Name: Przygotowanie tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura do ultrastrukturalnej analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Poznaj metody przygotowania tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura do analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych przy użyciu mikroskopii elektronowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten manuskrypt był wspierany przez NIH/NIGMS K08 123321 (do N.L.) oraz przez fundusze z Wydziału Anestezjologii Uniwersytetu Wirginii. Autorzy pragną podziękować Alev Erisir (Wydział Biologii, University of Virginia, Charlottesville, VA) za doskonałe szkolenie i pomoc techniczną w zakresie TEM oraz za jej nieocenioną krytykę manuskryptu. Autorzy dziękują również ośrodkowi Zaawansowanej Mikroskopii Elektronowej na Uniwersytecie Wirginii za pomoc techniczną w zakresie sekcji próbek i barwienia końcowego.

<ol><li>Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+exposure+to+general+anesthesia+disrupts+spatial+organization+of+presynaptic+vesicles+in+nerve+terminals+of+the+developing+subiculum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum.</a> Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).</li>
<li>Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+anesthesia+causes+long-lasting+disturbances+in+the+ultrastructural+properties+of+developing+synapses+in+young+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicity+Research%22%5BJournal%5D)">General anesthesia causes long-lasting disturbances in the ultrastructural properties of developing synapses in young rats.</a> Neurotoxicity Research. 17 (2), 179-188 (2010).</li>
<li>Sanchez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+anesthesia+causes+long-term+impairment+of+mitochondrial+morphogenesis+and+synaptic+transmission+in+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain.</a> Anesthesiology. 115 (5), 992-1002 (2011).</li>
<li>Boscolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+abolishment+of+anesthesia-induced+cognitive+impairment+by+timely+protection+of+mitochondria+in+the+developing+rat+brain%3A+the+importance+of+free+oxygen+radicals+and+mitochondria+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The abolishment of anesthesia-induced cognitive impairment by timely protection of mitochondria in the developing rat brain: the importance of free oxygen radicals and mitochondria integrity.</a> Neurobiology of Disease. 45 (3), 1031-1041 (2012).</li>
<li>Aghajanian, G. K., Bloom, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+synaptic+junctions+in+developing+rat+brain%3A+a+quantitative+electron+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The formation of synaptic junctions in developing rat brain: a quantitative electron microscopy study.</a> Brain Research. 6 (4), 716-727 (1967).</li>
<li>Akert, K., Sandri, C. Significance of the Maillet method for cytochemical studies of synapses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAkert%2C+K+%22Golgi+centennial+symposium%3B+Perspectives+in+Neurobiology%22">Golgi centennial symposium; Perspectives in Neurobiology</a>. Santini, M. , Raven Press. NY. 387-399 (1975).</li>
<li>Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemistry+of+synapses%3A+selective+staining+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytochemistry of synapses: selective staining for electron microscopy.</a> Science. 154 (3756), 1575-1577 (1966).</li>
<li>Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+structural+and+cytochemical+analysis+of+the+staining+of+synaptic+junctions+with+phosphotungstic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructure+Research%22%5BJournal%5D)">Fine structural and cytochemical analysis of the staining of synaptic junctions with phosphotungstic acid.</a> Journal of Ultrastructure Research. 22 (5-6), 361-375 (1968).</li>
<li>Burry, R. W., Lasher, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+electron+microscopy+study+of+synapse+formation+in+dispersed+cell+cultures+of+rat+cerebellum+stained+either+by+O-UL+or+by+E-PTA%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">A quantitative electron microscopy study of synapse formation in dispersed cell cultures of rat cerebellum stained either by O-UL or by E-PTA.</a> Brain Research. 147 (1), 1-15 (1978).</li>
<li>Pellegrino de Iraldi, A., Suburo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+staining+of+synaptic+vesicles+using+the+Champy-Maillet+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Electron staining of synaptic vesicles using the Champy-Maillet technique.</a> Journal of Microscopy. 91 (2), 99-103 (1970).</li>
<li>Pfenninger, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytochemistry+of+synaptic+densities.+I.+An+analysis+of+the+bismuth+iodide+impregnation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructural+Research%22%5BJournal%5D)">The cytochemistry of synaptic densities. I. An analysis of the bismuth iodide impregnation method.</a> Journal of Ultrastructural Research. 34 (1), 103-122 (1971).</li>
<li>Hayat, M. A. Chemical fixation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHayat%2C+MA+%22Principles+and+techniques+of+electron+microscopy.+Biological+applications%22">Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications</a>. Hayat, M. A. , Cambridge University Press. 4-84 (2000).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visual Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHayat%2C+MA+%22Fixation+for+electron+microscopy%22">Fixation for electron microscopy</a>. Hayat, M. A. , Academic Press. San Diego. (1981).</li>
<li>Behrman, E. J., et al. The chemistry of osmium tetroxide fixation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehrman%2C+EJ+%22The+science+of+biological+specimen+preparation+for+microscopy+and+microanalysis%22">The science of biological specimen preparation for microscopy and microanalysis</a>. Revel, J. P., et al. , Scanning Electron microscopy Inc, AMF. O’Hare, Chicago. 1-5 (1983).</li>
<li>Nielson, A. J., Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactions+of+osmium+tetroxide+with+protein+side+chains+and+unsaturated+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Chemical+Society%2C+Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">Reactions of osmium tetroxide with protein side chains and unsaturated lipids.</a> Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions. (6), 1084-1088 (1979).</li>
<li>Nielson, A. J., Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+fixation+by+osmium+tetroxide.+A+possible+role+for+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hystochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Tissue fixation by osmium tetroxide. A possible role for proteins.</a> Journal of Hystochemistry & Cytochemistry. 27 (5), 997-999 (1979).</li>
