Humanizowany model ksenoprzeszczepu z ludzkimi komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC) do badań immunoonkologicznych translacyjnych (I-O)

Nasz protokół może służyć jako ogólna wskazówka do ustanawiania modeli mysich odtworzonych za pomocą ludzkiego PBMC i nowotworów do badań immunoonkologicznych. Procedury te zapewniają opłacalne i wysoce powtarzalne podejście do częściowego odtworzenia ludzkiej odporności u myszy z nowotworem poprzez podskórne i zmieszanie ludzkiego PBMC z ksenoprzeszczepami nowotworowymi. Procedury zademonstrują mi Xinxin Cui, Yanjuan Zhang, Huichen Bai i Xiaolong Yang, przysłani nas z Działu Farmakologii.

W przypadku zubożenia komórek szpikowych dootrzewnowo podawaj 100 mg na kilogram cyklofosfamidu i doustnie podawaj 125 mg na kilogram disulfiramu samicom myszy w wieku od sześciu do ośmiu tygodni NOD/SCID raz dziennie przez dwa dni. 24 godziny po drugiej dawce cyklofosfamidu i disulfiramu ponownie zamieszaj pięć razy 10 z sześciu świeżo wyizolowanych ludzkich PBMC i 2,5 razy 10 z sześciu ludzkich komórek linii komórek nowotworowych i 200 mikrolitrów PBS plus 50% Metrogel na zwierzę i wstrzyknąć całą objętość podskórnie w prawą flankę każdego zwierzęcia doświadczalnego. Mierz i rejestruj objętość guza pierwotnego dwa razy w tygodniu przez cztery do sześciu tygodni.

Kiedy guzy osiągną średnią objętość od 200 do 500 milimetrów sześciennych, użyj nożyczek optomicznych, aby pobrać cały guz z każdego zwierzęcia. Do dalszej analizy należy wykorzystać linie komórek nowotworowych dawców PBMC i ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów, które powodują umiarkowany wzrost guza ze stosunkowo wysoką ekspresją PD-1, PD-L1 i CD8. W celu analizy immunohistochemicznej pobranych tkanek nowotworowych należy utrwalić próbki i formalinę na 24 do 72 godzin przed odwodnieniem i zatopieniem tkanek w parafinie.

Uzyskać trzy mikrometryczne skrawki osadzonych tkanek na szkiełkach pokrytych polilizyną i odparafinować próbki za pomocą trzech siedmiominutowych zanurzeń w ksylenie. Po trzecim zabiegu nawodnij sekcje trzyminutowymi stopniowymi zanurzeniami w alkoholu. Następnie trzykrotnie przepłucz szkiełko w wodzie dejonizowanej i usuń nadmiar płynu z szkiełek.

Aby pobrać antygen, umieść szkiełka w pojemniku i przykryj je 10-milimolowym buforem sodiocytrynianu. Podgrzej szkiełka, pojemnik, w kuchence mikrofalowej przez trzy minuty przed umieszczeniem szkiełek w łaźni wodnej o temperaturze 95 stopni Celsjusza na 30 minut. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej opłucz szkiełka trzykrotnie w wodzie dejonizowanej i odessaj nadmiar płynu z szkiełek.

Inkubować z 0,3% nadtlenkiem wodoru przez 10 minut, aby zablokować endogenną aktywność peroksydazy, a następnie blokować 3% BSA i PBS przez godzinę. Pod koniec inkubacji nadtlenku wodoru oznacz szkiełka odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka potraktuj szkiełka przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową przez godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie nałóż substrat kroplami na szkiełka, aż odpowiedni poziom brązowego zabarwienia zostanie zaobserwowany za pomocą mikroskopii świetlnej.

Następnie wybarwić próbki hematoksyliną. Po jednej minucie zatrzymaj reakcję z wodą destylowaną, a następnie zanurz przez pięć sekund w 0,5% alkoholu kwasu solnego i przez pięć sekund w 0,5% wodzie amoniakalnej. Następnie odwodnić próbki za pomocą trzech wstępujących trzyminutowych zanurzeń w etanolu i trzech pięciominutowych zanurzeń w ksylenie.

Aby ocenić aktywność przeciwnowotworową potencjalnego leku, należy rozpocząć leczenie w dniu inokulacji komórek zgodnie z planowanym protokołem eksperymentalnym i monitorować objętość guza pierwotnego dwa razy w tygodniu przez cztery do sześciu tygodni. W celu analizy dynamicznej komórek odpornościowych naciekających nowotwór za pomocą PharmaCODE, zmiel tkanki nowotworowe na małe kawałki i traw fragmenty za pomocą kolagenazy typu pierwszego i pożywki DNazy I oraz RPMI-1640 plus 5% FBS przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec trawienia przefiltrować strawioną tkankę przez sitko o wielkości 40 mikrometrów, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki i zebrać komórki przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić osad w ilości 10 razy siódmej komórki na mililitr stężenia lodowatego buforu faksowego i przenieść równą objętość komórek do odpowiedniej liczby dołków w 96-dołkowej okrągłej płycie dennej. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w 20 mikrogramach na mililitr ludzkiego IGG przez 30 minut, aby zablokować wszelkie niespecyficzne wiązanie. Następnie barwić komórki odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed ich analizą za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie ze standardowymi protokołami.

Jak wykazano, 100 miligramów na kilogram cyklofosfamidu i 125 miligramów na kilogram mieloablacji disulfiramu powoduje znaczne zmniejszenie liczby neutrofili i monocytów cztery dni po leczeniu. Po ludzkim PBMC i przeszczepie guza obecność nacieków ludzkich komórek odpornościowych można zweryfikować w mikrośrodowisku guza za pomocą immunohistochemii. Można przeprowadzić badanie przesiewowe in vivo panelu dawców PBMC w celu potwierdzenia obecności stosunkowo wysokiej infiltracji komórek odpornościowych do mikrośrodowiska guza przy akceptowalnym tempie wzrostu guza.

Ludzkie linie komórek rakowych w ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów różnych typów raka mogą być również oceniane w celu oceny tempa wzrostu guza i infiltracji komórek odpornościowych. W tym reprezentatywnym eksperymencie leczenie PBMC i przeszczepionych humanizowanych myszy humanizowanym przeciwciałem anty-PD1 spowodowało znaczące działanie przeciwnowotworowe. Disulfiram zmniejsza urotoksyczność cyklofosfamidu, połączenie może wywierać długotrwałe skutki neutropenii u myszy.

Może być konieczne wcześniejsze ustalenie dokładnego schematu dawkowania cyklofosfamidu i disulfiramu. Nowsze szczepy myszy z większym niedoborem odporności w celu łatwiejszej rekonstytucji ludzkiej odporności i zmniejszonego ksenogennego efektu GvHD zostały ustalone i oczekują na dalsze badania z naszym udokumentowanym protokołem. Nasz model jest przydatny do oceny terapii immunologicznych nowotworów angażujących limfocyty T, szczególnie podczas pracy w krótkich terminach lub do wyboru środków przed przejściem do bardziej złożonego modelu odporności wieloliniowej.