Name: Szerokokątny zapis optyczny pojedynczych fotonów w wycinkach mózgu przy użyciu barwnika wrażliwego na napięcie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Poznaj metodę szerokokątnego zapisu optycznego z barwnikiem wrażliwym na napięcie w wycinkach hipokampu myszy. Technika umożliwia stabilną rejestrację dynamiki neuronalnej przez 12 godzin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

TT otrzymało JSPS KAKENHI Grant (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038, and JP15K00413) od MEXT oraz granty od Ministerstwa Zdrowia, Pracy i Opieki Społecznej (MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] i H30 [18062156]). Serdecznie dziękujemy firmie Editage (www.editage.jp) za redakcję w języku angielskim.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Tokushima Bunri. Poniższy protokół przygotowania plastrów jest prawie standardową procedurą27 , ale modyfikacjami były protokoły barwienia i nagrywania za pomocą VSD.
1. Przygotowanie przed dniem eksperymentu
<ol>
	<li>Przygotować roztwory bulionu A (Tabela 1), bulionu B (Tabela 2) i bulionu C (Tabela 3) i przechowywać w lodówce.</li>
	<li>Przygotuj 1 l sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) (Tabela 4, patrz krok 3) i przechowuj go w lodówce.</li>
	<li>Przygotuj 1 l zmodyfikowanego ACSF (Tabela 5) i przechowuj go w lodówce.</li>
	<li>Dozować 500 μl porcji płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do fiolek o pojemności 2 ml i przechowywać w zamrażarce.</li>
	<li>Rozpuścić 4% proszku agarowego w ACSF (ok. 120 ml) w kuchence mikrofalowej i wlać do jednorazowej szalki Petriego o średnicy 90 mm. Płytkę agarową należy przechowywać w lodówce przed dalszym użyciem.</li>
	<li>W dniu poprzedzającym eksperyment umieść w zamrażarce następujące przedmioty: tacę chirurgiczną, pojemnik do krajalnicy i aluminiowy blok chłodzący (120 x 120 x 20 mm3).</li>
	<li>Upewnij się, że jest wystarczająca liczba pierścieni z pleksiglasu z filtrami membranowymi do systemu obsługi plastrów17,28 (patrz krok 6.12).</li>
	<li>Rozpuścić 2% proszku agarowego w 50 ml 3 M KCl w kuchence mikrofalowej. Pobrać około 85 μl ciepłego rozpuszczalnika agar-KCl w końcówkach o pojemności 200 μl, używając mikropipety do elektrody uziemiającej. Odczep końcówkę od jeszcze ciepłego żelu agarowego 3 M KCl. Powtórz ten krok, aby wypełnić około 20-40 końcówek 2% aganem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu podstawowego VSD (di-4-ANEPPS)
<ol>
	<li>Przygotuj 1 ml 10% polietylenowego roztworu oleju rycynowego z ultraczystą wodą.</li>
	<li>Dodać 1 ml etanolu do fiolki di-4-ANEPPS (fiolka 5 mg), wirować i sonikować przez 10 minut. Roztwór zmieni się w głęboki czerwony kolor z możliwymi małymi pozostałościami kryształów di-4-ANEPPS. 
	nuta: Etanol używany na tym etapie powinien być świeżo otwarty.</li>
	<li>Przenieść roztwór do mikroprobówki o pojemności 2 ml z pierścieniem uszczelniającym o przekroju okrągłym. Odwirować roztwór i dodać 500 μl 10% polietylenotlenionego roztworu oleju rycynowego. 
	nuta: Barwnik jest wysoce lipofilowy. DMSO i poloksamer mogą być również używane do rozpuszczania di-4-ANEPPS, ale jeśli chodzi o sygnał optyczny po zmianie potencjału błony, stwierdziliśmy, że zastosowanie etanolu - polietylenowanego oleju rycynowego daje lepszy stosunek sygnału do szumu. Może to być związane z szybkością przenoszenia rozpuszczalnika do błony komórkowej.</li>
	<li>Wirować i sonikować, aż barwnik całkowicie się rozpuści.</li>
	<li>Unikaj ekspozycji na światło i przechowuj go w lodówce. Nie przechowywać w zamrażarce. Zapas może wystarczyć na kilka miesięcy. 
	nuta: W dniu eksperymentu wykonaj kroki 3-9.</li>
</ol>
3. Codzienne przygotowanie ACSF (1 L) (Tabela 4)
<ol>
	<li>Zważyć NaCl,NaHCO3 i glukozę w kolbie.</li>
	<li>Dodać 950 ml wody destylowanej do kolby i rozpocząć bulgotanie 95% gazem O2/5% CO2 .</li>
	<li>Dodać 2,5 ml roztworu bulionowego A do kolby i inkubować przez około 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 2,5 ml podstawowego roztworu C do kolby.</li>
	<li>Dodaj wodę destylowaną, aby uzyskać roztwór na 1 l.</li>
</ol>
4. Codzienne przygotowanie roztworu do barwienia VSD
<ol>
	<li>Poddać sonifikacji 500 μl fiolki z roztworem podstawowym FBS i VSD (krok 2) w ultrasonikatorze przez 5 minut.</li>
	<li>Dodać 500 μl świeżo przygotowanego ACSF do fiolki FBS.</li>
	<li>Dodać do fiolki 20 (w przypadku myszy) lub 40 (w przypadku szczurów) μl roztworu podstawowego VSD.</li>
	<li>Ultra-sonikować i wirować fiolkę, aż roztwór stanie się bladopomarańczowy.</li>
</ol>
5. Przygotowanie do operacji
<ol>
	<li>Weź 100 ml schłodzonego ACSF oddzielnie do pojemnika ze stali nierdzewnej o pojemności 300 ml, zlewki o pojemności 300 ml i plastikowego pojemnika i umieść je w zamrażarce. Wlać 150 ml schłodzonego zmodyfikowanego ACSF (tabela 2) do innej zlewki i umieścić ją w zamrażarce. Poczekaj, aż roztwory ostygną; Potrzebny czas powinien być wcześniej zmierzony i określony.</li>
	<li>Złóż, aby przełamać żyletkę (stal węglowa, klasa przemysłowa o grubości 0,13 mm, ostrze po obu stronach) na pół do krajalnicy. 
	nuta: Drugą połowę można wykorzystać do rozwarstwienia za pomocą odpowiedniego uchwytu na ostrze.</li>
	<li>Przygotuj blok z płytki agarowej ACSF 4% za pomocą przyrządu regulacyjnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Przygotuj wilgotną komorę inkubacyjną (komora typu interfejsowego; zmodyfikowane, szczelnie zamknięte pudełko o pojemności 1,2 l z silikonowym opakowaniem) w celu utrzymania fizjologicznie żywych wycinków mózgu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2); dodaj ACSF do małego pojemnika i węglanuj 95% gazem O2/5% CO2 i napełnij szalkę Petriego o wymiarach 90 mm x 20 mm ACSF do góry. 
	nuta: Mniejsza szalka Petriego (60 mm x 20 mm) powinna być umieszczona na środku szalki 90 mm, aby podeprzeć bibułę filtracyjną na szalce.</li>
	<li>Umieść pudełko na urządzeniu grzewczym i odczekaj 20 minut, aby podgrzać je do 28 °C.</li>
	<li>Dodaj pokruszony lód do pojemnika krajalnicy. Umieść następujące narzędzia w ze stali nierdzewnej (małej) na lodzie: skalpel, uchwyt ostrza, pęseta pierścieniowa, blok agarowy i stolik krajalnicy. Przechowuj zamrożony ACSF i zmodyfikowany ACSF na lodzie i bąbelkuje 95% gazem O2/5% CO2 (inaczej karbogenem).</li>
	<li>Umieść następujące narzędzia w (dużej): nożyczki (duże, małe), pęsetę, szpatułkę, łyżkę i szczypce ukośne.</li>
</ol>
6. Chirurgia (myszy)
<ol>
	<li>Znieczulij mysz za pomocą izofluranu w dygestorium. Oceń poziom znieczulenia, sprawdzając odruch pedałowania zwierzęcia po uszczypnięciu palca</li>.
	<li>Odetnij głowę myszy i zanurz głowę w lodowatym ACSF w tacy chirurgicznej ze stali nierdzewnej.</li>
	<li>Wydobyć mózg w ciągu 1 minuty i umieścić go w zlewce zawierającej schłodzony ACSF na 5 minut.</li>
	<li>Wyjmij mózg ze zlewki i za pomocą skalpela przytnij blok mózgu (Rysunek 3A).</li>