<li>Hanker, J. S., Deb, C., Wasserkrug, H. L., Seligman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+tissue+for+light+and+electron+microscopy+by+bridging+metals+with+multidentate+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Staining tissue for light and electron microscopy by bridging metals with multidentate ligands.</a> Science. 152 (3729), 1631-1634 (1966).</li>
<li>Zobel, C. R., Beer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+heavy+metal+salts+as+electron+stains%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">The use of heavy metal salts as electron stains.</a> International Review of Cytology. 18, 363-400 (1965).</li>
<li>Silva, M. T., Guerra, F. C., Magalhaes, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fixative+action+of+uranyl+acetate+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">The fixative action of uranyl acetate in electron microscopy.</a> Experientia. 24 (10), 1074(1968).</li>
<li>Terzakis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uranyl+acetate%2C+a+stain+and+a+fixative%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructural+Research%22%5BJournal%5D)">Uranyl acetate, a stain and a fixative.</a> Journal of Ultrastructural Research. 22 (1-2), 168-184 (1968).</li>
<li>Feldman, I., Jones, J., Cross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chelation+of+uranyl+ions+by+adenine+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chelation of uranyl ions by adenine nucleotides.</a> Journal of the American Chemical Society. 89 (1), 49-53 (1967).</li>
<li>Shah, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+uranyl+ions+with+phospholipid+and+cholesterol+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Interaction of uranyl ions with phospholipid and cholesterol monolayer.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 29 (2), 210-215 (1969).</li>
<li>Daems, W. T., Persijn, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Section+staining+with+heavy+metals+of+osmium-fixed+and+formol-fixed+mouse+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal.+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">Section staining with heavy metals of osmium-fixed and formol-fixed mouse liver tissue.</a> Journal. Royal Microscopical Society. 81 (pts 3&4), 199-201 (1963).</li>
<li>Lombardi, L., Prenna, G., Okolicsanyi, L., Gautier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+staining+with+uranyl+acetate%3A+possible+role+of+free+amino+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Electron staining with uranyl acetate: possible role of free amino groups.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 19 (3), 161-168 (1971).</li>
<li>Cattini, P. A., Davies, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+lead+citrate+staining+of+thin+sections+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of lead citrate staining of thin sections for electron microscopy.</a> Stain Technology. 58 (1), 29-40 (1983).</li>
<li>Reynolds, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+lead+citrate+at+high+pH+as+an+electron+opaque+stain+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).</li>
<li>Cattini, P. A., Davies, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+kinetics+of+uranyl+acetate+and+phosphotungstic+acid+staining+of+chromatin+in+thin+sections+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">Observations on the kinetics of uranyl acetate and phosphotungstic acid staining of chromatin in thin sections for electron microscopy.</a> Stain Technology. 59 (5), 291-304 (1984).</li>
<li>Derksen, J. W., Meekes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+staining+of+nucleic+acid+containing+structures+by+uranyl+acetate-lead+citrate%5BTitle%5D)+AND+%22Micron+and+Microscopica+Acta%22%5BJournal%5D)">Selective staining of nucleic acid containing structures by uranyl acetate-lead citrate.</a> Micron and Microscopica Acta. 15 (1), 55-58 (1984).</li>
<li>Frasca, J. M., Parks, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+routine+technique+for+double-staining+ultrathin+sections+using+uranyl+and+lead+salts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A routine technique for double-staining ultrathin sections using uranyl and lead salts.</a> Journal of Cell Biology. 25 (1), 157-161 (1965).</li>
<li>Hanaichi, T., Sato, T., Iwamoto, T., Malavasi-Yamashiro, J., Hoshino, M., Mizuno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+lead+by+modification+of+Sato%E2%80%99s+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A stable lead by modification of Sato’s method.</a> Journal of Electron Microscopy. 35 (3), 304-306 (1986).</li>
<li>Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+method+for+lead+staining+of+thin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A modified method for lead staining of thin sections.</a> Journal of Electron Microscopy. 17 (2), 158-159 (1968).</li>
<li>Lever, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+staining+tissues+with+lead+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A method of staining tissues with lead for electron microscopy.</a> Nature. , 810-811 (1960).</li>
<li>Derek, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self+organization+of+the+Escherichia+Coli+chemotaxis+network+imaged+with+super-resolution+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Biology%22%5BJournal%5D)">Self organization of the Escherichia Coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy.</a> Public Library of Science Biology. 7 (6), e1000137(2009).</li>
<li>Richards, J. G. Ultrastructural histochemistry of nervous tissue. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRichards%2C+JG+%22Techniques+in+Neuroanatomical+Research%22">Techniques in Neuroanatomical Research</a>. Heyn, C., Forssmann, W. G. , Springer. Berlin. 277-292 (1981).</li>
<li>Wood, R. L., Luft, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+the+buffer+system+on+fixation+with+osmium+tetroxide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructural+Research%22%5BJournal%5D)">The influence of the buffer system on fixation with osmium tetroxide.</a> Journal of Ultrastructural Research. 12 (1-2), 22-45 (1965).</li>
<li>Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+dense+artifactual+deposits+in+tissue+sections%3A+the+role+of+ethanol%2C+uranyl+acetate+and+phosphate+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer.</a> Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obchodzenie się z skrawkami tkanek podczas przygotowywania próbki do TEM wymaga znacznego stopnia finezji, koncentracji i cierpliwości. W przypadku używania mikropipety do dodawania i wyjmowania roztworów, próbki mogą być zasysane do końcówki pipety pod wpływem napięcia powierzchniowego, dlatego należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia tkanek przez pipetę. Ponadto niektóre etapy sekwencji odwadniania mogą trwać nawet 1 minutę, dlatego operator musi działać szybko, aby upewnić się, że kolejny etap od...

