Name: Platforma mikroprzepływowa do stymulacji chondrocytów za pomocą dynamicznej kompresji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Poznaj mikroprzepływową platformę do badania mechanobiologii chondrocytów w 3D hydrogelach. Urządzenie umożliwia jednoczesną kompresję próbek o różnych natężeniach, wspierając mikroskopowe techniki obrazowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy doktorom Christopherowi Moraesowi i Stephenowi A. Morinowi za wsparcie w projektowaniu i produkcji urządzeń. Badanie to było wspierane przez grant Bioengineering for Human Health z University of Nebraska-Lincoln (UNL) i University of Nebraska Medical Center (UNMC) oraz grant AR070242 z NIH/NIAMS. Dziękujemy Janice A. Taylor i Jamesowi R. Talasce z Advanced Microscopy Core Facility w University of Nebraska Medical Center za pomoc w mikroskopii konfokalnej.

UWAGA: Na każdym kroku tego protokołu noś środki ochrony osobistej (PPE), takie jak rękawice i fartuch laboratoryjny.
1. Mistrz produkcji form
UWAGA: Wykonaj kroki 1.1 - 1.3 w dygestorium.
<ol>
	<li>Obróbka szkła 
	UWAGA: W kroku 1.1 należy nosić osłonę twarzy, rękawice i fartuch laboratoryjny.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór piranii (60 ml), mieszając kwas siarkowy (H2SO4) i nadtlenek wodoru (H2O2) o stosunku objętościowym 3:1, 
		UWAGA: Nie używaj roztworu Piranha i acetonu w tym samym dygestoriach ze względu na zagrożenie wybuchem.</li>
		<li>Umieścić szklaną płytkę (50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) w roztworze Piranha na 30 minut w temperaturze 40 °C.</li>
		<li>Opłukać szklaną płytkę wodą dejonizowaną (diH2O).</li>
		<li>Umieść szklaną płytkę w acetonie w temperaturze pokojowej na 10 minut.</li>
		<li>Przepłukać szklaną płytkę izopropanolem i osuszyć ją gazowym azotem (N2).</li>
		<li>Piecz szklaną płytę w temperaturze 200 °C przez 20 minut na gorącej płycie. Wszystkie kolejne etapy pieczenia wykorzystują płytę grzejną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzenie warstwy nasiennej SU-8 na szklanej płytce
	<ol>
		<li>Rozprowadzić SU-8 5 na szklanej płytce za pomocą jednorazowej pipety, aby pokryć około 2/3 powierzchni płytki.</li>
		<li>Wirować szklaną płytkę za pomocą fotorezystorów SU-8 5 z prędkością 500 obr./min przez 35 s (początkowy cykl wirowania), a następnie 2 500 obr./min przez 40 s (końcowy cykl wirowania) za pomocą powlekarki wirowej. Wszystkie kolejne etapy powlekania wirowego obejmują ten sam początkowy cykl wirowania.</li>
		<li>Piec powlekaną szklaną płytę SU-8 5 w temperaturze 65 °C przez 2 minuty, a następnie w temperaturze 95 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Wystaw powlekaną szklaną płytkę SU-8 5 na działanie światła UV (60 mW/cm2, odległość między lampą UV a fotomaską wynosi 20 cm, całkowita ilość energii światła UV = 60 mJ/cm2) przez 1 s. 
		UWAGA: Czas ekspozycji na promieniowanie UV należy dostosować do mocy używanego światła UV.</li>
		<li>Piecz powlekaną szklaną płytę SU-8 5 w temperaturze 65 °C przez 2 minuty i w temperaturze 95 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Umieść upieczony szklany talerz w wywoływaczu SU-8 na 2 minuty.</li>
		<li>Piec szkło powlekane SU-8 5 w temperaturze 180 °C przez 20 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie wzorów kanałów SU-8 przy użyciu fotolitografii (<silna klasa="xfig">Rysunek 2a Krok 1-3)
	<ol>
		<li>Wlej SU-8 100 na szklaną płytkę SU-8 5 z nasionami, aby pokryć około 2/3 powierzchni płytki.</li>
		<li>Obracaj szklaną płytkę za pomocą SU-8 100 z prędkością 3 000 obr./min przez 38 s (≈ 90 μm grubości).</li>
		<li>Piec powlekaną szklaną płytę SU-8 100 w temperaturze 65 °C przez 10 minut, a następnie w temperaturze 95 °C przez 30 minut. Jeśli po tej procedurze SU-8 100 nadal jest lepki, piecz szklaną płytkę przez dłuższy czas w temperaturze 95 °C, aż SU-8 100 stanie się nieklejąca.</li>
		<li>Umieść fotomaskę mikrokanałową o wysokiej rozdzielczości (25 400 dpi, patrz rysunek uzupełniający 1) na płycie szklanej powlekanej SU-8 100 i wystaw szklaną płytkę pokrytą fotomaską na działanie światła UV przez 4 s (całkowita ilość energii światła UV = 240 mJ/cm2). 
		UWAGA: Czas ekspozycji na promieniowanie UV należy dostosować do mocy używanego światła UV.</li>
		<li>Zdejmij fotomaskę ze szklanej płytki i piecz szklaną płytkę w temperaturze 65 °C przez 2 minuty, a następnie w temperaturze 95 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Upieczony szklany talerz przechowuj w pojemniku, który jest owinięty folią aluminiową, aby zablokować światło, do utwardzenia przez noc.</li>
