Name: Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i różnicowanie w kierunku prekursorów neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Poznaj metodę generowania indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i ich różnicowania w kierunku neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych w leczeniu choroby Parkinsona.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została wsparta przez następujące granty: Stem Cell and Translation National Key Project (2016YFA0101403), National Natural Science Foundation of China (81661130160, 81422014, 81561138004), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Talents Foundation (2017000021223TD03), Projekt Wsparcia Nauczycieli Wysokiego Szczebla na Uniwersytetach Miejskich w Pekinie w okresie 13. planu pięcioletniego (CIT & TCD20180333), Nagroda Talentów Wysokiego Szczebla Pekińskiego Systemu Medycznego (2015-3-063), Fundusz Miejskiej Komisji Zdrowia w Pekinie (PXM 2018_026283_000002), Fundusz Stu Tysięcy i Dziesięciu Tysięcy Talentów w Pekinie (2018A03), Rozwój Medycyny Klinicznej Specjalnej Wsparcia Finansowego Administracji Szpitali Miejskich w Pekinie (ZYLX201706) oraz Stypendium Królewskie Society-Newton Advanced Fellowship (NA150482).

<ol><li>Williams-Gray, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+cognitive+syndromes+of+Parkinson%27s+disease%3A+5+year+follow-up+of+the+CamPaIGN+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The distinct cognitive syndromes of Parkinson's disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort.</a> Brain. 132, Pt 11 2958-2969 (2009).</li>
<li>Dexter, D. T., Jenner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson+disease%3A+from+pathology+to+molecular+disease+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms.</a> Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).</li>
<li>Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Therapy+for+Parkinson%27s+Disease%3A+New+Hope+from+Reprogramming+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Cell Therapy for Parkinson's Disease: New Hope from Reprogramming Technologies.</a> Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Doi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+dopaminergic+progenitors+by+cell+sorting+for+successful+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation.</a> Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).</li>
<li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).</li>
<li>Perrier, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).</li>
<li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-derived+dopaminergic+neurons+function+in+a+primate+Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model.</a> Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).</li>
<li>Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+reprogramming+of+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Progress in the reprogramming of somatic cells.</a> Circulation Research. 112 (3), 562-574 (2013).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+adult+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+into+induced+neural+stem+cell+by+using+episomal+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors.</a> Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+precursors+differentiated+from+human+blood-derived+induced+neural+stem+cells+improve+symptoms+of+a+mouse+Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson's disease model.</a> Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).</li>
<li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+into+stably+expandable+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li>
<li>Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+a+small+amount+of+human+peripheral+blood+using+a+combination+of+activated+T+cells+and+Sendai+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus.</a> Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).</li>
<li>Bazley, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Reprogramming+of+Human+Primordial+Germ+Cells+into+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Efficient+Generation+of+Genetically+Engineered+Germ+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells.</a> Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).</li>
<li>Li, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+RNA+vector+derived+from+nontransmissible+Sendai+virus+with+efficient+gene+transfer+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression.</a> Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).</li>
<li>Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+urine+iPS+cell+lines+from+patients+with+Attention+Deficit+Hyperactivity+Disorder+%28ADHD%29+using+a+non-integrative+method%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method.</a> Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).</li>
<li>Ban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).</li>
<li>Cho, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+primary+somatic+cells+by+OCT4+and+chemical+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds.</a> Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).</li>
<li>Ono, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+neurogenic+potential+in+floor+plate+cells+along+an+anteroposterior+location%3A+midbrain+dopaminergic+neurons+originate+from+mesencephalic+floor+plate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells.</a> Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).</li>
<li>Kirkeby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+regionally+specified+neural+progenitors+and+functional+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions.</a> Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+functional+floor+plate+tissue+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).</li>
<li>Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+rodent+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochirurgica+Supplements%22%5BJournal%5D)">Transgenic rodent models of Parkinson's disease.</a> Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).</li>
<li>Sheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dopaminergic+neurons+directly+from+mouse+fibroblasts+and+fibroblast-derived+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors.</a> Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).</li>
<li>Prasad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+induced+pluripotent+stem+cell%2C+direct+conversion+by+trans-differentiation%2C+direct+reprogramming+and+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation.</a> Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiliśmy protokół, który obejmował różne etapy terapii komórkowej iNSC-DA dla modeli PD. Krytyczne aspekty tego protokołu obejmują: (1) izolację i ekspansję PBMNC oraz przeprogramowanie PBMNC do iNSC przez infekcję SeV, (2) różnicowanie iNSC do neuronów DA, (3) ustanowienie jednostronnych mysich modeli PD z uszkodzeniem 6-OHDA i ocenę behawioralną oraz (4) przeszczep komórek prekursorów DA i ocena behawioralna.
W tym protokole pierwsza część polega na zbieraniu i namnażani...