Opisujemy metody przygotowania tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura w celu uzyskania wysokiej jakości mikrofotografii elektronowych do dogłębnej analizy morfometrycznej przestrzennego rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych1,2. Mikrografie o wysokim kontraście, które można uzyskać, przetwarzając próbki zgodnie z tymi metodami, mogą być również wykorzystane do badania szczegółowej morfologii wielu składników komórkowych i ich wymiarowych relacji strukturalnych3,4.
Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM) jest potężnym narzędziem do ilościowego badania morfologii organelli i innych struktur komórkowych. Od tej dekady nie ma innych metod badawczych, które mogłyby zapewnić taki sam stopień rozdzielczości błon lipidowych i organelli bez znakowania immunologicznego, z wyjątkiem kriofiksacji przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem. Jednak techniki substytucji przez zamrożenie nie są powszechnie stosowane i zwykle wymagają drogiego sprzętu i długiego czasu przygotowania.
Aby skorzystać z wysokiej zdolności rozdzielczej TEM, optymalne przygotowanie próbki jest niezwykle ważne. Głównymi celami przygotowania próbki są zachowanie struktury tkanki przy minimalnych zmianach w stosunku do stanu żywego, zwiększenie kontrastu próbki oraz stabilizacja tkanki przed ekstrakcją składników komórkowych podczas przetwarzania i ekspozycji na wiązkę elektronów. Na przestrzeni lat kilka laboratoriów wprowadziło i udoskonaliło liczne protokoły przygotowania tkanek TEM. Wielu z nich skupiło się na metodach optymalnej wizualizacji pęcherzyków synaptycznych5,6,7,8,9,10,11. Spośród wielu dobrze znanych, złotych standardów, które są obecnie stosowanymi, wybraliśmy procedury utrwalania chemicznego, po utrwaleniu, barwienia en bloc, sekwencyjnego odwadniania, zatapiania żywicy i barwienia końcowego, które mają na celu zachowanie optymalnej struktury tkanki i osiągnięcie doskonałego kontrastu obrazu. Warto zauważyć, że zachowanie drobnej ultrastruktury może być szczególnie trudne podczas pracy z tkanką mózgową nowonarodzonego szczura. W rzeczywistości ośrodkowy układ nerwowy bardzo młodych zwierząt charakteryzuje się wyższą zawartością wody niż mózg dorosłego, wyraźniejszym powiększeniem przestrzeni zewnątrzkomórkowych i luźniejszymi połączeniami między komórkami12. To sprawia, że tkanka mózgowa nowonarodzonego szczura jest głęboko wrażliwa na zmiany w osmolarności i wyjątkowo podatna na sztuczne kurczenie się i/lub pęcznienie podczas przetwarzania za pomocą sekwencyjnych roztworów o różnej toniczności12. W związku z tym w naszych metodach wykorzystano rozwiązania do przetwarzania próbek, których osmolarność jest jak najbardziej zbliżona do mózgu nowonarodzonego szczura. Naszym celem było uzyskanie wysokiej jakości obrazów z mikroskopii elektronowej o wysokiej rozdzielczości do ilościowej oceny przestrzennego rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych. W szczególności staraliśmy się zmierzyć liczbę pęcherzyków w zakończeniu nerwowym, odległość pęcherzyków synaptycznych od presynaptycznej błony plazmatycznej, liczbę pęcherzyków zadokowanych na błonie presynaptycznej, rozmiar pęcherzyków synaptycznych i odległości między pęcherzykami1.
Zadowalające utrwalenie chemiczne jest warunkiem koniecznym do uzyskania wysokiej jakości mikrofotografii elektronowych, które mogą dostarczyć szczegółów morfologicznych niezbędnych do badania morfologii pęcherzyków synaptycznych i organizacji przestrzennej. Chociaż istnieje kilka sposobów utrwalania, utrwalanie tkanki mózgowej przez perfuzję naczyniową jest zdecydowanie lepsze od innych metod. Ponieważ utrwalenie poprzez perfuzję naczyniową rozpoczyna się natychmiast po zatrzymaniu krążenia ogólnoustrojowego, skraca to odstęp między odtlenieniem tkanki mózgowej a sieciowaniem białek z utrwalaczami, co skutkuje minimalnymi zmianami w strukturze komórki. Ponadto osiąga szybką i równomierną penetrację, dzięki szybkiemu przepływowi utrwalacza z łożyska naczyniowego do przedziałów zewnątrzkomórkowych i komórkowych12,13,14. Pierwotne utrwalenie aldehydem glutarowym, a następnie wtórne utrwalenie (po utrwaleniu) tetratlenkiem osmu, zapewnia doskonałe zachowanie drobnej struktury15,16,17. Mieszanina aldehydu glutarowego i paraformaldehydu ma dodatkową zaletę w postaci szybszej penetracji do tkanki12.
Ponieważ tkanki biologiczne nie są wystarczająco sztywne, aby można je było ciąć na cienkie odcinki bez wsparcia matrycy żywicznej, muszą one zostać osadzone w podłożu przed cienkim cięciem. Niemieszające się z wodą żywice epoksydowe są powszechnie stosowane jako medium do zatapiania w TEM. W przypadku stosowania tego typu matrycy, cała wolna woda w próbce musi zostać zastąpiona rozpuszczalnikiem organicznym przed infiltracją żywicy. Woda jest usuwana przez przepuszczenie próbki przez serię roztworów o rosnących stężeniach etanolu i/lub acetonu12. W tym protokole próbki są najpierw płasko osadzane między elastycznymi arkuszami aklaracji, a następnie umieszczane w kapsułce. Efektem końcowym jest tkanka znajdująca się na końcu cylindrycznego bloku żywicy, która ma idealną geometrię, aby w jak najmniejszym stopniu ulegała drganiom powstającym podczas cięcia mikrotomem.
