Name: Zastosowanie mikroskopii sił atomowych do pomiaru właściwości mechanicznych i ciśnienia turgoru komórek roślinnych i tkanek roślinnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Poznaj mikroskopię sił atomowych do pomiaru właściwości mechanicznych komórek roślinnych. Ta nieinwazyjna metoda pozwala mierzyć moduł Younga ściany komórkowej i ciśnienie turgoru w żywych tkankach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować zespołowi PLATIM za wsparcie techniczne, a także Arezki Boudaoud i członkom zespołu Biophysic w laboratorium RDP za pomocne dyskusje.

<ol><li>Du, F., Guan, C., Jiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+leaf+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of leaf morphogenesis.</a> Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).</li>
<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+the+plant+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Growth of the plant cell wall.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).</li>
<li>Dumais, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+mechanics+control+pattern+formation+in+plants%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Can mechanics control pattern formation in plants?</a> Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+flower+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early flower development in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li>
<li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).</li>
<li>Corson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+a+plant+tissue+into+a+living+cell+froth+through+isotropic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).</li>
<li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanical+feedback+restricts+sepal+growth+and+shape+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).</li>
<li>Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J. Chapter 11 - In-vivo analysis of morphogenesis in plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStanislas%2C+T+%22Methods+in+Cell%22">Methods in Cell</a>. Lecuit, T. 139, Academic Press. 203-223 (2017).</li>
<li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li>
<li>Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Hertzian+Approach+to+Analyzing+Mechanical+Properties+of+Endothelial+Cells+Probed+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).</li>
<li>Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically%2C+the+shoot+apical+meristem+of+Arabidopsis+behaves+like+a+shell+inflated+by+a+pressure+of+about+1MPa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+science%22%5BJournal%5D)">Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa.</a> Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).</li>
<li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li>
<li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls%3A+implications+for+cell+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).</li>
<li>Farahi, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity%2C+elasticity%2C+and+adhesion+energy+of+plant+cell+walls%3A+nanometrology+of+lignin+loss+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy.</a> Scientific Reports. 7, 152(2017).</li>
<li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).</li>
<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+growth+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Diffuse growth of plant cell walls.</a> Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).</li>
<li>Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+calibration+of+atomic+force+microscope+cantilevers%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).</li>
<li>Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+rectangular+atomic+force+microscope+cantilevers%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers.</a> Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).</li>
<li>Sikora, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Normal+Force+Measurements+by+Means+of+Atomic+Force+Microscopy+Towards+the+Accurate+and+Easy+Spring+Constant+Determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscience+and+Nanometrology%22%5BJournal%5D)">Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination.</a> Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).</li>
<li>Schillers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+Nanomechanical+Atomic+Force+Microscopy+Procedure+%28SNAP%29+for+Measuring+Soft+and+Biological+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Powstawanie kształtów u roślin jest determinowane głównie przez skoordynowane tempo i kierunek wzrostu w czasie i przestrzeni. Komórki roślinne są zamknięte w sztywnej ścianie komórkowej zbudowanej z macierzy polisacharydowej, która spaja je ze sobą. W konsekwencji ekspansja komórki jest kontrolowana przez równowagę między ciśnieniem turgorowym oddziałującym na ścianę komórkową a sztywnością ściany komórkowej stawiającej opór temu ciśnieniu. Aby zrozumieć mechanizmy leżące u podłoża rozwoju, istotna jest możliwość pomiar...

Mikroskopia sił atomowych (AFM) należy do rodziny mikroskopii z sondą skanującą (SPM), gdzie końcówka o promieniu zwykle kilku nanometrów skanuje powierzchnię próbki. Wykrywanie powierzchni nie odbywa się za pomocą metod optycznych lub opartych na elektronach, ale za pomocą sił oddziaływania między końcówką a powierzchnią próbki. Technika ta nie ogranicza się więc do topograficznej charakterystyki powierzchni próbki (rozdzielczość 3D, która może spaść do kilku nanometrów), ale pozwala również na pomiar dowolnego rodzaju sił oddziaływania, takich jak elektrostatyczne, van der Waalsa czy siły kontaktowe. Ponadto końcówka może być używana do przykładania sił na powierzchni próbki biologicznej i pomiaru powstałego odkształcenia, tzw. "wgłębienia", w celu określenia jej właściwości mechanicznych (np. modułu Younga, właściwości lepkosprężyste).
Właściwości mechaniczne ścian komórkowych roślin są niezbędne do uwzględnienia przy próbie zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw procesów rozwojowych1,2,3. Rzeczywiście, właściwości te są ściśle kontrolowane podczas rozwoju, w szczególności dlatego, że zmiękczenie ściany komórkowej jest wymagane, aby umożliwić komórkom wzrost. AFM może być używany do pomiaru tych właściwości i badania sposobu, w jaki zmieniają się one między narządami, tkankami lub etapami rozwoju.
W tym artykule opisujemy, jak używamy AFM do pomiaru zarówno właściwości mechanicznych ściany komórkowej, jak i ciśnienia turgoru. Te dwa zastosowania zostały zademonstrowane na dwóch różnych mikroskopach AFM i zostały szczegółowo opisane poniżej.