Choroba Parkinsona (PD) jest powszechnym zaburzeniem neurodegeneracyjnym, spowodowanym degeneracją neuronów dopaminergicznych (DA) w istocie czarnej pars compacta (SNpc) w brzusznym śródmózgowiu (VM), z częstością występowania ponad 1% w populacji powyżej 60 roku życia1,2. W ciągu ostatniej dekady terapia komórkowa, mająca na celu zastąpienie zwyrodnieniowych lub uszkodzonych komórek lub odżywienie mikrośrodowiska wokół degenerujących się neuronów, wykazała potencjał w leczeniu PD3. W międzyczasie technologia przeprogramowania poczyniła znaczne postępy4, co stanowi obiecujące źródło komórkowe dla terapii zastępczej. Udowodniono, że ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) i embrionalne komórki macierzyste (ESC) są w stanie różnicować się w komórki nerwowe DA, które mogą przetrwać, dojrzewać i poprawiać funkcje motoryczne po wszczepieniu do modeli PD szczurów i naczelnych innych niż ludzie5,6,7,8. Komórki iPS stanowią kamień milowy w technologiach przeprogramowania komórkowego i mają ogromny potencjał w transplantacji komórek; Jednak nadal istnieje obawa o ryzyko powstania guza z nie w pełni zróżnicowanych komórek. Alternatywnym źródłem komórkowym do przeszczepu komórek są dorosłe komórki macierzyste zaangażowane w linię uzyskane poprzez bezpośrednie przeprogramowanie, takie jak indukowane nerwowe komórki macierzyste (iNSC), które mogą pochodzić z niestabilnych produktów pośrednich, z pominięciem etapu pluripotencji9,10,11.
Zarówno iPSC, jak i iNSC mogą być przeprogramowane z autologicznych źródeł komórkowych, takich jak fibroblasty, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMNC) i różne inne typy komórek12,13,14, zmniejszając w ten sposób immunogenność przeszczepionych komórek w znacznym stopniu. Co więcej, w porównaniu z iPSC, iNSC są nieodłącznie związane ze zmniejszonym ryzykiem powstawania nowotworu i plastycznością zaangażowaną w linię, zdolnymi do różnicowania się tylko w neurony i glej11. We wstępnych badaniach ludzkie lub mysie iPSC i iNSC zostały wygenerowane z fibroblastów uzyskanych z biopsji skóry, co jest procedurą inwazyjną14,15. Pod tym względem, PBMNC są atrakcyjnym początkowym źródłem komórek ze względu na mniej inwazyjny proces próbkowania i łatwość uzyskania dużej liczby komórek w krótkim czasie ekspansji16. Początkowe badania nad przeprogramowaniem wykorzystywały integracyjne systemy dostarczania, takie jak wektory lentiwirusowe lub retrowirusowe, które są skuteczne i łatwe do wdrożenia w wielu typach komórek17; Jednak te systemy dostarczania mogą powodować mutacje i reaktywację resztkowych transgenów, co stanowi zagrożenie dla bezpieczeństwa dla klinicznych celów terapeutycznych12. Wirus Sendai (SeV) jest nieintegracyjnym wirusem RNA z jednoniciowym genomem o ujemnym znaczeniu, który nie integruje się z genomem gospodarza, a jedynie replikuje się w cytoplazmie zakażonych komórek, oferując wydajny i bezpieczny nośnik do przeprogramowania18,19. Dostępne są rekombinowane wektory SeV, które zawierają czynniki przeprogramowujące, w tym ludzkie OCT3/4, SOX2, KLF4 i c-MYC w swoich otwartych ramkach odczytu. Ponadto, wektory wirusowe SeV mogą być dalej ulepszane poprzez wprowadzanie mutacji wrażliwych na temperaturę, tak aby można je było szybko usunąć, gdy temperatura hodowli zostanie podniesiona do 39 °C20. W tym artykule opisujemy protokół do przeprogramowania PBMNC na iNSC za pomocą systemu SeV.
Wiele badań wykazało pochodzenie neuronów DA z ludzkich ESC lub iPSC przy użyciu różnych metod6,8,21. Brakuje jednak protokołów szczegółowo opisujących różnicowanie neuronów DA od iNSC. W tym protokole opiszemy efektywne generowanie neuronów DA z iNSC przy użyciu metody dwuetapowej. Prekursory neuronalne DA można przeszczepić do prążkowia mysich modeli PD w celu oceny bezpieczeństwa i skuteczności. W tym artykule zostanie przedstawiony szczegółowy protokół, który obejmuje różne etapy od wytworzenia indukowanych nerwowych komórek macierzystych przez wirusa Sendai, różnicowania iNSC w neurony DA, ustanowienia mysich modeli PD, aż do przeszczepienia prekursorów DA do prążkowia modeli PD. Korzystając z tego protokołu, można generować iNSC od pacjentów i zdrowych dawców oraz uzyskiwać neurony DA, które są bezpieczne, standaryzowalne, skalowalne i jednorodne do celów przeszczepu komórek lub do modelowania PD w naczyniu i badania mechanizmów leżących u podstaw początku i rozwoju choroby.

