Zastosowanie mikroskopii sił atomowych do pomiaru właściwości mechanicznych i ciśnienia turgoru komórek roślinnych i tkanek roślinnych

Właściwości mechaniczne komórek roślinnych są niezbędne, aby wziąć je pod uwagę przy próbie zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw rozwoju. Mikroskopia sił atomowych może być wykorzystana do pomiaru tych właściwości i śledzenia sposobu, w jaki się zmieniają między narządami, tkankami, wszystkimi etapami rozwoju. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie jest inwazyjna, jest stosunkowo szybka i nie wymaga leczenia, dzięki czemu można ją bezpośrednio stosować do żywych próbek.

Dla kogoś, kto jest nowy w tej procedurze, przekrój cis próbki jest naprawdę krytyczny, więc upewnij się, że naprawdę masz prawidłowe mechaniczne mocowanie próbki. Wizualna demonstracja tej procedury ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia zawiłości utrwalania próbki, kontroli jakości próbek i konfiguracji pomiarowej. Procedurę zademonstrują Simone Bovio, inżynier i Yuchen Long, adiunkt w moim laboratorium.

Aby rozpocząć, umieść kawałek dwustronnej taśmy w środku szalki Petriego o średnicy pięciu centymetrów. Dodaj próbkę genezjum, która została wyizolowana z pąka kwiatowego do taśmy. Szybko dodaj wodę do naczynia, aż próbka zostanie całkowicie pokryta, aby uniknąć odwodnienia.

Następnie umieść próbkę na stoliku AFM i przesuń głowicę tak, aby znalazła się nad próbką. Po skalibrowaniu wspornika, w oprogramowaniu upewnij się, że system jest w trybie QI i zbliż się do próbki z zadaną siłą piętnastu nanoniutonów. Następnie ustaw długość Z na cztery mikrony i ustaw obszar skanowania na osiemdziesiąt na osiemdziesiąt mikronów do kwadratu z liczbą pikseli ustawioną na czterdzieści na czterdzieści.

Następnie przejdź do panelu zaawansowanych ustawień obrazowania i ustaw tryb na stałą prędkość. Dodatkowo ustaw prędkość przedłużenia ścieżki wejściowej do dwustu mikronów na sekundę, a częstotliwość próbkowania na dwadzieścia pięć kiloherców. Po ustawieniu parametrów przesuń końcówkę do obszaru zainteresowania na próbce.

Sprawdź, czy skanowany obszar jest wolny od zanieczyszczeń, zlokalizuj obszar, który jest tak płaski, jak to możliwe, i włącz się, a następnie rozpocznij skanowanie i użyj szybkiego skanowania o niskiej sile, aby sprawdzić, czy próbka się porusza. Po zlokalizowaniu obszaru zainteresowania wybierz obszar o wymiarach czterdzieści na czterdzieści do sześćdziesięciu na sześćdziesiąt mikronów do kwadratu i zwiększ liczbę pikseli do dwóch pikseli na mikron. Następnie zwiększ nastawę do pięciuset nanoniutonów, aby uzyskać wgłębienie od stu do dwustu nanometrów.

Zmniejsz długość Z do dwóch mikronów, a wydłużenie prędkości wejściowej przewodu do stu mikronów na sekundę, a następnie zwiększ częstotliwość próbkowania do pięćdziesięciu kiloherców i rozpocznij skanowanie próbki. Po zakończeniu zapisz dane wyjściowe zarówno jako obraz, jak i plik danych. Otwórz oprogramowanie do przetwarzania danych i załaduj plik danych.

Kliknij przycisk Użyj tej mapy do przetwarzania wsadowego, aby użyć tych samych parametrów na wszystkich krzywych mapy, a następnie przejdź do załadowania predefiniowanego procesu i wybierz dopasowanie hercowe. Następnie przejdź do przełączanej operacji linii bazowej i ustaw odejmowanie na przesunięcie plus pochylenie, a X min między czterdziestoma a sześćdziesięcioma procentami. Na karcie pionowej pozycji końcówki wybierz opcję Smooth tight, jeśli wolisz pracować na surowych danych.