Barwienie metalami ciężkimi w celu zwiększenia kontrastu tkanek endogennych to kolejny ważny aspekt przygotowania próbki. Kontrast obrazu w TEM jest spowodowany rozpraszaniem elektronów przez atomy w tkance. Jednak materiały biologiczne składają się w dużej mierze z cząsteczek o niskiej masie atomowej (tj. węgla, wodoru, tlenu i azotu). Dlatego wytworzenie wystarczającego kontrastu rozpraszającego wymaga włączenia atomów o dużej masie atomowej do składników komórkowych tkanki. Osiąga się to poprzez barwienie próbki metalami ciężkimi12,18,19. Tetratlenek osmu, uran i ołów, które silnie wiążą się z lipidami, są najczęstszymi metalami ciężkimi stosowanymi jako barwienie elektronów.
Osm (liczba atomowa 76) jest jednym z najgęstszych istniejących metali. Jest to zarówno utrwalacz, jak i plama, chociaż jego podstawową rolą w TEM jest bycie niezawodnym utrwalaczem12. Spośród różnych stosowanych protokołów utrwalania, metoda podwójnego utrwalania aldehydem glutarowym, a następnie osmem jest najbardziej skuteczna w zmniejszaniu ekstrakcji składników komórkowych podczas przygotowywania próbki. Te dwa utrwalacze są używane do stabilizacji maksymalnej liczby różnych typów cząsteczek, zwłaszcza białek i lipidów, i zapewniają doskonałe zachowanie ultrastruktury tkanki12,14,15,16,17.
Uran (liczba atomowa 92) jest najcięższym metalem używanym jako barwnik elektronowy, najczęściej w postaci octanu uranylu. Podobnie jak osm, działa jako barwnik i utrwalacz, chociaż jego główną rolą w TEM jest plama20,21. Struktury błoniaste zawierające kwasy nukleinowe są silnie i preferencyjnie barwione solami uranylowymi w tkankach utrwalonych aldehydami22,23. Traktowanie tkanek octanem uranylu po osmikacji, a przed odwodnieniem, powoduje stabilizację struktur błoniastych i zawierających kwasy nukleinowe, a także zwiększony kontrast i pozwala na identyfikację niektórych szczegółów strukturalnych, które nie byłyby łatwe do wykrycia w próbkach barwionych samym osmem12,24,25. Uważa się, że octan uranylu może stabilizować delikatną strukturę poprzez połączenie ze zredukowanym osmem, który został osadzony na błonach lipidowych podczas osmikacji24. Maksymalny kontrast uzyskuje się, gdy octan uranylu jest nakładany przed zatopieniem i jako post-stainin w cienkich sekcjach12.
Ołów (liczba atomowa 82) jest najczęściej używanym barwnikiem do TEM i jest głównie używany do barwienia cienkich odcinków. Sole ołowiu mają wysoką nieprzezroczystość elektronów i wykazują powinowactwo do szerokiego zakresu struktur komórkowych, w tym błon, białek jądrowych i cytoplazmatycznych, kwasów nukleinowych i glikogenu26,27. Gdy stosowana jest metoda podwójnego barwienia (tj. po barwieniu octanem uranylu następuje obróbka ołowiem), ten ostatni działa jako twórca barwienia octanem uranylu. Na przykład, barwienie chromatyny ołowiem utrwalonym aldehydem glutarowym zwiększa trzykrotnie wychwyt octanu uranylu28,29,30,31,32. Ołów wzmacnia również zabarwienie nadawane przez inne metale, takie jak osm. Uważa się, że sole ołowiu zabarwiają błony tkanek utrwalonych przez osm, przyłączając się do polarnej grupy fosfatydów w obecności zredukowanego osmu33. Potencjalną wadą barwienia zarówno octanem uranylu, jak i ołowiem, szczególnie przez dłuższy czas, jest to, że wiele różnych elementów strukturalnych jest barwionych jednakowo i niespecyficznie, a zatem nie można ich łatwo odróżnić od siebie12.
Niedawne wprowadzenie alternatywnych źródeł światła, takich jak w optycznej mikroskopii lokalizacyjnej aktywowanej fotowoltą, znacznie poprawiło rozdzielczość mikroskopii świetlnej34. Ponieważ jednak mikroskopia świetlna opiera się na metodach histochemicznych i immunocytochemicznych do wizualizacji indywidualnie znakowanych białek lub enzymów, moc TEM do wyświetlania wszystkich elementów strukturalnych jednocześnie pozostaje niezrównana w dogłębnych badaniach morfologii i relacji wymiarowych struktur tkankowych. W szczególności żadna inna technika nie może dostarczyć szczegółów morfologicznych niezbędnych do przeprowadzenia analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych w napadach nerwów presynaptycznych. Niemniej jednak ważne jest, aby pamiętać, że mikrofotografie elektronowe rejestrują strukturę tkanki po śmierci organizmu, a zatem nie mogą dostarczyć informacji na temat dynamiki transportu pęcherzyków presynaptycznych i egzocytozy. W związku z tym należy rozważyć inne narzędzia, takie jak obrazowanie na żywo barwnikiem FM i elektrofizjologia klamry, gdy głównym celem jest badanie dynamicznych i/lub funkcjonalnych aspektów transportu pęcherzyków synaptycznych i egzocytozy.

