Name: Przygotowanie kriosekcji siatkówki myszy do immunohistochemii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Naucz się przygotowywać kriosekcje siatkówki myszy do immunohistochemii. Protokół obejmuje dyssekcję oka, utrwalanie w paraformaldehydzie, osadzanie w OCT i cięcie na kriostacie. Metoda zapewnia wysoką jakość preparatów do analizy struktur komórkowych siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze z NIH (RO1-GMO97327) i University Research Foundation (UPenn). Szczególnie dziękujemy Svetlanie Savinie za pomoc w opracowaniu protokołu immunohistochemicznego, Gordonowi Ruthelowi (University of Pennsylvania) i Penn Vet Imaging Core za pomoc w mikroskopii oraz dr Leslie King za krytyczną lekturę tego manuskryptu.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych dostarczonym przez Instytut Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Pensylwanii.
Wszystkie narzędzia i sprzęt do metod są pokazane w Rysunek 1 i wymienione w Tabeli Materiałów.
1 . Wyłuszczenie oka myszy, rozwarstwienie muszli ocznej i osadzanie
<ol>
	<li>Eutanazja myszy za pomocą dwutlenku węgla (CO2 ), a następnie dekapitacja (myszy po urodzeniu P0 - P11) lub zwichnięcie szyjki macicy (dorosłe myszy >P11). W przypadku myszy P0-P14 oczy są pokryte skórą. Upewnij się, że usunąłeś skórę przed kolejnymi krokami.</li>
	<li>Zaznacz skroniową część oka (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A) poprzez lekkie spalenie rogówki za pomocą kauteryzatora ogonowego. Unikaj wypalania w rogówce, dotykając rogówki bardzo lekko i nie dłużej niż przez ułamek sekundy kauteryzatorem.</li>
	<li>Natychmiast wyłuszczej oczy myszy za pomocą zakrzywionych kleszczy Dumont #5/45. Inkubować przez 15 minut w probówce krioprobówki o pojemności 1,5 ml z 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na lodzie.</li>
	<li>Po 15 minutach w 4% PFA, przenieś nieruchome oko za pomocą zakrzywionych kleszczy Dumont #5/45 do zmodyfikowanej 35 mm płytki preparacyjnej (patrz Tabela Materiałów i <klasa silna = "xfig" >Rysunek 1C) wypełnionej PBS i umieść pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie w miejscu oparzenia, prostopadle do rąbka (granicy rogówki) i tuż nad nim, używając mikronoża.</li>
	<li>Włóż zakrzywione nożyczki do nacięcia i wykonaj obwodowe cięcie rogówki wzdłuż rąbka (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).</li>
	<li>Usuń rogówkę i wyjmij soczewkę za pomocą cienkich kleszczyków Dumont #5 (<silna klasa="xfig">Ryc. 2B) i delikatnie unieś ją z tylnej części oka. Ciało szkliste, przezroczysty żel, który wypełnia przestrzeń między soczewką a siatkówką, wyjdzie wraz z soczewką (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B), a siatkówka będzie widoczna jako biała powierzchnia pokrywająca wnętrze tylnej muszli ocznej. Upewnij się, że nie ma widocznych uszkodzeń siatkówki, takich jak lub rozdarcia (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Umyj muszle oczne dwukrotnie w 1 ml PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Kriochronić muszle oczne, równoważąc je w roztworze 15% sacharozy w PBS przez noc w temperaturze 4 °C, aż muszla oczna opadnie</li>
	<li>Przenieś muszle oczne do 30% sacharozy w PBS na 2-3 godziny, aż muszla oczna opadnie.</li>
	<li>Osadź muszle oczne w OCT w krioformach 10 x 10 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). Za pomocą mikroskopu preparacyjnego ustaw oko w kriomoldie wzdłuż jego osi grzbietowo-brzusznej (<silna klasa="xfig">Ryc. 2D, <silna klasa="xfig">Ryc. 3A), obracając oko, aż ślad oparzenia znajdzie się na górze, nerw wzrokowy znajdzie się po lewej stronie, a wycięta część formy będzie skierowana w prawo (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D). Uważaj, aby uniknąć pęcherzyków w pobliżu tkanki. 
	UWAGA: Aby manipulować muszlą oczną, użyj tytanowej sondy wykonanej z tytanowego drutu przymocowanego do końcówki pipety.</li>
	<li>Aby błyskawicznie zamrozić tkankę siatkówki, zanurz kriomold na co najmniej 5 minut w metalowej zlewce zawierającej izopentan i umieść zlewkę w kąpieli z ciekłym azotem lub suchym lodem/100% etanolem (do 1/3 wysokości metalowej zlewki). 
