Name: Przestrzenna i czasowa kontrola inicjacji czerniaka myszy ze zmutowanych komórek macierzystych melanocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Poznaj metodę przestrzennej i czasowej kontroli inicjacji czerniaka u myszy poprzez aktywację zmutowanych komórek macierzystych melanocytów. Protokół umożliwia badanie wczesnych etapów rozwoju nowotworu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Biuro Asystenta Sekretarza Obrony ds. Zdrowia, poprzez Peer Reviewed Cancer Research Program pod nagrodą W81XWH-16-1-0272. Opinie, interpretacje, wnioski i zalecenia są opiniami autorów i niekoniecznie są zatwierdzone przez Departament Obrony. Praca ta została również wsparta grantem zalążkowym z Cornell Stem Cell Program dla A.C. White'a. H. Moon był wspierany przez Cornell Center for Vertebrate Genomics Scholar Program.

Wszystkie procedury na zwierzętach są wykonywane zgodnie z Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Cornell (IACUC).
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Zebrać klipsy ogonowe od myszy 12 dni po urodzeniu i trawić w 400 μl 0,05 N NaOH w temperaturze 95 °C przez 1 godzinę. Zwirować i dodać 32 μl 1 M Tris-HCl, pH 7. Genotyp myszy zgodnie z protokołami PCR dostarczonymi przez Jackson Laboratory i identyfikuj myszy z genotypem będącym przedmiotem zainteresowania6. 
	- Tyr-CreER – hemizygotyczny (+/CreER) 
	- LSL-BrafV600E – heterozygotyczny (+/LSL-V600E) 
	- Pten – flox homozygotyczny (flox/flox) 
	- LSL-tdPomidor – półmizygotyczny (+/LSL-tdTomato) 
	nuta: Sekwencje podkładowe znajdują się w tabeli materiałów.</li>
	<li>Użyj maszynki do strzyżenia włosów (trymera elektrycznego), aby ogolić skórę grzbietową 2 do 3 dni przed wszystkimi eksperymentami opisanymi poniżej oraz gdy myszy mają około 7 tygodni. Uważaj, aby nie uszkodzić cienkiej skóry myszy za pomocą trymera elektrycznego, ponieważ każdy uraz może wywołać reakcję gojenia się rany, która aktywuje komórki macierzyste mieszków włosowych, w tym MCSC.</li>
	<li>Określ, czy cykl włosa jest w telogenie i czy skóra jest zraniona w okresie oczekiwania. Jeśli skóra wykazuje jakiekolwiek oznaki urazu, mysz nie powinna być używana do tych zabiegów. 
	nuta: Chociaż cykl włosa może się nieznacznie różnić w zależności od podłoża genetycznego, w tym wieku cykl włosa w skórze grzbietowej jest zwykle w stanie telogenu11. Transgen Tyr-CreER będzie ukierunkowany na MCSC w skórze telogenowej, a późniejsze zmiany genetyczne ulegną trwałej ekspresji we wszystkich liniach MCSC, w tym w zróżnicowanych melanocytach i guzach melanocytowych.</li>
</ol>
2. Leczenie tamoksyfenem w rekombinacji genetycznej Cre-Lox
<ol>
	<li>Przygotowanie tamoksyfenu do wstrzyknięcia dootrzewnowego (IP) lub do podania miejscowego w celu ogólnoustrojowej lub miejscowej rekombinacji genetycznej 
	nuta: Aby tamoksyfen indukował rekombinację, musi najpierw zostać zmetabolizowany przez wątrobę do 4-hydroksytamoksyfenu (4-OHT), który może wiązać się i aktywować CreER. Miejscowe stosowanie tamoksyfenu nie będzie metabolizowane w ten sposób i 4-OHT musi być stosowany bezpośrednio. Do wystarczającej rekombinacji wymagana jest tylko jedna metoda podawania tamoksyfenu.
	<ol>
		<li>Tamoksyfen: Przygotować tamoksyfen w stężeniu 10 mg mL-1 rozpuszczony w oleju kukurydzianym. Aby pomóc w rozpuszczeniu leku w roztworze, dodaj do 10% całkowitej objętości 100% etanolu klasy cząsteczkowej do leku w postaci proszku, wiruj przez 3 minuty, a następnie dodaj pozostałą objętość oleju kukurydzianego. Kontynuuj wirowanie, aż materiał krystaliczny przestanie być widoczny w roztworze. Roztwór tamoksyfenu można sterylizować, przepuszczając przez filtr 0,2 μm. Przejdź do kroku 2.2.1 dotyczącego leczenia.</li>
		<li>4-OHT: Przygotować roztwór podstawowy hydroksytamoksyfenu do 3 mg mL-1 w 100% etanolu. Następnie roztwór roboczy można nałożyć tyle, ile potrzeba, aby pokryć obszar skóry (zwykle jednorazowa aplikacja). 
		nuta: Roztwór podstawowy hydroksytamoksyfenu można rozpuścić w 100% etanolu do końcowego stężenia 5 mM. Następnie, aby przygotować roztwór roboczy, 5 μl roztworu podstawowego 4OH-tamoksyfenu można rozcieńczyć na 15 μl 100% etanolu. W przypadku obszaru 4mm2 można stosować miejscowo od 1 do 3 μl roztworu roboczego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie myszy tamoksyfenem ogólnoustrojowo lub miejscowo 
	<ol>
		<li>W leczeniu ogólnoustrojowym należy podawać 2 mg tamoksyfenu we wstrzyknięciu IP raz na dobę przez 3 dni za pomocą igły 26 G. 
		nuta: Korzystając z tego modelu, około 93% ± 4% spokojnych MCSC jest oznaczonych tagiem tdTomato6.</li>
		<li>W celu aktywacji regionalnej należy wykonać jeden zabieg miejscowy z użyciem 4-OHT. Przykryj obszar skóry interesujący Cię roztworem roboczym. Ilość roztworu roboczego można określić na podstawie wielkości obszaru zainteresowania, jak opisano w kroku 2.1.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 48 godzinach od podania ostatniej dawki tamoksyfenu należy przejść do etapu 3 w przypadku inicjacji guza wywołanej depilacją chemiczną lub do etapu 4 w przypadku inicjacji guza wywołanej promieniowaniem UV-B</li>
</ol>
3. Depilacja chemiczna
<ol>
	<li>Wyposaż gabinet zabiegowy na myszach zawierający system izofluranu w następujące wymagane materiały: krem do depilacji, waciki, ściereczkę papierową i wodę.</li>
	<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej i znieczulenie 3,5 do 4,5% izofluranem i 1 l/min tlenu.</li>
	<li>Gdy częstość oddechów się ustabilizuje, upewnij się, że mysz znajduje się we właściwej płaszczyźnie znieczulenia, wykonując uszczypnięcie palca u nogi i przenieś mysz do głównej rurki, utrzymując znieczulenie za pomocą 1 do 1,5% izofluranu i 1 l / min tlenu. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu pod narkozą.</li>
	<li>Użyj bawełnianego wacika, aby nałożyć cienką warstwę kremu do depilacji na ogolony obszar skóry myszy.</li>