	<li>Umieść blok mózgu na 4% bloku agaru (krok 5.3, <silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Obie półkule mogą być zamontowane na bloku agarowym. Wytrzyj nadmiar ACSF z bloku bibułą filtracyjną.</li>
	<li>Nałóż cienki klej (super klej) na stół krajalnicy. Umieść na nim blok agaru i wytrzyj nadmiar kleju za pomocą bibuły filtracyjnej.</li>
	<li>Delikatnie nałóż niewielką ilość lodowatego ACSF (~5 ml) za pomocą pipety umieszczonej w górnej części bloku agaru mózgowego. Pomoże to zestalić nadmiar super kleju i zapobiegnie zakrywaniu mózgu przez klej i zakłócaniu krojenia.</li>
	<li>Przymocuj stół krajalnicy do tacy krajalnicy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C) i wlej zmodyfikowany ACSF.</li>
	<li>Ustaw krajalnicę na niską prędkość, z maksymalną częstotliwością ostrza.</li>
	<li>Ustaw grubość plastra na 350-400 μm i rozpocznij krojenie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). Umieść plastry na rogu tacki na plastry w kolejności, tak aby można było łatwo odróżnić głębokość plasterków. Zwykle z jednej półkuli można uzyskać od trzech do pięciu plasterków.</li>
	<li>Odetnij część pnia mózgu za pomocą igły 30 G (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D). 
	nuta: Mikrochirurgia wycinka mózgu, taka jak przecięcie między granicą CA3-CA1, powinna być wykonana na tym etapie pod mikroskopem dwuokularowym, jeśli to konieczne.</li>
	<li>Za pomocą małego pędzla z końcówką umieść plasterek na środku filtra membranowego (pory 0,45 μm, membrana PTFE, średnica 13 mm) trzymanego za pomocą pierścienia z pleksiglasu17 (średnica zewnętrzna 15 mm, średnica wewnętrzna 11 mm, grubość 1 mm, rysunek 3E). Umieść pierścień w komorze odzyskiwania wilgoci (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2) i zabezpiecz pokrywę, aby utrzymać wysokie ciśnienie wewnętrzne. 
	nuta: Plastry przyklejają się do membrany w ciągu 30 minut i można je przenosić za pomocą pierścieni w kolejnych krokach w komorze nagrywającej. Nie ma potrzeby używania odważników ani innych miar, aby utrzymać plasterek na miejscu.</li>
	<li>Dostosuj kierunek i położenie plasterka w pierścieniu, aby upewnić się, że jest dobrze wyśrodkowany i ma stały kierunek (patrz krok 9.3).</li>
	<li>Pozostawić próbkę w temperaturze 28 °C na 30 minut, a następnie w temperaturze pokojowej na co najmniej 10-30 minut w celu odzyskania plastrów. 
	nuta: Plastry mogą teraz zachować dobrą kondycję fizjologiczną przez co najmniej 15 godzin.</li>
</ol>
7. Barwienie i płukanie plastrów (myszy)
<ol>
	<li>Delikatnie nanieś 100-110 μl roztworu barwiącego (Krok 4) na każdy plasterek na pierścieniu za pomocą mikropipety. Osiem do dziewięciu plasterków można zabarwić jednym roztworem barwiącym przygotowanym w kroku 4. Pozostaw plastry na 20 minut do barwienia.</li>
	<li>Przygotuj 50-100 ml ACSF w pojemniku i umieść w nim pierścień z pokrojoną próbką, aby spłukać roztwór barwiący.</li>
	<li>Spłukany plasterek należy przechowywać w innej komorze inkubacyjnej. Odczekaj ponad 1 godzinę na regenerację przed eksperymentem. 
	nuta: Komora inkubacyjna może zostać odłączona od gazu i przeniesiona do miejsca zapisu w szczelnie zamkniętym stanie. Plaster może pozostać żywy przez co najmniej 20 minut bez dopływu gazu. Jest to przydatne w przypadku, gdy musisz przenieść wycinek w inne miejsce w celu nagrania.</li>
</ol>
8. Codzienne przygotowanie aparatury doświadczalnej
<ol>
	<li>Włącz wzmacniacz, komputer i system kamery, a następnie sprawdź, czy oprogramowanie jest uruchomione.</li>
	<li>Umieść ACSF w probówce o pojemności 50 ml i bąbelkuj karbogenem.</li>
	<li>Użyj pompy perystaltycznej do cyrkulacji ACSF. Dostosuj natężenie przepływu do około 1 ml/min.</li>
	<li>Wyreguluj wysokość pipety ssącej tak, aby poziom cieczy w komorze doświadczalnej był zawsze stały. 
	nuta: Poziom roztworu jest ważny dla uzyskania stabilnego zapisu, dlatego regulację należy wykonać za pomocą mikromanipulatora.</li>
	<li>Zainstaluj elektrodę uziemiającą wykonaną z żółtego wióra wypełnionego agarem 3 M KCl (2%) (krok 1.8) w uchwycie z drutem Ag-AgCl z niewielką ilością roztworu 3 M KCl.</li>
	<li>Napełnij niewielką ilość ACSF (około dwóch trzecich objętości) szklaną elektrodą (1 mm średnicy zewnętrznej, 0,78 mm średnicy wewnętrznej pociągniętą ściągaczem do mikropipet) za pomocą zwężającej się cienkiej żółtej końcówki rurki i umieść ją w uchwycie elektrody.</li>
	<li>Przymocuj uchwyt do pręta zainstalowanego w manipulatorze. Upewnij się za pomocą amplifier, że rezystancja elektrody wynosi około 1 MΩ. 
	nuta: Elektroda krosowa z długim trzpieniem i szerokim otworem (4-8 μm) powinna być dobra do nagrywania w terenie i jako elektroda stymulująca.</li>
</ol>
9. Rozpoczynanie sesji nagraniowej
<ol>
	<li>Weź plasterek preparatu z wilgotnej komory za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Szybko umieść plasterek w komorze doświadczalnej pod mikroskopem (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Mocno wciśnij krawędź pierścienia w silikonowy O-ring. Uważaj, aby nie uszkodzić membrany ani dna komory doświadczalnej. 
	nuta: Kierunek warstwy powinien być brany pod uwagę w odniesieniu do kierunku elektrod stymulujących i rejestrujących w polu view. Zdrowy plasterek powinien przykleić się do filtra membranowego, aby nie było potrzeby używania innych urządzeń do mocowania plastrów, takich jak ciężarki i siatki nylonowe.</li>
	<li>Umieść końcówkę elektrody stymulującej i elektrodę rejestrującą potencjał pola na plastrze pod mikroskopem ze światłem przechodzącym.</li>
	<li>Użyj systemu rejestracji elektrofizjologicznej, aby sprawdzić odpowiedź. Potwierdź zwykły (niezabarwiony) zapis elektrofizjologiczny z podaną konfiguracją. 
	nuta: Elektrodę rejestrującą można pominąć, ale jest ona przydatna do sprawdzenia fizjologii wycinka.</li>
	<li>Dostosuj natężenie światła wzbudzającego do około 70-80% maksymalnej pojemności w kamerze, co odpowiada 13-15 mW/cm2 na próbce podczas próbkowania z częstotliwością 10 kHz za pomocą soczewki obiektywowej zanurzonej w wodzie 5x i soczewki tubowej 1x PLAN APO. Długość fali światła wzbudzenia wynosi 530 nm, a filtr emisyjny musi mieć > 590 nm. 
	>nuta: Użyj migawki, aby zminimalizować ilość światła wzbudzającego. Ciągła ekspozycja na światło może pogorszyć fizjologię plastru. Ewentualny szkodliwy wpływ światła zależy od intensywności i czasu trwania światła. Użyj zapisu elektrofizjologicznego, aby ocenić wpływ światła. W przypadku wytrzymałości 13-15 mW/cm2 górną granicą tolerancji powinna być ekspozycja około 1 s.</li>
	<li>Dostosuj ostrość za pomocą systemu akwizycji za pomocą fluorescencyjnego źródła światła, ponieważ ostrość może być różna w zależności od długości fali i rozpocznij akwizycję.</li>
	<li>Sprawdź dane w oprogramowaniu do akwizycji obrazów. 
	nuta: Do szczegółowej analizy wykorzystaliśmy autorski pakiet mikroprogramistyczny oprogramowania do analizy numerycznej.</li>
</ol>

