Przygotowanie tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura do ultrastrukturalnej analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych

Spośród kilku istniejących protokołów przygotowania tkanek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej wybraliśmy metody, które zapewniają optymalne zachowanie struktury i mikrofotografie o wysokiej rozdzielczości do przeprowadzenia analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na końcach presynaptycznych. Obrazy o wysokim kontraście uzyskane tymi metodami pozwalają na ilościowe określenie parametrów, takich jak odległość pęcherzyków synaptycznych od błony presynaptycznej, liczba pęcherzyków zadokowanych na błonie presynaptycznej oraz odległości między pęcherzykami. Wszystkie te parametry wskazują na funkcję synaptyczną.

Ponieważ zmiany w organizacji przestrzennej pęcherzyków synaptycznych mogą być związane z zakłóceniem funkcji synaptycznych, metody te zostały wykorzystane do zbadania wpływu środków znieczulających ogólnie na rozwój synaptyków. Metody te mogą być również wykorzystane do zbadania wpływu dowolnego leku lub leczenia na szczegółową morfologię synaps, aby zapewnić wgląd w ich funkcję. Zacznij od przygotowania tetratlenku osmu do utrwalenia odcinków mózgu szczura uprzednio utrwalonych paraformaldehydem i aldehydem glutarowym poprzez perfuzję naczyniową.

Skrawki stają się sztywne po leczeniu tetratlenkiem osmu. Dlatego od tego momentu obchodzenie się z tkankami wymaga uwagi. Ponadto przed dodaniem osmu upewnij się, że twoje sekcje są spłaszczone, ponieważ każda fałda prawdopodobnie spowoduje pęknięcie tkanki.

Otwórz jedną pięciomililitrową szklaną ampułkę z 4% tetratlenkiem osmu i wodą i wrzuć ją do brązowej szklanej butelki. Dodaj pięć mililitrów 0,2-molowego buforu fosforanowego, a następnie dodaj dodatkowe 10 mililitrów 0,1-molowego buforu fosforanowego, aby uzyskać 1% końcowy roztwór. Użyj 20-mililitrowej strzykawki wyposażonej w długą igłę, aby pobrać 1% tetratlenek osmu, a następnie dodaj tetratlenek osmu do brązowego szklanego słoika pokrytego folią aluminiową.

Po upewnieniu się, że próbka została rozłożona i spłaszczona, dodaj 1% tetratlenek osmu i 0,1 mola PB do fiolki z próbką. Inkubować próbkę w tetratlenku osmu przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji wyekstrahować tetratlenek osmu za pomocą mikropipety i przepłukać skrawki zgodnie z opisem w protokole.

Aby przygotować octan uranylu, umieść 200-mililitrową szklaną kolbę miarową zawierającą 100 mililitrów 70% etanolu na płytce mieszającej. Dodać cztery gramy octanu uranylu do kolby, owinąć folią aluminiową, aby zapobiec wytrącaniu się światła i ciągle mieszać. Odwodnić sekcje w 50% etanolu.

Barwić przygotowanym 4% octanem uranylu przez jedną godzinę, a następnie stopniowo odwadniać i płukać zgodnie z opisem w manuskrypcie. Wyjąć tłok strzykawki z 60-mililitrowej strzykawki do zgłębnika i nakryć ją bezpieczną igłą. Ustawić strzykawkę otwartą stroną do góry i dodawać każdy składnik mieszanki żywicy jeden po drugim.

Na koniec dodaj 525 mikrolitrów DMP30 za pomocą pipety. Przesuwanie tłoka pipety bardzo powoli, ponieważ DMP jest bardzo lepki. Umieścić tłok z powrotem w strzykawce.

Odwrócić strzykawkę kilka razy, aby wymieszać zawartość. Kolor zmieni się z żółtego na bursztynowy. Usunąć powietrze z wnętrza strzykawki.

Następnie umieść go na bujaku z ciągłym potrząsaniem przez co najmniej 30 minut. Dodaj jedną objętość żywicy epoksydowej i jedną objętość acetonu do fiolki scyntylacyjnej i wstrząśnij w celu wymieszania. Nałóż tę mieszaninę żywicy i acetonu jeden do jednego na część tkanki po ostatnim płukaniu acetonem, trzymając pod przykryciem, aby uniknąć odparowania acetonu.

Po dwóch do czterech godzinach usuń mieszaninę żywicy i acetonu jeden do jednego, zastąp ją pełną żywicą i inkubuj przez cztery godziny. Wszystkie odpady żywicy należy umieścić w pojemniku zbiorczym pod maską w celu polimeryzacji i późniejszej utylizacji. Wytnij dwa prostokątne kawałki przezroczystej folii polichlorotrifluoroetylenowej i przetrzyj je 70% etanolem.