	<li>Po równomiernym nałożeniu kremu użyj czystych bawełnianych wacików, aby rozpocząć usuwanie. Łączny czas kontaktu kremu ze skórą nie powinien przekraczać 1 minuty.</li>
	<li>Delikatnie przetrzyj skórę wilgotną papierową szmatką i upewnij się, że wszelkie resztki kremu zostały usunięte. 
	nuta: Krem do depilacji może powodować podrażnienie skóry, jeśli nie zostanie całkowicie usunięty. Niektóre myszy, takie jak te na tle C57BL/6, mogą być podatne na rozwój zapalenia skóry12. Chociaż rzadko, u niektórych zwierząt zapalenie skóry rozwija się w ciągu 24 godzin po nałożeniu kremu do depilacji lub depilacji mechanicznej. Pamiętaj, aby sprawdzić myszy dzień po zabiegu, aby poszukać oznak regionalnego podrażnienia skóry.</li>
	<li>Wyrzuć usunięte łodygi włosów i wszelkie użyte materiały do kosza na zagrożenia biologiczne.</li>
	<li>Umieść mysz w pustej, czystej klatce dla myszy, aż znieczulenie ustąpi.</li>
	<li>Wróć myszy do ich klatek.</li>
</ol>
4. Naświetlanie UV-B
<ol>
	<li>Wyposaż gabinet zabiegowy na myszy zawierający system izofluranu w następujące wymagane materiały: system światła UV-B, światłomierz UV-B, pokrowiec ochronny dla myszy, dodatkowe środki ochrony osobistej UV-B dla badacza oraz timer.</li>
	<li>Myszy należy naświetlać dawką UV-B będącą przedmiotem zainteresowania (tj. 0-180 mJ/cm2). Użyj światłomierza UV-B, aby określić odpowiedni czas naświetlania myszy. 
	UWAGA: mW/cm2 x czas = dawka</li>
	<li>Znieczulij mysz izofluranem. W komorze indukcyjnej należy użyć od 3,5 do 4,5% izofluranu i 1 l/min tlenu.</li>
	<li>Po ustabilizowaniu myszy potwierdź efekty znieczulenia szczyptą palca u nogi i przenieś mysz do głównej rurki anestezjologicznej znajdującej się w komorze UV. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu pod narkozą. Utrzymuj znieczulenie za pomocą 1 do 1,5% izofluranu i 1 l/min tlenu.</li>
	<li>Przykryj skórę grzbietową materiałem ochronnym UV-B, tak aby odsłonięty był tylko żądany obszar. 
	nuta: W tym czasie należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. Czas potrzebny do naświetlania myszy zależy od intensywności użytej żarówki, ale znieczulenie może wymagać monitorowania, jeśli wymagany czas przekracza 30 s. </li>
	<li>Przykryj komorę UV pokrywką odporną na promieniowanie UV lub innymi odpowiednimi materiałami.</li>
	<li>Włącz lampę UV-B i naświetlaj mysz przez czas określony przez badaczy dla konkretnego celu.</li>
	<li>Wyłącz system UV i izofluran, a następnie umieść mysz w pustej klatce dla myszy, aż znieczulenie ustąpi.</li>
	<li>Wróć myszy do ich klatek.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie tkanek
<ol>
	<li>Izolacja skóry
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem należy zaopatrzyć się w następujące materiały: narzędzia do sekcji zwłok, bibułę filtracyjną i ręczniki papierowe.</li>
		<li>Poddaj myszy eutanazji zgodnie z zatwierdzonymi przez IACUC protokołami i potwierdź śmierć przed kontynuacją.</li>
		<li>Za pomocą maszynki do strzyżenia włosów zgol włosy z grzbietowej części skóry. Delikatnie przeczesz obszar niestrzępiącą się chusteczką, aby oczyścić obszar.</li>
		<li>Wykonaj małe nacięcie ostrymi nożyczkami tuż nad podstawą ogona.</li>
		<li>Włóż duże nożyczki do nacięcia i oddziel podskórne tkanki łączne.</li>
		<li>Ostrożnie odizoluj obszar skóry, który Cię interesuje, przecinając ostrymi nożyczkami wzdłuż krawędzi tkanki.</li>
		<li>Umieść tkankę skórną na czystym ręczniku papierowym i za pomocą kleszczy rozciągnij skórę, aby przylegała do ręcznika i była nauczona. Ten krok służy zapewnieniu dodatkowego wsparcia dla tkanki, aby można było nią manipulować i przetwarzać przy zachowaniu jej kształtu. 
		nuta: Należy uważać, aby dotykać tylko zewnętrznych obszarów tkanki skórnej, ponieważ kleszcze mogą spowodować uszkodzenie skóry, które można zobaczyć histologicznie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalanie tkanek
	<ol>
		<li>Złóż kawałek bibuły filtracyjnej na pół i odpowiednio oznacz. Umieść skórę wraz z podkładem ręcznika papierowego w złożonym papierze bezpośrednio przylegającym do zagięcia, upewniając się, że próbka jest gładka i nie jest pofałdowana ani pognieciona. Uszczelnij bibułę filtracyjną, zszywając otwarte boki, a następnie przytnij, aby pozostała bibuła mogła być wykorzystana do przyszłych próbek. 
		nuta: Ten krok jest wykonywany tak, aby skóra zachowała swój kształt podczas utrwalania.</li>
		<li>Całkowicie zanurzyć próbkę tkanki w 10% obojętnej buforowanej formalinie na 3 do 5 godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Po utrwaleniu wyjmij próbki z formaliny, umyj w wodzie dejonizowanej (2x, 5 min każda) i przystąp do wykonywania bloków tkankowych. Ostrożnie usuń wszelkie resztki materiału z tkanki skórnej (tj. resztki papieru).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzenie zamrożonych bloków tkanek (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
	<ol>
		<li>Przytnij krawędzie próbki skóry tak, aby nie były postrzępione, a następnie wykonaj 3 strzałkowe nacięcia. Szerokość tych pasków nie powinna być większa niż wysokość kriomoldu (5 mm). Następnie należy wykonać nacięcia poprzeczne, aby uzyskać kawałki skóry, które nie są dłuższe niż szerokość kriomoldu (20 mm) i mogą być osadzone. Powtórz z pozostałą połową skóry grzbietowej lub zachowaj tkankę do innych zastosowań (alternatywnie, zachowaj połowę przed utrwaleniem). 
		nuta: Ważne jest, aby utrzymać kawałki skóry we właściwej orientacji.</li>
		<li>Ustaw kriomold (25 x 20 x 5 mm3) w orientacji pionowej i umieść 4 do 5 kawałków skóry na wierzchu OCT. Gdy wszystkie elementy znajdą się na swoim miejscu, użyj 2 par cienkich kleszczy, aby przyłożyć długą krawędź skóry do dna krioformy. Skóra powinna teraz stać w OCT prostopadle do podstawy formy. Na tym etapie należy zwrócić uwagę, aby zminimalizować tworzenie się kieszeni powietrznych w OCT (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