	UWAGA: Kriomold powinien być zanurzony w izopentanie na więcej niż połowę swojej wysokości, ale nie musi być całkowicie zanurzony.</li>
	<li>Wyjmij zamrożony blok i zawiń go w folię aluminiową.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Zaznacz zamrożony blok za pomocą długopisu lub sharpie, aby zapisać orientację bloku (Rysunek 3B).</li>
</ol>
2 . Cięcie za pomocą kriostatu
<ol>
	<li>Po wyregulowaniu temperatury kriostatu (między -20 a -25 °C) należy odczekać, aby formy zawierające osadzone muszle oczne zrównoważyły się z temperaturą kriostatu przez 1 godzinę.</li>
	<li>Zamontuj blok o orientacji grzbietowo-brzusznej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C) i wytnij odcinki szeregowe o grubości 10 μm. Ostrożnie umieść skrawki siatkówki na szkiełkach mikroskopowych z adnotacjami i numerami.</li>
	<li>Szkiełka należy przechowywać w pudełkach na prowadnice w temperaturze -20 °C lub -80 °C do czasu zabiegów IHC.</li>
</ol>
3 . Barwienie immunologiczne fluorescencyjne za pomocą stojaka na slajdy
UWAGA: System Slide Rack (np. Sequenza) utrzymuje szklane szkiełka mikroskopowe z pokrywą, tworząc ~100 μL szczelinę kapilarną między szkiełkiem a płytą.
<ol>
	<li>Rozmrażaj kriosekcje w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 do 4 godzin, aby mogły wyschnąć i przymocuj do szkiełek mikroskopowych. 
	UWAGA: Możliwe jest również suszenie ich w temperaturze 30-37 °C przez 30 min do 1 h.</li>
	<li>Umieść szkiełka w stojaku na szkiełka i umyj sekcje siatkówki dwukrotnie w 100-200 μl PBS przez 2 minuty.</li>
	<li>Przepuszczalność skrawków siatkówki poprzez inkubację w 0,25% Triton-X / 0,05% NaN3w PBS przez 5 minut w RT.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu blokującego do szkiełek.</li>
	<li>Dodać do szkiełek 100 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym.</li>
	<li>Inkubować skrawki siatkówki przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: W tym czasie przykryj stojak na prowadnice, aby uniknąć wysuszenia sekcji.</li>
	<li>Przemyj odcinki siatkówki 3 razy, każdy przez 15 minut, używając 200 μl PBS. 
	UWAGA: Dodatek 0,001-0,002% Triton-X100 do PBS (PBS-T) pozwala na bardziej rygorystyczne mycie, ale może zakłócić działanie niektórych błon i struktur komórkowych.</li>
	<li>Inkubować skrawki siatkówki w znakowanych fluorescencyjnie przeciwciałach drugorzędowych przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Od teraz chroń się przed światłem.</li>
	<li>Umyj sekcje siatkówki 3 razy, każdy przez 15 minut.</li>
	<li>Inkubować skrawki siatkówki w temperaturze pokojowej przez 5 minut za pomocą markera jądrowego, takiego jak Hoechst 33342 lub roztwór DAPI.</li>
	<li>Myć sekcje siatkówki 1 raz przez 15 min.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na ręczniku papierowym na stole laboratoryjnym.</li>
	<li>Dodaj 2 krople środka montażowego zapobiegającego blaknięciu na środek szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Odwróć szkiełko, aby kriosekcja siatkówki była skierowana w dół.</li>
	<li>Ostrożnie zamontuj szkiełko nakrywkowe powoli, pod kątem ~45°, przechyl suwak na nośnik montażowy. 
	UWAGA: Unikanie tworzenia się pęcherzyków podczas opuszczania zjeżdżalni na miejscu.</li>
	<li>Zastosuj równomierny nacisk, używając ciężkiej książki lub katalogu (patrz poniżej), do kombinacji szkiełka nakrywkowego, aby wyeliminować nadmiar nośników montażowych. 
	UWAGA: Aby zapewnić spójność w przygotowaniu próbki, zawsze używaj tego samego przedmiotu (tj. tej samej książki lub katalogu), aby wywrzeć równomierny nacisk na szkiełko nakrywkowe podczas montażu szkiełka.</li>
	<li>Trzymaj płasko i pozostaw na noc do stwardnienia w temperaturze RT w ciemności. Szkiełka należy przechowywać płasko w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony.</li>
	<li>Obraz za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej szerokokątnej lub konfokalnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
</ol>

