Name: Solidny model mysiego zapalenia przyzębia indukowany ligaturą do oceny neutrofili jamy ustnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Poznaj model mysiego zapalenia przyzębia indukowany ligaturą do badania neutrofili jamy ustnej. Ta metoda zwiększa objętość tkanki dziąsłowej i redukuje liczbę zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J. W. C. jest wspierany przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (CIHR). Autorzy chcieliby podziękować dr Chunxiang Sun za pomoc w przeprowadzeniu barwienia błękitem trypanowym.

Wszystkie badania na myszach były zgodne z odpowiednimi przepisami etycznymi i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Toronto oraz Radę ds. Etyki Badań (Protokół 20011930).
1. Instalacja ligatury
UWAGA: To jest niesterylny zabieg chirurgiczny, który można przeprowadzić na standardowej sali operacyjnej. Wykorzystanie zwierząt wolnych od zarazków (nieomówione tutaj) wymaga obchodzenia się z nimi w komorze bezpieczeństwa biologicznego, używania sterylnych narzędzi i zaszczepiania jamy ustnej patogenami przyzębia w celu wywołania objawów klinicznych zapalenia przyzębia.
<ol>
	<li>Podać znieczulenie dootrzewnowe 8-12-tygodniowym samcom myszy C57BL/6, które powinny zostać zaaklimatyzowane w swoim obiekcie inwentarskim, za pomocą sterylnej igły podskórnej 0,5" 26 G i strzykawki 1 ml zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi komitetu ds. opieki nad zwierzętami i użytkowania (IACUC). 
	UWAGA: Połączenie ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) środków znieczulających szybko i niezawodnie indukuje odpowiedni poziom znieczulenia na czas zabiegu.</li>
	<li>Oceń głębokość znieczulenia przed zabiegiem i co 15 minut w jego trakcie, o czym świadczy utrata odruchu pedałowania.</li>
	<li>Umieść mysz na podgrzewanej platformie chirurgicznej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Ustabilizuj szczękę i żuchwę w pozycji otwartej za pomocą elastycznych taśm i podeprzyj szyję bawełnianą rolką, aby pomóc utrzymać szczękę w bardziej poziomej orientacji (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Przykryj ciało i ogon zwierzęcia, aby złagodzić utratę ciepła podczas zabiegu.</li>
	<li>Ustaw mikroskop chirurgiczny pod żądanym powiększeniem i oświetleniem (jeśli nie jest zamontowany bezpośrednio na mikroskopie) nad jamą ustną w celu wizualizacji uzębienia. Podczas gdy pożądane powiększenie zależy od operatora, optymalną wizualizację jamy ustnej uzyskuje się przy 16x.</li>
	<li>Załóż sterylny jedwabny szew pleciony 5-0 wokół pierwszych (M1) i drugich (M2) zębów trzonowych szczęki w obrębie bruzdy dziąsłowej za pomocą kleszczy odłamkowych. 
	UWAGA: W tym celu można zastosować plecione szwy jedwabne o mniejszej grubości, aby ułatwić szybszy montaż i zmniejszyć możliwość jatrogennego uszkodzenia tkanek miękkich.
	<ol>
		<li>Umieść dystalny ogon szwu po stronie podniebiennej uzębienia i włóż bliższy segment między kontaktem M2 i M3 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
		<li>Owiń szew wokół powierzchni policzkowej M2 i włóż go między kontakt M1 i M2. Upewnij się, że oba końce szwu są mocno naciągnięte, aby wbić szew w bruzdę dziąsłową i usunąć cały luz (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).</li>
		<li>Owiń proksymalny segment szwu wokół M1, poniżej jego wysokości konturu, i włóż go między styk M1 i M2. Pociągnij mocno proksymalny ogon szwu, aby wbić szew w bruzdę dziąsłową i usunąć cały luz (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). 
		UWAGA: Jeśli podczas zakładania szwu między M1 a M2 lub M2 i M3 obserwuje się opór, kontakt może być lekko otwarty za pomocą standardowego eksploratora dentystycznego.</li>
		<li>Zawiąż końce szwu węzłem chirurgicznym i przytnij ogony tak krótko, jak to możliwe. Umieść węzeł w otworze strzelniczym między M1 i M2 po stronie podniebiennej uzębienia szczęki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2D). 
		UWAGA: Kroki 1.4.1–1.4.4 można powtórzyć po stronie przeciwnej, jeśli jest to wymagane.</li>
		<li>Sterylizuj narzędzia chirurgiczne w sterylizatorze z gorącymi szklanymi kulkami między każdym zwierzęciem. 
		UWAGA: Końcówki kleszczy są niezwykle ostre i mogą łatwo spowodować uraz jamy ustnej i znaczne krwawienie. Przygotuj małe segmenty gazy, aby usunąć krew z jamy ustnej i uciskać aktywnie krwawiące rany.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po założeniu ligatury wyjmij mysz z aparatu chirurgicznego, umieść ją w czystej klatce pod lampą grzewczą i monitoruj, aż w pełni wyzdrowieje.</li>
