Name: Wykorzystanie fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości do pomiaru ekspresji białek w mózgu gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Poznaj protokół immunohistochemii z fluorescencją w bliskiej podczerwieni do pomiaru ekspresji białek w mózgu szczura. Ta metoda umożliwia ilościową analizę receptorów AMPA/NMDA w hipokampie i ciele migdałowatym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane w tym raporcie zostały sfinansowane z grantu celowego od NIGMS (1P20GM103653) przyznanego DK.

Następujący protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Delaware. Do tego protokołu wykorzystano samce szczurów Sprague Dawley w wieku około 55–75 dni.
1. Ekstrakcja mózgu i przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Znieczulenie szczura izofluranem w komorze indukcyjnej znieczulenia, aż szczur przestanie reagować na uszczypnięcie stopy.</li>
	<li>Składaj ofiary ze szczurów poprzez szybkie ścinanie głów za pomocą gilotyny.</li>
	<li>Przeciąć skórę na czaszce od tyłu do przodu i od góry czaszki.</li>
	<li>Użyj rongeurs, aby ostrożnie usunąć tylną część czaszki, a następnie za pomocą małych nożyczek preparacyjnych przetnij linię środkową czaszki, cały czas naciskając w górę na górną część czaszki, aby uniknąć uszkodzenia tkanki mózgowej.</li>
	<li>Użyj rongeurs, aby oderwać prawą i lewą połowę czaszki, aby odsłonić mózg.</li>
	<li>Użyj małej szpatułki, aby nabrać pod mózg i przeciąć nerwy, ostrożnie podnieś mózg i zamroź mózg w izopentanie schłodzonym na suchym lodzie (co najmniej -20 °C). Następnie przechowuj mózgi w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu pokrojenia.</li>
	<li>Pokrój mózgi w obszarach zainteresowania w temperaturze 30–50 μm w kriosacie utrzymywanym w temperaturze od -9 °C do -12 °C. Plastry należy umieścić bezpośrednio na szkiełkach podstawowych i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu testu immunocytochemicznego. 
	nuta: W tym protokole obszarami mózgu będącymi przedmiotem zainteresowania były hipokamp i ciało migdałowate.</li>
</ol>
2. Pojedyncza reakcja immunohistochemiczna
UWAGA: Dla podwójnej reakcji immunohistochemicznej, protokół jest taki sam jak w przypadku pojedynczej reakcji immunohistochemicznej, z wyjątkiem tego, że ta reakcja ma dwa pierwszorzędowe przeciwciała różnych gospodarzy (np. królika i myszy), a dwa drugorzędowe przeciwciała dla odpowiadających im przeciwciał pierwszorzędowych powinny pochodzić od jednego gospodarza (np. kozia anty-królik i kozia antymysz). Przeciwciała drugorzędowe muszą również pochodzić z dwóch różnych widm, które są dostępne w skanerach o wysokiej rozdzielczości. Na przykład jedno przeciwciało drugorzędowe o piku widma emisyjnego przy 680 nm i jedno przeciwciało drugorzędowe 800CW (pik widma emisyjnego przy 780 nm).
<ol>
	<li>Wyjmij szkiełka podstawowe z zamrażarki i pozostaw do osiągnięcia temperatury pokojowej na 30 minut.</li>
	<li>Pod wyciągiem oparowym utrwalić tkankę mózgową w 4% paraformaldehydzie w 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przepłukać szkiełka w 0,1 M buforowanym roztworem soli fizjologicznej (TBS) trzy razy przez 10 minut każde. Przepuszczalność błon komórkowych poprzez inkubację szkiełek w łagodnym detergencie (np. 0,01% detergentu) przez 30-60 minut.</li>
	<li>Opłucz szkiełka w TBS trzy razy po 15 minut każda.</li>
	<li>Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało dla białka będącego przedmiotem zainteresowania w PBS w odpowiednim stężeniu. Na przykład, aby wykryć natychmiastowy wczesny gen c-Fos, przygotuj pierwszorzędowe przeciwciało anty c-Fos królika w stężeniu 1:500.</li>
	<li>Pipetować roztwór przeciwciała pierwotnego bezpośrednio na tkankę mózgową (około 200 μl na szkiełko o wymiarach 3 cale x 1 cal).</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe należy stosować do inkubacji tkanki mózgowej na szkiełkach podstawowych w pierwotnym rozcieńczeniu przeciwciał przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc (~17 godzin) w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usuń szkiełka nakrywkowe i umyj szkiełka w TBS, do którego dodano niewielką ilość detergentu (np. 0,01% detergentu, "TBS-T") cztery razy przez 15 minut każdy.</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe należy stosować do inkubacji skrawków mózgu w przeciwciałie drugorzędowym w temperaturze pokojowej przez 2 godziny 
	nuta: Przeciwciało drugorzędowe musi być w odpowiednim rozcieńczeniu i w rozcieńczalniku zawierającym TBS, detergent i 1,5% surowicy gospodarza. Na przykład przeciwciało drugorzędowe kozie w rozcieńczeniu 1:2000 zawierałoby 1,5% surowicy koziej i 0,05% detergentu.</li>
	<li>Szkiełka podstawowe należy płukać w TBS-T cztery razy po 20 minut każda, a następnie w TBS cztery razy po 20 minut każda.</li>
	<li>Suszyć szkiełka w temperaturze pokojowej w ciemności przez noc. Gdy szkiełka wyschną, są gotowe do obrazowania.</li>
</ol>
3. Obrazowanie
<ol>
	<li>Umieść szkiełka na interfejsie skanowania w bliskiej podczerwieni tkanką skierowaną w dół. Obraz jednego szklanego slajdu lub wielu slajdów naraz za pomocą narzędzia do zaznaczania.</li>
	<li>Obraz przesuwa się przy użyciu najwyższego ustawienia jakości z przesunięciem 0 nm i rozdzielczością 21 μm. Skanowanie trwa zwykle 13-19 godzin, w zależności od używanego sprzętu skanującego.</li>
	<li>Importuj obrazy do oprogramowania do analizy obrazu (np. ImageStudio), aby wyświetlić i oznaczyć je do półilościowej analizy białek.</li>
</ol>
4. Analiza ekspresji białek
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu i wybierz obszar roboczy, do którego obraz został zeskanowany.</li>
	<li>Otwórz zeskanowany obraz w oprogramowaniu do analizy obrazu, aby wyświetlić skan i dostosuć, które długości fal są oglądane, a także wyświetlany kontrast, jasność i powiększenie bez zmiany surowego obrazu lub całkowitej emisji ilościowej.</li>
	<li>Zidentyfikuj kluczowe obszary do oceny ilościowej i wybierz kartę Analiza u góry strony, a następnie wybierz opcję Rysuj prostokąt (lub Rysuj elipsę/rysuj odręcznie), aby narysować prostokąt nad obszarem, który zostanie określony ilościowo.</li>
	<li>Aby wyświetlić rozmiar prostokąta, wybierz pozycję Kształty w lewym dolnym rogu ekranu, a następnie wybierz pozycję Kolumny w prawym dolnym rogu. Dodaj kolumny Wysokość i Szerokość, aby zidentyfikować rozmiar kształtu. 
	nuta: Ważne jest, aby kontrolować rozmiar kształtu podczas porównywania kwantyfikacji. Zaleca się stosowanie identycznych kształtów umieszczonych w żądanym miejscu oznaczania ilościowego, w celu uzyskania dokładnej próbki emisji dla tego regionu.</li>
	<li>Następnie nazwij kształt i powtórz czynność. Po próbkowaniu wszystkich regionów można agregować i analizować dane dostępne na karcie kolumny.</li>
</ol>

