Solidny model mysiego zapalenia przyzębia indukowany ligaturą do oceny neutrofili jamy ustnej

Opisany tutaj protokół dostarcza badaczom metody badania doustnych neutrofili w zwierzęcym modelu choroby przyzębia wywołanym ligaturą w sposób analogiczny do uczestników ludzkich. Główną zaletą tej techniki jest zwiększona objętość tkanek dziąseł objętych stanem zapalnym dostępnych do późniejszej analizy, co zmniejsza wykorzystanie przez zwierzęta. Nasza zdolność do pobierania ligatur pokrytych biofilmem z okolic zębów pozwala na symulację skutecznego leczenia zlokalizowanej choroby przyzębia.

Zastosowanie tego modelu może być zastosowane w badaniu ogólnoustrojowych skutków zapalenia przyzębia w modelu zwierzęcym, ze względu na zwiększone obszary tkanek dziąseł objętych stanem zapalnym. Zdecydowanie zaleca się zapoznanie się z użyciem narzędzi mikrochirurgicznych i mikroskopów preparacyjnych, a także wiązanie węzłów chirurgicznych przed kontaktem z żywymi zwierzętami. Wizualna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie dla skrócenia długości krzywej uczenia się wymaganej do osiągnięcia biegłego umieszczania ligatur

Procedurę zademonstruje Jeff Chadwig, doktorant z mojego laboratorium. Zacznij od umieszczenia myszy na podgrzewanej platformie chirurgicznej. Po upewnieniu się, że mysz jest odpowiednio znieczulona, należy ustabilizować szczękę i żuchwę w pozycji otwartej za pomocą gumek.

Podeprzyj szyję bawełnianą rolką, aby utrzymać szczękę w pozycji poziomej i zakryj ciało i ogon, aby złagodzić utratę ciepła. Ustawić mikroskop chirurgiczny pod żądanym powiększeniem i oświetleniem w jamie ustnej. Użyj kleszczyków odłamkowych, aby zainstalować sterylny jedwabny szew pleciony o długości 50 lub mniejszej wokół zębów trzonowych szczęki M1 i M2 w bruździe dziąsłowej.

Umieść dystalny ogon szwu po stronie podniebienia uzębienia i włóż bliższy segment między kontaktem M2 i M3. Następnie owiń go wokół powierzchni policzkowej M2 i włóż między styk M1 i M2. Upewnij się, że oba końce szwu są mocno ściągnięte, aby wbić go w bruzdę dziąseł. Owiń proksymalny segment szwu wokół M1 poniżej jego wysokości konturu i włóż go między styk M1 i M2. Pociągnij mocno proksymalny ogon szwu, aby usunąć cały luz. Zawiąż końce szwu węzłem chirurgicznym i przytnij ogony tak dobrze, jak to możliwe.

Umieść węzeł w otworze dziąsła między M1 i M2 po stronie podniebienia uzębienia szczęki. Bardzo ważne jest, aby węzeł używany do mocowania ligatury był bezpieczny i znajdował się w pozycji, w której nie będzie podrażniał zwierzęcia ani nie przeszkadzał w żuciu. Po założeniu ligatury wyjmij mysz z aparatu chirurgicznego i umieść ją w czystej klatce pod lampą grzewczą, upewniając się, że monitorujesz ją do momentu całkowitego wyzdrowienia.

Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne w sterylizatorze z gorącymi szklanymi kulkami między każdym zwierzęciem. Indywidualnie umieść każdą mysz z odpowiednim wzbogaceniem środowiska i pozwól ad libitum na dostęp do przefiltrowanej wody i puree standardowej karmy w środowisku o kontrolowanej temperaturze i wilgotności przez siedem do 11 dni. Gdy będziesz gotowy do pobrania próbek, użyj pipety, aby przepłukać jamę ustną 100 mikrolitrami wysterylizowanego PBS o temperaturze czterech stopni Celsjusza bez wapnia i magnezu przez 10 sekund.

Powtórz płukanie jeszcze dwa razy, umieszczając każde płukanie w tej samej stożkowej sterylnej probówce o pojemności 15 mililitrów dla każdego zwierzęcia. Przeprowadź zawartość każdej 15-mililitrowej probówki przez 40-milimetrowy nylonowy filtr siatkowy do 50-mililitrowej stożkowej probówki i przenieś filtrat do nowej 15-mililitrowej probówki. Dodaj 33,3 mikrolitrów 16% paraformaldehydu, aby ułatwić utrwalenie próbki.

Natychmiast należy wymieszać próbki i inkubować je na lodzie przez 15 minut. Paraformaldehyd jest najbardziej niebezpiecznym odczynnikiem zastosowanym w protokole i należy się z nim obchodzić przy użyciu zalecanego sprzętu ochrony osobistej zalecanego przez producenta. Po inkubacji napełnij probówkę do 15 mililitrów PBS, a następnie odwiruj ją w temperaturze 1000 x g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.

Odessać supernatant, ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu FACS w temperaturze czterech stopni Celsjusza i policzyć komórki na hemocytometrze lub automatycznym liczniku komórek. Powtórzyć wirowanie i odessać supernatant. Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości buforu FACS dla końcowego stężenia 500 000 do 1 miliona komórek na 50 mikrolitrów buforu FACS i przenieść komórki do probówki FACS.

Dodać jeden mikrolitr surowicy szczura i dwa mikrolitry przeciwciała anty-mysiego IGG do 50 mikrolitrów próbki. Natychmiast należy zagłodzić próbkę i zablokować ją na lodzie na 20 minut. Następnie dodaj odpowiednie przeciwciała do każdej próbki.

Wiruj i inkubuj na lodzie przez 30 minut w ciemności. Po inkubacji umyć próbki jednym mililitrem buforu FACS, krótko wirować i wirować przez pięć minut w temperaturze 1000 x g i czterech stopniach Celsjusza. Zrzuć supernatant i delikatnie zablokuj otwarcie rurki FACS.

Powtórzyć płukanie dwukrotnie, a następnie ponownie zawiesić próbki w 250 mikrolitrach buforu FACS w celu przechowywania. Przykryj probówki folią parafinową, zawiń je w folię aluminiową i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będą gotowe do analizy. Cytometria przepływowa została wykorzystana do analizy neutrofili odzyskanych z płukania jamy ustnej od naiwnej myszy, a także płukania jamy ustnej i odzyskanej ligatury od myszy z zapaleniem przyzębia wywołanym podwiązaniem.

Aby ocenić ubytek kości wyrostka zębodołowego, zmierzono poziom kości wyrostka zębodołowego od grzebienia kości wyrostka zębodołowego do połączenia cementowo-szkliwnego u zdrowych i podwiązanych myszy. Następnie obliczono różnice w pomiarach. Chociaż nie jest to tutaj omawiane, w zależności od pytania badawczego można również przeprowadzić ocenę histopatologiczną, immunohistochemiczną i morfometryczną przyzębia i kości wyrostka zębodołowego.

Model ten jest obecnie używany w moim laboratorium do badania wpływu wrodzonego układu odpornościowego jamy ustnej na zdrowie i choroby ogólnoustrojowe.