	<li>Indywidualnie umieść każdą mysz z odpowiednim wzbogaceniem środowiska i zapewnij ad libitum dostęp do przefiltrowanej wody i puree standardowego pokarmu w środowisku o kontrolowanej temperaturze i wilgotności (12-godzinny cykl światła/12-godzinny cykl ciemny) przez 7–11 dni. 
	UWAGA: Puree chow zmniejsza siły potrzebne do żucia, zmniejszając w ten sposób ból związany z karmieniem i pomaga w zapobieganiu przedwczesnej utracie zainstalowanej ligatury.</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Eutanazja myszy zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi IACUC. 
	UWAGA: Indywidualna eutanazja przy użyciu komory CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy jest preferowaną metodą w tym protokole. Może to ulec zmianie w zależności od eksperymentów, które wymagają pobrania dodatkowych tkanek.</li>
	<li>Za pomocą pipety natychmiast przepłukać jamę ustną 100 μL wysterylizowanego soli fizjologicznej buforowanej fosforanem o temperaturze 4 °C 1x PBS bez wapnia i magnezu przez 10 sekund.</li>
	<li>Powtórz krok 2.2 2x i umieść każde płukanie w pojedynczej stożkowej sterylnej probówce z polipropylenu o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Przenieś zawartość do stożkowej sterylnej probówki z polipropylenu o pojemności 50 ml, przepuszczając ją przez nylonowy filtr siatkowy o średnicy 40 μm.</li>
	<li>Przenieś tę zawartość do nowej sterylnej probówki ze stożka polipropylenowego o pojemności 15 ml. 
	UWAGA: Ostateczne przeniesienie próbki do mniejszej probówki pozwala na lepszą wizualizację osadu komórkowego w kolejnych krokach.
	<ol>
		<li>W razie potrzeby usunąć ligaturę (ligatury) molową i umieścić w 300 μl wysterylizowanego 1x PBS (4 °C, bez wapnia i magnezu) w oddzielnej sterylnej probówce ze stożka polipropylenowego o pojemności 15 ml. Delikatnie zamieszaj i usuń szew z tubki. Od tego momentu próbka ta jest traktowana identycznie jak próbka do płukania jamy ustnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 33,3 μl 16% paraformaldehydu (PFA), aby ułatwić utrwalenie próbki.</li>
	<li>Próbki należy natychmiast zwirować i inkubować na lodzie przez 15 minut.</li>
	<li>Napełnij probówkę do 15 ml 1x PBS w celu rozcieńczenia PFA, a następnie odwiruj przy 1000 x g i 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) w temperaturze 4 °C. Zliczyć komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Ponownie odwirować próbkę w temperaturze 1000 RCF i temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości buforu FACS do uzyskania końcowego stężenia 0,5–1,0 x 106 komórek/50 μl buforu FACS.</li>
</ol>
3. Barwienie przeciwciał do analizy metodą cytometrii przepływowej
UWAGA: Oznacz i schładzaj wszystkie wymagane probówki FACS przed użyciem.
<ol>
	<li>Dodać 1 μl surowicy szczura i 2 μl przeciwciała anty-mysiego IgG do 50 μl próbki, natychmiast przemieszać i blokować na lodzie przez 20 minut.</li>
	<li>Dodać odpowiednie przeciwciała do każdej próbki, natychmiast wirować i inkubować na lodzie przez 30 minut w ciemności. 
	UWAGA: Dobór i ilość przeciwciał zależą od wcześniejszych eksperymentów pilotażowych optymalizacyjnych dostosowanych do tej konkretnej techniki.</li>
	<li>Przemyć próbki 1 ml buforu FACS, krótko wirować i odwirować przez 5 minut w temperaturze 1000 x g i 4 °C. Powtórzyć ten krok 2 razy.</li>
	<li>Zawiesić próbki w 250 μl buforu FACS, przykryć probówki folią parafinową, zawinąć w folię aluminiową i utrzymać w temperaturze 4 °C do czasu analizy. 
	UWAGA: Idealnie nadaje się do analizy próbek w ciągu kilku godzin od ukończenia protokołu ze względu na utratę sygnału fluorescencyjnego podczas długich okresów przechowywania. Jednak próbki mogą być analizowane 2-3 dni później, jeśli jest to absolutnie wymagane.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najbardziej krytycznym elementem związanym ze stosowaniem mysiego modelu zapalenia przyzębia indukowanego przez więzadło jest zachowanie ligatury do czasu poświęcenia lub celowego usunięcia. Zainstalowana ligatura zatrzymująca biofilm jest w stanie wywołać znaczną utratę wysokości kości wyrostka zębodołowego w ciągu zaledwie 6 dni, utrzymując się na stałym poziomie między 11-16 dniami39. Decyzja o uśmierceniu zwierząt przed maksymalnym okresem utraty masy kostnej, co czyni ten model znacznie króts...