		<li>Napełnij formę OCT do drugiej wargi i umieść na płaskiej powierzchni suchego lodu. Użyj kleszczy, aby dostosować wszelkie kawałki skóry, które mogły się przesunąć podczas przenoszenia, gdy blok zaczyna zamarzać. Po zestaleniu się dolnej warstwy manipulacja tkankami będzie niemożliwa.</li>
		<li>Wytnij szkiełka o grubości 8-10 μm do analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie bloków tkankowych zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE)
	<ol>
		<li>Umieść 2 kawałki utrwalonej skóry w oznakowanej kasecie i odwodnij w rosnących stężeniach etanolu (75% etanolu przez 30 min, 85% przez 30 min, 90% przez 30 min, 95% przez 30 min, 100% przez 2x 30 min, ksylen lub substytut ksylenu przez 2x 30 min). Inkubować z parafiną w temperaturze 58-60°, najpierw przez 30 minut, a następnie przez noc.</li>
		<li>Zanurzyć tkankę w formie do tkanek ze stali nierdzewnej o wymiarach 24 x 24mm2 z ciekłą parafiną i zestalić w temperaturze -5 °C. Orientacja tkanki powinna być podobna do orientacji zamrożonych bloków tkankowych, tak aby można było uwidocznić podłużne odcinki w poprzek wielu mieszków włosowych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
		<li>Gdy parafina zastygnie, wyjmij formę i pokrój na odcinki 5-10 μm do analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+skin+cancer+in+adults%3A+updated+evidence+report+and+systematic+review+for+the+US+preventive+services+task+force%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force.</a> The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2018%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li>
<li>White, A. C., Lowry, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+the+role+for+adult+stem+cells+as+cancer+cells+of+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Refining the role for adult stem cells as cancer cells of origin.</a> Trends in Cell Biology. 25 (1), 11-20 (2015).</li>
<li>Moon, H., Donahue, L. R., White, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+cancer+cells+of+origin+in+cutaneous+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Understanding cancer cells of origin in cutaneous tumors.</a> Cancer Stem Cells. , 263-284 (2016).</li>
<li>Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+cellular+origin+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracing the cellular origin of cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (2), 126-134 (2013).</li>
<li>Moon, H., Donahue, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocyte+stem+cell+activation+and+translocation+initiate+cutaneous+melanoma+in+response+to+UV+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).</li>
<li>Moon, H., White, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+path+from+melanocyte+stem+cells+to+cutaneous+melanoma+illuminated+by+UVB%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">A path from melanocyte stem cells to cutaneous melanoma illuminated by UVB.</a> Molecular & Cellular Oncology. 5 (2), e1409864(2018).</li>
<li>Rabbani, P., Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+activation+of+Wnt+in+epithelial+and+melanocyte+stem+cells+initiates+pigmented+hair+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coordinated activation of Wnt in epithelial and melanocyte stem cells initiates pigmented hair regeneration.</a> Cell. 145 (6), 941-955 (2011).</li>
<li>Chou, W. C., Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+migration+of+follicular+melanocyte+stem+cells+to+the+epidermis+after+wounding+or+UVB+irradiation+is+dependent+on+Mc1r+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Direct migration of follicular melanocyte stem cells to the epidermis after wounding or UVB irradiation is dependent on Mc1r signaling.</a> Nature Medicine. 19 (7), 924-929 (2013).</li>
<li>Keyes, B. E., Segal, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nfatc1+orchestrates+aging+in+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nfatc1 orchestrates aging in hair follicle stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (51), E4950-9 (2013).</li>
<li>Müller-Röver, S., Handjiski, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+guide+for+the+accurate+classification+of+murine+hair+follicles+in+distinct+hair+cycle+stages%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 117 (1), 3-15 (2001).</li>
<li>Kastenmayer, R. J., Fain, M. A., Perdue, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retrospective+study+of+idiopathic+ulcerative+dermatitis+in+mice+with+a+C57BL%2F6+background%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%E2%80%AF%3A+JAALAS%22%5BJournal%5D)">A retrospective study of idiopathic ulcerative dermatitis in mice with a C57BL/6 background.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 45 (6), 8-12 (2006).</li>
<li>Vultur, A., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: melanoma.</a> Cancer Cell. 23 (5), 706-706.e1 (2013).</li>
<li>Dankort, D., Curley, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Braf%28V600E%29+cooperates+with+Pten+loss+to+induce+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma.</a> Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).</li>
<li>Viros, A., Sanchez-Laorden, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+radiation+accelerates+BRAF-driven+melanomagenesis+by+targeting+TP53%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet radiation accelerates BRAF-driven melanomagenesis by targeting TP53.</a> Nature. 511 (7510), 478-482 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Charakterystyczne zmiany genetyczne często występujące w nowotworach czerniaka skóry zostały dobrze opisane13. Najbardziej dominującą mutacją jest BrafV600E, a genetycznie zmodyfikowany mysi model czerniaka za pośrednictwem BrafV600E został wygenerowany przez grupęBosenberga 14 i zdeponowany w Jackson Laboratory. Korzystając z tego modelu mysiego, nasze ostatnie badanie wykazało wymóg aktywacji komórkowej MCSC podatnych na nowotwór w ...