<ol><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelled+antigens+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Labelled antigens and antibodies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).</li>
<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).</li>
<li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+antigen+in+tissue+cells%3B+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).</li>
<li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artefacts+in+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Artefacts in histopathology.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li>
<li>Hartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+sections+from+Bouin-fixed+material+in+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology.</a> Stain Technology. 20, 113(1945).</li>
<li>Benerini Gatta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+alternative+fixatives+to+formalin+in+diagnostic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology.</a> European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12(2012).</li>
<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+cryoultramicrotomy+to+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry.</a> Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).</li>
<li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+properties+of+rhodopsin+and+rod+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular properties of rhodopsin and rod function.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).</li>
<li>Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reexamination+of+Dopaminergic+Amacrine+Cells+in+the+Rabbit+Retina%3A+Confocal+Analysis+with+Double-+and+Triple-labeling+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry.</a> Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).</li>
<li>Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+and+Glutamate+Uptake+and+Metabolism+in+Retinal+Glial+%28Muller%29+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48(2013).</li>
<li>Nakhai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a+is+essential+for+the+differentiation+of+GABAergic+and+glycinergic+amacrine+cells+and+horizontal+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina.</a> Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).</li>
<li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li>
</ol>

Brak ujawniania informacji.

Rozwarstwienie siatkówki myszy jest delikatnym procesem ze względu na mały rozmiar i kształt oczu myszy oraz kruchość tkanki siatkówki. Mimo że wykonanie wysokiej jakości sekcji jest kwestią praktyki, posiadanie szczegółowego protokołu, zapewnienie skutecznych metod i wskazówek jest koniecznością do uzyskania wycinków siatkówki i IHC. Oprócz opisanych tutaj protokołów istnieje kilka wskazówek, które pozwalają na uzyskanie spójnych, wysokiej jakości odcinków siatkówki, które są odpowiednie dla powtarzalnego IHC.
<p cl...

