Platforma mikroprzepływowa do stymulacji chondrocytów za pomocą dynamicznej kompresji

To pneumatycznie aktywowane urządzenie do kompresji mikroprzepływowej może być używane do badania mechanobiologii w kulturach hydrożelowych 3D chondrocytów płytki wzrostowej. Urządzenie mikroprzepływowe jest opłacalne i efektywne czasowo, ponieważ może jednocześnie generować wiele wielkości ucisku na małych objętościach próbek, a za pomocą urządzenia można stosować różne obrazowania mikroskopowe. Nasza metoda może być również zastosowana do badania mechanobiologii innych typów komórek.

Aby ustawić warstwę mikrokanałową, najpierw mieszaj PDMS o stosunku wagowym 10 prepolimerów z jednym utwardzaczem przez pięć minut. Następnie umieść formę na podkładce piankowej i wlej mieszaninę do formy głównej. Odgazuj PDMS w komorze próżniowej na 30 minut i umieść odgazowany PDMS w kawałku przezroczystej folii.

Clamp zespół warstwowy ze szklaną płytą, podkładkami piankowymi i płytami z pleksi. Utwardź PDMS w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez sześć godzin i odizoluj warstwę PDMS i przezroczystą folię od struktury warstwowej. Aktywuj powierzchnie PDMS i czystą szklaną płytkę za pomocą środka do czyszczenia plazmowego na jedną minutę, a następnie przyklej PDMS do szklanej płytki w piekarniku o temperaturze 80 stopni Celsjusza na 30 minut.

Następnie usuń przezroczystą folię. W celu przygotowania cienkiej membrany PDMS, należy obrócić nieutwardzony PDMS na przezroczystej folii z prędkością 1 000 obrotów na minutę przez jedną minutę, aby uzyskać warstwę PDMS o grubości 60 mikrometrów. Częściowo utwardź PDMS z powłoką wirową w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut przed użyciem środka do czyszczenia plazmowego w celu aktywacji mikrokanałowej warstwy PDMS na szklanej płytce i cienkiej warstwy PDMS na jedną minutę.

Następnie przyklej cienką warstwę membrany PDMS do warstwy mikrokanałowej PDMS i umieść warstwy w piekarniku o temperaturze 80 stopni Celsjusza na noc. Do przygotowania bloku rurkowego umieść metalowe rurki pionowo na szalce Petriego i delikatnie wlej nieutwardzony PDMS do naczynia, aż około 3/4 probówek zostanie zanurzonych. Po odgazowaniu PDMS w komorze próżniowej przez 30 minut, utwardź PDMS w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez ponad sześć godzin.

Pod koniec procesu utwardzania wytnij kawałek bloku PDMS zawierający jedną rurkę i wybij otwór w cienkiej warstwie PDMS na wlot. Aktywuj blok PDMS i cienką warstwę PDMS za pomocą myjki plazmowej. Po jednej minucie przymocuj blok PDMS do otworu wlotowego cienkiej warstwy PDMS i umieść cały zespół uruchamiający w piekarniku w temperaturze 80 stopni Celsjusza na noc.

Do przygotowania formy w żelu agarozowym wymieszaj 5% agarozy i 200 milimolowy chlorek wapnia w wodzie dejonizowanej i podgrzej roztwór żelu agarozowego do wrzenia. Wlej ugotowany roztwór żelu agarozowego do aluminiowej formy i ułóż formę ze szklaną płytką. Po pięciu minutach wyjmij zestalony żel agarozowy z aluminiowej formy.

Umieść 150 mikrolitrów roztworu alginian-chondrocytów na amiinozylanizowanej szklanej płytce i przykryj roztwór formą żelu agarozowego na trzy minuty. Pod koniec inkubacji użyj żyletki, aby usunąć nadmiar roztworu żelu alginianowego i usuń formę żelu agarozowego z płytki. Następnie umieść konstrukty alginian-chondrocyty w roztworze sieciującym zawierającym 50 milimolowy chlorek wapnia i 140 milimolowy chlorek sodu w wodzie dejonizowanej na jedną minutę.

Aby zmontować urządzenie, umieść cztery przekładki PDMS o grubości jednego milimetra na czterech rogach cienkiej warstwy PDMS jednostki wykonawczej. Przykryj komory powietrzne cienkiej warstwy PDMS 700 mikrolitrami pożywki do hodowli chondrocytów. Za pomocą stereoskopowego mikrosopu umieść konstrukt alginian-chondrocyt na cienkiej warstwie PDMS, uważając, aby wyrównać konstrukty z komorami powietrznymi, i zaciśnij urządzenie za pomocą zacisków wydrukowanych w 3D.

Do uruchomienia urządzenia należy użyć kawałka silikonowej rurki do połączenia wylotu pompy powietrza z wlotem zaworu elektromagnetycznego. Użyj dodatkowego kawałka rurki, aby połączyć wylot elektrozaworu z wlotem zmontowanego urządzenia. Połącz zawór elektromagnetyczny z generatorem funkcyjnym i użyj fali prostokątnej o częstotliwości jednego herca generowanej przez generator funkcyjny do manipulowania zaworem elektromagnetycznym.

Następnie włącz pompę powietrza, aby uruchomić urządzenie pneumatycznie. Mikroprzepływowe urządzenie do kompresji chondrocytów zawiera pięć na pięć układów cylindrycznych konstruktów alginianowo-chondrocytowych, które można ściskać z pięcioma różnymi wielkościami kompresji. W tym przykładzie kolumna żelowa została ściśnięta o 33,8% wysokości przez największy balon PDMS, a wynikowe odkształcenie ściskające konstruktów żelowych wzrosło o około 5% na przyrost 0,2 milimetra i średnicę balonu PDMS.

Deformację kompresyjną chondrocytów określono przez obrazowanie komórek w objętości 613 na 613 na 40 do 55 mikrometrów w pobliżu centrum konstrukcji żelowej. Tutaj pokazano obraz chondrocytu, który został ściśnięty o 16% przez największy balon PDMS. Na tym wykresie można zaobserwować rozkład zmierzonych wartości odkształcenia kompresyjnego komórki.

W tej analizie komórki zostały ogólnie bardziej skompresowane przez większe balony PDMS. Podsumowując, dane te sugerują, że ilość żelu alginianowego i kompresji chondrocytów jest kontrolowana przez średnicę balonów PDMS pod stałym ciśnieniem 14 kilopaskalów. Aby zapewnić powtarzalność działania urządzenia, kluczowe jest stworzenie cienkiej membrany PDMS o stałej grubości i elastyczności.

Po tej procedurze można przeprowadzić różne testy biologiczne, takie jak immunofluorescencja i hybrydyzacja in situ. Korzystając z tej techniki, można odpowiedzieć na wiele pytań dotyczących mechanotransdukcji w płytce wzrostowej lub chondrocytach stawowych.