<table><tbody><tr><td>15-ml probówka stożkowa</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>1-tioglicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td>Działa toksycznie na wdychanie i kontakt ze skórą</td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Corning</td><td>3337</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 50 ml&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>6-OHDA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4381</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td>Odczynnik do dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>Apomorfina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4393</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A92902</td><td>Działa toksycznie w kontakcie ze skórą&nbsp;</td></tr><tr><td>B27 suplement&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego</td></tr><tr><td>Probówki do pobierania krwi zawierające heparynę sodową</td><td>BD</td><td>367871</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>yisheng</td><td>36106es60</td><td>Surowica bydlęca płodu</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td>Cykliczny monofosforan dibutyryloadenozyny</td></tr><tr><td>CellBanker 2</td><td>ZENOAQ</td><td>100ml</td><td>Stosowany jako pożywka do zamrażania PBMNC</td></tr><tr><td>Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowy</td><td>Invitrogen</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Gene Operation</td><td>04-0004</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Fisher</td><td>25*25-2</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417-10mg</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2915-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320</td><td></td></tr><tr><td>Surowica osła</td><td>Jackson</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>EPO</td><td>Peprotech</td><td>100-64-50UG</td><td>Erytropoetyna ludzka</td></tr><tr><td>FGF8b</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td>P = 1,077, średni gradient gęstości</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>Glejowy czynnik neurotroficzny</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>21051024</td><td>100 i razy; Roztwór podstawowy glutaminy</td></tr><tr><td>Ham's-F12</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175079</td><td>Zrównoważony roztwór soli</td></tr><tr><td>Czynnik hamujący białaczkę ludzką</td><td>Millpore</td><td>LIF1010</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki rekombinowany SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07-100UG</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1</td><td>Peprotech</td><td>100-11-100UG</td><td>Ludzki wzrost insulinopodobny czynnik&nbsp;</td></tr><tr><td>IL-3</td><td>Peprotech</td><td>200-03-10UG</td><td>Interleukina ludzka 3</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>215056-023</td><td>Zmodyfikowana pożywka Dulbecco</td></tr> firmy <tr><td>Isco, Insulina Roche&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>12585014</tr><tr><td>ITS-X</td><td>Invitrogen</td><td>51500-056</td><td>Suplement