Ocena reakcji na napięcie naczyniowe przy użyciu izolowanych tętnic krezkowych z naciskiem na modulację przez okołonaczyniowe tkanki tłuszczowe

Wymagany jest bardzo ścisły protokół, abyśmy mogli prawomocnie porównać preparaty od tych samych zwierząt lub od różnych zwierząt lub tętnic w obecności lub braku otaczającego je tłuszczu lub w obecności lub braku śródbłonka. Główną zaletą tej techniki eksperymentalnej jest to, że możemy porównać pierścienie tej samej tętnicy w warunkach izometrycznych, a tym samym miarodajnie wyciągnąć wnioski dotyczące wpływu badanych przez nas czynników eksperymentalnych. Protokół ten zapewnia wgląd w modulację reakcji naczyniowej przez okołonaczyniowe tkanki tłuszczowe różnych genetycznie zmodyfikowanych zwierząt.

Dysfunkcje tkanki tłuszczowej stanowią niezależny czynnik ryzyka nadciśnienia tętniczego i związanych z nim powikłań sercowo-naczyniowych. Nasz miograf składa się z wielu skomplikowanych etapów, które wymagają szczególnej ostrożności w każdym punkcie, aby uniknąć uszkodzenia naczynia, zwłaszcza podczas montażu, oraz aby upewnić się, że naczynie odpowiednio reaguje na różne bodźce. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania i wypreparowania pierścieni tętniczych krezki zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Włącz komputer i otwórz oprogramowanie do nagrywania danych. Zapisz eksperyment jako plik danych wykresu laboratoryjnego pod nową nazwą, aby uniknąć zastąpienia oryginalnego pliku ustawień. Otwórz okno ustawień normalizacji i ustaw współczynnik K na jeden.

Zaakceptuj wartości domyślne kalibracji adresów IP, ciśnienia docelowego, czasu uśredniania online i czasu opóźnienia. Kliknij OK, aby zapisać ustawienia. Wybierz interesujące Cię kanały i wprowadź średnicę drutu, punkty końcowe tkanki i początkowy odczyt mikrometru w oknie normalizacji.

Aby rozpocząć procedurę normalizacji, zastosuj pierwsze pasywne rozciąganie do naczynia krwionośnego, obracając mikrometryczną w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Po odczekaniu trzech minut, aż naczynie się ustabilizuje, wprowadź nowy odczyt mikrometru w oknie normalizacji. Naprężenie ściany jest obliczane automatycznie i wyświetlane jako punkt na wykresie.

Po każdym pasywnym rozciąganiu należy zastąpić kontrolny bufor Krebs izoosmotycznym buforem o wysokiej zawartości potasu zawierającym 150 milimolowy chlorek potasu. Gdy skurcz osiągnie plateau po około trzech minutach, zapisz aktywną siłę, odejmując siłę pasywną przy każdym rozciągnięciu od siły aktywowanej potasem. Oblicz naprężenie ściany, a także wartości obwodu wewnętrznego.

Usuń stan wysokiego stężenia potasu, zastępując bufor o wysokiej zawartości potasu świeżym buforem Krebs. Powtarzaj mycie trzy razy w ciągu pięciu minut. Powtórz kroki normalizacji, indukując pasywne rozciąganie, a następnie aktywny skurcz w naprzemiennych obrotach, aż aktywne napięcie zacznie się zmniejszać.

Dokładnie wypłukać bufor o wysokiej zawartości potasu i zrównoważyć preparaty przez kolejne 30 do 45 minut. Zresetuj podstawowe napięcia do zera, tak aby podczas kolejnego eksperymentu rejestrowane były tylko aktywne reakcje skurczowe. Przygotuj i zamontuj sparowane pierścienie tętnicze zgodnie z opisem w protokole tekstowym z sąsiednich odcinków każdej tętnicy.

Przygotuj jeden pierścień tętniczy z nienaruszonym PVAT, a drugi z usuniętym PVAT. Po normalizacji należy wstępnie zkontraktować odcinki tętnic buforem Krebsa o wysokiej zawartości potasu, dodając 115 milimolowy roztwór chlorku potasu do komory zawierającej Krebsa. Po skurczeniu się do okresu plateau wypłukać wysoki poziom potasu i zastąpić bufor świeżo napowietrzonym buforem krebs.