Przytnij je tak, aby z każdej strony sekcji znajdowało się co najmniej 1,5 centymetra plastiku bez bibuły, upewniając się, że mają tę samą szerokość, ale wysokość arkusza na górze wynosi około 2/3 dolnego arkusza. Powoli przechyl fiolkę i za pomocą cienkiego pędzla wielbłądziego oraz elastycznej mikroszpatułki bardzo delikatnie podnieś próbkę od dna. Następnie ostrożnie przesunąć wycinek wzdłuż ścianek fiolki i przenieść na dolny arkusz PCTFE.

Usuń nadmiar żywicy za pomocą mikroszpatułki i delikatnie przykryj próbkę górnym arkuszem. Delikatnie wypchnij uwięzione pęcherzyki powietrza bez bezpośredniego nacisku na część tkanki i zetrzyj nadmiar żywicy. Użyj pisaka odpornego na rozpuszczalniki, aby oznaczyć arkusze i umieść w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza na dwa do trzech dni w celu polimeryzacji.

Delikatnie rozsuń ułożone warstwowo arkusze PCTFE, aby je otworzyć. Użyj pisaka odpornego na rozpuszczalniki, aby zaznaczyć stronę arkusza, która zawiera przylegającą część, zaznaczając ją w pobliżu tkanki. Użyj dziurkacza tarczowego, aby uzyskać okrągłą próbkę przekroju, upewniając się, że ślad pisaka jest częścią wyciętej tkanki.

Ślad pióra będzie błyszczał, gdy na próbkę padnie światło. Umieścić nakrętkę kapsułki do zatapiania stroną do góry na uchwycie na kapsułki. Umieść kroplę żywicy na nasadce i włóż dziurkowany krążek do wnętrza nasadki częścią tkanki skierowaną do góry.

Włóż kapsułkę do nakrętki, wykonując delikatny ruch korkociągu. Użyj cienkiej pęsety, aby zwinąć i opuścić wydrukowany dwucentymetrowy kawałek papierowej etykiety do kapsułki, upewniając się, że pasuje do krzywizny bocznych ścianek kapsułki. Wlej żywicę do zatapiania do wnętrza kapsułki, napełnij do krawędzi kapsułki i użyj spiczastego drewnianego patyczka, aby popchnąć próbkę tkanki na dno.

Umieść kapsułkę w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza na dwa do trzech dni w celu polimeryzacji. A następnie kontynuuj cięcie i barwienie zgodnie z opisem w protokole. Mikrografia elektronowa zadowalającego zachowania struktury komórek neuronalnych pokazuje warstwowe błony komórkowe bez pęknięć.

Cytoplazma jest wreszcie ziarnista i bez pustych przestrzeni. Mitochondria nie są ani spuchnięte, ani skurczone, z zachowaną zewnętrzną podwójną błoną i nienaruszonymi wewnętrznymi grzebieniami. Optymalne zachowanie ultrastruktury neuronów i drobnych szczegółów morfologicznych jest niezbędne do wizualizacji pęcherzyków synaptycznych i zmierzenia ich odległości od błony presynaptycznej.

Pęcherzyki synaptyczne powinny być wyraźne i wyściełane nieprzerwaną pojedynczą błoną. Aby ułatwić analizę morfometryczną rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych, błony presynaptyczne i postsynaptyczne powinny być zachowane równolegle w swojej ciągłości. Mikrografia elektronowa wadliwego zachowania struktury tkankowej pokazuje zniekształcenie i pęknięcie błon komórkowych neuronów oraz obecność znacznie powiększonych przestrzeni zewnątrzkomórkowych.

Mitochondria wydają się rozdęte i mają spuchnięte grzebienie. W innym przykładzie zachowania wadliwej struktury tkankowej w cytoplazmie znajdowały się duże białe puste przestrzenie w miejscu drobnoziarnistej substancji cytoplazmatycznej z powiększonymi przestrzeniami zewnątrzkomórkowymi. Sztuczna błona prawdopodobnie powstała w wyniku mobilizacji lipidów podczas wiązania aldehydem glutarowym.

Podczas pracy z młodą tkanką mózgową należy stosować 1 molowy bufor fosforanowy jako rozpuszczalnik dla całego roztworu, aby utrzymać toniczność jak najbardziej zbliżoną do mózgu nowonarodzonego szczura i zminimalizować artefaktowe kurczenie się tkanek i/lub obrzęk. Mikrografie uzyskane tymi metodami mogą być wykorzystane do badania szczegółowej morfologii i wymiarowych relacji strukturalnych wielu składników komórkowych innych niż pęcherzyki synaptyczne. Na przykład mitochondria, aparat Golgiego i chromatyna jądrowa.

Kilka kroków w tym protokole wymaga chemikaliów, które mogą być toksyczne. Zawsze pracuj pod wyciągiem i noś środki ochrony osobistej podczas pracy z aldehydami, związkami osmu, uranu i ołowiu.