<table><tbody><tr><td>4% tetratlenek osmu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>19170</td><td>wodny</td></tr><tr><td>50% aldehyd glutarowy</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>16310</td><td>klasa EM, wodna</td></tr><tr><td>folia do zatapiania Aclar 33 C</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>50425-25</td><td>Grubość 7,8 mil, rozmiar 8 "x10"</td></tr> <tr><td>Uchwyt na kapsułki BEEM</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>69916</td><td>trzyma rozmiar "00" kapsułki</td></tr><tr><td>Kapsułki do zatapiania BEEM</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>70021</td> <td>"rozmiar 00, płaski (cięty dół)" "</td></tr><tr><td>Trymer blokowy Butler</td><td>Nauki o Mikroskopii Elektronowej</td><td>69945-01</td><td></td></tr><tr><td>Pędzel do malowania włosów wielbłąda</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>65576-01</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz dyskowy</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>77850-09</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Embed 812</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Octan ołowiu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>17600</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian ołowiu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>17800</td><td></td></tr><tr><td>Azotan ołowiu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom ultracut Leica UC7</td><td></td> Skala Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>Micro</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>62091-23</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>19208</td><td>Klasa EM, granulowana</td></tr><tr><td>Precyzyjna piec laboratoryjny Thelco Thelco</td><td></td><td>51221159</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldricht</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>StatMark</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72109-01</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór tylody</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>11760-05</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Mikroskopia elektronowa Proszek Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura do ultrastrukturalnej analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Nasze laboratorium i wiele innych wykorzystało wysoką zdolność rozdzielczą transmisyjnej mikroskopii elektronowej do badania morfologii i organizacji przestrzennej pęcherzyków synaptycznych. W celu uzyskania wysokiej jakości mikrofotografii elektronowych, które mogą zapewnić stopień szczegółowości morfologicznej niezbędny do analizy ilościowej rozmieszczenia pęcherzyków presynaptycznych, kluczowe znaczenie ma optymalne przygotowanie próbki. Utrwalanie chemiczne jest pierwszym krokiem w procesie przygotowania próbki i ma ogromne znaczenie dla zachowania drobnej ultrastruktury. Utrwalenie naczyń krwionośnych roztworem aldehydu glutarowego i formaldehydu, a następnie potraktowanie próbek wyciętych wibratomem tetratlenkiem osmu, stabilizuje maksymalną liczbę cząsteczek, zwłaszcza białek i lipidów, i skutkuje lepszą konserwacją ultrastruktury. Tkanka jest następnie przetwarzana za pomocą barwienia przeciwstawnego, sekwencyjnego odwadniania i zatapiania w żywicy. Barwienie en bloc octanem uranylu (tj. barwienie tkanki wyciętej wibratomem przed zatopieniem w żywicy) zwiększa kontrast endogenny i stabilizuje składniki komórek przed ekstrakcją podczas przetwarzania próbki. Kontrast można dodatkowo zwiększyć, nakładając octan uranylu jako post-stain na ultracienkie odcinki. Podwójne barwienie ultracienkich skrawków cytrynianem ołowiu po leczeniu octanem uranylu poprawia również rozdzielczość obrazu, poprzez intensyfikację nieprzezroczystości elektronów struktur zawierających kwas nukleinowy poprzez selektywne wiązanie ołowiu z octanem uranylu. Transmisyjna mikroskopia elektronowa jest potężnym narzędziem do charakteryzowania szczegółów morfologicznych pęcherzyków synaptycznych oraz ilościowego określania ich wielkości i organizacji przestrzennej w końcowym bulionie. Ponieważ jednak wykorzystuje utrwaloną tkankę, transmisyjna mikroskopia elektronowa może dostarczyć tylko pośrednich informacji na temat żywych lub ewoluujących procesów. Dlatego należy rozważyć inne techniki, gdy głównym celem jest badanie dynamicznych lub funkcjonalnych aspektów transportu pęcherzyków synaptycznych i egzocytozy.