Choroba przyzębia (PD) jest schorzeniem osteolitycznym związanym ze znaczną zachorowalnością gospodarza i obciążeniem ekonomicznym, które objawia się zapaleniem dziąseł i utratą zarówno przyczepu tkanek miękkich, jak i podparcia kostnego dla chorego uzębienia1,2,3,4. Proces ten jest regulowany przez interakcje między mikrobiotą jamy ustnej a wrodzonym układem odpornościowym gospodarza. Wiąże się to również z zaostrzeniem innych ogólnoustrojowych chorób zapalnych, w tym cukrzycy, chorób układu krążenia i raka5,6,7,8. Historycznie rzecz biorąc, postawiono hipotezę, że patogeneza choroby Parkinsona jest zależna od dużych ilości określonych bakterii, takich jak Porphyromonas gingivalis9. Jednak najnowsze dowody sugerują, że w mikrobiologicznym składniku PD pośredniczy biofilm zębowy. Biofilm jest zorganizowaną, złożoną społecznością licznych mikroorganizmów, które mogą istnieć w zdrowych, symbiotycznych i destrukcyjnych stanach dysbiotycznych10,11. Biofilm jamy ustnej zwykle zapewnia odporność gospodarza, zapobiegając tworzeniu się ognisk bakterii chorobotwórczych i promuje idealną strukturę i funkcję tkanki dziąseł poprzez regulację odpowiedzi immunologicznej gospodarza12,13. Zaburzenia równowagi między organizmami komensalnymi w obrębie jamy ustnej a układem odpornościowym gospodarza mogą prowadzić do zmian w homeostazie tkanek, co skutkuje dysbakteriozą i rozwojem charakterystycznych objawów klinicznych i radiologicznych PD5,10,12,13,14.
Interesujące, wytworzenie dysbakteriozy w jamie ustnej, choć wymagane do zainicjowania PD, nie jest wystarczające do wywołania PD u wszystkich osób, wymykając się zdolności odpowiedzi immunologicznej gospodarza do zakłócenia przejścia mikrobioty między stanami symbiotycznymi i dysbiotycznymi15. Kładzie to szczególny nacisk na środki, za pomocą których PD wpływa na jedną z głównych cech wrodzonego układu odpornościowego, a mianowicie granulocyt wielojądrzasten (PMN) lub neutrofile, z perspektywy lokalnej i ogólnoustrojowej16,17.
U ludzi PMN są rekrutowane z krążenia w tempie ~2 x 106 komórek/h w zdrowych tkankach łącznych przyzębia, gdzie są dominującą populacją leukocytów. Tutaj są one następnie wydalane z bruzdy dziąsłowej do jamy ustnej jako składnik płynu dziąsłowego. W obecności PD neutrofilia objawia się w krążeniu i jamie ustnej, gdzie te komórki efektorowe posiadają fenotyp hiperzapalny, który prowadzi do wspomnianego wcześniej zniszczenia przyzębia17,18,19,20,21,22. Dlatego zrozumienie roli PMN w chorobie Parkinsona i innych ogólnoustrojowych stanach zapalnych ma ogromne znaczenie.
Chociaż powszechnie przyjmuje się, że choroby przewlekłe są wzajemnie powiązane z chorobą Parkinsona, mechanizmy leżące u ich podstaw nie zostały jeszcze wyjaśnione, co przyczynia się do trudności w leczeniu tych chorobliwych i potencjalnie śmiertelnych chorób ogólnoustrojowych. Wiele eksperymentalnych modeli zwierzęcych, z których każdy ma unikalne zalety i wady, zostało wykorzystanych do badania patofizjologii PD23,24. Skupiając się w szczególności na modelach mysich, istnieje wiele protokołów, dzięki którym badanie PD jest ułatwione; Mają jednak kilka technicznych i fizjologicznych niedociągnięć25,26,27,28,29,30,31.