<table><tbody><tr><td><silny>Pożywka wzrostowa</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000x roztwór podstawowy</td><td></td><td></td> wimatyny <td>używany do produkcji ACM, skład patrz Stanislas i wsp., 2017. Dodać do ACM po autoklawowaniu, przed nalaniem .</td></tr><tr><td>Kwas 1-N-Naftyloftalamowy (NPA)</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>132-66-1</td><td>dodać do pożywki Arabidopsis, 10 &mu;M. Dodać po autoklawowaniu, przed rozlaniem.</td></tr><tr><td>Agar-agar</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>9002-18-0</td><td>dodać do pożywki Arabidopsis, 1% w/v.</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Merck Millipore</td><td>9012-36-6</td><td>służy do wytwarzania stałego ACM, 0,8% w/v.</td></tr><tr><td>Arabidopsis podłoże</td><td>Duchefa Biochimie</td><td>DU0742.0025</td><td>Do hodowli rzodkiewnika in vitro, 11,82 g/L.</td></tr><tr><td>Czterowodny azotan wapnia</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>13477-34-4</td><td>dodać do pożywki Arabidopsis, 2 mM.</td></tr><tr><td>MURASHIGE & SKOOG MEDIUM</td><td>Duchefa Biochimie</td><td>M0221.0025</td><td>Mieszanka soli podstawowej, używana do produkcji ACM, 2,2 g/L.</td></tr><tr><td>N6-benzyladenina (BAP)</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>1214-39-7</td><td>używana do produkcji ACM, 555 nM. Dodać do ACM po autoklawowaniu, przed nalaniem .</td></tr><tr><td>Oryzalin</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>19044-88-3</td><td>do leczenia oryzalinem, 10 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Mieszanina do konserwacji roślin (PPM)</td>Technologia <td></td><td>komórek roślinnych</td><td>stosowana do wytwarzania ACM, 0,1% v/v. Dodaj do ACM po autoklawowaniu, przed nalewaniem.</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Duchefa Biochimie</td><td>1310-58-3</td><td>używany do produkcji pożywki Arabidopsis i ACM, oba o pH 5,8.</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Duchefa Biochimie</td><td>57-50-1</td><td>używana do produkcji ACM, 1% w/v.</td></tr><tr><td>Tools for AFM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioScope Catalyst BioAFM</td><td>Bruker</td><td></td><td>AFM używany do pomiaru ciśnienia turgoru w tym protokole.</td></tr><tr><td>Nanowizard III + CellHesion</td><td>JPK (Bruker)</td><td></td><td>AFM służy do pomiaru właściwości mechanicznych.</td></tr><tr><td>Patafix</td><td>UHU</td><td>D1620</td><td></td></tr><tr><td>Referencyjna struktura elastyczna</td><td>NanoIdea</td><td>2Z00026</td><td></td></tr><tr><td>Reprorubber-Thin Pour</td><td>Flexbar</td><td>16135</td><td>biokompatybilny klej.</td></tr><tr><td>Końcówki sferyczne AFM</td><td>Nanoandmore</td><td>SD-SPHERE-NCH-S-10</td><td>Końcówki służące do pomiaru właściwości mechanicznych.</td></tr></tbody></table>

zastosowanie mikroskopii sił atomowych do pomiaru właściwości mechanicznych i ciśnienia turgoru komórek roślinnych i tkanek roślinnych

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

Prezentujemy tutaj użycie mikroskopii sił atomowych do wcinania tkanek roślinnych i odzyskiwania ich właściwości mechanicznych. Używając dwóch różnych mikroskopów w trybie wgłębień, pokazujemy, jak zmierzyć moduł sprężystości i wykorzystać go do oceny właściwości mechanicznych ściany komórkowej. Ponadto wyjaśniamy również, jak ocenić ciśnienie turgoru. Głównymi zaletami mikroskopii sił atomowych jest to, że jest nieinwazyjna, stosunkowo szybka (5 ~ 20 min) oraz że praktycznie każdy rodzaj żywej tkanki roślinnej, która jest powierzchownie płaska, może być analizowany bez konieczności leczenia. Rozdzielczość może być bardzo dobra, w zależności od rozmiaru końcówki i liczby pomiarów na jednostkę powierzchni. Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że daje ona bezpośredni dostęp tylko do powierzchownej warstwy komórek.