Czerniak, złośliwa forma guzów melanocytowych, jest najbardziej agresywnym nowotworem skóry, a czerniak skóry jest odpowiedzialny za większość zgonów z powodu raka skóry1. W Stanach Zjednoczonych czerniak jest powszechnie diagnozowany; Przewiduje się, że będzie to 5. do 6. najczęściej występujący typ raka wśród szacowanych nowych przypadków raka w 2018 r. <Klasa SUP="xref">2. Ponadto, podczas gdy ogólna zachorowalność na raka wykazywała tendencję do stopniowego zmniejszania się w ostatnich dziesięcioleciach, wskaźniki zachorowalności na czerniaka skóry w ciągu ostatnich kilku dekad wykazują ciągły i szybki wzrost u obu płci2.
Aby skuteczniej zwalczać czerniaka skóry, ważne jest jasne zrozumienie wczesnych etapów rozwoju czerniaka na podstawie komórek ich pochodzenia, aby lepiej zidentyfikować klinicznie skuteczne metody prewencji. Obecnie wiadomo, że dorosłe komórki macierzyste mogą znacząco przyczyniać się do powstawania nowotworów jako komórkowe pochodzenie nowotworów w wielu różnych typach narządów, w tym w tkankach skóry3,4,5. Podobnie, dorosłe komórki macierzyste melanocytów (MCSC) w mysiej skórze grzbietowej mogą działać jako komórki czerniaka pochodzenia po nieprawidłowej aktywacji szlaków Ras/Raf i Akt6. Jednak same te onkogenne mutacje nie są w stanie skutecznie indukować powstawania guza ze spoczynkowych MCSC. Guzy melanocytowe ostatecznie rozwijają się, gdy MCSC stają się aktywne podczas naturalnego cyklu włosowego. Jednak w tym protokole opiszemy metody sztucznego wywoływania aktywacji komórkowej MCSC podatnych na nowotwory, ułatwiając w ten sposób precyzyjną kontrolę inicjacji czerniaka6,7.
Dzięki opisanym tutaj metodom, przestrzenna i czasowa kontrola inicjacji czerniaka skóry z podatnych na nowotwory MCSC wykazujących ekspresję onkogennego BrafV600E wraz z utratą ekspresji Pten może być pomyślnie przeprowadzona, jak już wcześniej informowaliśmy6. Metoda ta uwzględnia wcześniejsze odkrycia, które pokazują aktywację komórek macierzystych mieszków włosowych poprzez depilację, a także to, w jaki sposób ekspozycja mysiej skóry na promieniowanie UV-B może ułatwić aktywację MCSC rezydujących w mieszku włosowym i translokację tej subpopulacji komórkowej do naskórka międzymieszkowego6,8,9,10. Te systemy modelowe in vivo mogą dostarczyć cennych informacji na temat tego, w jaki sposób zmiany fizjologiczne i środowiskowe mogą zmieniać status komórkowy MCSC podatnych na czerniaka, co z kolei może wywołać znaczną inicjację czerniaka w skórze.