Aby wybrać odpowiedni model dopasowania, przejdź do zakładki dopasowania elastyczności i wybierz jedną z opcji w oparciu o oczekiwaną siłę przyczepności. Jeśli nie ma przyczepności lub występuje słaba przyczepność, należy użyć krzywej podejścia i preferować model iznadera herców. W przypadku silniejszej przyczepności należy skorzystać z modelu Dergen Milia Dortoprov lub DMD i pracować nad krzywą opóźnioną.

Teraz ustaw parametry geometryczne końcówki na podstawie nominalnego kształtu końcówki. Końcówka użyta w tym eksperymencie to kulista końcówka o promieniu czterystu nanometrów. Następnie ustaw współczynnik Poissona na 0,5 i wybierz krzywe przesunięcia.

Dodaj drugą rutynę dopasowania elastyczności, klikając ikonę obok okna głównego i powtórz te same ustawienia parametrów. Na koniec określ żądane wcięcie w X min, a następnie zachowaj i zastosuj do wszystkich, aby iterować poprzednie kroki na wszystkich krzywych mapy. Zapisz wyniki, aby uzyskać obraz w pliku dot tsv.

Aby dokonać pomiaru z szybkimi zmianami roztworu, umieść próbkę na szalce Petriego, trzymając mały kawałek adhezyjnej masy uszczelniającej. Szybko uszczelnij szczelinę między mastyksem a podstawą próbki za pomocą biokompatybilnego kleju. Poczekaj, aż klej stwardnieje, a następnie zanurz próbkę w płynnym wierzchołkowym podłożu hodowlanym, zawierającym 0,1 procent mieszaniny do konserwacji roślin.

Po kalibracji systemu otwórz oprogramowanie akwizycyjne i przejdź najpierw do okna sprawdzania parametrów. Tam ustaw stałą sprężystości na wyprodukowaną przez wspornik stałą sprężystości lub wyznaczoną stałą sprężystości. Następnie ustaw promień końcówki na czterysta nanometrów, współczynnik Poissona próbki na 0,5, linię próbki na sto dwadzieścia osiem, aby zapewnić szybką akwizycję, szybkość skanowania na 0,2 herca, a rozmiar skanowania na jeden mikron.

Następnie przejdź do okna rampy i ustaw rozmiar rampy na pięć mikronów, próg wyzwalania na maksimum, a liczbę próbek na cztery tysiące sześćset osiem. Po ustawieniu wszystkich parametrów ostrożnie podejdź do próbki ręcznie. Gdy sonda znajduje się stosunkowo blisko powierzchni próbki, kliknij przycisk "Podejdź".

Po kontakcie stopniowo zwiększaj rozmiar skanu i modyfikuj szybkość skanowania, aż do osiągnięcia pożądanej równowagi bez uszkodzenia próbki lub końcówki. Przenieś skanowanie, jeśli obszar pomiaru nie jest zgodny z oczekiwaniami. Gdy będziesz zadowolony, kliknij przycisk, wyceluj i strzelaj, aby zainicjować okno wskaż i strzelaj.

Określ katalog zapisu i nazwę pliku. Następnie kliknij rampę przy następnym skanowaniu, aby rozpocząć nagrywanie. Po zakończeniu skanowania interfejs oprogramowania przekieruje do okna rampy.

Kliknij zeskanowany obraz, aby określić pozycje wcięcia. Wybierz co najmniej trzy celowniki wcięć na komórkę w pobliżu jej środka jagody, ustaw ją tak, aby powtarzała wcięcie trzy razy z każdej strony, a następnie kliknij rampę i przechwyć. W oprogramowaniu analitycznym otwórz plik kropkowy MCA, który pokazuje położenie każdej krzywej siły na zeskanowanym obrazie.

Następnie otwórz jedną krzywą siły, która ma zostać poddana analizie. Kliknij przycisk korekcji linii bazowej i przeciągnij niebieskie linie przerywane na krzywej siły, aż wydłuż początek źródłowej linii bazowej i wydłuż punkt źródłowej linii bazowej lub odpowiednio o 0 procent i 80 procent. Następnie kliknij wykonaj.