<ol><li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Principles+of+Neural+Science%22">Principles of Neural Science</a>. , McGraw Hill. New York. (2013).</li>
<li>Byrne, J. H., Roberts, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aByrne%2C+JH+%22From+Molecules+to+Networks%3A+An+Introduction+to+Cellular+and+Molecular+Neuroscience%22">From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience</a>. , Academic Press/Elsevier. (2009).</li>
<li>Salami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D2%2F3+binding+potential+modulates+neural+signatures+of+working+memory+in+a+load-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion.</a> Journal of Neuroscience. , (2018).</li>
<li>Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+amygdaloid+corticotropin-releasing+hormone+%28CRH%29+mediate+anxiety-like+behaviors%3F+Dissociation+of+anxiogenic+effects+and+CRH+release%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release.</a> European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).</li>
<li>English, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dataset+of+mouse+hippocampus+profiled+by+LC-MS%2FMS+for+label-free+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation.</a> Data in Brief. 7, 341-343 (2016).</li>
<li>David, M. A., Tayebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein+aggregates+in+brain+and+cerebrospinal+fluid+derived+from+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients.</a> Frontiers in Neurology. 5, 251(2014).</li>
<li>Oliver, C., Jamur, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2010).</li>
<li>Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescent+cells+in+rat+brain+can+be+convincing+impostors+in+green+fluorescent+reporter+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).</li>
<li>Knox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+c-Jun+to+identify+fear+extinction+learning-specific+patterns+of+neural+activity+that+are+affected+by+single+prolonged+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Researach%22%5BJournal%5D)">Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress.</a> Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).</li>
<li>Knox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+via+which+single+prolonged+stress+exposure+leads+to+fear+extinction+retention+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits.</a> Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).</li>
<li>Malinow, R., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).</li>
<li>Nabavi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+memory+with+LTD+and+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineering a memory with LTD and LTP.</a> Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).</li>
<li>Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. The Annual Delaware Neuroscience Research and Poster Symposium, Newark, DE, , (2018).</li>
<li>Eagle, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+prolonged+stress+enhances+hippocampal+glucocorticoid+receptor+and+phosphorylated+protein+kinase+B+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels.</a> Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wyniki przedstawione w tym artykule pokazują, że immunocytochemia w bliskiej podczerwieni w połączeniu ze skanowaniem w wysokiej rozdzielczości może być wykorzystana do uzyskania półilościowych pomiarów ekspresji białek w tkance mózgowej. Może być również używany do znakowania dwóch białek jednocześnie w tym samym regionie mózgu. Wcześniej używaliśmy immunohistochemii w bliskiej podczerwieni do pomiaru natychmiastowej wczesnej ekspresji genów w wielu regionach mózgu 9,10<sup class="xref...