<table><tbody><tr><td>Tamoksyfen</td><td>Sigma</td><td>T5648-1G</td><td>Do wstrzykiwań ogólnoustrojowych</td></tr><tr><td>Tamoksyfen</td><td>Cayman Chemical</td><td>13258</td><td>Do wstrzykiwań ogólnoustrojowych</td></tr><tr><td>Olej kukurydziany</td><td>Sigma</td><td>45-C8267-2.5L-EA</td><td></td></tr><tr><td>4OH-tamoksyfen</td><td>Sigma</td><td>H7904-25MG</td><td>Do leczenia miejscowego</td></tr><tr><td>26 G 1/2</td>" <td>igły różne</td><td></td><td>klasy weterynaryjnej</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maszynka do strzyżenia włosów zwierząt</td> weterynaryjnych <td>Wahl</td><td>09990-502</td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Nair</td><td>n/a</td><td>Dostępne w większości aptek</td></tr><tr><td>Waciki bawełniane</td><td>różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żarówka ultrafioletowa</td><td>UVP</td><td>95-0042-08</td><td>model XX-15M średniej klasy lampa UV</td></tr><tr><td>200 proof etanol</td><td>różne</td><td></td><td>czysty etanol</td></tr><tr><td>Histoplast PE</td><td>Fisher Scientific</td><td>22900700</td><td>pelety parafinowe</td></tr><tr><td>Neutralna buforowana formalina, 10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Thermo Scientific</td><td>6901</td><td>substytut ksylenu</td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>Thermo</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta na tkanki</td><td>Sakura</td><td>89199-430</td><td>do Przetwarzanie FFPE</td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Sakura</td><td>4557</td><td>25 x 20 mm</td></tr><tr><td>Metalowa forma FFPE</td><td>Leica</td><td>3803082</td><td>24 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>różne</td><td></td><td>Weterynaryjny</td></tr><tr><td>system inhalacyjny do znieczulenia</td><td>różne</td><td></td><td>Klasa weterynaryjna</td></tr><tr><td>Drobne nożyczki</td><td>FST</td><td>14085-09</td><td>Proste, ostre/ostre</td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki</td><td>FST</td><td>14558-09</td><td>Prosty, ostry/ostry</td></tr><tr><td>Metzenbaum</td><td>FST</td><td>14018-13</td><td>Prosty,/</td></tr><tr><td>Kleszcz</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Kleszcz</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td>Micro-Adson</td></tr><tr><td>Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f</td><td>Jackson Labs</td><td>13590</td><td></td></tr><tr><td>LSL-tdTomato</td><td>Jackson Labs</td><td>007914</td><td>ai14</td></tr><tr><td>Cre-1</td><td></td><td>n/a</td><td>GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG</td></tr><tr><td>Cre-2</td><td></td><td>n/a</td><td>GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG</td></tr><tr><td>Braf-V600E-1</td><td></td><td>n/a</td><td>TGAGTATTTTTGGCAACTGC</td></tr><tr><td>Biustonosz V600E-2</td><td></td><td>n/a</td><td>CTCTGCTGGGAAAGCGGC</td></tr><tr><td>Kras-G12D-1</td><td></td><td>n/a</td><td>AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA</td></tr><tr><td>Kras-G12D-2</td><td></td><td>n/a</td><td>CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA</td></tr><tr><td>Pten-1</td><td></td><td>n/a</td><td>ACTCAAGGCAGGGATGAGC</td></tr><tr><td>Pten-2</td><td></td><td>n/a</td><td>AATCTAGGGTCTCTTGTGCC</td></tr><tr><td>Pten-3</td><td></td><td>n/a</td><td>GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC</td></tr><tr><td>tdTomato-1</td><td></td><td>n/a</td><td>AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA</td></tr><tr><td>tdTomato-2</td><td></td><td>n/a</td><td>CCGAAAATCTGTGGGAAGTC</td></tr><tr><td>tdTomato-3</td><td></td><td>n/a</td><td>GGCATTAAAGCAGCGTATCC</td></tr><tr><td>tdTomato-4</td><td></td><td>n/a</td><td>CTGTTCCTGTACGGCATGG</td></tr></tbody></table>