Po pierwsze, model myszy z zgłębnikiem jamy ustnej wymaga wielu doustnych szczepień ludzkimi patogenami przyzębia, aby wywołać zapalenie dziąseł i utratę kości. Dodatkowo, jest on zazwyczaj poprzedzony okresem antybiotykoterapii w celu obalenia mysiej komensalnej flory jamy ustnej25. Model ten często wymaga specjalistycznego szkolenia, aby bezpiecznie wykonać zgłębnik jamy ustnej, wykorzystuje tylko niewielką część patogenów przyzębia z bardziej złożonego ludzkiego mikrobiomu jamy ustnej i wymaga kilku miesięcy na ustalenie ubytku kości wyrostka zębodołowego.
Dla kontrastu, chemicznie indukowane modele mysie wykorzystują doustne dostarczanie kwasu trinitrobenzenosulfonowego (TNBS) lub siarczanu dekstranu sodu (DSS), środków powszechnie stosowanych do tworzenia mysich modeli zapalenia jelita grubego przez okres kilku miesięcy w celu wywołania utraty kości przyzębia26. Dostępne są modele oparte na ropniu wewnątrzustnym i zewnątrzustnym, które obejmują odpowiednio mysie siekacze i tkanki grzbietu, a także kalwarii. W poprzednim modelu ropnia podaje się kilka zastrzyków z bakterii, co powoduje powstawanie wielu ropni dziąseł i niedostatek zaniku kości wyrostka zębodołowego, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach nad chorobą Parkinsona. Te ostatnie modele ropni są znacznie bardziej podatne na badanie zjadliwości bakteryjnej, stanu zapalnego i resorpcji kości w miejscach poza jamą ustną, co eliminuje ocenę mikrobiomu przyzębia i jamy ustnej27,28,29,30,31.
Korzystając z modelu zapalenia przyzębia wywołanego przez ligatury, zwykle zakłada się pleciony jedwabny szew wokół drugiego zęba trzonowego. Alternatywnie, pojedynczy liniowy segment materiału do szycia można umieścić między pierwszym a drugim zębem trzonowym32,33. Celem wszczepienia ligatury jest ułatwienie akumulacji bakterii i wytworzenie dysbiozy w obrębie bruzd dziąsłowych, skutkujących stanem zapalnym tkanek przyzębia i zniszczeniem tkanek tworzących przyzębie. Przede wszystkim model ten jest w stanie spowodować znacznie większy ubytek kości wyrostka zębodołowego w porównaniu z częściej stosowanym modelem gaźnika jamy ustnej34. Dodatkowym utrudnieniem stosowania modelu zgłębnika w jamie ustnej jest naturalna odporność kilku szczepów myszy (tj. C57BL/6) na rozwój utraty kości wyrostka zębodołowego. Jest to również problematyczne, ponieważ ten szczep jest najczęściej używany w badaniach na myszach na zwierzętach35.
Istniejące procedury opisane przez Marchesan et al. oraz Abe i Hajishengallis zostały opracowane w celu uproszczenia technicznego aktu umieszczania ligatury33,36. Niestety, poprzedni protokół wymaga specjalistycznego sprzętu drukowanego w 3D i stwarza ryzyko przedwczesnej utraty ligatur, co zwiększa wykorzystanie zwierząt i koszty związane z dodatkowym czasem spędzonym na sali operacyjnej. Co więcej, oba protokoły generują tylko małe obszary chorego przyzębia dostępne do badania.
Korzyści płynące z tej techniki wynikają z jednoczesnego badania dysbiozy jamy ustnej i immunologii, które rządzą przyzębiem, wykorzystania tanich zwierząt o różnym pochodzeniu genetycznym oraz prostych praktykach hodowlanych i hodowlanych. W związku z tym celem powinno być maksymalizowanie objętości chorej tkanki i, w próbach praktykowania zasad redukcji w badaniach na zwierzętach, ograniczenie spożycia zwierząt do jak najniższego poziomu. Wymaga to upewnienia się, że wszystkie zwierzęta mogą zostać włączone do analiz eksperymentalnych37. Należy jednak zauważyć, że bez względu na to, jaki zwierzęcy model choroby przyzębia zostanie wykorzystany, nie ma jednego modelu, który obejmowałby każdy element patofizjologii choroby Parkinsona u człowieka.
