Name: Oddzielenie naskórka i skóry właściwej szczura za pomocą termolizyny w celu wykrycia mRNA i białka zapalnego specyficznego dla miejsca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Poznaj metodę enzymatycznego rozdziału naskórka i skóry właściwej szczura przy użyciu termolizyny w temperaturze 4°C, zachowującą integralność mRNA i białek do analizy zapalnych mediatorów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tych badań zostało zapewnione przez National Institutes of Health NIH-AR047410 (KEM)

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Stanowego Oklahoma IACUC (#2016-03).
1. Zapalenie wywołane karagenem (C-II)
<ol>
	<li>Samce i/lub samice szczurów Sprague Dawley (200–250 g; w wieku 8–9 tygodni) znieczulić izofluranem (lub środkiem znieczulającym do wstrzykiwań).</li>
	<li>Sprawdź głębokość znieczulenia, dotykając rogówki i lekko szczypiąc lewą tylną łapę. Gdy zwierzę zostanie odpowiednio znieczulone, nie zaobserwuje się reakcji rogówki ani łapy.</li>
	<li>Podskórnie wstrzyknąć w prawą, nagą, tylną łapę 100 μl 1% (w/v) λ-karagenu rozcieńczonego w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS) i pozwolić szczurowi w pełni wyzdrowieć po znieczuleniu20.
	<ol>
		<li>Należy upewnić się, że stosowane są odpowiednie środki kontroli, takie jak wcześniejsze szczury bez izofluranu w tym raporcie. Wstępne badania wskazują, że nieleczone wcześniej szczury z izofluranem lub bez izofluranu mają taką samą podstawową ekspresję naskórkowej IL-6 i NGF. 
		UWAGA: Szczury nieleczone wcześniej są preferowaną grupą kontrolną w badaniach stanu zapalnego, ponieważ sól fizjologiczna podawana podskórnie lub PBS powodują miejscowe zapalenie23,37.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W punktach czasowych 6-12 godzin poddaj szczury eutanazji za pomocą CO2 i zmierz grubość śródstopia tylnej łapy za pomocą suwmiarki. Odetnij 1 mm x 2 mm kawałki nagiej skóry tylnej łapy ostrym skalpelem. Jeśli na skórze znajdują się włosy, ogol obszar przed odcięciem kawałków skóry o wymiarach 1 mm x 2 mm. 
	UWAGA: Upewnij się, że odpowiednie punkty czasowe zostały wybrane zgodnie z konkretnymi badaniami.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy do mikrodysekcji przenieś skórę do 1 ml zimnego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle Medium (DMEM) w probówce mikrowirówkowej na lodzie i utrzymuj w chłodzie przez 15–60 minut.</li>
</ol>
2. Termolizyna oddzielająca naskórek i skórę właściwą
<ol>
	<li>Przygotuj i aktywuj termolizynę.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór termolizyny, dodając 5 mg Geobacillus stearothermophilus do 10 ml PBS, przy pH = 8 (stężenie 500 μg/ml).</li>
		<li>Przygotować 1 M roztwór chlorku wapnia (CaCl2 bezwodny), dodając 1,11 g do 10 ml destylowanegoH2O.</li>
		<li>Aby zapobiec autolizie termolizyny, dodaj 10 μl chlorku wapnia do 10 ml roztworu termolizyny. Końcowe stężenie chlorku wapnia wyniesie 1 mM.</li>
		<li>Porcję 1 ml aktywowanej termolizyny rozmieścić w 10 dołkach 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj trawienia enzymatycznego termolizyny, aby oddzielić naskórek od skóry właściwej.
	<ol>
		<li>Za pomocą kleszczy do mikrodysekcji przenieś jedną próbkę skóry do każdej studzienki aktywowanej termolizyny. Należy uważać, aby nie zanurzać skóry w roztworze termolizyny.</li>
		<li>Delikatnie postukaj w skórę z boku studzienki, aby pomóc w uwolnieniu próbki skóry z kleszczy, aby unosiła się na roztworze termolizyny.</li>
		<li>Zanurz skórę w roztworze termolizyny warstwą rogową (zewnętrzny naskórek) stroną do góry i skórą właściwą skierowaną w dół. Bardzo ważne jest, aby skóra właściwa była skierowana w dół, w przeciwnym razie skuteczna separacja nie nastąpi. 
		UWAGA: Czas inkubacji termolizyny musi być określony empirycznie przez użytkownika końcowego. Naga, tylna skóra łapy szczurów Sprague Dawley (200–250 g; 8–9 tygodni) często wymaga 2,0–2,5 godziny na separację. Oczekuje się, że czas inkubacji będzie się różnił w zależności od gatunku i wieku.</li>
		<li>Po odpowiednim czasie inkubacji w termolizynie należy użyć kleszczyków do mikrodysekcji, aby przenieść jedną próbkę skóry do dołka 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej z 7–8 ml zimnego (4 °C) DMEM. Pozwala to na oddzielenie naskórka od skóry właściwej.</li>
		<li>Zanurz skórę w DMEM.</li>
		<li>Delikatnie przeczesz naskórek kleszczami po obwodzie skóry, aż na granicach pojawi się prawie przezroczysty naskórek. Jeśli nie można tego osiągnąć, należy umieścić próbkę skóry z powrotem w roztworze termolizyny na kolejne 15–30 minut.</li>
		<li>Gdy naskórek zauważalnie oddzieli się od skóry właściwej, ostrożnie przytrzymaj zarówno naskórek, jak i skórę właściwą za pomocą kleszczy do mikrodysekcji i bardzo powoli wyciągnij naskórek ze skóry właściwej.</li>
		<li>Oceń przezierność izolowanego naskórka i upewnij się, że jest on optycznie spójny. Zobacz Rysunek 2 dla przykładu próbki naskórka szczura o wymiarach 1 mm x 2 mm. Jeśli występuje różnica w przezroczystości, oznacza to, że nie nastąpiła właściwa separacja.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dezaktywuj termolizynę za pomocą kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w oddzielonych fragmentach naskórka i skóry właściwej. 