<ol><li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+%28LTP%29+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389(2018).</li>
<li>Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSD+Imaging+Method+of+Ex+Vivo+Brain+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+and+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation.</a> Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).</li>
<li>Homma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wide-field+and+two-photon+imaging+of+brain+activity+with+voltage-+and+calcium-sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes.</a> Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).</li>
<li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSDI%3A+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).</li>
<li>Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+fluorescence%2C+turbidity%2C+and+birefringence+associated+with+nerve+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).</li>
<li>Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+Scattering+and+Birefringence+Changes+during+Nerve+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity.</a> Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).</li>
<li>Hill, D., Keynes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opacity+changes+in+stimulated+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Opacity changes in stimulated nerve.</a> The Journal of Physiology. 108 (3), 278-281 (1949).</li>
<li>Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Large+Change+in+Axon+Fluorescence+that+Provides+a+Promising+Method+for+Measuring+Membrane+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+New+Biology%22%5BJournal%5D)">A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential.</a> Nature New Biology. 241 (109), 159(1973).</li>
<li>Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Recording+of+Impulses+in+Individual+Neurones+of+an+Invertebrate+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System.</a> Nature. 246 (5434), (1973).</li>
<li>Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Methods+for+Monitoring+Neuron+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optical Methods for Monitoring Neuron Activity.</a> Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).</li>
<li>Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+change+in+dye+absorption+during+the+action+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A large change in dye absorption during the action potential.</a> Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).</li>
<li>Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge-shift+probes+of+membrane+potential.+Characterization+of+aminostyrylpyridinium+dyes+on+the+squid+giant+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon.</a> Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).</li>
<li>Loew, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+naphthyl+analog+of+the+aminostyryl+pyridinium+class+of+potentiometric+membrane+dyes+shows+consistent+sensitivity+in+a+variety+of+tissue%2C+cell%2C+and+model+membrane+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations.</a> The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).</li>
<li>Mullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Fluorescence+Dyes+for+Monitoring+Neuronal+Activity+in+the+Embryonic+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System.</a> The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).</li>
<li>Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Voltage-Sensitive+Dyes+for+Long-Term+Recording+of+Neural+Activity+in+the+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus.</a> Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).</li>
<li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+optical+signals+with+electrophysiological+signals+in+neural+activities+of+Di-4-ANEPPS+stained+rat+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).</li>
<li>Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder. US Patent. , US 6,448,063 B2 (2002).</li>
<li>Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+viability+of+acute+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Extending the viability of acute brain slices.</a> Scientific Reports. 4 (1), srep05309 (2015).</li>
<li>Tanemura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+with+Tau+Accumulation+in+a+Transgenic+Mouse+Expressing+V337M+Human+Tau%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau.</a> Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).</li>
<li>Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+potential+response+profiles+of+CA1+pyramidal+cells+probed+with+voltage-sensitive+dye+optical+imaging+in+rat+hippocampal+slices+reveal+the+impact+of+GABAA-mediated+feed-forward+inhibition+in+signal+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation.</a> Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).</li>
<li>Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entorhinal+Cortex+Layer+III+Input+to+the+Hippocampus+Is+Crucial+for+Temporal+Association+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory.</a> Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).</li>
<li>Juliandi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Adult+Hippocampal+Neurogenesis+and+Cognitive+Impairments+following+Prenatal+Treatment+of+the+Antiepileptic+Drug+Valproic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid.</a> Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).</li>
<li>Stepan, J., Dine, J., Eder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+optical+probing+of+the+hippocampal+trisynaptic+circuit+in+vitro%3A+network+dynamics%2C+filter+properties%2C+and+polysynaptic+induction+of+CA1+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 160(2015).</li>
<li>Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overall+Assay+of+Neuronal+Signal+Propagation+Pattern+With+Long-Term+Potentiation+%28LTP%29+in+Hippocampal+Slices+From+the+CA1+Area+With+Fast+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389(2018).</li>
<li>Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+Plasticity+Involved+in+the+Spread+of+Neural+Activity+Within+the+Rhinal+Cortices+as+Revealed+by+Voltage-Sensitive+Dye+Imaging+in+Mouse+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20(2019).</li>
<li>Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPopovic%2C+M+%22Journal+of+visualized+experiments%22">Journal of visualized experiments</a>. , (2012).</li>
<li>Sakmann, B., Stuart, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. , (1995).</li>
<li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+long-lasting+depolarization+on+burst+stimulation+in+area+CA1+of+rat+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices.</a> Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).</li>
<li>Mennerick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Voltage-Sensitive+Dyes+Modulate+GABAAReceptor+Function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).</li>
<li>Canitano, R., Pallagrosi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autism+Spectrum+Disorders+and+Schizophrenia+Spectrum+Disorders%3A+Excitation%2FInhibition+Imbalance+and+Developmental+Trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories.</a> Frontiers in Psychiatry. 8, 69(2017).</li>
<li>Anticevic, A., Murray, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebalancing+Altered+Computations%3A+Considering+the+Role+of+Neural+Excitation+and+Inhibition+Balance+Across+the+Psychiatric+Spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum.</a> Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).</li>
<li>Busche, M., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairments+of+neural+circuit+function+in+Alzheimer%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Phil.+Trans.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Impairments of neural circuit function in Alzheimer’s disease.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429(2016).</li>
<li>Knöpfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687(2012).</li>
<li>Knöpfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+toolbox+for+remote+control+of+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits.</a> Nature Methods. 5 (4), 293(2008).</li>
<li>Tominaga, T., Tominaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+nonscanning+confocal+microscopy+module+for+functional+voltage-sensitive+dye+and+Ca2%2B+imaging+of+neuronal+circuit+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Fizjologia warstwy jest niezbędna do zebrania właściwego sygnału. Zastosowanie systemu filtrów pierścieniowo-membranowych w tym protokole zapewnia, że plasterek pozostaje zdrowy i niezniekształcony przez cały czas trwania procedury 2,16,17. Inne systemy mogą być używane do zachowania fizjologii wycinka podczas nagrywania, ale plasterek nie powinien ulec deformacji w żadnym momencie, ponieważ obrazowanie wymaga, aby każda część w...