Ustalono ogólne kryteria, które są powszechnie uznawane za wskaźniki satysfakcjonującego lub wadliwego utrwalenia preparatów do TEM. Kryteria te zostały zilustrowane na czterech wybranych mikrografiach elektronowych (dwa przykłady optymalnego przygotowania, dwa przykłady przygotowania wadliwego), które uzyskano poprzez opracowanie tkanki mózgu młodego szczura zgodnie z metodami opisanymi w niniejszym protokole.
Zasadniczo wysokiej jakości mikrografia elektronowa przedstawia uporządkowany, wyra...

Opisujemy procedury przetwarzania tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości mikrofotografii elektronowej do analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych. Mikrofotografie uzyskane tymi metodami mogą być również wykorzystane do badania morfologii wielu innych składników komórkowych i ich wymiarowych relacji strukturalnych.

Przygotowanie tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura do ultrastrukturalnej analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

Spośród kilku istniejących protokołów przygotowania tkanek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej wybraliśmy metody, które zapewniają optymalne zachowanie struktury i mikrofotografie o wysokiej rozdzielczości do przeprowadzenia analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na końcach presynaptycznych. Obrazy o wysokim kontraście uzyskane tymi metodami pozwalają na ilościowe określenie parametrów, takich jak odległość pęcherzyków synaptycznych od błony presynaptycznej, liczba pęcherzyków zadokowanych na błonie presynaptycznej oraz odległości między pęcherzykami. Wszystkie te parametry wskazują na funkcję synaptyczną.Ponieważ zmiany w organizacji przestrzennej pęcherzyków synaptycznych mogą być związane z zakłóceniem funkcji synaptycznych, metody te zostały wykorzystane do zbadania wpływu środków znieczulających ogólnie na rozwój synaptyków. Metody te mogą być również wykorzystane do zbadania wpływu dowolnego leku lub leczenia na szczegółową morfologię synaps, aby zapewnić wgląd w ich funkcję. Zacznij od przygotowania tetratlenku osmu do utrwalenia odcinków mózgu szczura uprzednio utrwalonych paraformaldehydem i aldehydem glutarowym poprzez perfuzję naczyniową.Skrawki stają się sztywne po leczeniu tetratlenkiem osmu. Dlatego od tego momentu obchodzenie się z tkankami wymaga uwagi. Ponadto przed dodaniem osmu upewnij się, że twoje sekcje są spłaszczone, ponieważ każda fałda prawdopodobnie spowoduje pęknięcie tkanki.Otwórz jedną pięciomililitrową szklaną ampułkę z 4% tetratlenkiem osmu i wodą i wrzuć ją do brązowej szklanej butelki. Dodaj pięć mililitrów 0,2-molowego buforu fosforanowego, a następnie dodaj dodatkowe 10 mililitrów 0,1-molowego buforu fosforanowego, aby uzyskać 1% końcowy roztwór. Użyj 20-mililitrowej strzykawki wyposażonej w długą igłę, aby pobrać 1% tetratlenek osmu, a następnie dodaj tetratlenek osmu do brązowego szklanego słoika pokrytego folią aluminiową.Po upewnieniu się, że próbka została rozłożona i spłaszczona, dodaj 1% tetratlenek osmu i 0,1 mola PB do fiolki z próbką. Inkubować próbkę w tetratlenku osmu przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji wyekstrahować tetratlenek osmu za pomocą mikropipety i przepłukać skrawki zgodnie z opisem w protokole.Aby przygotować octan uranylu, umieść 200-mililitrową szklaną kolbę miarową zawierającą 100 mililitrów 70% etanolu na płytce mieszającej. Dodać cztery gramy octanu uranylu do kolby, owinąć folią aluminiową, aby zapobiec wytrącaniu się światła i ciągle mieszać. Odwodnić sekcje w 50% etanolu.Barwić przygotowanym 4% octanem uranylu przez jedną godzinę, a następnie stopniowo odwadniać i płukać zgodnie z opisem w manuskrypcie. Wyjąć tłok strzykawki z 60-mililitrowej strzykawki do zgłębnika i nakryć ją bezpieczną igłą. Ustawić strzykawkę otwartą stroną do góry i dodawać każdy składnik mieszanki żywicy jeden po drugim.Na koniec dodaj 525 mikrolitrów DMP30 za pomocą pipety. Przesuwanie tłoka pipety bardzo powoli, ponieważ DMP jest bardzo lepki. Umieścić tłok z powrotem w strzykawce.Odwrócić strzykawkę kilka razy, aby wymieszać zawartość. Kolor zmieni się z żółtego na bursztynowy. Usunąć powietrze z wnętrza strzykawki.Następnie umieść go na bujaku z ciągłym potrząsaniem przez co najmniej 30 minut. Dodaj jedną objętość żywicy epoksydowej i jedną objętość acetonu do fiolki scyntylacyjnej i wstrząśnij w celu wymieszania. Nałóż tę mieszaninę żywicy i acetonu jeden do jednego na część tkanki po ostatnim płukaniu acetonem, trzymając pod przykryciem, aby uniknąć odparowania acetonu.Po dwóch do czterech godzinach usuń mieszaninę żywicy i acetonu jeden do jednego, zastąp ją pełną żywicą i inkubuj