Immunohistochemia (IHC) to potężna technika lokalizacji określonych białek i struktur komórkowych w tkankach in situ1,2,3. Niewłaściwe metody utrwalania i nieoptymalne sekcjonowanie złożonych tkanek mogą zakłócić strukturę tkanki, generować wysokie barwienie tła lub zmniejszać interakcje przeciwciało-epitop, co skutkuje artefaktami barwienia i w konsekwencji błędną interpretacją danych IHC4. Ponieważ siatkówka kręgowców jest złożonym i wysoce zorganizowanym narządem nerwowym składającym się z warstw połączonych ze sobą fotoreceptorów, interneuronów i komórek zwojowych, jest bardzo delikatna i może zostać łatwo rozerwana podczas sekcji i sekcji. Szczegółowy, ustandaryzowany i zwalidowany protokół, od sekcji i orientacji oka myszy po barwienie immunologiczne, pomoże znacznie zmniejszyć artefakty IHC, zwiększając w ten sposób wiarygodność wyników i umożliwiając dokładniejszą analizę danych porównawczych.
Istnieje wiele protokołów przygotowania tkanek do IHC, jednak nie wszystkie są odpowiednie dla tkanki siatkówki. Silne utrwalacze, takie jak 10% formalina lub roztwór Bouina, zachowują strukturę siatkówki podczas preparowania i cięcia5. Niestety, silne utrwalacze często prowadzą do zwiększonej fluorescencji tła i maskowania epitopów z powodu chemicznej modyfikacji epitopów6. Z drugiej strony, łagodniejsze utrwalacze, takie jak 4% paraformaldehyd (PFA), mogą złagodzić niektóre z tych artefaktów, ale wymagają skrupulatnego rozwarstwienia i cięcia, aby zachować optymalną strukturę siatkówki. PFA szybko wnika w tkankę, ale bardzo wolno sieciuje białka, zmniejszając ryzyko maskowania epitopów. Ponieważ krótkotrwała inkubacja PFA jest stosunkowo łagodnym utrwalaniem, tkanki często wymagają szybkiego zamrożenia w celu zachowania antygenów. Ważne jest, aby unikać tworzenia się kryształków lodu podczas zamrażania tkanek, ponieważ zniekształcają one i uszkadzają integralność komórek i tkanek7.
Tutaj opisujemy szczegółowe i ustandaryzowane protokoły preparacji, utrwalania i krioochrony tylnych bańek oka myszy, które dostarczają spójnych i wiarygodnych danych IHC.

