Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i różnicowanie w kierunku prekursorów neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych

Protokół ten opisuje metodę przeprogramowania komórek krwi i jednojądrzastych w nerwowe komórki macierzyste, które mogą być stosowane w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona. Stanowi autologiczne źródło komórek w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych. Ponadto ramy czasowe wymagane do konwersji do indukowanych nerwowych komórek macierzystych i różnicowania do pożądanych typów komórek są krótsze niż w przypadku indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Indukowane nerwowe komórki macierzyste mają dobrą zdolność proliferacyjną i mogą być skalowane w górę przed zastosowaniem. Ponieważ iNSC mogą być umieszczane w różnych komórkach nerwowych specyficznych dla regionu, takich jak neurony rdzenia kręgowego lub neurony ruchowe, metoda ta może zostać rozszerzona o leczenie innych chorób neurologicznych. Cała procedura zajmuje dużo czasu, a wszystkie kroki są ze sobą powiązane i krytyczne, więc demonstracja wizualna daje wyobrażenie o tym, jak wyglądają komórki i zawiera kilka wskazówek, jak zapewnić pomyślne wygenerowanie pożądanych komórek.

Na początek przenieś wcześniej wyizolowaną krew żylną obwodową do 50-mililitrowej stożkowej probówki i rozcieńcz ją równą objętością sterylnego PBS Dulbecco. W innej 50-mililitrowej stożkowej probówce przygotuj 15 mililitrów wysterylizowanego podłoża o gradiencie gęstości. Przechyl probówkę pod kątem 45 stopni i powoli i ostrożnie połóż 30 mililitrów rozcieńczonej krwi obwodowej na pożywce o gradiencie gęstości.

Odwirować probówkę o ciśnieniu 800 razy g przez 15 minut w temperaturze pokojowej z hamulcem wirówki ustawionym w pozycji wyłączonej. Odessaj żółtą, górną warstwę plazmy i wyrzuć ją. Użyj 10-mililitrowej pipety, aby przenieść białą, mętną, cienką warstwę zawierającą komórki jednojądrzaste do nowej 50-mililitrowej stożkowej probówki.

Dodaj 30 mililitrów D-PBS do probówki z MNC i odwiruj przy 600 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu dodać 45 mililitrów D-PBS i ponownie zawiesić komórki. Po odwirowaniu probówki o sile 400 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, odrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić komórki za pomocą pięciu mililitrów D-PBS, policzyć żywe komórki metodą wykluczania błękitu trypanowego, odłożyć na bok MNC potrzebne do ekspansji i zamrozić pozostałe komórki do wykorzystania w przyszłości. W dniu minus 14 zasiewaj MNC o gęstości od dwóch do trzech milionów komórek na mililitr na studzienkę sześciodołkowej płytki z 1,5 mililitra 37 stopni Celsjusza, wstępnie podgrzanej pożywki MNC. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez dwa dni.

W dniu minus 11 użyj wysterylizowanej pipety, aby zebrać komórki z pożywką i przenieść do nowej 15-mililitrowej stożkowej probówki. Wirować przy 250 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze wstępnie podgrzanej pożywki MNC. Po zliczeniu żywotnych komórek za pomocą błękitu trypanowego, zasiej MNC o gęstości miliona komórek na mililitr we wstępnie podgrzanym podłożu MNC na sześciodołkowej płytce.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez trzy dni i powtórzyć zbieranie komórek, wirowanie i posiewanie w pożywce MNC w dniach minus osiem i minus cztery. Wirus Sendai w tej procedurze jest niebezpieczny, a wszystkie procedury z udziałem wirusa Sendai muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa. Wszystkie końcówki i rurki narażone na wirusa Sendai należy przed usunięciem potraktować etanolem lub wybielaczem.

W dniu zero zbierz komórki w pożywce MNC i przenieś do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Po odwirowaniu komórek w temperaturze 200 razy g przez pięć minut, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki jednym mililitrem wstępnie podgrzanego podłoża MNC. Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego, a następnie ponownie zawieś je za pomocą wstępnie podgrzanej pożywki MNC do stężenia 200 000 komórek na studzienkę na płytkach 24-dołkowych.

Rozmrozić probówki wyjęte z przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza zawierających wirusa Sendai w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do 10 sekund, a następnie pozostawić je do rozmrożenia w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu umieść je natychmiast na lodzie. Dodaj rozmrożonego wirusa Sendai do studzienek 24-dołkowej płytki z MNC przy wielokrotności infekcji 10.

Aby ułatwić łączenie komórek, odwiruj płytki w temperaturze 1 000 razy g przez 30 minut, a następnie umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla. Pierwszego dnia przenieś komórki z pożywką do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Aby dalej odłączyć pozostałe komórki, przepłucz studzienki jednym mililitrem pożywki MNC na studzienkę i dodaj komórki z pożywką do probówki.

Po odwirowaniu zawiesiny komórkowej w ilości 200 razy g przez pięć minut, odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki za pomocą 500 mikrolitrów świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki MNC i dodać do dołka na 24-dołkowej płytce. Drugiego dnia użyj jednego mililitra na studzienkę uprzednio rozcieńczonych 50 mikrogramów na mikrolitr poli-D-lizyny w D-PBS, aby pokryć sześciodołkowe płytki przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej. Odessać poli-D-lizynę z płytek sześciodołkowych i suszyć na pionowej czystej ławce przez około 10 minut.

Następnie dodaj jeden mililitr na studzienkę uprzednio rozcieńczonej laminy o stężeniu pięciu mikrogramów na mililitr do płytek sześciodołkowych i inkubuj przez cztery do sześciu godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu pokrycia. Przed użyciem umyj płytki preparatem D-PBS. Trzeciego dnia umieść wszystkie MNC transdukowane wirusem Sendai w indukowanej pożywce nerwowych komórek macierzystych na sześciodołkowych płytkach pokrytych poli-D-lizyną/lamininą.