Powtórz mycie trzy razy w ciągu pięciu minut. Powtórzyć stymulację chlorkiem potasu i płukanie trzy razy i zapisać maksymalną reakcję skurczową na chlorek potasu, odejmując napięcie podstawowe od napięcia spowodowanego stymulacją chlorkiem potasu. Po ostatnim skurczu i przepłukaniu napełnij komorę ciepłym, napowietrzonym buforem krebs i pozwól tętnicy zregenerować się przez około 30 minut przed wykonaniem kolejnego zadania.

Do każdej komory dodać skumulowane ilości fenylefryny w celu wywołania zależnego od stężenia wzrostu i napięcia izometrycznego preparatów w stanie spoczynku. Po dodaniu ostatniej dawki agonisty należy dokładnie wypłukać lek i ponownie napełnić komorę świeżym buforem krebs. Wykreślić reakcje zależne od stężenia, gdy rosnący procent chlorku potasu indukował maksymalne skurcze.

Aby ocenić udział tlenku azotu, należy inkubować preparaty z inhibitorem syntazy tlenku azotu L-NAME przez 30 minut przed dodaniem fenylefryny. W celu sekwencyjnego wykonania drugiej krzywej stężenie-odpowiedź, należy całkowicie i wielokrotnie umyć komorę, aby usunąć wszystkie poprzednie agonistów, aż do momentu, gdy nie zaobserwuje się dalszych zmian tonu. Normalizację zależności długość-napięcie przeprowadzono dla tętnic krezkowych wyizolowanych z modeli mysich karmionych standardową karmą lub dietą wysokotłuszczową.

Pasywną zależność długość-napięcie ustalono poprzez stopniowe rozciąganie odcinków tętnicy, aż do uzyskania obwodu wewnętrznego odpowiadającego 100 milimetrom ciśnienia transściennego rtęci, czyli IC100. Po każdym rozciąganiu stosowano 115-milimolowy chlorek potasu w celu pobudzenia skurczów. Krzywe rozciągania długości czynnej zostały wykreślone na podstawie danych o sile czynnej na osi Y, a obliczone wartości IC na podstawie danych mikrometrycznych na osi X.

Wartość IC leżąca w obrębie plateau piku to IC1. Współczynnik normalizacji K obliczono jako stosunek IC1 i IC100, który można było następnie zastosować do próbek tego samego typu naczynia w kolejnym eksperymencie. Pokazano tutaj zapisy wyjściowe odpowiedzi zwężających naczynia krwionośne na fenylefrynę w tętnicach krezkowych z otaczającym PVAT lub bez niego.

Skumulowane stężenia fenylefryny zastosowano w celu stymulacji skurczów tętnic krezkowych pobranych od 16-tygodniowych myszy z zespołem tłuszczu pierwszego. Reakcje skurczowe zarejestrowano i obliczono jako procent maksymalnego skurczu wywołanego 150 milimolowym chlorkiem potasu. Obszar pod krzywymi skurczu wykreślono dla porównania.

Należy zauważyć, że PVAT z jednej myszy z tkanki tłuszczowej wywołał efekt przeciwskurczowy w odpowiedzi na fenylefrynę. Podczas uzyskiwania skurczów wywołanych przez KCL odpowiedzi muszą być stabilne i stabilne. Jeśli odpowiedź nadal się nasila po trzech stopniowych podaniu KCL, może być konieczna stymulacja KCL.

Aby osiągnąć optymalne warunki napięć, bardzo ważny jest etap normalizacji, ponieważ określa on siłę potrzebną do otwarcia naczyń krwionośnych. Jeśli nie zostanie to zrobione prawidłowo, wpłynie to na cały eksperyment. Protokół ten może być stosowany do innych ustawień oprócz skurczu lub rozluźnienia wywołanego przez fenylefrynę.

Na przykład w obecności lub braku okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej, nerwów autonomicznych lub śródbłonka. Dzięki temu protokołowi naukowcy mogą badać małe naczynia krwionośne z chorych modeli zwierzęcych w różnych stanach patofizjologicznych, takich jak otyłość, cukrzyca i choroby sercowo-naczyniowe.