		<li>Rozwijaj wzorce kanałów SU-8 100 na szklanej płycie w wywoływaczu SU-8 przez 15 minut.</li>
		<li>Umyj wzorzystą szklaną płytkę SU-8 (forma główna) alkoholem izopropylowym i osusz ją gazemN2. Jeśli podczas tego procesu pozostaną białe cząstki, powtórz krok 7 przez 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pneumatyczna jednostka uruchamiająca
<ol>
	<li>Warstwa mikrokanalikowa (warstwa 1) 
	UWAGA: Wykonaj kroki 2.1.1 - 2.1.2 w dygestorium.
	<ol>
		<li>Wrzuć 200 μl (tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo)-1-trichlorosilanu na szkiełko nakrywkowe i umieść je w komorze próżniowej z formą wzorcową.</li>
		<li>Stosować próżnię przez 2 min w komorze i odczekać 6 godzin (lub noc) na silanizację formy.</li>
		<li>Mieszać PDMS w proporcji wagowej 10:1 (prepolimer: utwardzacz) przez 5 min. 
		UWAGA: Wszystkie kolejne etapy odlewania PDMS zawierają ten sam stosunek wagowy prepolimeru i utwardzacza (10:1).</li>
		<li>Wlać PDMS na formę główną i odgazować PDMS w komorze próżniowej przez 30 min.</li>
		<li>Kanapka PDMS z kawałkiem przezroczystej folii.</li>
		<li>Zacisnąć powyższy zespół warstwowy za pomocą szklanej płyty, podkładek piankowych i płyt z pleksi (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2a Krok 4).</li>
		<li>Utwardzać PDMS w piecu w temperaturze 80 °C przez 6 godzin.</li>
		<li>Odizoluj warstwę PDMS (warstwa 1) folią przezroczystą od struktury warstwowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2a Krok 5).</li>
		<li>Aktywuj powierzchnie warstwy 1 i czystą płytkę szklaną (Płytka szklana 1; 50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) za pomocą myjki plazmowej przez 1 min. 
		UWAGA: Czas czyszczenia plazmowego może się różnić w zależności od mocy używanej myjki plazmowej.</li>
		<li>Przyklej warstwę 1 do szklanej płytki 1 i wstaw do piekarnika w temperaturze 80 °C na 30 minut.</li>
		<li>Usuń folię przezroczystą z warstwy 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cienka membrana PDMS (warstwa 2)
	<ol>
		<li>Wirować nieutwardzony PDMS na przezroczystej folii z prędkością 1 000 obr./min przez 1 minutę, aby uzyskać warstwę PDMS o grubości 60 μm.</li>
		<li>Częściowo utwardzić PDMS z powłoką wirową (warstwa 2) w piecu w temperaturze 80 °C przez 20-30 min.</li>
		<li>Aktywuj warstwę 1 na szklanej płytce 1 i warstwie 2 za pomocą myjki plazmowej przez 1 min. 
		UWAGA: Czas czyszczenia plazmowego może się różnić w zależności od mocy używanej myjki plazmowej.</li>
		<li>Przyklej warstwę 2 do warstwy 1 i wstaw na noc do piekarnika w temperaturze 80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blok rurowy
	<ol>
		<li>Umieść metalowe rurki pionowo na szalce Petriego.</li>
		<li>Delikatnie wlej PDMS do naczynia, aby zanurzyć około 3/4 metalowych rurek.</li>
		<li>Utwardzać PDMS w piecu w temperaturze 60 °C przez 6 godzin (lub przez noc).</li>
		<li>Wytnij kawałek bloku PDMS zawierający jedną metalową rurkę.</li>
		<li>Wybij otwór w warstwie 2 na wlot.</li>
		<li>Aktywuj blok PDMS i warstwę 2 za pomocą myjki plazmowej na 1 minutę.</li>
		<li>Przymocuj blok PDMS do części wlotowej warstwy 2 i umieść całą jednostkę uruchamiającą w piekarniku w temperaturze 80 °C na noc.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Konstrukty alginianowo-chondrocytowe (lub koralikowe)
<ol>
	<li>Płytka szklana aminosilanizowana
	<ol>
		<li>Wytnij szklaną płytkę (50,8 mm × 76,2 mm × 1,2 mm) na dwie połówki szklanej płytki (50,8 mm × 38,1 mm × 1,2 mm) za pomocą rysika diamentowego.</li>
		<li>Umieść szklane płytki w 0,2 M chlorowodoru (HCl) i delikatnie potrząśnij nimi (np. 55 obr./min) przez noc.</li>
		<li>Opłukać szklane płytki za pomocą diH2O.</li>
		<li>Potrząsać szklanymi płytkami w 0,1 M wodorotlenku sodu (NaOH) przez 1 godzinę przy 55 obr./min i przepłukać je diH2O.</li>
		<li>Potrząsać szklanymi płytkami w 1% (v/v) 3-aminopropylotrimetoksysilanie (APTES) przez 1 godzinę przy 55 obr./min i przepłukać je diH2O.</li>
		<li>Wysuszyć aminosilanizowane szklane płytki w dygestoriach przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Forma żelu agarozowego do konstrukcji żelu alginianowego
	<ol>
		<li>Zmieszać 5% (w/v) agarozy i 200 mM chlorku wapnia (CaCl2) w diH2O.</li>
		<li>Zagotuj roztwór żelu agarozowego w kuchence mikrofalowej (lub płycie grzejnej). Czas gotowania różni się w zależności od objętości roztworu żelu agarozowego i mocy kuchenki mikrofalowej (lub temperatury płyty grzejnej).</li>
		<li>Wlej ugotowany roztwór żelu agarozowego na aluminiową formę (patrz rysunek uzupełniający S2) i ułóż go na szklanej płytce.</li>