Ten nowy protokół wykorzystuje umieszczanie ligatury wokół wielu zębów trzonowych szczęki przy użyciu narzędzi i materiałów, które można znaleźć w większości laboratoriów. Daje to wystarczającą ilość czasu na łatwe i pewne zainstalowanie ligatury, która prawdopodobnie nie ulegnie przedwczesnemu złudzeniu. Wreszcie, ponieważ PMN koordynują niszczenie przyzębia w PD, przedstawiono również nową metodologię odzyskiwania doustnych neutrofili w sposób analogiczny do ludzkiego.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało przeciw myszom F4/80</td><td>BioLegend</td><td></td><td>123131 BV421, klon BM8</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw myszom Ly6G</td><td>BD</td><td>560602</td><td>PerCP-Cy5.5, klon 1A8</td></tr><tr><td>C57BL/6 samce myszy</td><td>Charles River</td><td></td> w <td>wieku od 8 do 12 tygodni</td></tr><tr><td>Stożkowa probówka wirówkowa</td><td>FroggaBio</td><td>TB15-500</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>stożkowa probówka wirówkowa</td><td>FroggaBio</td><td>TB50-500</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Bufor FACS</td><td>wielokrotny</td><td></td><td>1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)</td></tr><tr><td>FACSDiva</td><td>BD</td><td></td><td>v8.0.1</td></tr><tr><td>Fibre-Lite</td><td>Dolan-Jenner</td><td></td><td>Model 180</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Tree Star</td><td></td><td>v10.0.8r1</td></tr><tr><td>Pompa do terapii cieplnej</td><td>Hallowell</td><td></td><td>HTP-1500</td></tr><tr><td>Sterylizator gorących szklanych kulek</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>66118-10</td><td>Germinator 500</td></tr><tr><td>Nożyczki do tęczówki</td><td>Almedic</td><td>7602-A8-684</td><td>Prosta</td></tr><tr><td>ketamina</td><td>Vetoquinol</td><td></td><td>100mg/mL</td></tr><tr><td>LSRFortessa</td><td>BD</td><td></td><td>X-20</td></tr><tr><td>Mysie serum</td><td>Sigma</td><td>M5905-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Nylonowy filtr siatkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td>40 i Mikro; m</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>16% (w/v), Sól fizjologiczna buforowana fosforanem bez metanolu</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML</td><td>Bez CaCl2 i MgCl2, 10x</td></tr><tr><td>plastikowe jednorazowe strzykawki</td><td>BD</td><td>309659</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Rat Serum</td><td>Sigma</td><td>R9759-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Jedwabny szew</td><td>Covidien</td><td>SS652</td><td>C13 USP 5-0</td></tr><tr><td>Kleszcze przeciwodłamkowe</td><td>Almedic</td><td>7726-A10-700</td><td>#1</td></tr><tr><td>Kleszcze odłamkowe</td><td>Almedic</td><td>7727-A10-704</td><td>#5</td></tr><tr><td>Stereoskopowy mikroskop preparacyjny</td><td>Carl Zeiss</td><td>28865</td><td>Photo-Zusatz</td></tr><tr><td>Sterylna igła hipodemiczna</td><td>BD</td><td>305111</td><td>26G X 1/2"</td></tr> <tr><td>Strzykawka</td><td>BD</td><td>309659</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Rompun</td><td></td><td>20mg/ml</td></tr></tbody></table>