Szerokokątne obrazowanie barwnika wrażliwego na napięcie pojedynczego fotonu (VSD) preparatów z wycinków mózgu barwionych masowo stało się użytecznym narzędziem ilościowym do oceny dynamiki obwodów neuronowych1,2,3,4. Po analizie zmian właściwości optycznych spowodowanych wzbudzeniem błonowym5,6,7, obrazowanie VSD zostało po raz pierwszy opisane na początku lat 70. przez Cohena i innych6,8,9.; Jest to odpowiednia metoda monitorowania funkcji mózgu w czasie rzeczywistym, ponieważ barwnik bezpośrednio bada zmiany potencjału błonowego (tj. Główny sygnał neuronów).
Najwcześniejsze VSD posiadały cechy pożądane do zrozumienia systemu mózgu, takie jak szybka stała czasowa pozwalająca śledzić szybką kinetykę zdarzeń potencjału błony neuronalnej oraz liniowość ze zmianą potencjału błony9,10,11,12,13,14,15. Podobnie jak inne eksperymenty z obrazowaniem, ta technika wymaga szerokiego zakresu specyficznych dostrojeń, takich jak kamery, optyka, oprogramowanie i fizjologia plasterków, aby osiągnąć pożądane rezultaty. Z powodu tych technicznych pułapek, oczekiwane korzyści podczas początkowych wysiłków niekoniecznie zmaterializowały się w przypadku większości laboratoriów, które nie specjalizowały się w tej technice.
Główną przyczyną trudności technicznych była niska wrażliwość VSD na zmianę potencjału membrany podczas stosowania do masowego barwienia preparatów plastrowych. Wielkość sygnału optycznego (tj. ułamkowa zmiana fluorescencji) wynosi zwykle 10-4-10-3 sygnału kontrolnego (F0) w warunkach fizjologicznych. Skala czasowa zmiany potencjału błonowego w neuronie wynosi od około milisekund do kilkuset milisekund. Aby zmierzyć zmiany potencjału błonowego neuronu, kamera używana do nagrywania powinna być w stanie rejestrować obrazy z dużą prędkością (od 10 kHz do 100 Hz). Niska czułość VSD i szybkość potrzebna do podążania za sygnałem neuronowym wymaga, aby duża ilość światła była zbierana przez kamerę z dużą prędkością, z wysokim stosunkiem sygnału do szumu (S/N)2,16.
Optyka systemu rejestrującego jest również kluczowym elementem zapewniającym zbieranie wystarczającej ilości światła i poprawiającym S/N. Powiększenie osiągane przez optykę jest często zbyt małe, na przykład od 1X do 10X, aby uwidocznić lokalny funkcjonalny obwód neuronowy. Na przykład, aby zobrazować dynamikę obwodu hipokampa, odpowiednie byłoby powiększenie około 5. Tak małe powiększenie ma niską wydajność fluorescencji; Dlatego zaawansowana optyka byłaby korzystna dla takiego nagrywania.
Ponadto, fizjologia wycinków jest również niezbędna. Ponieważ analiza obrazowa wymaga, aby wycinki były nienaruszone, konieczne jest ostrożne obchodzenie się z plasterkami17. Ponadto ważne są środki podjęte w celu utrzymania żywotności wycinka przez dłuższy czas18.
Niniejszy artykuł opisuje protokół przygotowania plastrów, barwienia VSD i pomiarów. W artykule przedstawiono również ulepszenia VSD, urządzenia do obrazowania i optyki oraz inne dodatkowe udoskonalenia systemu eksperymentalnego, które umożliwiły wykorzystanie tej metody jako prostego, potężnego i ilościowego testu do wizualizacji modyfikacji funkcji mózgu19,20,21,22,23,24,25. Technika ta może być również szeroko stosowana do długotrwałego wzmacniania w obszarze CA1 plastrów hipokampa1. Co więcej, technika ta jest również przydatna w optycznym rejestrowaniu potencjałów błonowych w pojedynczej komórce nerwowej26.