<table><tbody><tr><td>Zlewka ze stali nierdzewnej (185 x 218 mm) Gilson</td><td>&nbsp;</td><td>#MA-48</td><td>Do ciekłego azotu (rysunek 1E)</td></tr><tr><td>Folia aluminiowa&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kauteryzator&nbsp;</td><td>Bovie</td><td>#AA01</td><td>Do oznaczania orientacji oczu (Rysunek 1A)</td></tr><tr><td>Kleszcze zakrzywione, pęseta Dumont #5/45, zgięta pod kątem 45 stopni&nbsp;</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>#72703-D</td><td>Do enukleacji i konserwacji oka myszy (Rysunek 1A)</td></tr><tr><td>Nożyczki zakrzywione, Nożyczki sprężynowe Vannas - krawędź tnąca 2,5 mm&nbsp;</td><td>Narzędzia naukowe&nbsp;</td><td>#15002-08</td><td>Aby przeciąć rogówkę na obwodzie (Rysunek 1B)</td></tr><tr><td>Pokryta woskiem dentystycznym naczynie</td><td></td><td></td> preparacyjne 35 mm <td>Do wypreparowania muszli ocznej (Rysunek 1C)</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny&nbsp;</td><td>Leica, Houston, Stany Zjednoczone&nbsp;</td><td>MZ12.5 Wysokowydajny mikroskop stereoskopowy</td><td></td></tr><tr><td>Mikro noże - Plastikowa rękojeść&nbsp;</td><td>Narzędzia naukowe&nbsp;</td><td>#10315-12</td><td>Aby wykonać małe nacięcie w miejscu oparzenia (Rysunek 1A)</td></tr><tr><td>Różowy wosk dentystyczny&nbsp;</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej&nbsp;</td><td>#72660</td><td>Do powlekania naczynia preparacyjnego</td></tr><tr><td>Stojak na prowadnice i pokrywę</td><td>Ted Pella</td><td>#36107</td><td>Do siatkówki IHC (Rysunek 1G)</td></tr><tr><td>Zlewka ze stali nierdzewnej (89 x 114mm)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>#MA-40</td><td>Do kąpieli izopentanowej (Rysunek 1E)</td></tr><tr><td>Skrzynka</td><td></td><td></td> styropianowa <td>Do izolowanej chłodnicy</td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze Dumont #5&nbsp; &nbsp;</td><td>Narzędzia naukowe&nbsp;</td><td>#11254-20</td><td>Aby usunąć rogówkę i wyjąć soczewkę (Rysunek 1B)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek cryomold&nbsp; (10mm x 10mm x 5mm)</td><td>Nauki o błędnej analizie elektronów&nbsp;</td><td>#62534-10</td><td>Forma do zatapiania OCT</td></tr><tr><td>Buffers and Reagents</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> blokujący <td>2% Normalna surowica końska, 1,5% Zimna skóra rybia Żelatyna (w 40-50% w H2O, kat. #G7765), 5% albumina surowicy bydlęcej (kat. #AK1391-0100) w buforze permeabilizacyjnym. &nbsp;</td></tr><tr><td>Gelvatol (środek montażowy zapobiegający blaknięciu)</td><td></td><td></td><td>Pod wyciągiem rozpuść 0,337 g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) w 10 ml Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).&nbsp; Dostosuj do pH 8-8,5 za pomocą 12N HCl (~ 5 kropli).&nbsp; Przechowywać w bursztynowej butelce z kroplami w temperaturze 4&deg; C&nbsp; (8).&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 1000x Stock</td><td>Thermo Scientific</td><td>#62249</td><td>1 mg/ml w PBS (1000x). Aliquot i przechowywać w ciemności, w temperaturze 4&deg; C do 1 roku lub przy -20&deg; C do długotrwałego przechowywania. Przygotuj świeże&nbsp; przy 1 μg/ml (1x)&nbsp;</td></tr><tr><td>Izopentan, 99%&nbsp;</td><td>GFS Chemicals</td><td>#2961</td><td></td></tr> Paraformaldehyd <tr><td>ciekłego azotu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(PFA) w</td><td>naukach o mikroskopii elektronowej PBS&nbsp;</td><td>#15710</td><td>Przygotowane świeże 4% PFA z 16% PFA. Pozostałe 16% PFA należy przechowywać w temperaturze 4&deg; C w ciemności.&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td><td>przepuszczalny PBS + 0,25% Triton-X (AMRESCO kat. #0694-1L) + 0,05% NaN3. Przygotuj świeże.</td></tr><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Bioworld&nbsp;</td><td>#41620015-20</td><td>0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.&nbsp; Przygotowane z 10x stock&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwory sacharozy</td><td>Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>#S-5-500</td><td>Rozpuść odpowiednią ilość sacharozy w&nbsp; 37&deg; C PBS (rozpuszczenie trwa ~15 minut). Może być przechowywany przez kilka dni w temperaturze 4&nbsp;</td></tr><tr><td>Związek Tissue-Tek OCT&nbsp;</td><td>Sakura</td><td>&nbsp;#4583</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>anti-calbindin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8666</td><td>Do oznaczania komórek horinzotalnych&nbsp;</td></tr><tr><td>anty-GAD65</td><td>Chemicon</td><td>AB5082</td><td>Do oznaczania GABA-ergicznych komórek amakrynowych</td></tr><tr><td>Anty-GS</td><td>BD Transdukcja</td><td>610517</td><td>Do oznaczania M&uuml; komórki ller</td></tr><tr><td>anty-rodopsyna</td><td>Millipore</td><td>MAB5316</td><td>Do etykietowania prętów</td></tr></tbody></table>