		<li>Odczekaj 5 minut i wyjmij zestalony żel agarozowy z aluminiowej formy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbiór chondrocytów na płytce wzrostu
	<ol>
		<li>Wyizoluj płytki wzrostu z tylnych kończyn nowonarodzonych myszy.</li>
		<li>Umieścić płytki wzrostowe w 1 ml 0,25% kolagenazy przez 3 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 8% dwutlenku węgla (CO2 ), aby usunąć macierz zewnątrzkomórkową (ECM).</li>
		<li>Odwirować strawioną próbkę przez 5 minut przy sile 125 x g, aby uzyskać osad chondrocytów i usunąć supernatant z próbki. Tutaj 1 x g to przyspieszenie ziemskie.</li>
		<li>Zawiesić osad chondrocytów w 1 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco.</li>
		<li>Policz liczbę chondrocytów w DMEM za pomocą licznika komórek.</li>
		<li>Odwirować chondrocyty w DMEM przez 5 minut przy 125 x g, aby ponownie wytworzyć osad chondrocytów i usunąć supernatant z próbki.</li>
		<li>Opcjonalnie ponownie zawiesić osad chondrocytów w pożywce do hodowli chondrocytów (CCM)34 zawierającej 2 μM kalceiny AM i inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Powtórzyć krok 3.3.6 i przejść do kroku 3.3.8.</li>
		<li>Zawiesić osad chondrocytów w żądanej objętości CCM i przechowywać go w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 8% CO2 przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konstrukty alginianowo-chondrocytowe (lub koralikowe) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2c)
	<ol>
		<li>Zmieszać 1,5% (w/v) alginianu w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS) z 5 mg/ml sulfo-NHS, 10 mg/ml chlorowodorku 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC).</li>
		<li>Dodać 8 x 106 chondrocytów do 1 ml roztworu żelu alginianowego [lub dodać 3 μl kulek fluorescencyjnych o średnicy 1 μm (542/612 nm) w 1 ml roztworu żelu alginianowego (0,3% (v/v))].</li>
		<li>Umieścić 150 μl roztworu alginianu i chondrocytów (lub kulek) na aminosilanizowanej szklanej płytce wykonanej w kroku 3.1.</li>
		<li>Przykryj roztwór żelu alginianowego foremką z żelu agarozowego na 3 minuty.</li>
		<li>Usuń nadmiar roztworu żelu alginianowego przelewającego się z formy żelu agarozowego za pomocą żyletki i usuń formę żelu agarozowego. Następnie na aminosilanizowanej szklanej płytce uzyskuje się cylindryczne konstrukty alginianowo-chondrocytowe (lub perełki).</li>
		<li>Umieść konstrukty alginian-chondrocyty w roztworze sieciującym (50 mM CaCl2 / 140 mM NaCl w diH2O) na 1 minutę w celu dalszej polimeryzacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Montaż urządzenia (Rysunek 2d)
UWAGA: Przekładki PDMS i zaciski drukowane w 3D muszą być przygotowane osobno.
<ol>
	<li>Zlokalizuj cztery podkładki dystansowe PDMS o grubości 1 mm w czterech rogach warstwy 2 jednostki uruchamiającej.</li>
	<li>Umieścić 700 μl CCM w celu przykrycia komór powietrznych warstwy 2.</li>
	<li>Umieść konstrukty alginianowo-chondrocytowe (lub koraliki) na warstwie 2, ostrożnie wyrównując konstrukty z komorami powietrznymi.</li>
	<li>Zamocuj urządzenie za pomocą zacisków wydrukowanych w 3D (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1c).</li>
</ol>
5. Uruchomienie urządzenia
<ol>
	<li>Połączyć wylot pompy powietrza (patrz tabela materiałów) z wlotem zaworu elektromagnetycznego z silikonową rurką.</li>
	<li>Połącz wylot elektrozaworu z wlotem zmontowanego urządzenia za pomocą silikonowej rurki.</li>
	<li>Podłączyć zawór elektromagnetyczny do generatora funkcyjnego.</li>
	<li>Manipulować zaworem elektromagnetycznym za pomocą fali prostokątnej (np. 1 Hz) generowanej przez generator funkcyjny.</li>
	<li>Włącz pompę powietrza, aby uruchomić urządzenie pneumatycznie.</li>
</ol>
6. Obrazowanie chondrocytów w urządzeniu
UWAGA: Aby uzyskać dobrą jakość obrazu, zobrazuj chondrocyty (lub fluorescencyjne koraliki) w żelu alginianowym przez Szklaną płytkę 2, ponieważ rozszerzone balony PDMS i komory powietrzne mogą zniekształcać obrazy optyczne. Jeśli do obrazowania używany jest mikroskop odwrócony, urządzenie należy ustawić tak, aby szklana płytka 2 była skierowana w dół.
<ol>
	<li>Przygotuj urządzenie z chondrocytami (lub kulkami fluorescencyjnymi), jak pokazano w poprzednich sekcjach.</li>
	<li>Wykonaj obrazy chondrocytów (lub kulek fluorescencyjnych) za pomocą mikroskopu konfokalnego odpowiednio przed i pod kompresją. Wybierz rozmiar kroku Z w oparciu o głębię ostrości używanego systemu obrazowania konfokalnego.</li>
	<li>Wysokość chondrocytów (lub konstruktu z kulek alginianowych) można zmierzyć za pomocą metody automatycznego przetwarzania obrazu przedstawionej w poprzednich literaturach26,35.</li>
</ol>