Badanie neuronauki dotyczy badania, w jaki sposób komórki w mózgu pośredniczą w określonych funkcjach1. Mogą one mieć charakter komórkowy, na przykład w jaki sposób komórki glejowe nadają odporność w ośrodkowym układzie nerwowym lub mogą obejmować eksperymenty, które mają na celu wyjaśnienie, w jaki sposób aktywność neuronów w grzbietowym hipokampie prowadzi do nawigacji przestrzennej. W szerokim znaczeniu funkcja komórkowa jest determinowana przez białka, które ulegają ekspresji w komórce i aktywność tych białek2. W rezultacie, pomiar ekspresji i/lub aktywności białek w komórkach mózgowych ma kluczowe znaczenie dla badań neurobiologii.
Dostępnych jest wiele technik pomiaru ekspresji białek w mózgu. Należą do nich metody in vivo, takie jak topografia emisji pozytonów dla gęstości receptorów3 oraz mikrodializa dla małych peptydów4. Częściej metody ex vivo są stosowane do badania funkcji i ekspresji białek. Należą do nich techniki spektrometrii mas5, test immunoenzymatyczny western blot i enzymatyczny (ELISA)6 oraz immunocytochemistry7. Immunocytochemia jest szeroko stosowana w dziedzinie neuronauki. Technika ta polega na użyciu przeciwciała pierwszorzędowego do wykrycia białka (lub antygenu) będącego przedmiotem zainteresowania (np. c-Fos) oraz sprzężonego przeciwciała drugorzędowego do wykrycia kompleksu białko-przeciwciało pierwotne (ryc. 1). Aby umożliwić wykrycie kompleksu białko-przeciwciało pierwszorzędowe-przeciwciało drugorzędowe, przeciwciała drugorzędowe mają sprzężone z nimi czynniki utleniające, takie jak peroksydaza chrzanowa (HRP). Pozwala to na tworzenie się osadów w komórkach, które można wykryć za pomocą mikroskopii świetlnej7. Przeciwciała drugorzędowe mogą również mieć sprzężone z nimi substancje chemiczne fluoryzujące (tj. Fluorofory). Po stymulacji te substancje chemiczne emitują światło, które może być wykorzystane do wykrywania kompleksów białko-przeciwciało pierwotne-przeciwciało drugorzędowe7. Wreszcie, czasami przeciwciała pierwszorzędowe mają przyłączone środki redukujące i chemikalia fluorescencyjne, które bezpośrednio negują potrzebę stosowania przeciwciał drugorzędowych7 (Figura 1).
Interesujące, wiele metod immunocytochemicznych pozwala na wizualizację białek w komórkach mózgowych, ale nie pozwala na ilościowe określenie ilości białka w określonej komórce lub regionie mózgu. Wykorzystanie mikroskopii świetlnej do wykrywania osadów z reakcji redukcji pozwala na wizualizację neuronów i gleju, ale metoda ta nie może być stosowana do ilościowego określania ekspresji białek w komórkach lub w określonym regionie mózgu. Teoretycznie można do tego wykorzystać mikroskopię fluorescencyjną, ponieważ światło emitowane przez fluorescencyjne przeciwciało drugorzędowe jest miarą kompleksu białko-przeciwciało pierwotne-przeciwciało wtórne. Jednak autofluorescencja w tkance mózgowej może utrudniać wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego określenia ekspresji białek w tkance mózgowej8. W rezultacie, światło emitowane z fluorescencyjnych obrazów tkanki mózgowej jest rzadko wykorzystywane do ilościowego określania ekspresji białek w mózgu.
Wiele z tych problemów można rozwiązać za pomocą immunocytochemii w bliskiej podczerwieni w połączeniu ze skanowaniem w wysokiej rozdzielczości9,10. W tym artykule opisujemy, w jaki sposób immunocytochemia sprzężona z fluoroforami w widmach emisyjnych w bliskiej podczerwieni może być połączona ze skanowaniem w wysokiej rozdzielczości (np. 10–21 μm) w celu uzyskania ostrych obrazów, które pozwalają na częściową kwantyfikację białka w różnych obszarach mózgu.