<table><tbody><tr><td>Szybki system akwizycji obrazu</td><td>Brainvision co., Ltd.</td><td>MiCAM - System obrazowania Ultima</td><td></td></tr><tr><td>Szybki system akwizycji obrazu</td><td>Brainvision co., Ltd.</td><td>MiCAM 02</td><td>System obrazowania</td></tr><tr><td>Macroscepe do obrazowania szerokokątnego</td><td>Brainvision co., Ltd.</td><td>Makroskop THT</td><td>makroskop</td></tr><tr><td>System oświetlenia LED o wysokim poare ze stabilizatorem fotodiododowym</td><td>Brainvision co., Ltd.</td><td>Oświetlenie LED</td> <td>LEX-2G</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji obrazu</td><td>Brainvision co., Ltd.</td><td>Oprogramowanie do akwizycji obrazu</td> <td>BV-ana</td></tr><tr><td>Wielofunkcyjny stymulator elektryczny</td><td>Brainvision co., Ltd.</td><td>ESTM-8</td><td>Izolator bodźców + konwerter AD / DA</td></tr><tr><td>Krajalnica</td><td>Leica</td><td>VT-1200S</td><td></td></tr><tr><td>krajalnica Krajalnica</td><td>Leica</td><td>VT-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze do krajalnicy</td><td>Feather Safety Razor Co., Ltd.</td><td>#99027</td><td>żyletka ze stali węglowej</td></tr><tr><td>Filtr membranowy do podparcia plastrów</td><td>Merk Millipore Ltd., MA, USA</td><td>Omnipore, JHWP01300, 0.45 &micro; m pory,</td> <td>filtr membranowy/0,45 13</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy numerycznej</td><td>Wavemetrics Inc., OR, USA</td><td>Oprogramowanie analityczne</td><td>IgorPro</td></tr><tr><td>Izolator stymulacji</td><td>WPI Inc.</td><td>A395</td><td>Izolator bodźców</td></tr><tr><td>Konwerter AD/DA</td><td>Instrutech</td><td>ITC-18</td><td>Konwerter AD/DA</td></tr><tr><td>Barwnik wrażliwy na napięcie Di-4-ANEPPS</td><td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>numer katalogowy: D-1199</td><td>VSD: Di-4-ANEPPS</td></tr><tr><td>Poloxamer</td><td>Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>Pluronic F-127 P30000MP</td><td>Poloxamer/Pluronic F-127 (20% roztwór w DMSO)</td></tr><tr><td>Polietylenooksylowany olej rycynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cremophor EL C5135</td><td>polietylenooksylowany olej rycynowy</td></tr></tbody></table>