<ol><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+shear+devices+for+quantitative+analysis+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion.</a> Analytical Chemistry. 76 (18), 5257-5264 (2004).</li>
<li>Malek, A. M., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+endothelial+cell+shape+change+and+cytoskeletal+remodeling+in+response+to+fluid+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanism of endothelial cell shape change and cytoskeletal remodeling in response to fluid shear stress.</a> Journal of Cell Science. 109 (4), 713-726 (1996).</li>
<li>Paguirigan, A. L., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+meet+cell+biology%3A+bridging+the+gap+by+validation+and+application+of+microscale+techniques+for+cell+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Microfluidics meet cell biology: bridging the gap by validation and application of microscale techniques for cell biological assays.</a> BioEssays. 30 (9), 811-821 (2008).</li>
<li>García-Cardeña, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+activation+of+vascular+endothelium+as+a+determinant+of+its+functional+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (8), 4478-4485 (2001).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+arrays+for+high-throughput+screening+of+cellular+response+to+cyclic+substrate+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation.</a> Lab on a Chip. 10 (2), 227-234 (2010).</li>
<li>Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+platform+for+high-throughput+unconfined+compression+of+micropatterned+biomaterial+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays.</a> Biomaterials. 31 (3), 577-584 (2010).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+growth+in+3D+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnology and Bioengineering. 102 (2), 632-643 (2009).</li>
<li>Bougault, C., Paumier, A., Aubert-Foucher, E., Mallein-Gerin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+chondrocytes+cultured+in+agarose+in+response+to+dynamic+compression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of chondrocytes cultured in agarose in response to dynamic compression.</a> BMC Biotechnology. 8 (1), 71(2008).</li>
<li>Kaviani, R., Londono, I., Parent, S., Moldovan, F., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compressive+mechanical+modulation+alters+the+viability+of+growth+plate+chondrocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Compressive mechanical modulation alters the viability of growth plate chondrocytes in vitro.</a> Journal of Orthopaedic Research. 33 (11), 1587-1593 (2015).</li>
<li>Ménard, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamic+loading+reduces+bone+growth+without+histomorphometric+changes+of+the+growth+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamic loading reduces bone growth without histomorphometric changes of the growth plate.</a> Journal of Orthopaedic Research. 32 (9), 1129-1136 (2014).</li>
<li>Robling, A. G., Duijvelaar, K. M., Geevers, J. V., Ohashi, N., Turner, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+appositional+and+longitudinal+bone+growth+in+the+rat+ulna+by+applied+static+and+dynamic+force%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Modulation of appositional and longitudinal bone growth in the rat ulna by applied static and dynamic force.</a> Bone. 29 (2), 105-113 (2001).</li>
<li>Sergerie, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+plate+explants+respond+differently+to+in+vitro+static+and+dynamic+loadings%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Growth plate explants respond differently to in vitro static and dynamic loadings.</a> Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 473-480 (2011).</li>
<li>Valteau, B., Grimard, G., Londono, I., Moldovan, F., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamic+bone+growth+modulation+is+less+detrimental+but+as+effective+as+static+growth+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamic bone growth modulation is less detrimental but as effective as static growth modulation.</a> Bone. 49 (5), 996-1004 (2011).</li>
<li>Walsh, A. J. L., Lotz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+response+of+the+intervertebral+disc+to+dynamic+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading.</a> Journal of Biomechanics. 37 (3), 329-337 (2004).</li>
<li>Zimmermann, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+deformation+of+growth+plate+chondrocytes+in+stress-controlled+static+vs+dynamic+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">In situ deformation of growth plate chondrocytes in stress-controlled static vs dynamic compression.</a> Journal of Biomechanics. 56, 76-82 (2017).</li>
<li>Akyuz, E., Braun, J. T., Brown, N. A. T., Bachus, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+versus+dynamic+loading+in+the+mechanical+modulation+of+vertebral+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Static versus dynamic loading in the mechanical modulation of vertebral growth.</a> Spine. 31 (25), E952-E958 (2006).</li>
<li>Alberty, A., Peltonen, J., Ritsilä, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+distraction+and+compression+on+proliferation+of+growth+plate+chondrocytes%3A+A+study+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthopaedica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Effects of distraction and compression on proliferation of growth plate chondrocytes: A study in rabbits.</a> Acta Orthopaedica Scandinavica. 64 (4), 449-455 (1993).</li>
<li>Amini, S., Veilleux, D., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+and+cellular+morphological+changes+in+growth+plate+explants+under+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Tissue and cellular morphological changes in growth plate explants under compression.</a> Journal of Biomechanics. 43 (13), 2582-2588 (2010).</li>
<li>Aronsson, D. D., Stokes, I. A. F., Rosovsky, J., Spence, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+modulation+of+calf+tail+vertebral+growth%3A+implications+for+scoliosis+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Spinal+Disorders%22%5BJournal%5D)">Mechanical modulation of calf tail vertebral growth: implications for scoliosis progression.</a> Journal of Spinal Disorders. 12 (2), 141-146 (1999).</li>
<li>Cancel, M., Grimard, G., Thuillard-Crisinel, D., Moldovan, F., Villemure, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+in+vivo+static+compressive+loading+on+aggrecan+and+type+II+and+X+collagens+in+the+rat+growth+plate+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Effects of in vivo static compressive loading on aggrecan and type II and X collagens in the rat growth plate extracellular matrix.</a> Bone. 44 (2), 306-315 (2009).</li>
<li>Reich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weight+loading+young+chicks+inhibits+bone+elongation+and+promotes+growth+plate+ossification+and+vascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Weight loading young chicks inhibits bone elongation and promotes growth plate ossification and vascularization.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2381-2389 (2005).</li>
<li>Stokes, I. A., Mente, P. L., Iatridis, J. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlargement+of+growth+plate+chondrocytes+modulated+by+sustained+mechanical+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery%22%5BJournal%5D)">Enlargement of growth plate chondrocytes modulated by sustained mechanical loading.</a> Journal of Bone and Joint Surgery. 84 (10), 1842-1848 (2002).</li>
<li>Stokes, I. A. F., Clark, K. C., Farnum, C. E., Aronsson, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+growth+plate+associated+with+growth+modulation+by+sustained+compression+or+distraction%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Alterations in the growth plate associated with growth modulation by sustained compression or distraction.</a> Bone. 41 (2), 197-205 (2007).</li>
<li>Lee, D., Erickson, A., Dudley, A. T., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+of+growth+plate+chondrocytes%3A+previous+approaches+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Mechanics%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation of growth plate chondrocytes: previous approaches and future directions.</a> Experimental Mechanics. , (2018).</li>
<li>Lee, D., Erickson, A., You, T., Dudley, A. T., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumatic+microfluidic+cell+compression+device+for+high-throughput+study+of+chondrocyte+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Pneumatic microfluidic cell compression device for high-throughput study of chondrocyte mechanobiology.</a> Lab on a Chip. 18 (14), 2077-2086 (2018).</li>
<li>Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compression-induced+changes+in+the+shape+and+volume+of+the+chondrocyte+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Compression-induced changes in the shape and volume of the chondrocyte nucleus.</a> Journal of Biomechanics. 28 (12), 1529-1541 (1995).</li>
<li>Knight, M. M., Ghori, S. A., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+deformation+of+isolated+chondrocytes+in+agarose+subjected+to+cyclic+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Engineering+%26+Physics%22%5BJournal%5D)">Measurement of the deformation of isolated chondrocytes in agarose subjected to cyclic compression.</a> Medical Engineering & Physics. 20 (9), 684-688 (1998).</li>
<li>Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+platforms+for+mechanically+dynamic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microfabricated platforms for mechanically dynamic cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e224(2010).</li>
<li>Sim, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pneumatic+micro+cell+chip+for+the+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+under+mechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A pneumatic micro cell chip for the differentiation of human mesenchymal stem cells under mechanical stimulation.</a> Lab on a Chip. 7 (12), 1775-1782 (2007).</li>
<li>Hosmane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valve-based+microfluidic+compression+platform%3A+single+axon+injury+and+regrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth.</a> Lab on a Chip. 11 (22), 3888-3895 (2011).</li>
<li>Ho, K. K. Y., Wang, Y. L., Wu, J., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+microfluidic+device+designed+for+cyclic+compression+of+single+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advanced microfluidic device designed for cyclic compression of single adherent cells.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6 (148), (2018).</li>
<li>Seo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interconnectable+dynamic+compression+bioreactors+for+combinatorial+screening+of+cell+mechanobiology+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Interconnectable dynamic compression bioreactors for combinatorial screening of cell mechanobiology in three dimensions.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (16), 13293-13303 (2018).</li>
<li>Erickson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable%2C+three-dimensional+in+Vitro+culture+model+of+growth+plate+cartilage+using+alginate+hydrogel+acaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">A tunable, three-dimensional in Vitro culture model of growth plate cartilage using alginate hydrogel acaffolds.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (1-2), 94-105 (2018).</li>
<li>Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+confocal+microscopy+indentation+method+for+hydrogel+elasticity+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement.</a> Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).</li>
<li>Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+characterization+of+bulk+Sylgard+184+for+microfluidics+and+microengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby przetestować wpływ stresu ściskającego na chondrocyty płytki wzrostu, opracowaliśmy mikroprzepływowe urządzenie do kompresji chondrocytów (ryc. 1), aby zastosować różne poziomy stresu ściskającego do chondrocytów w rusztowaniu hydrożelowym alginianowym do hodowli 3D w sposób wysokoprzepustowy. Aby pomóc innym badaczom w przyjęciu naszego urządzenia lub opracowaniu podobnych urządzeń, w tym artykule dotyczącym protokołu przedstawiliśmy szczegółowe informacje na temat etapów produkcji urzą...