solidny model mysiego zapalenia przyzębia indukowany ligaturą do oceny neutrofili jamy ustnej

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

Główne zalety badania patofizjologii chorób przyzębia za pomocą modeli mysich to obniżony koszt zwierząt, szereg genetycznie modyfikowanych szczepów, ogromna liczba analiz, które można przeprowadzić na pobranych tkankach miękkich i twardych. Wiele z tych systemów jest jednak przedmiotem krytyki proceduralnej. Alternatywnie można zastosować model choroby przyzębia indukowany przez ligatury, napędzany przez miejscowy rozwój i utrzymanie dysbiotycznego mikrobiomu jamy ustnej, który jest szybko indukowany i stosunkowo niezawodny. Niestety, warianty protokołu mysiego zapalenia przyzębia wywołanego ligaturą są izolowane do ogniskowych obszarów przyzębia i podlegają przedwczesnemu zwichnięciu zainstalowanej ligatury. Minimalizuje to ilość tkanki dostępnej do kolejnych analiz i zwiększa liczbę zwierząt potrzebnych do badania. Protokół ten opisuje precyzyjne manipulacje wymagane do umieszczenia rozszerzonych ligatur trzonowych z lepszą retencją i zastosowaniem nowatorskiej techniki płukania w celu odzyskania doustnych neutrofili u myszy przy użyciu alternatywnego podejścia, które łagodzi wyżej wymienione wyzwania techniczne.

Przedstawiono reprezentatywne dane z cytometrii przepływowej próbek z płukania jamy ustnej myszy naiwnej (Rysunek 3A) oraz z jamy ustnej z objawami stanu zapalnego (Rysunek 3B) w następstwie periodontitis wywołanego przez ligaturę. Wykazano również odzysk PMN z zainstalowanej ligatury (Rysunek 3C). Napięcia kanałów cytometru przepływowego zostały skalibrowane ręcznie, a kompensacja ...

Ten artykuł przedstawia protokół tworzenia indukowanego przez ligaturę modelu mysiego zapalenia przyzębia obejmującego wiele zębów trzonowych szczęki, co skutkuje większymi obszarami zaangażowanej tkanki dziąsłowej i kości do późniejszej analizy, a także zmniejszeniem zużycia przez zwierzęta. Opisano również technikę oceny neutrofili w jamie ustnej w sposób analogiczny do osób badanych u ludzi.

Solidny model mysiego zapalenia przyzębia indukowany ligaturą do oceny neutrofili jamy ustnej

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Opisany tutaj protokół dostarcza badaczom metody badania doustnych neutrofili w zwierzęcym modelu choroby przyzębia wywołanym ligaturą w sposób analogiczny do uczestników ludzkich. Główną zaletą tej techniki jest zwiększona objętość tkanek dziąseł objętych stanem zapalnym dostępnych do późniejszej analizy, co zmniejsza wykorzystanie przez zwierzęta. Nasza zdolność do pobierania ligatur pokrytych biofilmem z okolic zębów pozwala na symulację skutecznego leczenia zlokalizowanej choroby przyzębia.Zastosowanie tego modelu może być zastosowane w badaniu ogólnoustrojowych skutków zapalenia przyzębia w modelu zwierzęcym, ze względu na zwiększone obszary tkanek dziąseł objętych stanem zapalnym. Zdecydowanie zaleca się zapoznanie się z użyciem narzędzi mikrochirurgicznych i mikroskopów preparacyjnych, a także wiązanie węzłów chirurgicznych przed kontaktem z żywymi zwierzętami. Wizualna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie dla skrócenia długości krzywej uczenia się wymaganej do osiągnięcia biegłego umieszczania ligatur.Procedurę zademonstruje Jeff Chadwig, doktorant z mojego laboratorium. Zacznij od umieszczenia myszy na podgrzewanej platformie chirurgicznej. Po upewnieniu się, że

robust-ligature-induced-model-murine-periodontitis-for-evaluation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Modele zwierzęce okazały się nieocenionymi narzędziami w definiowaniu mechanizmów specyficznych dla gospodarza i patogenu, które przyczyniają się do rozwoju przewlekłego stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy mysi model zakażenia jamy ustnej ludzkim patogenem Porphyromonas gingivalis i szczegółowo opisujemy metodologie oceny postępu stanu zapalnego w miejscach miejscowych i ogólnoustrojowych.

