Oddzielenie naskórka i skóry właściwej szczura za pomocą termolizyny w celu wykrycia mRNA i białka zapalnego specyficznego dla miejsca

Nasz protokół jest łatwą w użyciu i niedrogą techniką separacji naskórkowo-skórnej do określania specyficznej dla miejsca produkcji mediatorów stanu zapalnego i neurotrofin podczas zapalenia skóry. Główną zaletą tej techniki jest to, że enzymatyczne oddzielenie naskórka od skóry właściwej odbywa się w czterech stopniach Celsjusza, przy zachowaniu integralności mRNA i białka. Metoda ta zapewnia wgląd w typy mediatorów, które uwrażliwiają pierwotne zakończenia doprowadzające podczas ostrego i przewlekłego stanu zapalnego w celu opracowania nowych interwencji terapeutycznych.

Gojenie się ran, choroby skóry, przewlekłe rany i oparzenia mogą skorzystać z tych badań. Metodę tę można zastosować do innych powierzchni nabłonkowych, takich jak przewód pokarmowy i rogówka. Optymalny czas separacji może się nieznacznie różnić w zależności od laboratorium.

Zaleca się wstępny eksperyment porównujący różne punkty czasowe w połączeniu z oceną morfologii 2D w celu określenia jakości separacji. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania u znieczulonego ośmio- do dziewięciotygodniowego szczura Sprague Dawley, wstrzyknij podskórnie w prawą nagą tylną łapę 100 mikrolitrów karagenu 1X Lambda rozcieńczonego w PBS. Za pomocą suwmiarki należy zmierzyć grubość śródstopia tylnej łapy bezpośrednio przed wstrzyknięciem oraz po 6 i 12 godzinach od wstrzyknięcia, aby określić objętość obrzęku w odpowiedzi na bodziec.

W odpowiednim punkcie końcowym doświadczenia użyj ostrego skalpela, aby zebrać jeden na dwa milimetrowe kawałki nagiej skóry tylnej łapy z wstrzykniętej łapy i użyj kleszczy do mikrodysekcji, aby przenieść skórę do jednego mililitra zimnego DMEM w probówce mikrowirówkowej na lodzie przez 15 do 60 minut. Podczas inkubacji tkanki dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanej aktywowanej termolizyny do 10 dołków 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej na lodzie. Pod koniec inkubacji użyj kleszczy do mikrodysekcji, aby przenieść jedną próbkę skóry do każdej studzienki aktywowanej termolizyny, warstwą rogową rogówki do góry, bez zanurzania próbek w roztworze.

Bardzo ważne jest, aby skóra nie była zanurzona w termolizynie i aby warstwa rogowa naskórka była skierowana do góry, aby uzyskać skuteczne oddzielenie. Po dwóch do trzech godzinach użyj kleszczy do mikrodysekcji, aby zanurzyć jedną próbkę skóry w siedmiu do ośmiu mililitrach DMEM o czterech stopniach Celsjusza na szalce Petriego, aby zapewnić więcej miejsca na oddzielenie się naskórka od skóry właściwej. Za pomocą kleszczy delikatnie przeczesuj naskórek na obwodzie skóry, aż na granicach próbki pojawi się prawie przezroczysty naskórek.

Gdy naskórek zauważalnie oddzieli się od skóry właściwej, ostrożnie chwyć każdą warstwę skóry pojedynczą parą kleszczy i powoli wyciągnij naskórek ze skóry właściwej, a następnie oceń przezroczystość izolowanego naskórka za pomocą mikroskopii świetlnej, aby upewnić się, że jest optycznie spójny. Jeśli warstwy zostały odpowiednio oddzielone, umieść tkanki naskórka i skóry właściwej w indywidualnych pojemnikach z pięciomilimolowym EDTA w DMEM w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 30 minut. Po dezaktywacji termolizyny utrwalić część naskórka w odpowiednim utrwalaczu na jedną godzinę w temperaturze pokojowej ze mieszaniem.

Pod koniec inkubacji umieścić utrwaloną tkankę w 10% sacharozie w PBS na jedną godzinę w temperaturze pokojowej z mieszaniem, a następnie zamrozić próbkę w odpowiedniej matrycy do zatapiania tkanek w celu sekcji. Za pomocą kriostatu uzyskaj przekroje o grubości 14 mikrometrów i rozmroź je na szkiełkach mikroskopowych pokrytych żelatyną. Po wysuszeniu na podgrzewaczu do szkiełek należy zabarwić próbki roztworem roboczym błękitu toluidynowego przez 90 sekund.

Następnie delikatnie zmyć błękit toluidynowy ze szkiełek za pomocą PBS i przeciwstawić szkiełka nakrywkowe wodnym podłożem montażowym, a następnie obserwować naskórek za pomocą mikroskopii Brightfield w powiększeniu od 50 do 250x. Wstrzyknięcie karagenu w tylną łapę szczura powoduje klasyczne objawy zapalenia, takie jak zaczerwienienie i obrzęk zarówno po 6, jak i 12 godzinach od wstrzyknięcia. Mikroskopia jasnego pola może być wykorzystana do oceny skuteczności separacji termolizyny naskórka i skóry właściwej nagiej skóry tylnej łapy szczura.

Rzeczywiście, niebieskie zabarwienie przekrojów naskórka pokazuje, że naskórek jest oddzielony od skóry właściwej na błonie podstawowej, ale grzbiety Rete naskórka i wgłębienia z brodawki skórnej pozostają nienaruszone. Ponadto obserwuje się wszystkie warstwy komórek keratynocytów. Western blot naskórka oddzielonego termolizyną daje spójne wyniki, wskazując na stabilny poziom białka podczas techniki w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

W naiwnym naskórku szczura wykrywa się bardzo mało białka NGF, ale poziom białka NGF jest znacznie podwyższony po sześciu godzinach zapalenia wywołanego karagenem. 12 godzin po wstrzyknięciu poziomy NGF są zmniejszone w porównaniu z obserwowanymi po sześciu godzinach, ale pozostają podwyższone w porównaniu z grupą kontrolną. Zgodnie z oczekiwaniami wynikającymi z analizy Western blot, immunoreaktywność NGF nie jest wykrywana w naiwnych próbkach tkanki kontrolnej naskórka, ale po sześciu godzinach od zapalenia wywołanego karagenem immunoreaktywność NGF obserwuje się w większości keratynocytów warstwy ziarnistej i warstwy jasnej.

Kilka komórek w warstwie kolczastej jest również immunoreaktywnych NGF. W przypadku stosowania termolizyny do izolacji nienaruszonego naskórka należy pamiętać, że optymalny czas separacji musi być empirycznie określony przez użytkownika końcowego. Różne techniki proteomiczne i molekularne mogą być stosowane do walidacji ekspresji określonych białek i/lub transkryptów genów pierwotnych, aby potwierdzić, że procedura ta nie zmienia ekspresji podstawowej.

Ta technika separacji naskórkowo-skórnej pozwoli naukowcom odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące specyficznej dla miejsca ekspresji neurotrofin i mediatorów stanu zapalnego w różnych modelach zapalenia skóry. Kwas pikrynowy i paraformaldehyd są niebezpieczne. Pracuj z obiema substancjami chemicznymi w dygestorium, używaj osobistej odzieży ochronnej i rękawic, a po użyciu umyj twarz i ręce.