przez cztery godziny. Wszystkie odpady żywicy należy umieścić w pojemniku zbiorczym pod maską w celu polimeryzacji i późniejszej utylizacji. Wytnij dwa prostokątne kawałki przezroczystej folii polichlorotrifluoroetylenowej i przetrzyj je 70% etanolem.Przytnij je tak, aby z każdej strony sekcji znajdowało się co najmniej 1,5 centymetra plastiku bez bibuły, upewniając się, że mają tę samą szerokość, ale wysokość arkusza na górze wynosi około 2/3 dolnego arkusza. Powoli przechyl fiolkę i za pomocą cienkiego pędzla wielbłądziego oraz elastycznej mikroszpatułki bardzo delikatnie podnieś próbkę od dna. Następnie ostrożnie przesunąć wycinek wzdłuż ścianek fiolki i przenieść na dolny arkusz PCTFE.Usuń nadmiar żywicy za pomocą mikroszpatułki i delikatnie przykryj próbkę górnym arkuszem. Delikatnie wypchnij uwięzione pęcherzyki powietrza bez bezpośredniego nacisku na część tkanki i zetrzyj nadmiar żywicy. Użyj pisaka odpornego na rozpuszczalniki, aby oznaczyć arkusze i umieść w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza na dwa do trzech dni w celu polimeryzacji.Delikatnie rozsuń ułożone warstwowo arkusze PCTFE, aby je otworzyć. Użyj pisaka odpornego na rozpuszczalniki, aby zaznaczyć stronę arkusza, która zawiera przylegającą część, zaznaczając ją w pobliżu tkanki. Użyj dziurkacza tarczowego, aby uzyskać okrągłą próbkę przekroju, upewniając się, że ślad pisaka jest częścią wyciętej tkanki.Ślad pióra będzie błyszczał, gdy na próbkę padnie światło. Umieścić nakrętkę kapsułki do zatapiania stroną do góry na uchwycie na kapsułki. Umieść kroplę żywicy na nasadce i włóż dziurkowany krążek do wnętrza nasadki częścią tkanki skierowaną do góry.Włóż kapsułkę do nakrętki, wykonując delikatny ruch korkociągu. Użyj cienkiej pęsety, aby zwinąć i opuścić wydrukowany dwucentymetrowy kawałek papierowej etykiety do kapsułki, upewniając się, że pasuje do krzywizny bocznych ścianek kapsułki. Wlej żywicę do zatapiania do wnętrza kapsułki, napełnij do krawędzi kapsułki i użyj spiczastego drewnianego patyczka, aby popchnąć próbkę tkanki na dno.Umieść kapsułkę w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza na dwa do trzech dni w celu polimeryzacji. A następnie kontynuuj cięcie i barwienie zgodnie z opisem w protokole. Mikrografia elektronowa zadowalającego zachowania struktury komórek neuronalnych pokazuje warstwowe błony komórkowe bez pęknięć.Cytoplazma jest wreszcie ziarnista i bez pustych przestrzeni. Mitochondria nie są ani spuchnięte, ani skurczone, z zachowaną zewnętrzną podwójną błoną i nienaruszonymi wewnętrznymi grzebieniami. Optymalne zachowanie ultrastruktury neuronów i drobnych szczegółów morfologicznych jest niezbędne do wizualizacji pęcherzyków synaptycznych i zmierzenia ich odległości od błony presynaptycznej.Pęcherzyki synaptyczne powinny być wyraźne i wyściełane nieprzerwaną pojedynczą błoną. Aby ułatwić analizę morfometryczną rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych, błony presynaptyczne i postsynaptyczne powinny być zachowane równolegle w swojej ciągłości. Mikrografia elektronowa wadliwego zachowania struktury tkankowej pokazuje zniekształcenie i pęknięcie błon komórkowych neuronów oraz obecność znacznie powiększonych przestrzeni zewnątrzkomórkowych.Mitochondria wydają się rozdęte i mają spuchnięte grzebienie. W innym przykładzie zachowania wadliwej struktury tkankowej w cytoplazmie znajdowały się duże białe puste przestrzenie w miejscu drobnoziarnistej substancji cytoplazmatycznej z powiększonymi przestrzeniami zewnątrzkomórkowymi. Sztuczna błona prawdopodobnie powstała w wyniku mobilizacji lipidów podczas wiązania aldehydem glutarowym.Podczas pracy z młodą tkanką mózgową należy stosować 1 molowy bufor fosforanowy jako rozpuszczalnik dla całego roztworu, aby utrzymać toniczność jak najbardziej zbliżoną do mózgu nowonarodzonego szczura i zminimalizować artefaktowe kurczenie się tkanek i/lub obrzęk. Mikrografie uzyskane tymi metodami mogą być wykorzystane do badania szczegółowej morfologii i wymiarowych relacji strukturalnych wielu składników komórkowych innych niż pęcherzyki synaptyczne. Na przykład mitochondria, aparat Golgiego i chromatyna jądrowa.Kilka kroków w tym protokole wymaga chemikaliów, które mogą być toksyczne. Zawsze pracuj pod wyciągiem i noś środki ochrony osobistej podczas pracy z aldehydami, związkami osmu, uranu i ołowiu.

preparation-newborn-rat-brain-tissue-for-ultrastructural-morphometric

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano protokół systemu hodowli agregatów embrionalnego mózgu szczura. Wielopotencjalne komórki progenitorowe w agregatach mogą rozwijać się i różnicować w neurony, astrocyty oraz oligodendrocyty.