przestrzenna i czasowa kontrola inicjacji czerniaka myszy ze zmutowanych komórek macierzystych melanocytów

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Czerniak skóry jest dobrze znany jako najbardziej agresywny rak skóry. Chociaż czynniki ryzyka i poważne zmiany genetyczne są nadal dokumentowane z coraz większą głębią, częstość występowania czerniaka skóry wykazała szybki i ciągły wzrost w ostatnich dziesięcioleciach. Aby znaleźć skuteczne metody zapobiegawcze, ważne jest zrozumienie wczesnych etapów inicjacji czerniaka w skórze. Wcześniejsze dane wykazały, że komórki macierzyste melanocytów pęcherzykowych (MCSC) w dorosłych tkankach skóry mogą działać jako komórki czerniaka w przypadku ekspresji mutacji onkogennych i zmian genetycznych. Nowotworzenie wynikające z MCSC podatnych na czerniaka może być indukowane, gdy MCSC przechodzą ze stanu spoczynku do stanu aktywnego. To przejście w MCSC podatnych na czerniaka może być promowane przez modulację stanu aktywności komórek macierzystych mieszków włosowych lub przez zewnętrzne czynniki środowiskowe, takie jak ultrafiolet B (UV-B). Czynniki te mogą być sztucznie manipulowane w laboratorium poprzez depilację chemiczną, która powoduje przejście komórek macierzystych mieszków włosowych i MCSC ze stanu spoczynku do stanu aktywnego, oraz poprzez ekspozycję na promieniowanie UV-B przy użyciu światła laboratoryjnego. Metody te zapewniają skuteczną kontrolę przestrzenną i czasową inicjacji czerniaka skóry w mysiej skórze grzbietowej. W związku z tym te systemy modelowe in vivo będą cenne dla zdefiniowania wczesnych etapów inicjacji czerniaka skóry i mogą być wykorzystane do testowania potencjalnych metod zapobiegania nowotworom.

Inicjacja czerniaka skóry indukowana chemiczną depilacją
Procedura depilacji chemicznej przedstawiona jest na Rysunku 2. Gdy myszy osiągają wiek 7 tygodni, ich skóra grzbietowa znajduje się w fazie telogenu. Podczas telogenu komórki macierzyste mieszków włosowych oraz MCSCs pozostają w stanie spoczynku (quiescent state). Po goleniu na skórze nie powinno być widocznego znaczącego wzr...

Poniższa procedura opisuje metodę przestrzennej i czasowej kontroli inicjacji guza melanocytowego w skórze grzbietowej myszy, przy użyciu genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy. Protokół ten opisuje makroskopową i mikroskopową inicjację czerniaka skóry.

Przestrzenna i czasowa kontrola inicjacji czerniaka myszy ze zmutowanych komórek macierzystych melanocytów