szerokokątny zapis optyczny pojedynczych fotonów w wycinkach mózgu przy użyciu barwnika wrażliwego na napięcie

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Szerokokątne obrazowanie barwnika wrażliwego na napięcie pojedynczego fotonu (VSD) preparatów do wycinków mózgu jest użytecznym narzędziem do oceny funkcjonalnej łączności w obwodach neuronowych. Ze względu na ułamkową zmianę sygnału świetlnego trudno było zastosować tę metodę jako test ilościowy. W tym artykule opisano specjalną optykę i systemy obsługi plastrów, które sprawiają, że ta technika jest stabilna i niezawodna. Niniejszy artykuł szczegółowo przedstawia obchodzenie się z plastrami, barwienie i rejestrowanie wycinków hipokampa barwionych VSD. System utrzymuje warunki fizjologiczne przez długi czas, z dobrym barwieniem i zapobiega mechanicznym ruchom plastra podczas nagrań. Ponadto umożliwia barwienie plastrów niewielką ilością barwnika. Optyka osiąga wysoką aperturę numeryczną przy małym powiększeniu, co pozwala na zapis sygnału VSD z maksymalną częstotliwością odświeżania 10 kHz, z rozdzielczością przestrzenną 100 x 100 pikseli. Ze względu na wysoką liczbę klatek na sekundę i rozdzielczość przestrzenną, technika ta pozwala na zastosowanie filtrów po nagraniu, które zapewniają wystarczający stosunek sygnału do szumu do oceny zmian w obwodach neuronowych.

Rysunek 5 przedstawia reprezentatywny sygnał optyczny po stymulacji elektrycznej kolaterali Schaffera w obszarze CA1 w plastrze hipokampa myszy. Kolejne obrazy na Rysunku 5A ukazują sygnał optyczny przed zastosowaniem jakichkolwiek filtrów przestrzennych i czasowych, natomiast Rysunek 5B przedstawia te same dane po dwukrotnym zastosowaniu sześcianowego filtra 5 x 5 x 5 (splot jądra Gaussa, 5 x 5 w wy...

Wprowadzamy powtarzalną i stabilną metodę zapisu optycznego dla wycinków mózgu przy użyciu barwnika wrażliwego na napięcie. W artykule opisano barwienie barwnikiem wrażliwym na napięcie oraz rejestrację sygnałów optycznych przy użyciu konwencjonalnych preparatów plastrów hipokampa.

Szerokokątny zapis optyczny pojedynczych fotonów w wycinkach mózgu przy użyciu barwnika wrażliwego na napięcie