Następnie kliknij przycisk filtra samochodowego i kliknij wykonaj, aby wygładzić krzywą siły. Następnie kliknij przycisk wcięcia. W oknie wejściowym ustaw aktywną krzywą na wydłużenie, piątą metodę na model zlinearyzowany, granicę dopasowania maksymalnej siły na 99 procent, granicę dopasowania minimalnej siły na 75 procent, a model dopasowania na sztywność.

Analizuj krzywe siły w partii. Aby to osiągnąć, kliknij przycisk historii uruchamiania, określ katalog raportów i dodaj inne krzywe siły, które wymagają tego samego traktowania. Po zakończeniu kliknij przycisk Uruchom.

Po dopasowaniu wsadowym wartości K kliknij przycisk Historia i przejdź do pozycji pięć wcięć, aby powrócić do okna wcięć. Tam zmień granicę dopasowania maksymalnej siły na dziesięć procent i minimalną granicę dopasowania siły na jeden procent. Następnie ustaw model dopasowania na Hertzian.

Następnie otwórz odpowiedni plik, aby wyświetlić różne zeskanowane kanały. W oknie wysokiego kanału kliknij przycisk sekcji. Umożliwi to pomiar krzywizny powierzchni próbki, która jest wymagana do odliczenia ciśnienia turgoru.

Następnie narysuj linię w poprzek długiej osi jednej komórki, przesuń granice linii przerywanej do krawędzi komórki i zapisz wartość promienia. Na koniec postępuj zgodnie z protokołem tekstowym, aby obliczyć średni moduł Younga, stałą sprężystości, E, K i ciśnienie turgoru dla każdej komórki. Obraz po lewej stronie to mapa modułu młodego, uzyskana poprzez analizę całego wgłębienia do nastawy siły zdefiniowanej przez użytkownika, podczas gdy obraz po prawej stronie pokazuje wynik analizy pierwszych stu nanometrów wcięcia.

W tym przypadku obie mapy wyglądają bardzo podobnie, jednak zmienność głębokości wgłębienia może w niektórych przypadkach prowadzić do lepszego uwydatnienia niejednorodności próbki, co może być pomocne w identyfikacji lokalizacji lub dostarczeniu informacji na temat zachowania struktur wewnętrznych. Dla każdego punktu na tych mapach istnieje podstawowa krzywa siły. Pokazana tutaj krzywa ma dwa efekty, o których warto wspomnieć.

Po pierwsze, jeśli zbliżająca się część krzywej siły kończy się na pięciuset nanoniutonach. Ruch końcówki w dół trwa nadal. Oznacza to, że końcowa siła przyłożona przez końcówkę jest wyższa niż oczekiwano.

Drugą rzeczą, na którą należy zwrócić uwagę, jest fala na krzywej wycofania podkreślona przez elipsę. Takie falowanie może być wskaźnikiem przesuwania się lub drgania próbki pod wpływem działania końcówki i może być wymagane przejście na inną metodę utrwalania. Korzystając z procedury opisanej w tym artykule, wszystkie kluczowe parametry dla odliczenia ciśnienia turgoru, z wyjątkiem grubości ścianki komórki, można uzyskać ze skanów i wgłębień AFM.

Krzywa siły głębokiego wgłębienia w pozycji czerwonego krzyża opisuje moduł Younga ściany komórkowej i pozorną sztywność próbki w różnych reżimach krzywej. Utrwalenie próbki ma kluczowe znaczenie. Podczas procesu pomiaru należy zwrócić uwagę na oznaki niestabilności próbki.

Ostrożnie wybierz obszar o płaskiej powierzchni, aby zapewnić prostopadłe wcięcie. Postępując zgodnie z tą procedurą, można monitorować właściwości mechaniczne w czasie i w różnych warunkach. Można również nakładać pomiary mechaniczne na obrazy konfokalne w celu badań korelacyjnych.

Technika ta toruje drogę do powiązania biomechaniki z rozwojem fizjologii i innymi procesami biologicznymi.