insuliny-transferyny-selenu-X</td></tr><tr><td>Wymiana surowicy nokautującej</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>Surowica wolna podłoże bazowe</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11243217001</tr><tr><td>Mikrostrzykawka</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>N2 suplement&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td>Aminokwas endogenny</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>10888</td><td>Podłoże podstawowe</td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td>Poli-D-lizyna</td></tr><tr><td>SAG1</td><td>Enzo</td><td>ALX-270-426-M01</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Gene Operation</td><td>04-0010-10mg</td><td>Przechowywać ze światła przy -20?</td></tr><tr><td>Wirus Sendai</td><td>Life Technologies</td><td>MAN0009378</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>baiaoshengke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta;?</td><td>Peprotech</td><td>100-36E</td><td>Transformujący czynnik wzrostu&nbsp; &beta;?</td></tr><tr><td>Transferyna</td><td>R& D Systems</td><td>2914-HT-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>baiaoshengke</td><td></td><td>Niejonowy środek powierzchniowo czynny</td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Gibco</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1126</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i różnicowanie w kierunku prekursorów neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Choroba Parkinsona (PD) jest spowodowana degeneracją neuronów dopaminergicznych (DA) w istocie czarnej pars compacta (SNpc) w brzusznym śródmózgowiu (VM). Terapia zastępcza komórek jest bardzo obiecująca w leczeniu choroby Parkinsona. Ostatnio indukowane nerwowe komórki macierzyste (iNSC) pojawiły się jako potencjalny kandydat do terapii zastępczej komórek ze względu na zmniejszone ryzyko powstania guza i plastyczność w celu powstania specyficznych dla regionu neuronów i gleju. iNSC można przeprogramować z autologicznych somatycznych źródeł komórkowych, takich jak fibroblasty, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMNC) i różne inne typy komórek. W porównaniu z innymi typami komórek somatycznych, PBMNC są atrakcyjnym typem komórek startowych ze względu na łatwość dostępu i ekspansji w hodowli. Wirus Sendai (SeV), nieintegrujący RNA, kodujący czynniki przeprogramowujące, w tym ludzkie OCT3/4, SOX2, KLF4 i c-MYC, ma jednoniciowy, niesegmentowany genom o ujemnym sensie, który nie integruje się z genomem gospodarza, a jedynie replikuje się w cytoplazmie zakażonych komórek, oferując wydajny i bezpieczny pojazd do przeprogramowania. W tym badaniu opisujemy protokół, w którym iNSC są uzyskiwane przez przeprogramowanie PBMNC i różnicowane w wyspecjalizowane neurony VM DA metodą dwuetapową. Następnie prekursory DA są przeszczepiane do jednostronnie zmienionych 6-hyroksydopaminą (6-OHDA) mysich modeli PD w celu oceny bezpieczeństwa i skuteczności w leczeniu PD. Metoda ta stanowi platformę do badania funkcji i efektów terapeutycznych specyficznych dla pacjenta komórek nerwowych DA in vitro i in vivo.