Rysunek 1A oraz Rysunek 1B przedstawiają zrzut ekranu ilustrujący wynik kroków od 1.3.4 do 1.3.6 protokołu, służących do zlokalizowania obszaru zainteresowania, w którym zostanie uzyskana mapa QI. Warto wspomnieć, że obszar zainteresowania wybrano tak, aby nie znajdował się on na powierzchni nachylonej (tj. był jak najbardziej płaski). Rzeczywiście, jak zauważyli Routier i wsp.5, jeśli oś wciśnięcia nie je...

Tutaj prezentujemy mikroskopię sił atomowych (AFM), działającą jako narzędzie do nano- i mikro-indentacji komórek i tkanek. Przyrząd pozwala na jednoczesne pozyskiwanie topografii powierzchni 3D próbki i jej właściwości mechanicznych, w tym modułu Younga ściany komórkowej oraz ciśnienia turgoru.

Zastosowanie mikroskopii sił atomowych do pomiaru właściwości mechanicznych i ciśnienia turgoru komórek roślinnych i tkanek roślinnych

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

Właściwości mechaniczne komórek roślinnych są niezbędne, aby wziąć je pod uwagę przy próbie zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw rozwoju. Mikroskopia sił atomowych może być wykorzystana do pomiaru tych właściwości i śledzenia sposobu, w jaki się zmieniają między narządami, tkankami, wszystkimi etapami rozwoju. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie jest inwazyjna, jest stosunkowo szybka i nie wymaga leczenia, dzięki czemu można ją bezpośrednio stosować do żywych próbek.Dla kogoś, kto jest nowy w tej procedurze, przekrój cis próbki jest naprawdę krytyczny, więc upewnij się, że naprawdę masz prawidłowe mechaniczne mocowanie próbki. Wizualna demonstracja tej procedury ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia zawiłości utrwalania próbki, kontroli jakości próbek i konfiguracji pomiarowej. Procedurę zademonstrują Simone Bovio, inżynier i Yuchen Long, adiunkt w moim laboratorium.Aby rozpocząć, umieść kawałek dwustronnej taśmy w środku szalki Petriego o średnicy pięciu centymetrów. Dodaj próbkę genezjum, która została wyizolowana z pąka kwiatowego do taśmy. Szybko dodaj wodę do naczynia, aż próbka zostanie całkowicie pokryta, aby uniknąć odwodnienia.Następnie umieść próbkę na stoliku AFM i przesuń głowicę tak, aby znalazła się nad próbką. Po skalibrowaniu wspornika, w oprogramowaniu upewnij się, że system jest w trybie QI i zbliż się do próbki z zadaną siłą piętnastu nanoniutonów. Następnie ustaw długość Z na cztery mikrony i ustaw obszar skanowania na osiemdziesiąt na osiemdziesiąt mikronów do kwadratu z liczbą pikseli ustawioną na czterdzieści na czterdzieści.Następnie przejdź do panelu zaawansowanych ustawień obrazowania i ustaw tryb na stałą prędkość. Dodatkowo ustaw prędkość przedłużenia ścieżki wejściowej do dwustu mikronów na sekundę, a częstotliwość próbkowania na dwadzieścia pięć kiloherców. Po ustawieniu parametrów przesuń końcówkę do obszaru zainteresowania na próbce.Sprawdź, czy skanowany obszar jest wolny od zanieczyszczeń, zlokalizuj obszar, który jest tak płaski, jak to możliwe, i włącz się, a następnie rozpocznij skanowanie i użyj szybkiego skanowania o niskiej sile, aby sprawdzić, czy próbka się porusza. Po zlokalizowaniu obszaru zainteresowania wybierz obszar o wymiarach czterdzieści na czterdzieści do sześćdziesięciu na sześćdziesiąt mikronów do kwadratu i zwiększ liczbę pikseli do dwóch pikseli na mikron. Następnie zwiększ nastawę do pięciuset nanoniutonów, aby uzyskać wgłębienie od stu do dwustu nanometrów.Zmniejsz długość Z do dwóch mikronów, a wydłużenie prędkości wejściowej przewodu do stu mikronów na sekundę, a następnie zwiększ częstotliwość próbkowania do pięćdziesięciu kiloherców i rozpocznij skanowanie próbki. Po zakończeniu zapisz dane