Platformy mikroinżynieryjne są cennymi narzędziami do badania biologii na poziomie molekularnym, komórkowym i tkankowym, ponieważ umożliwiają dynamiczną kontrolę zarówno fizycznych, jak i chemicznych mikrośrodowisk1,2,3,4,5,6,7, 8. W ten sposób wiele hipotez może być jednocześnie testowanych w ściśle kontrolowany sposób. W przypadku chrząstki płytki wzrostowej istnieje coraz więcej dowodów na ważną rolę stresu ściskającego w modulowaniu wzrostu kości poprzez działanie na chrząstkę płytki wzrostowej9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. Jednak mechanizm działania stresu ściskającego – a w szczególności sposób, w jaki stres kieruje tworzeniem kolumn chondrocytów w płytce wzrostowej – jest słabo poznany.
Celem tego protokołu jest stworzenie pneumatycznie uruchamiającego mikroprzepływowego urządzenia do kompresji chondrocytów26 w celu wyjaśnienia mechanizmów mechanobiologii w chondrocytach płytki wzrostu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1a-c). Urządzenie składa się z dwóch części: pneumatycznej jednostki uruchamiającej i konstrukcji z żelu alginianowego. Mikroprzepływowy napęd pneumatyczny jest wytwarzany przy użyciu polidimetylosiloksanu (PDMS) w oparciu o foto- i miękką litografię. To urządzenie zawiera układ 5 x 5 cienkich balonów membranowych PDMS, które można napompować w różny sposób w zależności od ich średnicy. Konstrukt żelu alginianowego składa się z chondrocytów osadzonych w układzie cylindrów z żelu alginianowego o wymiarach 5 x 5, a całe konstrukty alginianowo-chondrocytowe są połączone z jednostką uruchamiającą. Konstrukty żelu alginianowego są ściskane przez pneumatycznie napompowane balony PDMS (<silna klasa="xfig">Rysunek 1b). Urządzenie mikroprzepływowe może generować pięć różnych poziomów naprężeń ściskających jednocześnie na jednej platformie w oparciu o różnice w średnicy balonu PDMS. W ten sposób możliwy jest wysokoprzepustowy test mechanobiologii chondrocytów w warunkach wielokrotnej kompresji.
Urządzenie mikroprzepływowe opisane w tym protokole ma wiele zalet w porównaniu z konwencjonalnymi urządzeniami kompresyjnymi, takimi jak zewnętrzne stabilizatory14,21,23 i makroskopowe urządzenia kompresyjne16,19,27,28 do badania mechanobiologii chondrocytów: 1) Urządzenie mikroprzepływowe jest opłacalne, ponieważ zużywa mniejszą objętość próbek niż makroskopowe urządzenie kompresyjne, 2) Urządzenie mikroprzepływowe jest efektywne czasowo, ponieważ może testować wiele warunków kompresji jednocześnie, 3) Urządzenie mikroprzepływowe może łączyć bodźce mechaniczne i chemiczne, tworząc gradient stężeń substancji chemicznych oparty na ograniczonym mieszaniu w mikrokanałach, oraz 4) Różne techniki mikroskopowe (mikroskopia poklatkowa i fluorescencyjna mikroskopia konfokalna) mogą być stosowane za pomocą urządzenia mikroprzepływowego wykonanego z przezroczystego PDMS.
Przyjęliśmy i zmodyfikowaliśmy metodę Moraes et al.7,29, aby stworzyć różne poziomy stresu kompresyjnego w jednym urządzeniu, aby umożliwić wysokoprzepustowe badania mechanobiologii kompresji chondrocytów. Nasze podejście jest odpowiednie dla komórek (np. chondrocytów), które wymagają trójwymiarowego (3D) środowiska hodowli oraz dla testów biologicznych po kompresji komórek. Chociaż niektóre urządzenia do kompresji komórek mikroprzepływowych mogą kompresować komórki hodowane na dwuwymiarowych (2D) podłożach30,31,32, nie mogą być używane do chondrocytów, ponieważ chondrocyty hodowane 2D deróżnicują. Istnieją platformy mikroprzepływowe do kompresji komórek hodowanych w 3D w fotopolimeryzowanych hydrożelach7,33, ale są one ograniczone w izolowaniu komórek po eksperymentach z kompresją, ponieważ izolowanie komórek od fotopolimeryzowanego hydrożelu nie jest łatwe. Ponadto może być konieczna ocena wpływu ekspozycji na promieniowanie ultrafioletowe (UV) i inicjatorów sieciowania fotograficznego na komórki. W przeciwieństwie do tego, nasza metoda pozwala na szybką izolację komórek po eksperymentach kompresyjnych do testów postbiologicznych, ponieważ hydrożele alginianowe mogą być szybko depolimeryzowane przez chelatory wapnia. Szczegółowe metody wytwarzania i charakteryzowania urządzeń są opisane w niniejszym protokole. Krótka procedura wytwarzania mikroprzepływowego urządzenia do kompresji chondrocytów jest pokazana na Rysunek 2.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropylo)trietoksysilan (ATPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>741442-100ML</td><td></td></tr><tr><td>(Tridekafluoro-1, 1, 2, 2-Tetrahydrooktylo)-1-Trichlorosilan</td><td>United Chemical Technologies</td><td>T2492-KG</td><td></td></tr><tr><td>Arkusz akrylowy</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K354</td><td></td></tr><tr><td>Pompa powietrza</td><td>Schwarzer Precision</td><td>SP 500 EC-LC4.5V DC</td><td>Użyliśmy modelu zakupionego w 2015 roku. Na początku 2016 roku zmieniła się wewnętrzna konstrukcja i wydajność pompy powietrza (SP 500 EC-LC). Również wydajność pompy powietrza zmieniła się z biegiem czasu. Dlatego ciśnienie powietrza wytwarzane przez pompę powietrza SP 500 EC-LC powinno być skalibrowane przed użyciem.</td></tr><tr><td>Proszek alginianowy</td><td>FMC Corporation</td><td>Pronova UP MVG</td><td></td></tr><tr><td>Barb Łączniki proste (metalowa rurka)</td><td>Pneumadyne</td><td>EB40-250</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Invitrogen</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Barwione na czerwono wodne cząstki fluorescencyjne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0100</td><td></td></tr><tr><td>EDC (chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu)Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka piankowa</td><td>GRAINGER</td><td>Pozycja # 5GCE8</td><td></td></tr><tr><td>Funkcja / Generator przebiegów arbitralnych</td><td>Keysight Technologies</td><td>33210A</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher Chemical</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek</td><td>wodoru Fisher BioOdczynniki</td><td>BP2633500</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>BDH1174-4LP</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-267-013</td><td></td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia</td><td>plazmy Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST ZESTAW 0,5KG</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>Keysight Technologies</td><td>E3630A</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Chemical</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Kolektor elektromagnetyczny</td><td>Pneumadyne</td><td>MSV10-1</td><td></td></tr><tr><td>Zawór elektromagnetyczny</td><td>Pneumadyne</td><td>S10MM-30-12-3</td><td></td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-650Mz-23NPPB</td><td></td></tr><tr><td>SU8 Deweloper</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y020100 4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>SU8-100</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y131273 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>SU8-5</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y131252 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS (N-hydroksysulfobursztynimid)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>EMD Millipore</td><td>MSX12445</td><td></td></tr></tbody></table>