W niniejszej pracy przedstawiamy protokół obejmujący różne etapy terapii komórkowej z użyciem iNSC-DA w leczeniu modeli PD. W pierwszej kolejności wyizolowano i namnożono PBMNC, a następnie przeprogramowano je w iNSC poprzez infekcję SeV. Schematyczne przedstawienie procedur namnażania PBMNC i indukcji iNSC pokazano na Rysunku 1. W dniu -14 wyizolowano PBMNC z wykorzystaniem medium do gradientu gęstości (Tabela Materiałów). Przed wirowaniem krew rozcieńczoną w PBS oraz mediu...

Protokół przedstawia przeprogramowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w celu wywołania nerwowych komórek macierzystych przez infekcję wirusem Sendai, różnicowanie iNSC w neurony dopaminergiczne, przeszczepianie prekursorów DA do jednostronnie uszkodzonych modeli mysich choroby Parkinsona oraz ocenę bezpieczeństwa i skuteczności prekursorów DA pochodzących z iNSC w leczeniu PD.

Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i różnicowanie w kierunku prekursorów neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Protokół ten opisuje metodę przeprogramowania komórek krwi i jednojądrzastych w nerwowe komórki macierzyste, które mogą być stosowane w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona. Stanowi autologiczne źródło komórek w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych. Ponadto ramy czasowe wymagane do konwersji do indukowanych nerwowych komórek macierzystych i różnicowania do pożądanych typów komórek są krótsze niż w przypadku indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.Indukowane nerwowe komórki macierzyste mają dobrą zdolność proliferacyjną i mogą być skalowane w górę przed zastosowaniem. Ponieważ iNSC mogą być umieszczane w różnych komórkach nerwowych specyficznych dla regionu, takich jak neurony rdzenia kręgowego lub neurony ruchowe, metoda ta może zostać rozszerzona o leczenie innych chorób neurologicznych. Cała procedura zajmuje dużo czasu, a wszystkie kroki są ze sobą powiązane i krytyczne, więc demonstracja wizualna daje wyobrażenie o tym, jak wyglądają komórki i zawiera kilka wskazówek, jak zapewnić pomyślne wygenerowanie pożądanych komórek.Na początek przenieś wcześniej wyizolowaną krew żylną obwodową do 50-mililitrowej stożkowej probówki i rozcieńcz ją równą objętością sterylnego PBS Dulbecco. W innej 50-mililitrowej stożkowej probówce przygotuj 15 mililitrów wysterylizowanego podłoża o gradiencie gęstości. Przechyl probówkę pod kątem 45 stopni i powoli i ostrożnie połóż 30 mililitrów rozcieńczonej krwi obwodowej na pożywce o gradiencie gęstości.Odwirować probówkę o ciśnieniu 800 razy g przez 15 minut w temperaturze pokojowej z hamulcem wirówki ustawionym w pozycji wyłączonej. Odessaj żółtą, górną warstwę plazmy i wyrzuć ją. Użyj 10-mililitrowej pipety, aby przenieść białą, mętną, cienką warstwę zawierającą komórki jednojądrzaste do nowej 50-mililitrowej stożkowej probówki.Dodaj 30 mililitrów D-PBS do probówki z MNC i odwiruj przy 600 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu dodać 45 mililitrów D-PBS i ponownie zawiesić komórki. Po odwirowaniu probówki o sile 400 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, odrzucić supernatant.Ponownie zawiesić komórki za pomocą pięciu mililitrów D-PBS, policzyć żywe komórki metodą wykluczania błękitu trypanowego, odłożyć na bok MNC potrzebne do ekspansji i zamrozić pozostałe komórki do wykorzystania w przyszłości. W dniu minus 14 zasiewaj MNC o gęstości od dwóch do trzech milionów komórek na mililitr na studzienkę sześciodołkowej płytki z 1,5 mililitra 37 stopni Celsjusza, wstępnie podgrzanej pożywki MNC. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez dwa dni.W dniu minus 11 użyj wysterylizowanej pipety, aby zebrać komórki z pożywką i przenieść do nowej 15-mililitrowej stożkowej probówki. Wirować przy 250 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze wstępnie podgrzanej pożywki MNC. Po zliczeniu żywotnych komórek za pomocą błękitu trypanowego, zasiej MNC o gęstości miliona komórek na mililitr we wstępnie podgrzanym podłożu MNC na sześciodołkowej płytce.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez trzy dni i powtórzyć zbieranie komórek, wirowanie i posiewanie w pożywce MNC w dniach minus osiem i minus cztery. Wirus Sendai w tej procedurze jest niebezpieczny, a wszystkie procedury z udziałem wirusa Sendai muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa. Wszystkie końcówki i rurki narażone na wirusa Sendai należy przed usunięciem potraktować etanolem lub wybielaczem.W dniu zero zbierz komórki w pożywce MNC i przenieś do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Po odwirowaniu komórek w temperaturze 200 razy g przez pięć minut, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki jednym mililitrem wstępnie podgrzanego podłoża MNC. Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego, a następnie ponownie zawieś je za pomocą wstępnie podgrzanej pożywki MNC do stężenia 200 000 komórek na studzienkę na płytkach 24-dołkowych.Rozmrozić probówki wyjęte z przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza zawierających wirusa Sendai w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do 10 sekund, a następnie pozostawić je do rozmrożenia w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu umieść je natychmiast na lodzie. Dodaj rozmrożonego wirusa Sendai do studzienek 24-dołkowej płytki z MNC przy wielokrotności infekcji 10.Aby ułatwić łączenie komórek, odwiruj płytki w temperaturze 1 000 razy g przez 30 minut, a następnie umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla. Pierwszego dnia przenieś komórki z pożywką do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Aby dalej odłączyć pozostałe komórki, przepłucz studzienki jednym mililitrem pożywki MNC na studzienkę i dodaj komórki z pożywką do probówki.Po odwirowaniu zawiesiny komórkowej w ilości 200 razy g przez pięć minut, odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki za pomocą 500 mikrolitrów świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki MNC i dodać do dołka na 24-dołkowej płytce. Drugiego dnia użyj jednego mililitra na studzienkę uprzednio rozcieńczonych 50 mikrogramów na mikrolitr poli-D-lizyny w D-PBS, aby pokryć sześciodołkowe płytki przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej. Odessać poli-D-lizynę z płytek sześciodołkowych i suszyć na pionowej czystej ławce przez około 10 minut.Następnie dodaj jeden mililitr na studzienkę uprzednio rozcieńczonej laminy o stężeniu pięciu mikrogramów na mililitr do płytek sześciodołkowych i inkubuj przez cztery do sześciu godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu pokrycia. Przed użyciem umyj płytki preparatem D-PBS. Trzeciego dnia umieść wszystkie MNC transdukowane wirusem Sendai w indukowanej pożywce nerwowych komórek macierzystych na sześciodołkowych płytkach pokrytych poli-D-lizyną/lamininą.W piątym i siódmym dniu delikatnie dodaj jeden mililitr podgrzanej pożywki iNSC o temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdej studzienki z sześciodołkowych płytek. Od dziewiątego do 28 dnia codziennie zastępuj pożywkę świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką iNSC. Monitoruj pojawianie się kolonii iNSC i po około dwóch do trzech tygodniach wybierz kolonie o odpowiedniej morfologii za pomocą spalonych szklanych pipet i przenieś każdą kolonię do oddzielnej studzienki na sześciodołkowej płytce w celu ekspansji.Aby ustalić jednostronne modele myszy z uszkodzeniem 6-hyroksydopaminą, ogol głowę znieczulonej, dorosłej, męskiej, beżowej myszy SCID i nałóż maść do oczu z erytromycyną. Umieść mysz na aparacie stereotaktycznym i