przygotowanie kriosekcji siatkówki myszy do immunohistochemii

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Przygotowanie wysokiej jakości mysich wycinków oczu do immunohistochemii (IHC) jest kluczowe dla oceny struktury i funkcji siatkówki oraz dla określenia mechanizmów leżących u podstaw chorób siatkówki. Utrzymanie integralności strukturalnej przez cały okres przygotowania tkanki ma kluczowe znaczenie dla uzyskania powtarzalnych danych IHC siatkówki, ale może być trudne ze względu na kruchość i złożoność cytoarchitektury siatkówki. Silne utrwalacze, takie jak 10% formalina lub roztwór Bouina, optymalnie zachowują strukturę siatkówki, często utrudniają analizę IHC poprzez wzmocnienie fluorescencji tła i/lub zmniejszenie interakcji przeciwciało-epitop, proces znany jako maskowanie epitopów. Z drugiej strony, łagodniejsze utrwalacze, takie jak 4% paraformaldehydu, zmniejszają fluorescencję tła i maskują epitopy, należy stosować skrupulatne techniki preparacji, aby zachować strukturę siatkówki. W tym artykule przedstawiamy kompleksową metodę przygotowania tylnych miseczek ocznych myszy do IHC, która jest wystarczająca do zachowania większości interakcji przeciwciało-epitop bez utraty integralności strukturalnej siatkówki. Dołączamy reprezentatywny IHC z przeciwciałami przeciwko różnym markerom typu komórek siatkówki, aby zilustrować zachowanie i orientację tkanek w optymalnych i nieoptymalnych warunkach. Naszym celem jest optymalizacja badań siatkówki IHC poprzez dostarczenie kompletnego protokołu od rozwarstwienia tylnej części oka do IHC.

Aby zilustrować, w jaki sposób protokoły te zapewniają optymalną konserwację siatkówki do IHC, przebadaliśmy przekroje siatkówki myszy WT w 28. dniu po urodzeniu (P28, szczep C57BL/6N) przy użyciu przeciwciał przeciwko rodopsynie (markerowi fotoreceptorów)8,ydekarboksylazie kwasu glutaminowego 65 (Gad65, markerowi komórek amakrynowych)9, syntetazie glutaminowej (GS, markerowi komórek Müllera)10 oraz kalbindynie (marke...

Ten raport opisuje kompleksowe metody przygotowania zamrożonych wycinków siatkówki myszy do immunohistochemii (IHC). Opisane metody obejmują rozwarstwienie tylnej części gałki ocznej, utrwalanie paraformaldehydu, osadzanie w pożywkach o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i orientację tkanki, cięcie i barwienie immunologiczne.