W piątym i siódmym dniu delikatnie dodaj jeden mililitr podgrzanej pożywki iNSC o temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdej studzienki z sześciodołkowych płytek. Od dziewiątego do 28 dnia codziennie zastępuj pożywkę świeżą, wstępnie podgrzaną pożywką iNSC. Monitoruj pojawianie się kolonii iNSC i po około dwóch do trzech tygodniach wybierz kolonie o odpowiedniej morfologii za pomocą spalonych szklanych pipet i przenieś każdą kolonię do oddzielnej studzienki na sześciodołkowej płytce w celu ekspansji.

Aby ustalić jednostronne modele myszy z uszkodzeniem 6-hyroksydopaminą, ogol głowę znieczulonej, dorosłej, męskiej, beżowej myszy SCID i nałóż maść do oczu z erytromycyną. Umieść mysz na aparacie stereotaktycznym i przymocuj mysz za pomocą siekaczy. Włóż nauszniki prawidłowo, aby bezpiecznie i odpowiednio ustawić główkę myszy.

Wysterylizuj głowę jodem powidonu i alkoholem izopropylowym, a następnie za pomocą ostrza skalpela wykonaj około 1,5-centymetrowe strzałkowe nacięcie na skórze głowy, odsłaniając czaszkę. Wyreguluj siekacze i nauszniki, aby zmniejszyć różnicę wysokości między bregmą a lambdą do mniej niż 0,1 milimetra. Powoli przesuwaj i opuszczaj końcówkę igły mikrostrzykawki w kierunku bregmy i traktuj bregma jako punkt zerowy.

Przesuń końcówkę do pozycji o współrzędnych przednich 0,5 milimetra i bocznych 2,1 milimetra względem bregmy. Schowaj końcówkę, zaznacz punkt markerem i za pomocą wiertarki elektronicznej wybij mały otwór w czaszce. Ekstrahować do mikrostrzykawki dwa mikrolitry po pięć mikrogramów na mililitr roztworu 6-hyroksydopaminy.

Ustawić igłę z powrotem w zaznaczonym miejscu i włożyć igłę na głębokość 3,2 milimetra grzbietową/brzuszną. Wstrzyknąć roztwór 6-hyroksydopaminy ze strzykawki w ilości jednego mikrolitra na minutę, pozostawić igłę do wstrzykiwań na miejscu na kolejne pięć minut, a następnie powoli ją wycofać. Po zamknięciu nacięcia szwami należy ponownie nałożyć na oczy maść z erytromycyną na oczy.

Wyjmij mysz z aparatu stereotaktycznego, umieść ją w klatce odzyskiwania i pozwól na dostęp do jedzenia i wody, aż odzyska przytomność. Po tym, jak PBMNC zostały zakażone SeV, ich morfologia się zmieniała, a komórki przechodziły drastyczną śmierć aż do piątego dnia. Kolonie INSC pojawiły się w 12 dniu.

Po wybraniu i przeniesieniu klonów iNSC do ekspansji przez kilka pasaży, wykazały one dobrą morfologię i mogły stabilnie odnawiać się w pożywce iNSC, zarówno w formie jednowarstwowej, jak i jako kulki. Po 24 dniach różnicowania iNSC zidentyfikowano jako neurony dopaminergiczne, ponieważ większość z nich wykazywała ekspresję hydroksylazy tyrozyny, skrzynki widełkowej A2 i specyficznych dla neuronów markerów beta-tubuliny klasy III. Po ustaleniu jednostronnych mysich modeli choroby Parkinsona z uszkodzeniem 6-hyroksydopaminą, przeprowadzono ocenę behawioralną w celu oszacowania objawów choroby Parkinsona.

Myszy, które otrzymały przeszczep komórek, wykazały znaczną poprawę funkcji motorycznych. Zakres zmian indukowanych przez 6-hyroksydopaminę zweryfikowano za pomocą pośmiertnego barwienia immunofluorescencyjnego na TH w prążkowiu, pęczku przyśrodkowym przodomózgowia i istocie czarnej pars compacta. Sygnały TH-dodatnie zostały znacznie odzyskane w prążkowiu, w którym wszczepiono komórki, a także łagodnie odzyskane w SN. Trzy miesiące po przeszczepie, wśród komórek, które przeżyły, około 13,84% stanowiły TH-dodatnie neurony dopaminergiczne.

Około 91,72% komórek TH-dodatnich wyrażało sierocy receptor jądrowy, około 86,76% wyrażało FOXA2, a około 98,77% było znakowanych prostownikiem wewnętrznym potasu sprzężonym z białkiem G. Nakładając 30 milicali rozcieńczonej krwi obwodowej na podłoże gradientu gęstości, rób to powoli i ostrożnie, aby nie zakłócać interfejsu gradientu. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć powtarzającego się rozmrażania i zamrażania wirusa Sendai, aby zapewnić wysoką aktywność wirusa.

Podczas przeprogramowywania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej na indukowane nerwowe komórki macierzyste, należy uważnie obserwować morfologię komórek każdego dnia. Ponadto 6-hydroksydopamina jest wrażliwa na światło i temperaturę. Należy uważać, aby chronić roztwór przed światłem i przechowywać go na lodzie przed użyciem.

Po tej procedurze można kontynuować badanie mechanizmów choroby, wykorzystując w hodowli rodzinne neurony dopaminergiczne pochodzące od pacjentów z chorobą Parkinsona. Można również kontynuować badania, w jaki sposób przeszczepione komórki wpływają na uszkodzone obwody neuronalne.