wyjściowe zarówno jako obraz, jak i plik danych. Otwórz oprogramowanie do przetwarzania danych i załaduj plik danych.Kliknij przycisk Użyj tej mapy do przetwarzania wsadowego, aby użyć tych samych parametrów na wszystkich krzywych mapy, a następnie przejdź do załadowania predefiniowanego procesu i wybierz dopasowanie hercowe. Następnie przejdź do przełączanej operacji linii bazowej i ustaw odejmowanie na przesunięcie plus pochylenie, a X min między czterdziestoma a sześćdziesięcioma procentami. Na karcie pionowej pozycji końcówki wybierz opcję Smooth tight, jeśli wolisz pracować na surowych danych.Aby wybrać odpowiedni model dopasowania, przejdź do zakładki dopasowania elastyczności i wybierz jedną z opcji w oparciu o oczekiwaną siłę przyczepności. Jeśli nie ma przyczepności lub występuje słaba przyczepność, należy użyć krzywej podejścia i preferować model iznadera herców. W przypadku silniejszej przyczepności należy skorzystać z modelu Dergen Milia Dortoprov lub DMD i pracować nad krzywą opóźnioną.Teraz ustaw parametry geometryczne końcówki na podstawie nominalnego kształtu końcówki. Końcówka użyta w tym eksperymencie to kulista końcówka o promieniu czterystu nanometrów. Następnie ustaw współczynnik Poissona na 0,5 i wybierz krzywe przesunięcia.Dodaj drugą rutynę dopasowania elastyczności, klikając ikonę obok okna głównego i powtórz te same ustawienia parametrów. Na koniec określ żądane wcięcie w X min, a następnie zachowaj i zastosuj do wszystkich, aby iterować poprzednie kroki na wszystkich krzywych mapy. Zapisz wyniki, aby uzyskać obraz w pliku dot tsv.Aby dokonać pomiaru z szybkimi zmianami roztworu, umieść próbkę na szalce Petriego, trzymając mały kawałek adhezyjnej masy uszczelniającej. Szybko uszczelnij szczelinę między mastyksem a podstawą próbki za pomocą biokompatybilnego kleju. Poczekaj, aż klej stwardnieje, a następnie zanurz próbkę w płynnym wierzchołkowym podłożu hodowlanym, zawierającym 0,1 procent mieszaniny do konserwacji roślin.Po kalibracji systemu otwórz oprogramowanie akwizycyjne i przejdź najpierw do okna sprawdzania parametrów. Tam ustaw stałą sprężystości na wyprodukowaną przez wspornik stałą sprężystości lub wyznaczoną stałą sprężystości. Następnie ustaw promień końcówki na czterysta nanometrów, współczynnik Poissona próbki na 0,5, linię próbki na sto dwadzieścia osiem, aby zapewnić szybką akwizycję, szybkość skanowania na 0,2 herca, a rozmiar skanowania na jeden mikron.Następnie przejdź do okna rampy i ustaw rozmiar rampy na pięć mikronów, próg wyzwalania na maksimum, a liczbę próbek na cztery tysiące sześćset osiem. Po ustawieniu wszystkich parametrów ostrożnie podejdź do próbki ręcznie. Gdy sonda znajduje się stosunkowo blisko powierzchni próbki, kliknij przycisk "Podejdź".Po kontakcie stopniowo zwiększaj rozmiar skanu i modyfikuj szybkość skanowania, aż do osiągnięcia pożądanej równowagi bez uszkodzenia próbki lub końcówki. Przenieś skanowanie, jeśli obszar pomiaru nie jest zgodny z oczekiwaniami. Gdy będziesz zadowolony, kliknij przycisk, wyceluj i strzelaj, aby zainicjować okno wskaż i strzelaj.Określ katalog zapisu i nazwę pliku. Następnie kliknij rampę przy następnym skanowaniu, aby rozpocząć nagrywanie. Po zakończeniu skanowania interfejs oprogramowania przekieruje do okna rampy.Kliknij zeskanowany obraz, aby określić pozycje wcięcia. Wybierz co najmniej trzy celowniki wcięć na komórkę w pobliżu jej środka jagody, ustaw ją tak, aby powtarzała wcięcie trzy razy z każdej strony, a następnie kliknij rampę i przechwyć. W oprogramowaniu analitycznym otwórz plik kropkowy MCA, który pokazuje położenie każdej krzywej siły na zeskanowanym obrazie.Następnie otwórz jedną krzywą