Badania elektrofizjologiczne funkcji synaps retinogenikulacyjnych i kortykogenicznych

W niniejszej pracy przedstawiono protokoły przygotowania ostrych wycinków mózgu zawierających jądro kolankowate boczne oraz badania elektrofizjologiczne funkcji synapsy kolankowatej siatkówki i kory mózgowej. Aksony komórek zwojowych siatkówki wchodzą do jądra kolankowatego bocznego z dala od wejść korowych. Pozwala to na oddzielną stymulację synaps kolankowatych siatkówki i korowych synaps kolankowatych, które mają bardzo różne właściwości funkcjonalne.

Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj dwie komory kropelkowe, jedną wypełnioną 100 mililitrami roztworu preparacyjnego, a drugą 100 mililitrami roztworu rejestrującego. Umieścić dwie zlewki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i bulgotać roztwory karbogenem przez co najmniej 15 minut przed rozbieraniem. Następnie napełnij plastikową zlewkę 250 mililitrami prawie lodowatego roztworu preparacyjnego i bąbelkuj go karbogenem przez co najmniej 15 minut przed użyciem.

Następnie napełnij plastikową szalkę Petriego zimnym roztworem preparacyjnym do sekcji mózgu. Umieść kawałek bibuły filtracyjnej w pokrywie szalki Petriego i napełnij ją niewielką ilością roztworu preparacyjnego. Następnie schłodzić komorę rozwarstwiającą wibratomu.

Przetnij skórę głowy od ogonowej do nosowej i trzymaj ją otwartą palcami, aby odsłonić czaszkę. Aby uzyskać przodomózgowie, najpierw przetnij czaszkę wzdłuż tylnej/przedniej linii środkowej. Następnie przeciąć jeszcze dwa razy szew koronalny i szew lambdoidalny.

Usuń czaszkę między szwem koronalnym a szwem lambdoidalnym, aby odsłonić mózg. Przetnij opuszkę węchową i oddziel przodomózgowie od śródmózgowia cienkim ostrzem. Usuń mózg z czaszki cienką szpatułką i umieść go na bibule filtracyjnej w pokrywie szalki Petriego.

Aby zachować integralność sygnałów czuciowych i korowych do grzbietowego bocznego jądra kolankowatego w wycinku mózgu, oddziel dwie półkule cięciem przystrzałkowym pod kątem od trzech do pięciu stopni. Następnie wysusz przyśrodkowe płaszczyzny boczne dwóch półkul, umieszczając je na bibule filtracyjnej. Następnie przyklej je do etapu cięcia pod kątem od 10 do 25 stopni od płaszczyzny poziomej.

Umieść stolik na środku metalowej tacki buforowej i delikatnie wlej resztę lodowatego roztworu preparacyjnego do tacki buforowej. Wykonaj ten krok ostrożnie, ponieważ zbyt mocne nalewanie może usunąć wklejony mózg. Następnie trzymaj tackę buforową w tacce wypełnionej lodem, aby utrzymać niską temperaturę podczas sekcji.

Sekcja 250 mikrometrów kroi żyletką z prędkością 0,1 milimetra na sekundę i amplitudą jednego milimetra. Przenieść plastry do komory przetrzymywania wypełnionej natlenionym roztworem rozbiorowym w temperaturze 34 stopni Celsjusza na około 30 minut, a następnie pozostawić plastry do odzyskania w roztworze rejestrującym w temperaturze 34 stopni Celsjusza przez kolejne 30 minut. Po wyzdrowieniu wyjmij komorę na plastry z łaźni wodnej i utrzymuj plastry w temperaturze pokojowej do czasu wykorzystania w eksperymentach.

W tej procedurze należy wyciągnąć pipety rejestrujące za pomocą kapilar ze szkła borokrzemianowego i ściągacza do filamentu. Następnie pociągnij pipety stymulujące zgodnie z tym samym protokołem, ale po pociągnięciu lekko złamij końcówkę, aby zwiększyć średnicę. Następnie napełnij pipety rejestrujące roztworem wewnątrzkomórkowym i biocytyną, a pipety stymulujące napełnij roztworem rejestrującym.

Następnie umieść plastry w komorze nagrywającej i w sposób ciągły perfekuj je natlenionym roztworem nagrywającym w temperaturze pokojowej. Wizualizacja plastrów za pomocą mikroskopu pionowego wyposażonego w mikroskopię wideo IR-DIC. Sprawdź wszystkie plasterki i wybierz te, które mają nienaruszone drogi wzrokowe.