przymocuj mysz za pomocą siekaczy. Włóż nauszniki prawidłowo, aby bezpiecznie i odpowiednio ustawić główkę myszy.Wysterylizuj głowę jodem powidonu i alkoholem izopropylowym, a następnie za pomocą ostrza skalpela wykonaj około 1,5-centymetrowe strzałkowe nacięcie na skórze głowy, odsłaniając czaszkę. Wyreguluj siekacze i nauszniki, aby zmniejszyć różnicę wysokości między bregmą a lambdą do mniej niż 0,1 milimetra. Powoli przesuwaj i opuszczaj końcówkę igły mikrostrzykawki w kierunku bregmy i traktuj bregma jako punkt zerowy.Przesuń końcówkę do pozycji o współrzędnych przednich 0,5 milimetra i bocznych 2,1 milimetra względem bregmy. Schowaj końcówkę, zaznacz punkt markerem i za pomocą wiertarki elektronicznej wybij mały otwór w czaszce. Ekstrahować do mikrostrzykawki dwa mikrolitry po pięć mikrogramów na mililitr roztworu 6-hyroksydopaminy.Ustawić igłę z powrotem w zaznaczonym miejscu i włożyć igłę na głębokość 3,2 milimetra grzbietową/brzuszną. Wstrzyknąć roztwór 6-hyroksydopaminy ze strzykawki w ilości jednego mikrolitra na minutę, pozostawić igłę do wstrzykiwań na miejscu na kolejne pięć minut, a następnie powoli ją wycofać. Po zamknięciu nacięcia szwami należy ponownie nałożyć na oczy maść z erytromycyną na oczy.Wyjmij mysz z aparatu stereotaktycznego, umieść ją w klatce odzyskiwania i pozwól na dostęp do jedzenia i wody, aż odzyska przytomność. Po tym, jak PBMNC zostały zakażone SeV, ich morfologia się zmieniała, a komórki przechodziły drastyczną śmierć aż do piątego dnia. Kolonie INSC pojawiły się w 12 dniu.Po wybraniu i przeniesieniu klonów iNSC do ekspansji przez kilka pasaży, wykazały one dobrą morfologię i mogły stabilnie odnawiać się w pożywce iNSC, zarówno w formie jednowarstwowej, jak i jako kulki. Po 24 dniach różnicowania iNSC zidentyfikowano jako neurony dopaminergiczne, ponieważ większość z nich wykazywała ekspresję hydroksylazy tyrozyny, skrzynki widełkowej A2 i specyficznych dla neuronów markerów beta-tubuliny klasy III. Po ustaleniu jednostronnych mysich modeli choroby Parkinsona z uszkodzeniem 6-hyroksydopaminą, przeprowadzono ocenę behawioralną w celu oszacowania objawów choroby Parkinsona.Myszy, które otrzymały przeszczep komórek, wykazały znaczną poprawę funkcji motorycznych. Zakres zmian indukowanych przez 6-hyroksydopaminę zweryfikowano za pomocą pośmiertnego barwienia immunofluorescencyjnego na TH w prążkowiu, pęczku przyśrodkowym przodomózgowia i istocie czarnej pars compacta. Sygnały TH-dodatnie zostały znacznie odzyskane w prążkowiu, w którym wszczepiono komórki, a także łagodnie odzyskane w SN. Trzy miesiące po przeszczepie, wśród komórek, które przeżyły, około 13,84% stanowiły TH-dodatnie neurony dopaminergiczne.Około 91,72% komórek TH-dodatnich wyrażało sierocy receptor jądrowy, około 86,76% wyrażało FOXA2, a około 98,77% było znakowanych prostownikiem wewnętrznym potasu sprzężonym z białkiem G. Nakładając 30 milicali rozcieńczonej krwi obwodowej na podłoże gradientu gęstości, rób to powoli i ostrożnie, aby nie zakłócać interfejsu gradientu. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć powtarzającego się rozmrażania i zamrażania wirusa Sendai, aby zapewnić wysoką aktywność wirusa.Podczas przeprogramowywania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej na indukowane nerwowe komórki macierzyste, należy uważnie obserwować morfologię komórek każdego dnia. Ponadto 6-hydroksydopamina jest wrażliwa na światło i temperaturę. Należy uważać, aby chronić roztwór przed światłem i przechowywać go na lodzie przed użyciem.Po tej procedurze można kontynuować badanie mechanizmów choroby, wykorzystując w hodowli rodzinne neurony dopaminergiczne pochodzące od pacjentów z chorobą Parkinsona. Można również kontynuować badania, w jaki sposób przeszczepione komórki wpływają na uszkodzone obwody neuronalne.