siły, która ma zostać poddana analizie. Kliknij przycisk korekcji linii bazowej i przeciągnij niebieskie linie przerywane na krzywej siły, aż wydłuż początek źródłowej linii bazowej i wydłuż punkt źródłowej linii bazowej lub odpowiednio o 0 procent i 80 procent. Następnie kliknij wykonaj.Następnie kliknij przycisk filtra samochodowego i kliknij wykonaj, aby wygładzić krzywą siły. Następnie kliknij przycisk wcięcia. W oknie wejściowym ustaw aktywną krzywą na wydłużenie, piątą metodę na model zlinearyzowany, granicę dopasowania maksymalnej siły na 99 procent, granicę dopasowania minimalnej siły na 75 procent, a model dopasowania na sztywność.Analizuj krzywe siły w partii. Aby to osiągnąć, kliknij przycisk historii uruchamiania, określ katalog raportów i dodaj inne krzywe siły, które wymagają tego samego traktowania. Po zakończeniu kliknij przycisk Uruchom.Po dopasowaniu wsadowym wartości K kliknij przycisk Historia i przejdź do pozycji pięć wcięć, aby powrócić do okna wcięć. Tam zmień granicę dopasowania maksymalnej siły na dziesięć procent i minimalną granicę dopasowania siły na jeden procent. Następnie ustaw model dopasowania na Hertzian.Następnie otwórz odpowiedni plik, aby wyświetlić różne zeskanowane kanały. W oknie wysokiego kanału kliknij przycisk sekcji. Umożliwi to pomiar krzywizny powierzchni próbki, która jest wymagana do odliczenia ciśnienia turgoru.Następnie narysuj linię w poprzek długiej osi jednej komórki, przesuń granice linii przerywanej do krawędzi komórki i zapisz wartość promienia. Na koniec postępuj zgodnie z protokołem tekstowym, aby obliczyć średni moduł Younga, stałą sprężystości, E, K i ciśnienie turgoru dla każdej komórki. Obraz po lewej stronie to mapa modułu młodego, uzyskana poprzez analizę całego wgłębienia do nastawy siły zdefiniowanej przez użytkownika, podczas gdy obraz po prawej stronie pokazuje wynik analizy pierwszych stu nanometrów wcięcia.W tym przypadku obie mapy wyglądają bardzo podobnie, jednak zmienność głębokości wgłębienia może w niektórych przypadkach prowadzić do lepszego uwydatnienia niejednorodności próbki, co może być pomocne w identyfikacji lokalizacji lub dostarczeniu informacji na temat zachowania struktur wewnętrznych. Dla każdego punktu na tych mapach istnieje podstawowa krzywa siły. Pokazana tutaj krzywa ma dwa efekty, o których warto wspomnieć.Po pierwsze, jeśli zbliżająca się część krzywej siły kończy się na pięciuset nanoniutonach. Ruch końcówki w dół trwa nadal. Oznacza to, że końcowa siła przyłożona przez końcówkę jest wyższa niż oczekiwano.Drugą rzeczą, na którą należy zwrócić uwagę, jest fala na krzywej wycofania podkreślona przez elipsę. Takie falowanie może być wskaźnikiem przesuwania się lub drgania próbki pod wpływem działania końcówki i może być wymagane przejście na inną metodę utrwalania. Korzystając z procedury opisanej w tym artykule, wszystkie kluczowe parametry dla odliczenia ciśnienia turgoru, z wyjątkiem grubości ścianki komórki, można uzyskać ze skanów i wgłębień AFM.Krzywa siły głębokiego wgłębienia w pozycji czerwonego krzyża opisuje moduł Younga ściany komórkowej i pozorną sztywność próbki w różnych reżimach krzywej. Utrwalenie próbki ma kluczowe znaczenie. Podczas procesu pomiaru należy zwrócić uwagę na oznaki niestabilności próbki.Ostrożnie wybierz obszar o płaskiej powierzchni, aby zapewnić prostopadłe wcięcie. Postępując zgodnie z tą procedurą, można monitorować właściwości mechaniczne w czasie i w różnych warunkach. Można również nakładać pomiary mechaniczne na obrazy konfokalne w celu badań korelacyjnych.Technika ta toruje drogę do powiązania biomechaniki z rozwojem fizjologii i innymi procesami biologicznymi.