Mysi model przewlekłego stanu zapalnego wywołanego przez patogeny w miejscach lokalnych i ogólnoustrojowych

W tym badaniu, szczurzy model indukcji zapalenia przyzębia jest prezentowany poprzez kombinację ligatury retencyjnej i powtarzających się iniekcji lipopolisacharydu pochodzącego z Porphyromonas gingivalis, przez 14 dni wokół pierwszych zębów trzonowych szczęki. Techniki podwiązania i iniekcji LPS były skuteczne w wywoływaniu zapalenia ozębnej, co skutkowało utratą kości wyrostka zębodołowego i stanem zapalnym.

Indukcja zapalenia przyzębia poprzez połączenie ligatury i wstrzyknięcia lipopolisacharydu w modelu szczurzym

To jest raport na temat eksperymentalnego modelu zapalenia okołoimplantowego wywołanego ligaturą u myszy. Opisujemy wszystkie etapy chirurgiczne, od przed- i pooperacyjnego postępowania ze zwierzętami, ekstrakcji, wszczepienia implantu i zapalenia okołoimplantowego wywołanego podwiązaniem.

Eksperymentalny model peri-implantitis wywołanego ligaturą u myszy

To badanie opisuje zmodyfikowaną metodę podwiązania nylonu 6-0 do wywoływania zapalenia przyzębia u myszy, która jest wysoce powtarzalna i stanowi alternatywę dla badaczy do badania chorób przyzębia od ich rozwoju do patologicznych konsekwencji.

Mysi model zaawansowanego zapalenia przyzębia wywołanego przez ligaturę nylonową w drugim górnym zębie trzonowym

W tym filmie prezentujemy procedurę aktywacji CD40 i ekspansji mysich limfocytów B z splenocytów myszy C57BL/6, które mogą służyć jako model komórki prezentującej antygen (APC) do badania indukcji odporności.

Mysi model aktywacji limfocytów B przez CD40

Biofilmy tworzące się na powierzchniach zębów są wysoce złożone i narażone na stałe wrodzone oraz egzogenne wyzwania środowiskowe, które modulują ich architekturę, fizjologię oraz transkryptom. Opracowaliśmy zestaw narzędzi do badania składu, organizacji strukturalnej i ekspresji genów w biofilmach jamy ustnej, które można zaadaptować do innych obszarów badań nad biofilmami.

Analityczny zestaw narzędzi do kompleksowej oceny biochemicznej, strukturalnej i transkrypcyjnej biofilmów jamy ustnej indukowanych przez paciorkowce z grupy mutans

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy test qRT-PCR do analizy sygnatur ekspresji IFN typu I i III. Test dyskryminuje różnice w pojedynczej parze zasad między bardzo podobnymi transkryptami tych genów. Dzięki montażowi wsadowemu i zrobotyzowanemu pipetowaniu testy są spójne i powtarzalne.

Wysokoprzepustowy ilościowy test RT-PCR w czasie rzeczywistym do określania profili ekspresji podtypów interferonu typu I i III

Protokół opisuje intubację dorosłego danio pręgowanego za pomocą leku biologicznego; następnie preparację i przygotowanie jelita do cytometrii, mikroskopii konfokalnej i qPCR. Metoda ta pozwala na podawanie związków bioaktywnych w celu monitorowania wychwytu jelitowego i wywołanego miejscowego bodźca immunologicznego. Ma to znaczenie dla badania dynamiki jelit w profilaktyce doustnej.

Doustna intubacja dorosłego danio pręgowanego: model oceny wychwytu związków bioaktywnych w jelitach

Tutaj udostępniamy szczegółowe protokoły doustnego podawania antybiotyków myszom, pobierania próbek kału, ekstrakcji DNA i kwantyfikacji bakterii kałowych metodą qPCR.

Ilościowe analizy mikrobioty jelitowej myszy po doustnym leczeniu antybiotykami oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół dla modelu doustnego podawania z użyciem larw Galleria mellonella i jak scharakteryzować indukowane wrodzone reakcje immunologiczne. Korzystając z tego protokołu, naukowcy bez praktycznego doświadczenia będą mogli stosować metodę wymuszonego karmienia G. mellonella.

Model doustnego podawania Galleria mellonella do badania wrodzonych odpowiedzi immunologicznych wywołanych komensalem

Poznaj model mysiego zapalenia przyzębia indukowany ligaturą do badania neutrofili jamy ustnej. Ta metoda zwiększa objętość tkanki dziąsłowej i redukuje liczbę zwierząt.

Solidny model mysiego zapalenia przyzębia indukowany ligaturą do oceny neutrofili jamy ustnej

Przeglądaj więcej filmów