platforma mikroprzepływowa do stymulacji chondrocytów za pomocą dynamicznej kompresji

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Wiadomo, że bodźce mechaniczne modulują biologiczne funkcje komórek i tkanek. Ostatnie badania sugerują, że stres kompresyjny zmienia architekturę chrząstki płytki wzrostowej i powoduje modulację wzrostu kości długich u dzieci. Aby określić rolę naprężeń ściskających we wzroście kości, stworzyliśmy urządzenie mikroprzepływowe uruchamiane ciśnieniem pneumatycznym, aby dynamicznie (lub statycznie) ściskać chondrocyty płytki wzrostowej osadzone w cylindrach z hydrożelem alginianowym. W tym artykule opisujemy szczegółowe metody wytwarzania i charakteryzowania tego urządzenia. Zalety naszego protokołu to: 1) Pięć różnych wielkości naprężeń ściskających można wygenerować na pięciu kontrpróbach technicznych na jednej platformie, 2) Łatwo jest zobrazować morfologię komórek za pomocą konwencjonalnego mikroskopu świetlnego, 3) Komórki można szybko wyizolować z urządzenia po kompresji, aby ułatwić dalsze testy, oraz 4) platforma może być stosowana do badania mechanobiologii dowolnego typu komórek, które mogą rosnąć w hydrożelach.

Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowe etapy wykonania mikrofluidycznego urządzenia do kompresji chondrocytów (Rysunek 2). Urządzenie zawiera macierz 5 x 5 cylindrycznych konstruktów alginianowo-chondrocytowych, które mogą być poddawane kompresji o pięciu różnych wartościach (Rysunek 1, Rysunek 3 oraz Rysunek 4). Wysokość pneumatycznego mikrokanału wynosi około 90 μm, a średnice baloników z PDMS to o...

