimization.
- Optimization of UV-B dose and timing is critical to avoid confounding effects on melanocyte activity.