<table><tbody><tr><td>Komora indukcyjna anestezjologiczna</td><td></td> do ekstrakcji <td></td> mózgu Kent Scientific VetFlo-0530SM <td></td></tr><tr><td>Gilotyna Kleine'a</td><td>Aparat Harvard</td><td>73-1920</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16000-14</td><td>służy do usuwania tylnej części czaszki</td></tr><tr><td></td> Delikatne nożyczki preparacyjne Fischer Scientific 08-951-5 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>służy do cięcia w górę wzdłuż linii środkowej czaszki</td></tr><tr><td>Mikroszpatułka</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-401-5</td><td>służy do wydobywania mózgu</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-549-6</td><td></td></tr><tr><td>Reakcja</td><td></td><td></td><td></td> immunohistochemiczna</tr><tr><td>&nbsp; Triton X-100</td><td></td><td></td><td>Stosowany jako łagodny detergent do przepuszczalności komórek po utrwaleniu w paraformaldehydzie, stosowany również jako łagodny detergent w połączeniu z surowicą gospodarza i przeciwciałem drugorzędowym&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td></td><td></td><td>Stosowany jako niewielka ilość detergentu dodawana do TBS&nbsp; w celu uzyskania TBS-T po nakrywkach z pierwotnym przeciwciałem</td></tr><tr><td>Skaner Licor Odyssey Licor</td><td>Biotechnology Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>Licor Biotechnology Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości do pomiaru ekspresji białek w mózgu gryzoni