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Uważa się, że metoda zapisu optycznego z barwnikiem wrażliwym na napięcie jest idealną technologią do wizualizacji działania mózgu. Ta metoda pozwoliła nam rejestrować dynamikę neuropsychiczną stabilnie i niezawodnie przez 12 godzin, co dało nam pogląd na aktywność psychiczną. Staramy się rozszerzyć aplikację o wykrywanie zmian w obwodzie spowodowanych przez substancje chemiczne na wszystkich etapach rozwoju, takich jak cenna aplikacja kwasu dla matek.Technika jest już dobrze ugruntowana. Proszę spróbować odtworzyć badania, postępując zgodnie z przedstawioną tutaj metodą. Aby rozpocząć tę procedurę, zanurz odciętą głowę w lodowatym ACSF w tacce chirurgicznej ze stali nierdzewnej.Wydobyć mózg w ciągu jednej minuty i umieścić go w zlewce zawierającej schłodzony ACSF na pięć minut. Następnie podziel część mózgu na linii środkowej skalpelem i umieść obie półkule na 4% bloku agaru. Następnie umieść blok mózgu z obiema półkulami na 4% bloku agarowym.Wytrzyj nadmiar ACSF z bloku bibułą filtracyjną. Następnie nałóż superglue na platformę wibratomową. Umieść na nim blok agaru i przetrzyj nadmiar kleju bibułą filtracyjną.Delikatnie nałóż niewielką ilość lodowatego ACSF z górnej części bloku agaru mózgowego, aby pomóc zestalić nadmiar superglue i zapobiec pokrywaniu mózgu przez klej i zakłócaniu krojenia. Następnie przymocuj platformę do tacki na wibratom i wlej zmodyfikowany ACSF. Ustaw wibratom na niską prędkość i ustaw częstotliwość ostrza na maksimum.Następnie zacznij kroić. Umieść plastry w rogu komory na plastry w kolejności, aby można było łatwo odróżnić kolejność plastrów. Zwykle z jednej półkuli można uzyskać od trzech do pięciu plasterków.Następnie odetnij część pnia mózgu za pomocą igły o rozmiarze 30. Za pomocą małego pędzla z końcówką umieść plasterek na filtrze membranowym przytrzymanym pierścieniem z pleksiglasu. Umieść pierścień w wilgotnej komorze regeneracyjnej i zabezpiecz pokrywę, aby utrzymać wysokie ciśnienie wewnętrzne.Umieszczając plasterek na filtrze membranowym, dostosuj kierunek i położenie plasterka w pierścieniu, aby upewnić się, że jest dobrze wyśrodkowany i ma stały kierunek. Pozostaw próbkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza na 30 minut, a następnie w temperaturze pokojowej na co najmniej 10 do 30 minut w celu odzyskania. Aby zabarwić plastry, delikatnie nałóż 100 mikrolitrów roztworu barwiącego na każdy plasterek i inkubuj przez 20 minut do temperatury pokojowej.Następnie przygotuj od 50 do 100 mililitrów ACSF w pojemniku. Umieść w nim pierścień z próbką, aby spłukać roztwór barwiący. Następnie przenieś opłukane plastry do innej komory inkubacyjnej.Odczekaj ponad godzinę na regenerację przed eksperymentem. Aby rozpocząć tę procedurę, włącz amplifier, komputer i system kamer oraz otwórz oprogramowanie. Wlej ACSF do 50-mililitrowej probówki i bąbelkuj karbogenem.Użyj pompy perystaltycznej do cyrkulacji ACSF i dostosuj natężenie przepływu do około jednego mililitra na minutę. Następnie wyreguluj wysokość pipety ssącej tak, aby poziom cieczy w komorze doświadczalnej był zawsze stały. Umieść elektrodę masową w komorze.Następnie napełnij szklaną elektrodę niewielką ilością ACSF i umieść ją w uchwycie elektrody. Przymocuj uchwyt do pręta manipulatora. Korzystając ze wzmacniacza, upewnij się, że rezystancja elektrody wynosi około jednego megaoma.Podczas sesji nagraniowej przenieś plaster z komory wilgotnej do komory eksperymentalnej. Mocno wciśnij krawędź pierścienia w silikonowy o-ring. Uważaj, aby nie naruszyć membrany ani dna komory doświadczalnej.Pod mikroskopem umieść końcówkę elektrody stymulującej i elektrodę rejestrującą potencjał pola na warstwie. Sprawdź wywołaną reakcję, dostarczając bodziec. Upewnij się, że pole widzenia obejmuje prawy obwód neuronowy w optycznym systemie zapisu.Następnie dostosuj natężenie światła wzbudzającego na około 70 do 80% maksymalnej pojemności kamery. Korzystając z fluorescencyjnego źródła światła, wyreguluj ostrość za pomocą systemu akwizycji. Następnie rozpocznij nagrywanie i przeanalizuj dane w oprogramowaniu do akwizycji obrazu po akwizycji.Rysunek ten przedstawia reprezentatywny sygnał optyczny po elektrycznej stymulacji kollaterolu Schaffera w obszarze CA1 wycinka hipokampa myszy. Te kolejne obrazy pokazują sygnał optyczny przed zastosowaniem jakichkolwiek filtrów przestrzennych i czasowych, podczas gdy te obrazy pokazują te same dane po dwukrotnym zastosowaniu filtra sześciennego pięć na pięć na pięć. Ze względu na dużą liczbę klatek na sekundę i wysoką rozdzielczość przestrzenną, zastosowanie filtra nie zmieniło sygnału, ale odfiltrowało szumy, które można zaobserwować również w przebiegu czasowym zarejestrowanym w pikselach w pojedynczej próbie.Oto porównanie typowych odpowiedzi w obszarze CA1 wycinków hipokampa między myszą a szczurem. Niewielką odpowiedź hiperpolaryzacyjną obserwuje się po dystalnej stronie CA1 po 24 milisekundach w wycinku hipokampa myszy, ale bardziej masywna odpowiedź hiperpolaryzacyjna wyprzedziła odpowiedź depolaryzacyjną w wycinku hipokampa szczura. Po wybarwieniu plastry powinny wystarczyć na ponad 12 godzin i można na nich wykonać inne zapisy elektrofizjologiczne.

wide-field-single-photon-optical-recording-brain-slices-using-voltage

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół ilustruje, w jaki sposób barwniki napięciowo-wrażliwe umożliwiają optyczną rejestrację aktywności elektrycznej z nienaruszonych sieci neuronalnych, takich jak sploty jelitowego układu nerwowego świnki morskiej, z regulowaną rozdzielczością obejmującą zakres od pojedynczych komórek po obwody wieloganglionarne.