Umieść pipetę stymulacyjną na plasterku przed załataniem komórki pipetą rejestrującą. Aby zbadać synapsy kolankowate siatkówki, umieść pipetę stymulującą bezpośrednio na przewodzie wzrokowym, w którym znajdują się włókna aksonowe z komórek zwojowych siatkówki. Aby przeanalizować synapsy kolankowate kory, umieść elektrodę stymulującą na jądrze wzgórza reticularis, które przylega rostrobrzusznie do grzbietowego bocznego jądra kolankowatego.

Po zanurzeniu pipety rejestrującej w roztworze do nagrywania należy zastosować pięciomiliwoltowy krok, aby monitorować opór pipety. Ustaw potencjał podtrzymania na zero miliwoltów i anuluj potencjał przesunięcia tak, aby prąd podtrzymania wynosił zero pikoamperów. Zbliżyć się do celi z pipetą rejestrującą, stosując nadciśnienie.

Gdy pipeta ma bezpośredni kontakt z błoną komórkową, zwolnij nadciśnienie i ustaw potencjał utrzymywania na minus 70 miliwoltów. Następnie zastosuj lekkie podciśnienie, aby błona komórkowa mogła przymocować się do szklanej pipety, tak aby utworzyło się uszczelnienie gigaomowe. Skompensuj pojemność pipety i otwórz celę, stosując impulsy podciśnienia.

Aby zbadać funkcję synaptyczną, zastosuj 0,1-milisekundowe impulsy prądu za pomocą pipety stymulującej. Monitoruj rezystancję szeregową w sposób ciągły, stosując krok pięciomiliwoltowy. Rezystancję szeregową można oszacować, dzieląc pięć miliwoltów przez szczytową amplitudę wywołanego prądu.

Do analizy należy używać tylko ogniw o rezystancji szeregowej mniejszej niż 20 megaomów. W przypadku znakowania biocytyną utrzymuj konfigurację całej komórki przez co najmniej pięć minut, aby umożliwić dyfuzję biocytyny do dystalnych dendrytów. Po nagraniu delikatnie wyjmij pipetę z celi, aby soma nie została zniszczona.

Przygotuj 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej. Napełnij każdą studzienkę 300 mikrolitrami 4% PFA. Uważaj, aby nie zanieczyścić PFA niczego, co będzie miało kontakt z plastrami, które mają być rejestrowane.

Przenieś plastry z komory rejestracyjnej na płytkę zawierającą PFA za pomocą gumowej pipety i utrwal je na noc. Następnego dnia zastąp PFA PBS. Przechowuj plastry w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza do przyszłego przetwarzania.

Aby zabarwić komórki, trzykrotnie umyj plastry świeżym PBS. Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania, inkubując plastry w roztworze blokującym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej. Następnie wyrzuć roztwór blokujący i inkubuj plastry ze streptawidyną Alexa 568 rozcieńczoną w roztworze blokującym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc na wytrząsarce orbitalnej.

Następnego dnia wyrzuć roztwór przeciwciała i umyj plastry trzy razy PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej. Następnie przed montażem umyj plastry wodą z kranu. Umieść plasterki z jednej myszy na jednym szklanym szkiełku.

Upewnij się, że poplamione komórki są obecne na górnej powierzchni plastrów. Wchłoń wodę wokół plastrów chusteczkami, a następnie pozostaw plastry do wyschnięcia na około 15 minut. Następnie nałóż dwie krople podłoża montażowego na każdą plastrę i zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku bez wytwarzania pęcherzyków powietrza.

Przechowuj oznaczone plastry w temperaturze czterech stopni Celsjusza po obejrzeniu ich pod mikroskopem konfokalnym. Ten obraz IR-DIC pokazuje somę neuronu przekaźnikowego jądra kolankowatego grzbietowego bocznego z końcówką pipety z plastrem. Barwienie biocytyną pozwala nam uzyskać wgląd w zarejestrowany neuron.

W odróżnieniu od interneuronów, które mają morfologię dwubiegunową, neurony przekaźnikowe mają wielobiegunowe trzpienie dendrytyczne zawierające więcej niż trzy pierwotne dendryty. Następnie wygenerowano trójwymiarową rekonstrukcję neuronu przekaźnikowego znakowanego biocytyną, który wykazuje promieniście symetryczną architekturę dendrytyczną. Zachowanie danych wejściowych kolankowatego siatkówki i wejść kolankowatego kolankowatego kory w tych samych wycinkach mózgu jest najważniejsze w tym protokole.

Postępując zgodnie z tą procedurą, możemy na przykład zbadać również wejścia inhibitora z jądra reticularis thalami do neuronów jądra kolankowatego grzbietowego bocznego. Pamiętaj, aby nosić rękawiczki podczas mocowania plastrów mózgu za pomocą PFA, ponieważ PFA jest niebezpieczny.