Przygotowanie hodowli agregatów mózgu szczura do badań nad rozwojem neuronów i gleju

Opisujemy protokół perfuzji transkardiakalnej u myszy, usuwania i sekcjonowania mózgu, a także barwienia immunoperoksydazowego, zatapiania w żywicy i przygotowywania ultracienkich przekrojów z sekcji mózgu. Po zakończeniu tych procedur materiał poddany immunobarwieniu jest gotowy do badania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Przygotowanie tkanki mózgu myszy do immunoelektromikroskopii

Niniejszy raport demonstruje technikę mechanicznej izolacji pojedynczych żywych neuronów z zachowaniem przytwierdzonych boutonów presynaptycznych. Neurony poddane wibrodysocjacji charakteryzują się zaletami takimi jak szybki czas przygotowania, doskonała kontrola farmakologiczna oraz usprawniona stabilizacja potencjału błonowego (space-clamp) bez wpływu komórek sąsiednich. Metoda ta może być wykorzystywana do obrazowania elementów synaptycznych oraz rejestracji metodą patch-clamp.

Wibrodysocjacja neuronów z plastrów mózgu gryzoni w celu badania transmisji synaptycznej i obrazowania terminali presynaptycznych

Aby zrozumieć strukturę sieci neuronowych, konieczna jest funkcjonalna i morfologiczna charakterystyka poszczególnych neuronów. Tutaj demonstrujemy znakowanie biocytyny przykłasomalnej, które umożliwia zapisy elektrofizjologiczne w konfiguracji zewnątrzkomórkowej, zachowując jednocześnie zdolność do wewnątrzkomórkowego znakowania neuronu w celu rekonstrukcji post hoc architektury dendrytycznej i aksonalnej.

Znakowanie biocytyny Juxtasomal w celu zbadania zależności struktura-funkcja poszczególnych neuronów korowych

Opisano protokół generowania systemu kokulturowego składającego się z neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), pierwotnych neuronów korowych i astrocytów. Ten system kohodowli umożliwia wykrycie powstawania kontaktów i obwodów synaptycznych między nowymi neuronami pochodzącymi z iPSC a istniejącymi wcześniej neuronami korowymi wykazującymi ekspresję rodopsyny kanałowej-2.

Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

Tutaj oferujemy łatwy, tani i efektywny czasowo protokół chemicznego utrwalania tkanki mózgowej naczelnych za pomocą utrwalacza akroleiny, co pozwala na długoterminową konserwację, która jest zgodna z immunohistochemią dla transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Przygotowanie tkanki mózgowej naczelnych innych niż ludzie do wstępnego zatopienia immunohistochemii i mikroskopii elektronowej

Ten protokół zarówno wizualnie komunikuje przygotowanie pnia mózgu i rdzenia kręgowego, jak i wyjaśnia przygotowanie przekrojów poprzecznych pnia mózgu w kompleksowy sposób krok po kroku. Został on zaprojektowany w celu zwiększenia odtwarzalności i zwiększenia prawdopodobieństwa uzyskania żywotnych, długotrwałych, rytmicznie aktywnych wycinków do rejestrowania wyjścia neuronalnego z obszarów oddechowych pnia mózgu.

Przygotowanie rytmicznie aktywnego in vitro noworodka gryzonia pień-rdzeń kręgowy i cienki plasterek

Połączenie transmisyjnej mikroskopii elektronowej i transdukcji in utero jest potężnym podejściem do badania zmian morfologicznych w ultrastrukturze układu nerwowego podczas rozwoju. Ta połączona metoda pozwala na dogłębny wgląd w zmiany w szczegółach strukturalnych leżących u podstaw neuroplastyczności w odniesieniu do ich reprezentacji topograficznej.

Ocena ultrastrukturalnych parametrów neuroplastyczności po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego

Tutaj prezentujemy protokół, który wykorzystuje barwniki bliskiej podczerwieni w połączeniu z immunohistochemią i skanowaniem w wysokiej rozdzielczości do oznaczania białek w obszarach mózgu.

Wykorzystanie fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości do pomiaru ekspresji białek w mózgu gryzoni

Przedstawiamy protokół do oznaczania i analizowania neuronów piramidowych, który jest kluczowy dla oceny potencjalnych zmian morfologicznych w neuronach i kolcach dendrytycznych, które mogą leżeć u podstaw nieprawidłowości neurochemicznych i behawioralnych.

Znakowanie balistyczne neuronów piramidowych w wycinkach mózgu i w pierwotnej hodowli komórkowej

Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę półilościowego określania liczby neuronów dopaminergicznych u szczurzej istoty czarnej pars compacta.

Półilościowe oznaczanie gęstości neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej modeli gryzoni przy użyciu automatycznej analizy obrazu

Poznaj metody przygotowania tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura do analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych przy użyciu mikroskopii elektronowej.

Przygotowanie tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura do ultrastrukturalnej analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura do ultrastrukturalnej analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych

Przeglądaj więcej filmów