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuronauka to nauka o tym, jak komórki w mózgu pośredniczą w różnych funkcjach. Pomiar ekspresji białek w neuronach i gleju ma kluczowe znaczenie dla badań neurobiologii, ponieważ funkcja komórkowa zależy od składu i aktywności białek komórkowych. W tym artykule opisujemy, w jaki sposób immunocytochemię można połączyć ze skanowaniem w bliskiej podczerwieni o wysokiej rozdzielczości, aby zapewnić półilościową miarę ekspresji białek w różnych obszarach mózgu. Technika ta może być stosowana do pojedynczej lub podwójnej ekspresji białka w tym samym regionie mózgu. Pomiar białek w ten sposób może być wykorzystany do uzyskania względnej zmiany w ekspresji białek za pomocą eksperymentalnej manipulacji, molekularnej sygnatury uczenia się i pamięci, aktywności w szlakach molekularnych i aktywności neuronalnej w wielu regionach mózgu. Korzystając z odpowiednich białek i analizy statystycznej, można również określić funkcjonalne połączenia między regionami mózgu. Biorąc pod uwagę łatwość wdrożenia immunocytochemii w laboratorium, zastosowanie immunocytochemii ze skanowaniem w bliskiej podczerwieni w wysokiej rozdzielczości może rozszerzyć możliwości neurobiologa do badania procesów neurobiologicznych na poziomie systemowym.

Przed zastosowaniem skanowania o wysokiej rozdzielczości do immunohistochemii należy zweryfikować poprawność działania protokołu. Można to osiągnąć za pomocą testu walidacyjnego, w którym przekroje mózgu z tego samego zwierzęcia są inkubowane z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi, samym przeciwciałem drugorzędowym lub bez przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych. Wyniki takiego testu walidacyjnego przedstawiono na Rysunku 2. W tej reakcji ...

Tutaj prezentujemy protokół, który wykorzystuje barwniki bliskiej podczerwieni w połączeniu z immunohistochemią i skanowaniem w wysokiej rozdzielczości do oznaczania białek w obszarach mózgu.

Wykorzystanie fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości do pomiaru ekspresji białek w mózgu gryzoni