use-atomic-force-microscopy-to-measure-mechanical-properties-turgor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Celem niniejszej pracy jest przeszkolenie czytelnika w obsłudze zintegrowanego mikroskopu sił atomowych i obrazowania optycznego do stymulacji mechanicznej żywych komórek w hodowli. Przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.

Badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych

Ten artykuł demonstruje protokół charakteryzujący właściwości mechaniczne żywych komórek za pomocą mikrowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM).

Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Opisujemy metodę mapowania właściwości mechanicznych tkanek roślinnych za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM). Skupiamy się na tym, jak rejestrować zmiany mechaniczne, które zachodzą w ścianach komórkowych podczas rozwoju roślin w mezoskali szerokopolowej, umożliwiając skorelowanie tych zmian ze wzrostem i morfogenezą.

Mapowanie właściwości elastycznych ścian komórkowych w oparciu o AFM: w rozdzielczościach tkankowych, komórkowych i subkomórkowych

Tutaj opisujemy protokół obrazowania żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul korowych na merystemie wierzchołkowym pędu i monitorowania jego reakcji na zmiany sił fizycznych.

Obrazowanie żywych komórek cytoszkieletu mikrotubul i manipulacja mikromechaniczna merystemu wierzchołkowego rzodkiewnika

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Protokół wgłębień mikroskopii sił atomowych oferuje możliwość przeanalizowania roli fizycznych właściwości ściany komórkowej konkretnej komórki tkanki lub organu podczas normalnego lub ograniczonego wzrostu (tj. przy niedoborze wody).

Mikroskopia sił atomowych w celu zbadania właściwości fizycznych komórek naskórka żywych korzeni rzodkiewnika

Badania biomechaniki ściany komórkowej są niezbędne do zrozumienia wzrostu i morfogenezy roślin. Zaproponowano następujący protokół do zbadania cienkich pierwotnych ścian komórkowych w tkankach wewnętrznych młodych organów roślinnych za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Charakterystyka właściwości mechanicznych pierwotnej ściany komórkowej w żywych organach roślinnych z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych

Ten protokół opisuje metodę testowania hipotezy, że odwrócenie efektywnego pola geomagnetycznego (GMF) indukuje różnicową ekspresję genów i zmienia morfologię Arabidopsis thaliana. Trójosiowy ośmiokątny układ par cewek Helmholtza został wykorzystany do sztucznego generowania odwróconych warunków GMF w komorze wzrostu roślin.

Pole geomagnetyczne (Gmf) i ewolucja roślin: badanie wpływu odwrócenia GMF na rozwój Arabidopsis thaliana i ekspresję genów

Precyzyjna regulacja transkrypcji genów leży u podstaw decyzji o losie komórki embrionalnej. W niniejszym artykule opisujemy testy immunoprecypitacji chromatyny stosowane do badania epigenetycznej regulacji zarówno różnicowania komórek macierzystych w sercu, jak i rozwoju serca zarodków myszy.

Epigenetyczna regulacja różnicowania serca embrionalnych komórek macierzystych i tkanek

Przedstawiona tutaj jest prosta technika konfokalnego obrazowania poklatkowego o wysokiej rozdzielczości rozwoju korzeni i hipokotylu przez okres do 3 dni przy użyciu obiektywów o dużej aperturze numerycznej i perfluorodekaliny jako medium immersyjnego.

Prosta komora do długoterminowego obrazowania konfokalnego rozwoju korzeni i hipokotylu

Poznaj mikroskopię sił atomowych do pomiaru właściwości mechanicznych komórek roślinnych. Ta nieinwazyjna metoda pozwala mierzyć moduł Younga ściany komórkowej i ciśnienie turgoru w żywych tkankach.

Zastosowanie mikroskopii sił atomowych do pomiaru właściwości mechanicznych i ciśnienia turgoru komórek roślinnych i tkanek roślinnych (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie mikroskopii sił atomowych do pomiaru właściwości mechanicznych i ciśnienia turgoru komórek roślinnych i tkanek roślinnych

Przeglądaj więcej filmów