Przygotowanie kriosekcji siatkówki myszy do immunohistochemii

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Rozwarstwienie siatkówki myszy jest naprawdę delikatnym procesem ze względu na wielkość i kształt oczu oraz kruchość przekroju siatkówki. Konieczne do praktyki, posiadanie szczegółowego protokołu, który zapewnia skuteczną metodę i wskazówki, jest kluczem do wysokiej jakości rozwarstwienia i przekroju siatkówki. Udzielamy wskazówek i porad, które pomogą badaczom uniknąć typowych pułapek i uzyskać wysokiej jakości skrawki siatkówki odpowiednie do immunohistochemii.Zaznacz skroniową część oka myszy poddanej eutanazji za pomocą kauteryzatora ogonowego, dotykając rogówki bardzo lekko i nie dłużej niż przez ułamek sekundy, aby lekko spalić rogówkę i uniknąć zrobienia. Zaraz po tym użyto zakrzywionych kleszczy Dumont 545 do wyłuszczenia oczu myszy. Umieść oczy w 1,5 mililitrowej krioprobówce z jednym mililitrem 4% PFA i PBS i inkubuj przez 15 minut na lodzie.Następnie przenieś nieruchome oczy za pomocą zakrzywionych kleszczy Dumont 545 do zmodyfikowanej 35-milimetrowej czaszy preparacyjnej wypełnionej PBS i umieść pod mikroskopem preparacyjnym. Za pomocą mikronoża wykonaj małe nacięcie w miejscu oparzenia prostopadłym do i tuż nad granicą rąbka rogówki. Włóż zakrzywione nożyczki do nacięcia i wykonaj obwodowe cięcie rogówki wzdłuż rąbka.Następnie za pomocą cienkich kleszczyków Dumont 5 usuń rogówkę, wyjmij soczewkę i delikatnie unieś ją z tylnej części oka. Ciało szkliste wyjdzie wraz z soczewką, a siatkówka będzie widoczna jako biała powierzchnia pokrywająca wnętrze tylnej muszli ocznej. Umyj izolowane gałki oczne dwukrotnie w jednym mililitrze PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Aby kriochronić gałązki oczne, zrównoważ je w 15% sacharozie i PBS przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż opadną. Następnie przenieś muszle oczne do 30% sacharozy i PBS na dwie do trzech godzin, aż opadną. Umieść muszle oczne w OCT w krioformach o wymiarach 10 na 10 milimetrów w celu zatopienia.Pod mikroskopem preparacyjnym ustaw oko w krioformie wzdłuż jego grzbietowej osi brzusznej, obracając oko, aż ślad oparzenia znajdzie się na górze. Nerw wzrokowy jest jednym z lewych, a wycięta część formy jest skierowana w prawo. Aby zatrzasnąć tkankę siatkówki, zanurz krioformę na co najmniej pięć minut w metalowej zlewce zawierającej izopentan, a następnie umieść zlewkę w ciekłym azocie do jednej trzeciej wysokości zlewki.Wyjmij zamrożony blok, zawiń go w folię aluminiową i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Użyj pióra lub sharpie, aby oznaczyć zamrożony blok, aby zarejestrować jego orientację. Po dostosowaniu temperatury kriostatu w zakresie od minus 20 do minus 25 stopni Celsjusza, umieść w środku formy zawierające osadzone muszle oczne i pozwól im zrównoważyć się z temperaturą kriostatu przez godzinę.Zainstaluj blok w kriostacie w orientacji grzbietowo-brzusznej i rozpocznij cięcie odcinków szeregowych o grubości 10 mikrometrów. Ostrożnie umieść skrawki siatkówki na szkiełkach mikroskopowych z adnotacjami i numerami, a następnie przechowuj w pudełkach na szkiełka w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub minus 80 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do barwienia immunologicznego. Na wycinkach siatkówki przeprowadzono immunohistochemię z przeciwciałami przeciwko rodopsyny, markerowi fotoreceptora, dekarboksylazie kwasu glutaminowego 65 i markerowi komórek amakrynowych, syntetazie glutaminy i markerowi komórkowemu Mullera oraz kalbindynie, poziomemu markerowi komórkowemu.Wyniki wskazują, że protokół ten daje wysokiej jakości i dobrze zachowane skrawki siatkówki, w przeciwieństwie do złej jakości odcinków siatkówki uzyskanych z innego protokołu. Bogate w rodopsynę segmenty wewnętrzne i zewnętrzne pozostają pionowe i nienaruszone, z niewielką lub żadną separacją od pokrywającego nabłonka barwnikowego siatkówki. Interneurony, takie jak Gad65-dodatnie komórki amakrynowe, pozostają prawidłowo rozwarstwione w wewnętrznej warstwie jądrowej i wewnętrznej warstwie splotowatej.Ponadto komórki Müllera pozostają dobrze zachowane, a soma jest prawidłowo ustawiona w procesach cytoplazmatycznych, które rozciągają się od warstwy komórek zwojowych do zewnętrznej warstwy jądrowej. Co więcej, dobrze zdefiniowane komórki poziome są wykrywalne na wewnętrznej warstwie jądrowej i zewnętrznej granicy warstwy splotowatej. Ważne jest, aby zaznaczyć obszar górnej części oczu i zachować orientację podczas osadzania.Paraformaldehyd należy zawsze przygotowywać pod maską przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.

preparation-of-mouse-retinal-cryo-sections-for-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy protokół perfuzji transkardiakalnej u myszy, usuwania i sekcjonowania mózgu, a także barwienia immunoperoksydazowego, zatapiania w żywicy i przygotowywania ultracienkich przekrojów z sekcji mózgu. Po zakończeniu tych procedur materiał poddany immunobarwieniu jest gotowy do badania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Przygotowanie tkanki mózgu myszy do immunoelektromikroskopii

Mysia siatkówka noworodka dostarcza dobrze scharakteryzowanego fizjologicznego modelu angiogenezy, który pozwala na badanie ról różnych genów lub leków modulujących angiogenezę w kontekście in vivo. Barwienie immunofluorescencyjne w celu dokładnej wizualizacji splotu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego typu badań.

Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo

Opisany tutaj protokół służy do oceny strukturalnej preparatu całego siatkówki. Obejmuje to opisy rozwarstwiania tkanek, montażu na hydrofilizowanej wkładce membranowej z politetrafluoroetylenu (PTFE), ładowania bolusa markerami fluorescencyjnymi oraz porównanie utrwalania z karbodiimidem i paraformaldehydem do analizy immunohistochemicznej składników komórkowych i synaptycznych.

Zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii

Pokazujemy trzy różne techniki przygotowania tkanek do immunohistochemicznej wizualizacji mikrokrążeń siatkówki szczura, tj. kriosekcje, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowanie sieci naczyniowej.

Kriowycinki siatkówki, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowane preparaty naczyniowe do immunohistochemicznej wizualizacji perycytów mikronaczyniowych

Celem tego raportu jest opisanie protokołu do solidnego immunohistochemicznego wykrywania markerów epigenetycznych, 5-metylocytozyny (5mC) i 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC) w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy.

Immunohistochemiczne wykrywanie 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy

Tutaj prezentujemy protokół adaptacji metody CLARITY tkanek mózgowych do całych siatkówek, aby poprawić jakość standardowego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania w wysokiej rozdzielczości neuronów siatkówki i ich struktur subkomórkowych.

Barwienie immunologiczne całych siatkówek metodą CLARITY Tissue Clearing

Modele myszy mogą być użytecznymi narzędziami do badania biologii nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Ustalono, że u myszy może rozwinąć się szereg patologii RPE. W tym miejscu opisujemy protokół fenotypowania w celu wyjaśnienia i ilościowego określenia patologii RPE u myszy za pomocą światła, elektronów transmisyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Protokół oceny i ilościowego określenia patologii barwnikowego nabłonka siatkówki w mysich modelach zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem

Ten protokół opisuje szczegółowe etapy wstępnego wdrażania mikroskopii immunoelektronowej, skupiając się na badaniu obwodów synaptycznych i lokalizacji białek w siatkówce.

Badanie obwodów siatkówki i lokalizacji molekularnej poprzez wstępne osadzenie mikroskopii immunoelektronowej

Perycyty w unaczynieniu siatkówki zostały zbadane za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego z receptorem czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego β po retro-orbitalnym wstrzyknięciu fluorescencyjnej lektyny pomidorowej. Znakowaną siatkówkę poddano dalszej obróbce metodą oczyszczania tkanek i zamontowano w całości w celu wizualizacji trójwymiarowych widoków perycytów otaczających naczynia krwionośne siatkówki pod mikroskopem konfokalnym.

Wizualizacja 3D perycytów naczyniowych siatkówki myszy za pomocą immunostainingu

Opisano protokół przygotowania kriosekcji siatkówki myszy i przeprowadzania barwienia immunologicznego na fotoreceptorach. Artykuł ten umożliwia naukowcom konsekwentne wytwarzanie zamrożonych skrawków siatkówki myszy z dobrze zachowaną morfologią i wysokiej jakości wynikami barwienia immunologicznego.

Kriosekcja i barwienie immunologiczne siatkówki myszy

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Naucz się przygotowywać kriosekcje siatkówki myszy do immunohistochemii. Protokół obejmuje dyssekcję oka, utrwalanie w paraformaldehydzie, osadzanie w OCT i cięcie na kriostacie. Metoda zapewnia wysoką jakość preparatów do analizy struktur komórkowych siatkówki.

Przygotowanie kriosekcji siatkówki myszy do immunohistochemii

Przeglądaj więcej filmów