generation-induced-neural-stem-cells-from-peripheral-mononuclear

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Rozprzestrzenianie się człowieka zarodkowych komórek macierzystych (ES) Cells

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

Ten film demonstruje przeprogramowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) na indukowane nerwowe komórki macierzyste (iNSC) za pomocą wirusa Sendai. Wirus Sendai jest nieintegrującym się wirusem, który oferuje skuteczny i bezpieczny pojazd do przeprogramowania komórek.

Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych (iNSC) z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC): procedura oparta na wirusie Sendai w celu przeprogramowania PBMNC na iNSC

Ten film pokazuje bezpośrednie przeprogramowanie genetycznie zmodyfikowanych hematopoetycznych komórek progenitorowych na neuronalne komórki macierzyste. Czynniki transkrypcyjne ulegające ekspresji przez krwiotwórcze komórki progenitorowe wywołują kaskadę zdarzeń molekularnych ułatwiających ich transformację. Dalsze specyficzne pożywki są używane do selekcji i wzrostu indukowanych neuronalnych komórek macierzystych.

Bezpośrednie przeprogramowanie hematopoetycznych komórek progenitorowych w neuronalne komórki macierzyste

Ten film demonstruje różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w neurony dopaminergiczne, aby dostarczyć modelu do badania choroby Parkinsona. HESC są hodowane w pożywce do indukcji neuronalnej na płytce mikrodołkowej w celu utworzenia neurosfer 3D. Są one następnie hodowane w pożywce do indukcji neuronalnej, aby promować różnicowanie w dopaminergiczne neurony progenitorowe. Końcowe dojrzewanie neuronów zachodzi we wstawce hodowlanej w warunkach granicy faz...

Wytwarzanie dopaminergicznych organoidów neuronalnych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

My, opierając się na wiedzy z biologii rozwojowej i opublikowanych badaniach, opracowaliśmy zoptymalizowany protokół do efektywnego generowania neuronów dopaminergicznych A9 śródmózgowia zarówno z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, jak i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, co byłoby przydatne do modelowania chorób i terapii zastępczej w chorobie Parkinsona.

Ukierunkowane różnicowanie neuronów dopaminergicznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Opracowano metodę bezpośredniego pozyskiwania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych wzbogaconych o komórki krwi obwodowej.

Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Komórki zrębu szpiku (MSC) o potencjale neuronalnym istnieją w szpiku kostnym. Nasz protokół wzbogaca tę populację komórek poprzez wstępne kondycjonowanie hipoksyjne, a następnie kieruje je do dojrzałych komórek Schwanna.

Wstępne kondycjonowanie hipoksyjne komórek progenitorowych pochodzących ze szpiku jako źródło do wytwarzania dojrzałych komórek Schwanna

Prezentujemy metodę bez modyfikacji genetycznie (GMO) do uzyskania komórek z fenotypem neuronalnym z przeprogramowanych komórek krwi obwodowej. Aktywacja szlaku sygnałowego powiązanego z nowym ludzkim białkiem połączonym z GPI ujawnia skuteczną, wolną od GMO metodę pozyskiwania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie komórek neuronalnych pochodzących z krwi bez GMO

Tutaj opisujemy protokół inżynierii chemicznie przeprogramowanych komórek macierzystych w celu osiągnięcia precyzyjnej modulacji neuronalnej poprzez różnicowanie tych komórek w dopaminergiczne komórki prekursorowe, przeszczepianie ich do mysich modeli choroby Parkinsona oraz ocenę wyników behawioralnych i elektrofizjologicznych w celu potwierdzenia udanej integracji i funkcjonalnej skuteczności przeszczepionych komórek.

Regulacja chemogenetyczna w przeprogramowanych komórkach prekursorowych pochodzących z komórek macierzystych w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych

Poznaj metodę generowania indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i ich różnicowania w kierunku neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych w leczeniu choroby Parkinsona.

Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i różnicowanie w kierunku prekursorów neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i różnicowanie w kierunku prekursorów neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych

Przeglądaj więcej filmów