Ten artykuł zawiera szczegółowe metody wytwarzania i charakteryzowania pneumatycznie uruchamiającego urządzenia mikroprzepływowego do kompresji chondrocytów.

Platforma mikroprzepływowa do stymulacji chondrocytów za pomocą dynamicznej kompresji

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

To pneumatycznie aktywowane urządzenie do kompresji mikroprzepływowej może być używane do badania mechanobiologii w kulturach hydrożelowych 3D chondrocytów płytki wzrostowej. Urządzenie mikroprzepływowe jest opłacalne i efektywne czasowo, ponieważ może jednocześnie generować wiele wielkości ucisku na małych objętościach próbek, a za pomocą urządzenia można stosować różne obrazowania mikroskopowe. Nasza metoda może być również zastosowana do badania mechanobiologii innych typów komórek.Aby ustawić warstwę mikrokanałową, najpierw mieszaj PDMS o stosunku wagowym 10 prepolimerów z jednym utwardzaczem przez pięć minut. Następnie umieść formę na podkładce piankowej i wlej mieszaninę do formy głównej. Odgazuj PDMS w komorze próżniowej na 30 minut i umieść odgazowany PDMS w kawałku przezroczystej folii.Clamp zespół warstwowy ze szklaną płytą, podkładkami piankowymi i płytami z pleksi. Utwardź PDMS w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez sześć godzin i odizoluj warstwę PDMS i przezroczystą folię od struktury warstwowej. Aktywuj powierzchnie PDMS i czystą szklaną płytkę za pomocą środka do czyszczenia plazmowego na jedną minutę, a następnie przyklej PDMS do szklanej płytki w piekarniku o temperaturze 80 stopni Celsjusza na 30 minut.Następnie usuń przezroczystą folię. W celu przygotowania cienkiej membrany PDMS, należy obrócić nieutwardzony PDMS na przezroczystej folii z prędkością 1 000 obrotów na minutę przez jedną minutę, aby uzyskać warstwę PDMS o grubości 60 mikrometrów. Częściowo utwardź PDMS z powłoką wirową w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut przed użyciem środka do czyszczenia plazmowego w celu aktywacji mikrokanałowej warstwy PDMS na szklanej płytce i cienkiej warstwy PDMS na jedną minutę.Następnie przyklej cienką warstwę membrany PDMS do warstwy mikrokanałowej PDMS i umieść warstwy w piekarniku o temperaturze 80 stopni Celsjusza na noc. Do przygotowania bloku rurkowego umieść metalowe rurki pionowo na szalce Petriego i delikatnie wlej nieutwardzony PDMS do naczynia, aż około 3/4 probówek zostanie zanurzonych. Po odgazowaniu PDMS w komorze próżniowej przez 30 minut, utwardź PDMS w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez ponad sześć godzin.Pod koniec procesu utwardzania wytnij kawałek bloku PDMS zawierający jedną rurkę i wybij otwór w cienkiej warstwie PDMS na wlot. Aktywuj blok PDMS i cienką warstwę PDMS za pomocą myjki plazmowej. Po jednej minucie przymocuj blok PDMS do otworu wlotowego cienkiej warstwy PDMS i umieść cały zespół uruchamiający w piekarniku w temperaturze 80 stopni Celsjusza na noc.Do przygotowania formy w żelu agarozowym wymieszaj 5% agarozy i 200 milimolowy chlorek wapnia w wodzie dejonizowanej i podgrzej roztwór żelu agarozowego do wrzenia. Wlej ugotowany roztwór żelu agarozowego do aluminiowej formy i ułóż formę ze szklaną płytką. Po pięciu minutach wyjmij zestalony żel agarozowy z aluminiowej formy.Umieść 150 mikrolitrów roztworu alginian-chondrocytów na amiinozylanizowanej szklanej płytce i przykryj roztwór formą żelu agarozowego na trzy minuty. Pod koniec inkubacji użyj żyletki, aby usunąć nadmiar roztworu żelu alginianowego i usuń formę żelu agarozowego z płytki. Następnie umieść konstrukty alginian-chondrocyty w roztworze sieciującym zawierającym 50 milimolowy chlorek wapnia i 140 milimolowy chlorek sodu w wodzie dejonizowanej na jedną minutę.Aby zmontować urządzenie, umieść cztery przekładki PDMS o grubości jednego milimetra na czterech rogach cienkiej warstwy PDMS jednostki wykonawczej. Przykryj komory powietrzne cienkiej warstwy PDMS 700 mikrolitrami pożywki do hodowli chondrocytów. Za pomocą stereoskopowego mikrosopu umieść konstrukt alginian-chondrocyt na cienkiej warstwie PDMS, uważając, aby wyrównać konstrukty z komorami powietrznymi, i zaciśnij urządzenie za pomocą zacisków wydrukowanych w 3D.Do uruchomienia urządzenia należy użyć kawałka silikonowej rurki do połączenia wylotu pompy powietrza z wlotem zaworu elektromagnetycznego. Użyj dodatkowego kawałka rurki, aby połączyć wylot elektrozaworu z wlotem zmontowanego urządzenia. Połącz zawór elektromagnetyczny z generatorem funkcyjnym i użyj fali prostokątnej o częstotliwości jednego herca generowanej przez generator funkcyjny do manipulowania zaworem elektromagnetycznym.Następnie włącz pompę powietrza, aby uruchomić urządzenie pneumatycznie. Mikroprzepływowe urządzenie do kompresji chondrocytów zawiera pięć na pięć układów cylindrycznych konstruktów alginianowo-chondrocytowych, które można ściskać z pięcioma różnymi wielkościami kompresji. W tym przykładzie kolumna żelowa została ściśnięta o 33,8% wysokości przez największy balon PDMS, a wynikowe odkształcenie ściskające konstruktów żelowych wzrosło o około 5% na przyrost 0,2 milimetra i średnicę balonu PDMS.Deformację kompresyjną chondrocytów określono przez obrazowanie komórek w objętości 613 na 613 na 40 do 55 mikrometrów w pobliżu centrum konstrukcji żelowej. Tutaj pokazano obraz chondrocytu, który został ściśnięty o 16% przez największy balon PDMS. Na tym wykresie można zaobserwować rozkład zmierzonych wartości odkształcenia kompresyjnego komórki.W tej analizie komórki zostały ogólnie bardziej skompresowane przez większe balony PDMS. Podsumowując, dane te sugerują, że ilość żelu alginianowego i kompresji chondrocytów jest kontrolowana przez średnicę balonów PDMS pod stałym ciśnieniem 14 kilopaskalów. Aby zapewnić powtarzalność działania urządzenia, kluczowe jest stworzenie cienkiej membrany PDMS o stałej grubości i elastyczności.Po tej procedurze można przeprowadzić różne testy biologiczne, takie jak immunofluorescencja i hybrydyzacja in situ. Korzystając z tej techniki, można odpowiedzieć na wiele pytań dotyczących mechanotransdukcji w płytce wzrostowej lub chondrocytach stawowych.

