Szerokokątny zapis optyczny pojedynczych fotonów w wycinkach mózgu przy użyciu barwnika wrażliwego na napięcie
20 czerwca 2019
Wprowadzamy powtarzalną i stabilną metodę zapisu optycznego dla wycinków mózgu przy użyciu barwnika wrażliwego na napięcie. W artykule opisano barwienie barwnikiem wrażliwym na napięcie oraz rejestrację sygnałów optycznych przy użyciu konwencjonalnych preparatów plastrów hipokampa.
Uważa się, że metoda zapisu optycznego z barwnikiem wrażliwym na napięcie jest idealną technologią do wizualizacji działania mózgu. Ta metoda pozwoliła nam rejestrować dynamikę neuropsychiczną stabilnie i niezawodnie przez 12 godzin, co dało nam pogląd na aktywność psychiczną. Staramy się rozszerzyć aplikację o wykrywanie zmian w obwodzie spowodowanych przez substancje chemiczne na wszystkich etapach rozwoju, takich jak cenna aplikacja kwasu dla matek.
Technika jest już dobrze ugruntowana. Proszę spróbować odtworzyć badania, postępując zgodnie z przedstawioną tutaj metodą. Aby rozpocząć tę procedurę, zanurz odciętą głowę w lodowatym ACSF w tacce chirurgicznej ze stali nierdzewnej.
Wydobyć mózg w ciągu jednej minuty i umieścić go w zlewce zawierającej schłodzony ACSF na pięć minut. Następnie podziel część mózgu na linii środkowej skalpelem i umieść obie półkule na 4% bloku agaru. Następnie umieść blok mózgu z obiema półkulami na 4% bloku agarowym.
Wytrzyj nadmiar ACSF z bloku bibułą filtracyjną. Następnie nałóż superglue na platformę wibratomową. Umieść na nim blok agaru i przetrzyj nadmiar kleju bibułą filtracyjną.
Delikatnie nałóż niewielką ilość lodowatego ACSF z górnej części bloku agaru mózgowego, aby pomóc zestalić nadmiar superglue i zapobiec pokrywaniu mózgu przez klej i zakłócaniu krojenia. Następnie przymocuj platformę do tacki na wibratom i wlej zmodyfikowany ACSF. Ustaw wibratom na niską prędkość i ustaw częstotliwość ostrza na maksimum.
Następnie zacznij kroić. Umieść plastry w rogu komory na plastry w kolejności, aby można było łatwo odróżnić kolejność plastrów. Zwykle z jednej półkuli można uzyskać od trzech do pięciu plasterków.
Następnie odetnij część pnia mózgu za pomocą igły o rozmiarze 30. Za pomocą małego pędzla z końcówką umieść plasterek na filtrze membranowym przytrzymanym pierścieniem z pleksiglasu. Umieść pierścień w wilgotnej komorze regeneracyjnej i zabezpiecz pokrywę, aby utrzymać wysokie ciśnienie wewnętrzne.
Umieszczając plasterek na filtrze membranowym, dostosuj kierunek i położenie plasterka w pierścieniu, aby upewnić się, że jest dobrze wyśrodkowany i ma stały kierunek. Pozostaw próbkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza na 30 minut, a następnie w temperaturze pokojowej na co najmniej 10 do 30 minut w celu odzyskania. Aby zabarwić plastry, delikatnie nałóż 100 mikrolitrów roztworu barwiącego na każdy plasterek i inkubuj przez 20 minut do temperatury pokojowej.
Następnie przygotuj od 50 do 100 mililitrów ACSF w pojemniku. Umieść w nim pierścień z próbką, aby spłukać roztwór barwiący. Następnie przenieś opłukane plastry do innej komory inkubacyjnej.
Odczekaj ponad godzinę na regenerację przed eksperymentem. Aby rozpocząć tę procedurę, włącz amplifier, komputer i system kamer oraz otwórz oprogramowanie. Wlej ACSF do 50-mililitrowej probówki i bąbelkuj karbogenem.
Użyj pompy perystaltycznej do cyrkulacji ACSF i dostosuj natężenie przepływu do około jednego mililitra na minutę. Następnie wyreguluj wysokość pipety ssącej tak, aby poziom cieczy w komorze doświadczalnej był zawsze stały. Umieść elektrodę masową w komorze.
Następnie napełnij szklaną elektrodę niewielką ilością ACSF i umieść ją w uchwycie elektrody. Przymocuj uchwyt do pręta manipulatora. Korzystając ze wzmacniacza, upewnij się, że rezystancja elektrody wynosi około jednego megaoma.
Podczas sesji nagraniowej przenieś plaster z komory wilgotnej do komory eksperymentalnej. Mocno wciśnij krawędź pierścienia w silikonowy o-ring. Uważaj, aby nie naruszyć membrany ani dna komory doświadczalnej.