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala na ilościowe określenie dwóch białek w tym samym regionie mózgu. Pozwala to eksperymentatorowi przyjrzeć się aktywności molekularnych szlaków sygnałowych w regionach mózgu poprzez oznaczenie panek i fosfoprotein. Może być również stosowany do oznaczania białek, które są markerami różnych zjawisk poznawczych.Używamy stosunkowo prostej techniki, takiej jak immunohistochemia, aby odpowiedzieć na pytania, które zwykle wymagają bardziej skomplikowanych technik. W tym badanie aktywności molekularnych szlaków sygnałowych, badanie stosunku AMPA/NMDA. Używając kriostatu utrzymywanego w temperaturze od minus 9 stopni Celsjusza do minus 12 stopni Celsjusza, pokrój wcześniej wyizolowany i zamrożony mózg szczura w obszarach zainteresowania w odległości 30-50 mikrometrów.Plastry należy montować bezpośrednio na szkiełkach podstawowych i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu uzyskania immunocytochemii. Wyjmij szkiełka podstawowe z zamrażarki i pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową przez 30 minut. Pracując pod wyciągiem, umieść szkiełka w 4% paraformaldehydzie w 0,1 molowym PBS na jedną do dwóch godzin w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia tkanek.Następnie przepłukać szkiełka w 0,1 molowym TBS trzy razy przez 10 minut każde. Aby przepuszczalność błon komórkowych, inkubuj szkiełka w łagodnym detergencie przez 30-60 minut. I ponownie spłucz w TBS trzy razy po 15 minut każdy.Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało dla białka będącego przedmiotem zainteresowania w PBS w odpowiednim stężeniu, jak opisano w manuskrypcie. Pipetować roztwór przeciwciała pierwotnego bezpośrednio na tkankę mózgową. Umieścić szkiełka nakrywkowe na szkiełkach i inkubować tkankę mózgową w rozcieńczeniu przeciwciał pierwotnych przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.Po inkubacji zdjąć szkiełka nakrywkowe i umyć szkiełka w TBS z dodatkiem niewielkiej ilości detergentu, cztery razy po 15 minut każde. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w rozcieńczalniku zawierającym TBS, detergent i 1,5% surowicy gospodarza. Dodać przeciwciało wtórne do szkiełek, przykryć szkiełkami nakrywkowymi i inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.Po inkubacji przepłukać szkiełka w TBS-T cztery razy przez 20 minut każde, a następnie w TBS cztery razy po 20 minut każde. Wysuszyć szkiełka w temperaturze pokojowej w ciemności, przez noc. Umieść szkiełka na interfejsie skanowania w bliskiej podczerwieni z tkanką skierowaną w dół.Obrazowanie wielu slajdów jednocześnie za pomocą narzędzia do zaznaczania. Obrazuj slajdy przy użyciu najwyższej jakości ustawienia z rozdzielczością 21 mikrometrów. Z przesunięciem zerowym nanometrów zaimportuj obrazy do oprogramowania do analizy obrazu, aby wyświetlić i oznaczyć do półilościowej analizy białek.Po otwarciu oprogramowania do analizy obrazu wybierz obszar roboczy, do którego obraz został zeskanowany. Następnie otwórz zeskanowany obraz w oprogramowaniu do analizy obrazu, aby wyświetlić skan i dostosować długości fal, kontrast, jasność i powiększenie wyświetlane bez zmiany surowego obrazu lub całkowitej emisji ilościowej. Po zidentyfikowaniu kluczowych regionów do oceny ilościowej wybierz kartę analizy u góry strony, a następnie wybierz pozycję Rysuj prostokąt, aby narysować prostokąt nad obszarem, który zostanie określony ilościowo.Aby wyświetlić rozmiar prostokąta, zaznacz kształty w lewym dolnym rogu ekranu. Następnie wybierz kolumny w prawym dolnym rogu. Następnie dodaj kolumny wysokości i szerokości, aby określić rozmiar kształtu.Na koniec nazwij kształt i powtórz. Po próbkowaniu wszystkich regionów kontynuuj łączenie i analizowanie danych dostępnych na karcie kolumny. Aby sprawdzić, czy ten protokół działa, skrawki mózgu inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi, samym przeciwciałem drugorzędowym lub ani ani przeciwciałem pierwszorzędowym, ani drugorzędowym.Natychmiastowa wczesna ekspresja genu c-jun została wykryta w grzbietowym hipokampie i ciele migdałowatym tylko wtedy, gdy do tkanki mózgowej zastosowano zarówno pierwszorzędowe, jak i drugorzędowe przeciwciała. Podjednostkę GluR1 receptora AMPA i podjednostkę NR2A receptora NMDA oznaczono w wykrywaniu białek kału w jądrach ciała migdałowatego. Pozwoliło to na zbadanie stosunku receptorów AMPA NMDA w podjądrach ciała migdałowatego, które są neurobiologiczną sygnaturą uczenia się i pamięci.Średnie i znormalizowane pomiary ekspresji białek uzyskano ze skanów o wysokiej rozdzielczości w brzusznym hipokampie. Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, prostokąt jest umieszczany w obszarze zainteresowania, a średnie natężenie światła z kształtu zostało użyte jako miara ekspresji fluoroforu, która jest miarą ekspresji białka. Aby uzyskać znormalizowaną krzywą, kształt umieszczono w poprzek regionu, który wyraża wysoki sygnał i niski sygnał w obszarze pod krzywą, który został użyty jako miara ekspresji białka.Największym wyzwaniem związanym z tą procedurą jest znalezienie przeciwciała i upewnienie się, że działa. Aplikacja jest prosta. Moja rada byłaby taka, aby najpierw spróbować regularnej procedury immunohistochemicznej, a następnie wypróbować tę technikę.Zawsze najpierw przeprowadzaj test walidacyjny. Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest sprawdzenie rozcieńczenia przeciwciał i upewnienie się, że jest ono prawidłowo stosowane. Bez tych kroków procedura zakończy się niepowodzeniem.

using-near-infrared-fluorescence-high-resolution-scanning-to-measure

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę obrazowania fluorescencyjnie znakowanych komórek w półgrubych skrawkach mózgu. Poprzez utrwalenie, pocięcie i optyczne klarowanie tkanki mózgowej opisujemy, w jaki sposób standardowe obrazowanie epifluorescencyjne lub konfokalne może być wykorzystane do wizualizacji poszczególnych komórek i sieci neuronalnych w obrębie nienaruszonej tkanki nerwowej.

Szybka metoda obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości w półgrubych przekrojach mózgu

Ten film demonstruje barwienie immunofluorescencyjne wycinka mózgu myszy w celu ilościowego określenia rozkładu określonego białka presynaptycznego. Proces ten polega na blokowaniu miejsc niespecyficznych, zastosowaniu pierwszorzędowych przeciwciał dla białka docelowego i markera referencyjnego, a następnie wtórnym znakowaniu przeciwciał i przeciwbarwieniu jądrowym. Marker referencyjny zapewnia dokładną kwantyfikację, zapewniając spójną linię wyjściową, a dystrybucja białka presynaptycznego...