Optyczny zapis aktywności elektrycznej w sieciach jelitowych świnki morskiej z użyciem barwników napięcioczułych

Zrozumienie funkcji ośrodkowego układu nerwowego kręgowców wymaga rejestracji aktywności wielu neuronów, ponieważ funkcje kory powstają na poziomie populacji neuronów. Opisujemy tutaj optyczną metodę rejestracji nadprogowej aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczych komórek i pojedynczych impulsów (spikes), zwaną skanowaniem z losowym dostępem z ditherowaniem (dithered random-access scanning). Metoda ta rejestruje somatyczne sygnały fluorescencji wapnia z maksymalnie 100 neuronów z...

Optyczna rejestracja ponadprogowej aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczych komórek i pojedynczych impulsów

Opisano technikę obrazowania służącą do monitorowania zmian potencjału błonowego z rozdzielczością przestrzenną poniżej mikrometra i rozdzielczością czasową poniżej milisekundy. Technika ta, oparta na wzbudzaniu laserowym barwników wrażliwych na napięcie, umożliwia pomiar sygnałów w aksonach i kolaterałach aksonalnych, końcowych gałęziach dendrytycznych oraz pojedynczych kolcach dendrytycznych.

Rejestracja za pomocą barwników napięciowo-czułych z aksonów, dendrytów i kolców dendrytycznych pojedynczych neuronów w skrawkach mózgu

Ten film demonstruje procedurę obserwacji zmian w aktywności neuronalnej w wycinku mózgu zabarwionym barwnikiem wrażliwym na napięcie. Barwnik odzwierciedla zmiany w potencjale błonowym neuronu poprzez zmianę jego intensywności fluorescencji. Dzięki zastosowaniu bodźców elektrycznych i zaawansowanych technik obrazowania, proces ten umożliwia wizualne śledzenie zmian potencjału błony neuronalnej w czasie rzeczywistym w oparciu o fluorescencję VSD.

Optyczny zapis aktywności neuronalnej w wycinkach mózgu barwionych barwnikiem wrażliwym na napięcie

Ten film przedstawia metodę jednoczesnego obrazowania i rejestrowania aktywności elektrycznej z transgenicznych wycinków mózgu, które zawierają specyficzne dla neuronów białka fluorescencyjne. Procedura polega na utrzymywaniu wycinka mózgu w komorze perfuzyjnej z napowietrzonym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, użyciu źródła światła do wzbudzenia komórek znakowanych fluorescencyjnie oraz rejestrowaniu sygnałów elektrycznych za pomocą wielokanałowej sondy i zacisku krosowego.

Jednoczesne optyczne i elektrofizjologiczne monitorowanie komórek neuronalnych w wycinkach mózgu

Ten film demonstruje procedurę badania efektywności synaptycznej w bocznej korze śródwęchowej (LEC) poprzez optogenetyczną stymulację aksonów przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC) i rejestrowanie odpowiedzi neuronów piramidowych w LEC. Metoda ta łączy zapisy patch-clamp z aktywacją synaptyczną przez stymulację światłem w celu zbadania plastyczności synaptycznej.

Stymulacja optogenetyczna i elektrofizjologiczny zapis zdarzeń synaptycznych w wycinkach mózgu szczura

Tutaj przedstawiono procedurę selektywnej aktywacji białka neuronalnego za pomocą krótkiego impulsu światła poprzez genetyczne kodowanie fotoreaktywnego nienaturalnego aminokwasu do docelowego białka neuronalnego wyrażanego w neuronach w hodowli lub in vivo.

Optyczna kontrola białka neuronalnego za pomocą genetycznie kodowanego nienaturalnego aminokwasu w neuronach

Prezentujemy metodę łączącą zapisy z całokomórkowego patch-clampu i obrazowania dwufotonowego w celu zarejestrowania stanów przejściowych Ca2+ w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

Wycinki mózgu ex vivo mogą być używane do badania wpływu lotnych środków znieczulających na wywołane reakcje na bodźce aferentne. Optogenetyka jest wykorzystywana do niezależnej aktywacji aferentów wzgórzowo-korowych i korowo-korowych do niepierwotnej kory nowej, a odpowiedzi synaptyczne i sieciowe są modulowane izofluranem.

Optogenetyczna aktywacja szlaków aferentnych w wycinkach mózgu i modulacja odpowiedzi za pomocą lotnych środków znieczulających

Ten protokół przedstawia metodę obrazowania aktywności populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczej komórki u nietransgenicznych gatunków bezkręgowców przy użyciu barwników absorbancyjnych wrażliwych na napięcie i matrycy fotodiodowej. Takie podejście umożliwia szybki przepływ pracy, w którym obrazowanie i analiza mogą być realizowane w ciągu jednego dnia.

Obrazowanie optyczne oparte na fotodiodach do rejestrowania dynamiki sieci z rozdzielczością pojedynczego neuronu u bezkręgowców nietransgenicznych

Ten artykuł ma na celu opisanie systematycznego protokołu uzyskiwania poziomych wycinków mózgu hipokampa u myszy. Celem tej metodologii jest zachowanie integralności szlaków włókien hipokampa, takich jak ścieżka perforantu i szlak włókien omszałych, w celu oceny procesów neurologicznych związanych z zakrętem zębatym.

Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

Poznaj metodę szerokokątnego zapisu optycznego z barwnikiem wrażliwym na napięcie w wycinkach hipokampu myszy. Technika umożliwia stabilną rejestrację dynamiki neuronalnej przez 12 godzin.

Szerokokątny zapis optyczny pojedynczych fotonów w wycinkach mózgu przy użyciu barwnika wrażliwego na napięcie

Przeglądaj więcej filmów