a-microfluidic-platform-for-stimulating-chondrocytes-with-dynamic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Opisano trójwymiarowy system hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w wysokim stężeniu płynu stawowego. Płyn stawowy odzwierciedla najbardziej naturalne mikrośrodowisko dla chrząstki stawowej, a jego pozyskanie i przechowywanie są łatwe. System ten może zatem być wykorzystywany do badania regeneracji chrząstki oraz do przesiewu terapeutyków stosowanych w leczeniu zapalenia stawów.

System 3D do hodowli ludzkich chondrocytów stawowych w płynie stawowym

Biosynteza chrzęstnej macierzy pozakomórkowej przez chondrocyty może ulegać zmianom pod wpływem bodźców mechanicznych. Niniejsza metoda opisuje technikę aplikowania dynamicznych odkształceń ściskających do chondrocytów zamkniętych w konstrukcjach 3D oraz ocenę indukowanych zmian w metabolizmie chondrocytów.

Mechaniczna stymulacja hydrożeli z chondrocytów i agarozy

Zaprojektowaliśmy nowatorski bioreaktor obciążenia mechanicznego, który może zastosować jednoosiowe lub dwuosiowe naprężenie mechaniczne do biokompozytu chrząstki przed przeszczepem do ubytku chrząstki stawowej.

Projekt dwuosiowego bioreaktora obciążenia mechanicznego dla inżynierii tkankowej

Naprawa chrząstki stanowi niespełnione wyzwanie medyczne, a oparte na komórkach podejścia do inżynierii ludzkiej chrząstki stawowej są obiecującym rozwiązaniem. W tym miejscu opisujemy trójwymiarowe (3D) hydrożele biomimetyczne jako idealne narzędzie do ekspansji i dojrzewania chondrocytów stawowych człowieka.

Rusztowania hydrożelowe 3D do hodowli chondrocytów stawowych i wytwarzania chrząstek

Chondrogeneza z komórek macierzystych wymaga precyzyjnego dostrojenia warunków hodowli. W tym miejscu przedstawiamy magnetyczne podejście do kondensacji komórek, które jest niezbędnym krokiem do zainicjowania chondrogenezy. Ponadto wykazaliśmy, że dynamiczne dojrzewanie w bioreaktorze stosuje mechaniczną stymulację konstruktów komórkowych i zwiększa produkcję chrzęstnej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Agregacja magnetycznych komórek macierzystych 3D i dojrzewanie bioreaktora w celu regeneracji chrząstki

Przedstawiamy metodę oceny przestrzennego zasięgu uszkodzenia/śmierci komórek na powierzchni stawowej nienaruszonych stawów mysich po zastosowaniu kontrolowanych obciążeń mechanicznych lub uderzeń. Metoda ta może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób choroba zwyrodnieniowa stawów, czynniki genetyczne i/lub różne schematy obciążenia wpływają na podatność chondrocytów in situ.

Wizualizacja i analiza w czasie rzeczywistym uszkodzeń chondrocytów spowodowanych obciążeniem mechanicznym w całkowicie nienaruszonych eksplantatach chrząstki myszy

Tutaj prezentujemy protokoły analizy przebudowy kości w ramach platformy lab-on-a-chip. Wydrukowane w 3D mechaniczne urządzenie ładujące można sparować z platformą w celu wywołania mechanostransdukcji osteocytów poprzez deformację macierzy komórkowej. Platforma może być również wykorzystana do ilościowego określenia funkcjonalnych wyników przebudowy kości na podstawie osteoklastów i osteoblastów (resorpcja/tworzenie).

Platforma lab-on-a-chip do stymulacji mechanotransdukcji osteocytów i analizy funkcjonalnych wyników przebudowy kości

Udostępniamy szczegółowe metody generowania czterech typów tkanek z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, które są używane do rekapitulacji chrząstki, kości, poduszeczki tłuszczowej i błony maziowej w ludzkim stawie kolanowym. Te cztery tkanki są zintegrowane z dostosowanym bioreaktorem i połączone za pomocą mikrofluidyki, tworząc w ten sposób staw kolanowy na chipie.

Stworzenie stawu kolanowego na chipie do modelowania chorób stawów i testowania leków

To badanie opisuje metodę wytwarzania sferoid chondrocytarnych poprzez agregację komórek w sferoidy w warunkach niskiej adhezji przy użyciu grawitacji, a następnie hodowlę powstałych sferoid w mini-bioreaktorach.

Generowanie sferoid z różnych chondrocytów przy użyciu warunków niskiej przyczepności w warunkach grawitacyjnych i domowych mini-bioreaktorów

Poznaj mikroprzepływową platformę do badania mechanobiologii chondrocytów w 3D hydrogelach. Urządzenie umożliwia jednoczesną kompresję próbek o różnych natężeniach, wspierając mikroskopowe techniki obrazowania.

Platforma mikroprzepływowa do stymulacji chondrocytów za pomocą dynamicznej kompresji

Przeglądaj więcej filmów