Kwantyfikacja rozmieszczenia białka presynaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Źródło: Jolly, S., et.al. Połączenie podwójnej fluorescencji  hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w sekcjach mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2016). Ten film demonstruje zastosowanie hybrydyzacji in situ z podwójną fluorescencją do wizualizacji ekspresji dwóch celów RNA w sekcjach mózgu myszy. Protokół obejmuje sekwencyjne wykrywanie RNA za pomocą sond znakowanych izotiocyjanianem fluoresceiny i digoksygeniną, a następnie enzymatyczne wzmacnianie sygnału w...

 Wykonywanie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ w celu wykrycia ekspresji genów w skrawkach mózgu myszy

Source: Kimmelmann-Shultz, B., et. al. Używanie fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości do pomiaru ekspresji białek w mózgu gryzoni.J. Vis. Exp. (2019) Ten film demonstruje metodę fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości do pomiaru ekspresji białek w mózgu gryzonia.

Pomiar ekspresji białek w mózgu gryzoni za pomocą fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości 

Źródło: Lacin, E., et al. Budowa komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych (CNiFER) do optycznej detekcji neuroprzekaźników in vivo. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia technikę obrazowania uwalniania neuroprzekaźników in vivo przy użyciu komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych (CNiFER), wyspecjalizowanych komórek reporterowych wstępnie wstrzykniętych do kory myszy. Umieszczona pod mikroskopem dwufotonowym mysz umożliwia wizualizację sygnalizacji wapniowej indukowanej przez...

Obrazowanie uwalniania neuroprzekaźników za pomocą komórkowych neuroprzekaźników fluorescencyjnych

Celem tego protokołu jest użycie techniki sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) do sortowania określonych typów komórek nerwowych w celu późniejszej analizy ekspresji genów specyficznych dla typu komórki, markerów epigenetycznych i/lub ekspresji białek.

Wykorzystanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją do zbadania ekspresji genów specyficznych dla typu komórki w tkance mózgowej szczura

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Ten protokół opisuje niezbędne kroki do uzyskania wyników lokalizacji białek subkomórkowych na siatkówce danio pręgowanego poprzez korelację obrazów z superrozdzielczej mikroskopii świetlnej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna superrozdzielczość i mikroskopia elektronowa w celu ustalenia lokalizacji białek w siatkówce danio pręgowanego

Tutaj opisujemy ilościowe podejście do określania rozkładu białka synaptycznego względem białka markerowego za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, mikroskopii konfokalnej i analizy komputerowej.

Kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Ten protokół ma na celu efektywne ilościowe określanie aktywności systemu ubikwityna-proteasom (UPS) w różnych przedziałach komórkowych mózgu gryzoni. Użytkownicy mogą badać działanie UPS we frakcjach jądrowych, cytoplazmatycznych i synaptycznych u tego samego zwierzęcia, co skraca czas i liczbę zwierząt potrzebnych do przeprowadzenia tych złożonych analiz.

Kwantyfikacja subkomórkowej aktywności ubikwityny-proteasomu w mózgu gryzoni

Przedstawiamy prosty, efektywny czasowo i wysokoprzepustowy test oparty na spektroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania włókien aktynowych w próbkach biologicznych ex vivo z tkanek mózgowych gryzoni i ludzi.

Efektywny czasowo test oparty na spektroskopii fluorescencji do oceny stanu polimeryzacji aktyny w tkankach mózgu gryzoni i ludzi

Poznaj protokół immunohistochemii z fluorescencją w bliskiej podczerwieni do pomiaru ekspresji białek w mózgu szczura. Ta metoda umożliwia ilościową analizę receptorów AMPA/NMDA w hipokampie i ciele migdałowatym.

Wykorzystanie fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości do pomiaru ekspresji białek w mózgu gryzoni (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości do pomiaru ekspresji białek w mózgu gryzoni

Przeglądaj więcej filmów