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Czerniak jest powszechnie diagnozowany na całym świecie, z coraz częstszą częstością. Protokoły te pozwalają na dokładne kontrolowanie wczesnych etapów inicjacji czerniaka, co ułatwia badanie jego rozwoju. Kontrolując czas i miejsce aktywacji komórek macierzystych melanocytów, mamy możliwość dostrzeżenia zmian w populacji komórek macierzystych i inicjacji nowego szczepu czerniaka.Procedurę zademonstrują Dahihm Kim i Luye An, absolwenci laboratorium. Dwa do trzech dni przed rozpoczęciem zabiegu użyj elektrycznego trymera, aby ogolić skórę grzbietową każdej znieczulonej siedmiotygodniowej myszy. W dniu eksperymentu za pomocą bawełnianego wacika nałóż cienką warstwę kremu do depilacji na odsłoniętą skórę.Po równomiernym nałożeniu kremu użyj czystych bawełnianych wacików, aby usunąć krem, a następnie delikatnie przetrzyj wilgotną szmatką, aby usunąć resztki kremu. Następnie przywróć każdą mysz do jej klatki domowej z monitorowaniem aż do pełnego odzyskania sprawności. W przypadku naświetlania promieniowaniem UV-B należy przykryć skórę grzbietową materiałem ochronnym UV-B, tak aby odsłonięty był tylko pożądany obszar, a komorę UV przykryć pokrywą odporną na promieniowanie UV.Następnie włącz lampę UV-B, aby naświetlić mysz przez odpowiedni okres czasu eksperymentalnego przed powrotem myszy do pustej klatki z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia. Aby wyizolować próbki skóry, użyj elektrycznego trymera, aby usunąć wszelkie włosy z grzbietowego obszaru skóry poddanych eutanazji napromieniowanych myszy i delikatnie wyszczotkuj odsłoniętą skórę niestrzępiącą się chusteczką, aby oczyścić obszar. Wykonaj małe nacięcie ostrymi nożyczkami tuż nad podstawą ogona i włóż duże, nożyczki do nacięcia, aby oddzielić podskórne tkanki łączne.Za pomocą ostrych nożyczek ostrożnie przeciąć wzdłuż krawędzi obszaru skóry będącego przedmiotem zainteresowania, aby wyizolować próbkę tkanki i umieścić wyciętą tkankę skórną na czystym ręczniku papierowym. Następnie użyj kleszczyków, aby rozciągnąć skórę tak, aby przylegała do ręcznika i była napięta. Po zebraniu wszystkich próbek należy umieścić próbkę skóry i podkład z ręcznika papierowego w kawałku złożonej bibuły filtracyjnej bezpośrednio przylegającej do zagięcia, uważając, aby próbka była gładka i nie była pofałdowana ani pognieciona.Zamknij boki bibuły filtracyjnej zszywkami i przytnij bibułę. Następnie całkowicie zanurz próbki w 10% neutralnej buforowanej formalinie na trzy do pięciu godzin w temperaturze pokojowej, a następnie umyj tkanki dwoma pięciominutowymi płukaniami w wodzie dejonizowanej. Po drugim przemyciu ostrożnie usunąć wszelkie pozostałości materiału z tkanek skóry i przyciąć krawędzie próbek tak, aby nie były postrzępione.Następnie wykonaj trzy nacięcia strzałkowe w każdej próbce, tak aby szerokość pasków nie przekraczała pięciu milimetrów, i wykonaj cięcia poprzeczne, aby próbki nie miały więcej niż 20 milimetrów szerokości. Umieść formę kriogeniczną zawierającą optymalną temperaturę cięcia lub medium OCT w orientacji pionowej i umieść cztery do pięciu kawałków skóry na wierzchu OCT. Gdy wszystkie kawałki są na swoim miejscu, użyj dwóch par cienkich kleszczy, aby przysunąć długą krawędź każdego kawałka skóry do dna formy kriogenicznej, tak aby próbki były pionowe w OCT i prostopadłe do podstawy formy.Następnie napełnij formę dodatkowym OCT do drugiej wargi i umieść formę na płaskiej powierzchni kawałka suchego lodu, używając kleszczyków do regulacji wszelkich kawałków skóry, które mogły się przesunąć podczas przenoszenia, gdy blok zaczyna zamarzać w razie potrzeby. Kiedy myszy są siedem tygodni po porodzie, ich skóra grzbietowa jest w telogenie. Podczas telogenu wiadomo, że mieszki włosowe i komórki macierzyste melanocytów znajdują się w stanie spoczynku, a skóra po goleniu nie powinna wykazywać znaczącego wzrostu włosów.Depilacja chemiczna może jednak wywołać aktywację komórek macierzystych mieszków włosowych, wywołując znaczny wzrost włosów w obszarze zainteresowania. Ponieważ depilacja chemiczna może znacząco wywołać aktywację zarówno komórek macierzystych mieszków włosowych, jak i melanocytów, komórki macierzyste melanocytów podatne na czerniaka w stanie aktywnym mogą tworzyć guzy, a mikroskopijną inicjację czerniaka można zaobserwować w ciągu dwóch tygodni od depilacji chemicznej. Promieniowanie UV-B może również indukować inicjację guza ze spoczynkowych, podatnych na nowotwór komórek macierzystych melanocytów.Co ważne, UV-B indukuje bezpośrednią translokację komórek macierzystych melanocytów z ich niszy pęcherzykowych komórek macierzystych do naskórka międzymieszkowego. Ponadto promieniowanie UV-B może indukować powstawanie czerniaka skóry pochodzącego z komórek macierzystych melanocytów w całym naskórku międzymieszkowym. Podobnie jak w przypadku skóry grzbietowej, inicjację czerniaka wywołaną promieniowaniem UV-B można zaobserwować w innych obszarach skóry, takich jak skóra uszu.Rzeczywiście, w porównaniu ze skórą ucha kontrolną, pokrytą tkaniną odporną na promieniowanie UV, skóra uszu wystawiona na działanie promieniowania UV-B wykazuje wyższą pigmentację ze względu na większe obciążenie inicjacją czerniaka. Różne dawki UV-B mogą mieć różny wpływ na skórę myszy i aktywność melanocytów. Dlatego ważne jest, aby określić i zoptymalizować dawkę promieniowania przed rozpoczęciem eksperymentu.