Pod mikroskopem umieść końcówkę elektrody stymulującej i elektrodę rejestrującą potencjał pola na warstwie. Sprawdź wywołaną reakcję, dostarczając bodziec. Upewnij się, że pole widzenia obejmuje prawy obwód neuronowy w optycznym systemie zapisu.
Następnie dostosuj natężenie światła wzbudzającego na około 70 do 80% maksymalnej pojemności kamery. Korzystając z fluorescencyjnego źródła światła, wyreguluj ostrość za pomocą systemu akwizycji. Następnie rozpocznij nagrywanie i przeanalizuj dane w oprogramowaniu do akwizycji obrazu po akwizycji.
Rysunek ten przedstawia reprezentatywny sygnał optyczny po elektrycznej stymulacji kollaterolu Schaffera w obszarze CA1 wycinka hipokampa myszy. Te kolejne obrazy pokazują sygnał optyczny przed zastosowaniem jakichkolwiek filtrów przestrzennych i czasowych, podczas gdy te obrazy pokazują te same dane po dwukrotnym zastosowaniu filtra sześciennego pięć na pięć na pięć. Ze względu na dużą liczbę klatek na sekundę i wysoką rozdzielczość przestrzenną, zastosowanie filtra nie zmieniło sygnału, ale odfiltrowało szumy, które można zaobserwować również w przebiegu czasowym zarejestrowanym w pikselach w pojedynczej próbie.
Oto porównanie typowych odpowiedzi w obszarze CA1 wycinków hipokampa między myszą a szczurem. Niewielką odpowiedź hiperpolaryzacyjną obserwuje się po dystalnej stronie CA1 po 24 milisekundach w wycinku hipokampa myszy, ale bardziej masywna odpowiedź hiperpolaryzacyjna wyprzedziła odpowiedź depolaryzacyjną w wycinku hipokampa szczura. Po wybarwieniu plastry powinny wystarczyć na ponad 12 godzin i można na nich wykonać inne zapisy elektrofizjologiczne.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia stabilną metodę rejestracji optycznej z wykorzystaniem barwnika wrażliwego na napięcie dla skrawków mózgu, koncentrując się na sygnalizacji neuronów hipokampa. Technika ta oferuje niezawodny wgląd w dynamikę neuropsychiczną w dłuższych odstępach czasu, ułatwiając badania zmian w obwodach wynikających z aplikacji substancji chemicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Obrazowanie optyczne
Wstęp
- Barwniki napięciowo-wrażliwe są kluczowe dla wizualizacji aktywności mózgu.
- Konwencjonalne preparaty skrawków hipokampa służą jako model biologiczny.
- Badanie analizuje dynamikę neuropsychiczną oraz zmiany w obwodach neuronalnych.
- Poprzednie metody cechowały się brakiem niezawodności podczas długotrwałych pomiarów.
Cel badania
- Wprowadzenie powtarzalnej metody rejestracji optycznej w skrawkach mózgu.
- Zapewnienie wglądu w wpływ substancji chemicznych na dynamikę obwodów mózgowych.
- Umożliwienie długoterminowej obserwacji aktywności i odpowiedzi neuronów.
Zastosowane metody
- Wykorzystaną platformą są plastry mózgu ex vivo przygotowane z hipokampa myszy.
- Kluczowy model obejmuje plastry hipokampa, co ułatwia badania nad aktywnością elektryczną.
- Nie wspomniano o przepływach multiomicznych; nacisk położono na techniki optyczne i elektrofizjologiczne.
- Przygotowanie obejmuje staranne etapy, takie jak chłodzenie, barwienie i inkubowanie plastrów.
- Sesje rejestracyjne są przeprowadzane w komorze eksperymentalnej z precyzyjnymi wymaganiami dotyczącymi konfiguracji.
Główne wyniki
- Metoda optyczna umożliwia niezawodne gromadzenie danych w okresie 12 godzin.
- Porównanie odpowiedzi w plastrach hipokampa myszy i szczura wykazuje odmienne profile neurofizjologiczne.
- Zmiany elektrofizjologiczne, takie jak odpowiedzi hiperpolaryzacyjne, są potwierdzone zapisami optycznymi.
- Technika ta pogłębia naszą wiedzę na temat dynamiki obwodów neuronalnych w różnych warunkach.
Wnioski
- Metoda ta stanowi znaczące usprawnienie w badaniu obwodów mózgowych i zjawisk neuropsychicznych.
- Umożliwia ona badaczom obserwację zmian w sygnalizacji neuronalnej w czasie rzeczywistym.
- Zrozumienie tych mechanizmów może dostarczyć wiedzy na temat plastyczności oraz potencjalnych zastosowań terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie szerokopolowe z użyciem jednofotonowego barwnika wrażliwego na napięcie umożliwia stabilną, długoterminową ocenę funkcjonalną obwodów neuronalnych w skrawkach mózgu, co rozwiązuje kluczowy problem w walidacji celów w neuronauce. Metoda ta wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez dostarczanie ilościowych, wysokorozdzielczych optycznych odczytów aktywności neuronów w dłuższych okresach, co jest krytyczne dla oceny wpływu związków na dynamikę obwodów w fazie przedklinicznego odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację dynamiki sygnałów neuronalnych w czasie rzeczywistym w obwodach hipokampa.
