Wykorzystanie fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości do pomiaru ekspresji białek w mózgu gryzoni

Protokół ten jest istotny, ponieważ pozwala na ilościowe określenie dwóch białek w tym samym regionie mózgu. Pozwala to eksperymentatorowi przyjrzeć się aktywności molekularnych szlaków sygnałowych w regionach mózgu poprzez oznaczenie panek i fosfoprotein. Może być również stosowany do oznaczania białek, które są markerami różnych zjawisk poznawczych.

Używamy stosunkowo prostej techniki, takiej jak immunohistochemia, aby odpowiedzieć na pytania, które zwykle wymagają bardziej skomplikowanych technik. W tym badanie aktywności molekularnych szlaków sygnałowych, badanie stosunku AMPA/NMDA. Używając kriostatu utrzymywanego w temperaturze od minus 9 stopni Celsjusza do minus 12 stopni Celsjusza, pokrój wcześniej wyizolowany i zamrożony mózg szczura w obszarach zainteresowania w odległości 30-50 mikrometrów.

Plastry należy montować bezpośrednio na szkiełkach podstawowych i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu uzyskania immunocytochemii. Wyjmij szkiełka podstawowe z zamrażarki i pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową przez 30 minut. Pracując pod wyciągiem, umieść szkiełka w 4% paraformaldehydzie w 0,1 molowym PBS na jedną do dwóch godzin w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia tkanek.

Następnie przepłukać szkiełka w 0,1 molowym TBS trzy razy przez 10 minut każde. Aby przepuszczalność błon komórkowych, inkubuj szkiełka w łagodnym detergencie przez 30-60 minut. I ponownie spłucz w TBS trzy razy po 15 minut każdy.

Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało dla białka będącego przedmiotem zainteresowania w PBS w odpowiednim stężeniu, jak opisano w manuskrypcie. Pipetować roztwór przeciwciała pierwotnego bezpośrednio na tkankę mózgową. Umieścić szkiełka nakrywkowe na szkiełkach i inkubować tkankę mózgową w rozcieńczeniu przeciwciał pierwotnych przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji zdjąć szkiełka nakrywkowe i umyć szkiełka w TBS z dodatkiem niewielkiej ilości detergentu, cztery razy po 15 minut każde. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w rozcieńczalniku zawierającym TBS, detergent i 1,5% surowicy gospodarza. Dodać przeciwciało wtórne do szkiełek, przykryć szkiełkami nakrywkowymi i inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Po inkubacji przepłukać szkiełka w TBS-T cztery razy przez 20 minut każde, a następnie w TBS cztery razy po 20 minut każde. Wysuszyć szkiełka w temperaturze pokojowej w ciemności, przez noc. Umieść szkiełka na interfejsie skanowania w bliskiej podczerwieni z tkanką skierowaną w dół.

Obrazowanie wielu slajdów jednocześnie za pomocą narzędzia do zaznaczania. Obrazuj slajdy przy użyciu najwyższej jakości ustawienia z rozdzielczością 21 mikrometrów. Z przesunięciem zerowym nanometrów zaimportuj obrazy do oprogramowania do analizy obrazu, aby wyświetlić i oznaczyć do półilościowej analizy białek.

Po otwarciu oprogramowania do analizy obrazu wybierz obszar roboczy, do którego obraz został zeskanowany. Następnie otwórz zeskanowany obraz w oprogramowaniu do analizy obrazu, aby wyświetlić skan i dostosować długości fal, kontrast, jasność i powiększenie wyświetlane bez zmiany surowego obrazu lub całkowitej emisji ilościowej. Po zidentyfikowaniu kluczowych regionów do oceny ilościowej wybierz kartę analizy u góry strony, a następnie wybierz pozycję Rysuj prostokąt, aby narysować prostokąt nad obszarem, który zostanie określony ilościowo.

Aby wyświetlić rozmiar prostokąta, zaznacz kształty w lewym dolnym rogu ekranu. Następnie wybierz kolumny w prawym dolnym rogu. Następnie dodaj kolumny wysokości i szerokości, aby określić rozmiar kształtu.

Na koniec nazwij kształt i powtórz. Po próbkowaniu wszystkich regionów kontynuuj łączenie i analizowanie danych dostępnych na karcie kolumny. Aby sprawdzić, czy ten protokół działa, skrawki mózgu inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi, samym przeciwciałem drugorzędowym lub ani ani przeciwciałem pierwszorzędowym, ani drugorzędowym.

Natychmiastowa wczesna ekspresja genu c-jun została wykryta w grzbietowym hipokampie i ciele migdałowatym tylko wtedy, gdy do tkanki mózgowej zastosowano zarówno pierwszorzędowe, jak i drugorzędowe przeciwciała. Podjednostkę GluR1 receptora AMPA i podjednostkę NR2A receptora NMDA oznaczono w wykrywaniu białek kału w jądrach ciała migdałowatego. Pozwoliło to na zbadanie stosunku receptorów AMPA NMDA w podjądrach ciała migdałowatego, które są neurobiologiczną sygnaturą uczenia się i pamięci.

Średnie i znormalizowane pomiary ekspresji białek uzyskano ze skanów o wysokiej rozdzielczości w brzusznym hipokampie. Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, prostokąt jest umieszczany w obszarze zainteresowania, a średnie natężenie światła z kształtu zostało użyte jako miara ekspresji fluoroforu, która jest miarą ekspresji białka. Aby uzyskać znormalizowaną krzywą, kształt umieszczono w poprzek regionu, który wyraża wysoki sygnał i niski sygnał w obszarze pod krzywą, który został użyty jako miara ekspresji białka.

Największym wyzwaniem związanym z tą procedurą jest znalezienie przeciwciała i upewnienie się, że działa. Aplikacja jest prosta. Moja rada byłaby taka, aby najpierw spróbować regularnej procedury immunohistochemicznej, a następnie wypróbować tę technikę.

Zawsze najpierw przeprowadzaj test walidacyjny. Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest sprawdzenie rozcieńczenia przeciwciał i upewnienie się, że jest ono prawidłowo stosowane. Bez tych kroków procedura zakończy się niepowodzeniem.