spatial-temporal-control-murine-melanoma-initiation-from-mutant

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W niniejszym protokole zidentyfikowaliśmy nową populację komórek melanocytopodobnych (znanych również jako melanocyty serca) w sercach myszy i ludzi, które przyczyniają się do wyzwalania arytmii przedsionkowej u...

Izolowanie pierwotnych komórek melanocytopodobnych z serca myszy

W tym filmie komórki czerniaka pochodzenia ludzkiego są wszczepiane podskórnie w obszar boczny myszy z obniżoną odpornością. Model PDX umożliwia przedkliniczne badanie komórek czerniaka, które lepiej oddaje niejednorodność guza i agresywność czerniaka obserwowane w warunkach in vivo.

Modelowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta: technika generowania mysich modeli czerniaka

Melanina naskórkowa jest indukowana przez miejscowe stosowanie forskoliny w mysim modelu człowieka o jasnej karnacji, wrażliwego na promieniowanie UV.    Farmakologiczna manipulacja poziomami cAMP w skórze i ciemnienie naskórka silnie chronią przed stanem zapalnym o podłożu UV (oparzenia słoneczne), mierzonym za pomocą testu minimalnej dawki rumieniowej (MED).

Farmakologiczna indukcja melaniny naskórka i ochrona przed oparzeniami słonecznymi w humanizowanym modelu myszy

Opisujemy sekcję i hodowlę ex vivo skóry embrionalnej myszy. System hodowli utrzymuje granicę faz powietrze-ciecz na powierzchni tkanki i umożliwia obrazowanie pod mikroskopem odwróconym. Melanoblasty, składnik rozwijającej się skóry, są znakowane fluorescencyjnie, co pozwala na obserwację ich zachowania za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Ex vivo Hodowla skóry embrionalnej myszy i obrazowanie na żywo migracji melanoblastów

Ta praca opisuje protokół różnicowania in vitro do produkcji pigmentowanych, dojrzałych melanocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą grzebienia nerwowego i etapu pośredniego melanoblastu przy użyciu 25-dniowego protokołu bez karmienia.

Bezkarmowe pozyskiwanie melanocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy protokół generowania 3D organotypowego modelu skóry czerniaka sferoidalnego, który podsumowuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządu/guza in vivo, ale jednocześnie uwzględnia systematyczną interwencję eksperymentalną.

Organotypowy model sferoidalny czerniaka 3D

Ten protokół przedstawia szybką metodę jednoczesnego generowania kultur melanocytów i fibroblastów ze skóry myszy w wieku 0-4 dni. Te pierwotne kultury mogą być utrzymywane i manipulowane in vitro w celu badania różnych fizjologicznie istotnych procesów, w tym biologii komórek skóry, pigmentacji, gojenia się ran i czerniaka.

Szybkie generowanie pierwotnych mysich kultur melanocytów i fibroblastów

Czerniak jest bardzo agresywną chorobą, która szybko rozprzestrzenia się na inne narządy. Protokół ten opisuje zastosowanie obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości, w połączeniu z renderowaniem 3D, do monitorowania objętości pachwinowych węzłów chłonnych w mysim modelu czerniaka z przerzutami Braf/Pten.

Analiza objętości węzłów chłonnych za pomocą obrazowania ultrasonograficznego o ultrawysokiej częstotliwości w genetycznie zmodyfikowanym mysim modelu czerniaka Braf/Pten

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system bezpośredniego przeprogramowania melanocytów oraz wysoce wydajny, skoncentrowany system pakowania wirusów, który zapewnia płynne bezpośrednie przeprogramowanie.

Bezpośrednie przeprogramowanie mysich fibroblastów w melanocyty

Ten artykuł opisuje przebieg techniki wykorzystywane do testowania nowych kandydatów na mediatory przerzutów czerniaka i ich mechanizm(y) działania.

Solidna platforma odkrywcza do identyfikacji nowych mediatorów przerzutów czerniaka

Niniejszy protokół opisuje implantację i ocenę czerniaka w mysim naczyniówce za pomocą optycznej koherentnej tomografii.

Implantacja i ocena czerniaka w mysim naczyniówce za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Poznaj metodę przestrzennej i czasowej kontroli inicjacji czerniaka u myszy poprzez aktywację zmutowanych komórek macierzystych melanocytów. Protokół umożliwia badanie wczesnych etapów rozwoju nowotworu.

Przestrzenna i czasowa kontrola inicjacji czerniaka myszy ze zmutowanych komórek macierzystych melanocytów

Przeglądaj więcej filmów