- Wartość operacyjna: Zapewnia stabilne i powtarzalne rejestracje przez ponad 12 godzin, co pozwala na podłużną ocenę zaangażowania celu i modulacji szlaków.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia wykrywanie zmian w obwodach indukowanych przez aplikacje chemiczne, pomagając w wczesnej identyfikacji efektów związków neuroaktywnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Osiągnięto częstotliwość odświeżania obrazu 10 kHz i rozdzielczość 100x100 pikseli, co umożliwia wysokoprzepustową analizę czasową i przestrzenną odpowiedzi neuronalnych.
- Jakość sygnału: Filtrowanie po rejestracji poprawia stosunek sygnału do szumu, co pozwala na niezawodną detekcję podprogowych zmian w obwodach, kluczowych dla czułości analizy.
- Powtarzalność: Stabilne protokoły manipulacji skrawkami i barwienia minimalizują artefakty mechaniczne, zapewniając spójność danych pomiędzy powtórzeniami i sesjami eksperymentalnymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Wspiera ocenę zmian w obwodach sieci hipokampa, obszaru zaangażowanego w zaburzenia poznawcze i neuropsychiatryczne.
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia równoległe rejestracje optyczne i elektrofizjologiczne, co wzmacnia walidację wyników funkcjonalnych w różnych modalnościach pomiarowych.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wyraźne różnice w profilach odpowiedzi między skrawkami tkanek myszy i szczura dostarczają informacji na temat translacji międzygatunkowej i pomagają zmniejszyć ryzyko przy wyborze kandydatów przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, dostarczając funkcjonalne odczyty z obwodów, które stanowią pomost między walidacją celu a identyfikacją wiodących związków, szczególnie w przypadku związków neuroaktywnych wymagających oceny fenotypowej na poziomie obwodowym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących dynamiki neuropsychicznej i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez bezpośrednią wizualizację wywołanych sygnałów optycznych w określonych obwodach neuronalnych.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowe, wysokorozdzielcze dane optyczne odpowiednie do zautomatyzowanej analizy i porównywania zmian w aktywności neuronalnej indukowanych przez związki chemiczne.
- Analityka: Umożliwia stosowanie filtrów czasoprzestrzennych w celu oddzielenia sygnału od szumu, co ułatwia obiektywną kwantyfikację odpowiedzi obwodów oraz ocenę zmienności.
- Badania translacyjne: Łączy obserwacje obwodów z fazy odkrywania z walidacją przedkliniczną, umożliwiając wielokrotne rejestracje w dłuższych odstępach czasu w celu oceny stabilności i powtarzalności efektów działania związków.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Standaryzacja przygotowania skrawków i platformy obrazowania umożliwia ponowne wykorzystanie w wielu projektach i seriach związków, co redukuje zmienność metodologiczną w kaskadach przesiewowych w neuronauce.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Dostarcza wglądu w mechanizmy funkcjonowania obwodów neuronalnych, zmniejszając niejednoznaczność w walidacji celów i zwiększając wiarygodność predykcyjną w badaniach przesiewowych neurofarmakologicznych.
- Wartość operacyjna: Utrzymuje warunki fizjologiczne i zapobiega przemieszczaniu się skrawka, zapewniając stabilne, wolne od artefaktów pozyskiwanie danych dla niezawodnego przesiewu związków.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez umożliwienie wczesnego wykrywania efektów poza wskazaniami lub niepożądanych działań w obwodach, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach rozwoju leków ukierunkowanych na ośrodkowy układ nerwowy.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o funkcjonalne profile obwodów, zwiększając efektywność kapitałową w przedklinicznych rurach projektowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy z zakresu elektrofizjologii, obrazowania optycznego oraz technik przygotowania tkanek, aby zapewnić odpowiednią żywotność skrawków i efektywność barwienia.
- Zależność od systemów szybkich kamer, fluorescencyjnych źródeł światła oraz układów perfuzyjnych zdolnych do utrzymania warunków fizjologicznych podczas długotrwałych rejestracji.
- Konieczność standaryzacji orientacji skrawków, czasu barwienia oraz protokołów regeneracji w obrębie zespołów badawczych w celu zminimalizowania zmienności linii bazowej sygnału optycznego oraz jego responsywności.
- Adaptacja metody do innych obszarów mózgu lub modeli chorobowych może wymagać walidacji efektywności barwienia oraz ekspresji sygnału specyficznego dla danego obwodu.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność starnej optymalizacji intensywności światła wzbudzenia, aby zapobiec fototoksyczności przy zachowaniu amplitudy sygnału wystarczającej do detekcji.