	UWAGA: Termolizyna, która pozostaje w naskórku i skórze właściwej, jest nadal aktywna i może uszkodzić warstwy, jeśli nie zostanie dezaktywowana.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy 0,5 M EDTA. Aby to zrobić, powoli dodaj 0,93 g EDTA do 5 ml podwójnie destylowanej wody. Dodaj wodorotlenek sodu do roztworu, aż się oczyści. Upewnij się, że pH roztworu wynosi ~8,0.</li>
		<li>Wykonaj roztwór 5 mM EDTA w DMEM. Dodać 0,25 ml 0,5 M roztworu podstawowego EDTA do 25 ml DMEM.</li>
		<li>Umieścić oddzielony naskórek i skórę właściwą w 5 mM roztworze EDTA/DMEM w temperaturze 4 °C na 30 minut, aby dezaktywować aktywność termolizyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń naskórek za pomocą histologii barwiewki8,9,10.
	<ol>
		<li>Utrwal część naskórka w 10% neutralnej formalinie, 4% paraformaldehydzie lub 0,25% paraformaldehydzie z 0,8% roztworem kwasu pikrynowego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT) z mieszaniem.</li>
		<li>Umieścić utrwalony naskórek w 10% sacharozie w PBS na 1 godzinę w temperaturze pokojowej ze wzburzeniem.</li>
		<li>Zamroź naskórek w matrycy osadzającej tkankę w celu przekroju. Wytnij przekroje 14 μm za pomocą kriostatu i zamontuj sekcje do rozmrażania na szkiełkach mikroskopowych pokrytych żelatyną.</li>
		<li>Wysuszyć skrawki na podgrzewaczu szkiełkowym i zabarwić roztworem roboczym błękitu toluidynowego (TB; 10% TB w 1% chlorku sodu) przez 90 s. Szkiełka nakrywkowe nakładać wodnym medium mocującym.</li>
		<li>Obserwuj naskórek za pomocą mikroskopii jasnego pola przy 50x–250x. 
		UWAGA: Jeśli nastąpiło prawidłowe oddzielenie, naskórek zostanie czysto oddzielony od skóry właściwej i zostanie wykrytych pięć warstw: warstwa podstawna, warstwa kolczasta, warstwa ziarnista, warstwa jasna i warstwa rogowa naskórka. Przykład oddzielonego naskórka skóry szczura można zobaczyć w <silna klasa="xfig">Rysunek 3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ekstrakcja białek i analiza western blot
<ol>
	<li>Wykonaj western blot na oddzielonych próbkach tkanek przy użyciu wcześniej opublikowanego protocol21.</li>
	<li>Homogenizuj naskórek w 50 μl buforu do lizy (25 mM Tris HCl, pH = 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% glicerolu i 1% Triton X-100) zawierającego koktajl inhibitorów fosfatazy i proteazy.</li>
	<li>Odwirować próbki z maksymalną prędkością przez 15 minut w temperaturze 4 °C i ocenić supernatant pod kątem stężenia białka przy użyciu zestawu do oznaczania białek.</li>
	<li>Załadować równe stężenia białka (30 μg) do żeli SDS, wykonać elektroforezę, a następnie przenieść białka do membran nitrocelulozowych lub PVDF.</li>
	<li>Blokować błony 5% mlekiem przez 2 godziny i inkubować przez noc w przeciwciałie pierwszorzędowym (mysi anty-NGF, E12, 1:1000).</li>
	<li>Przemyć 3x PBS z 0,3% tween przez 10 minut każdy i inkubować z znakowanym przeciwciałem drugorzędowym (np. IgG anty-mysim znakowanym fosfatazą alkaliczną</li>).
	<li>Użyj systemu skanowania do oceny sygnału western blot (np. substratu ECF i platformy obrazowania).</li>
</ol>
4. Immunohistochemia
<ol>
	<li>Umieść próbki tkanek w utrwalaczu w celu uzyskania optymalnej immunoreaktywności: 0,96% (w/v) kwasu pikrynowego i 0,2% (w/v) formaldehydu w 0,1 M buforze fosforanu sodu, pH = 7,321,22,23 przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Przenieść na 10% sacharozy w PBS przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wykonaj standardową immunohistochemię na skrawkach tkanki21,22,23.</li>
	<li>Osadź naskórek zwierząt w pojedynczym zamrożonym bloku w matrycy do zatapiania i wytnij 10–30 μm odcinki na kriostacie. Zamontuj skrawki na pokrytych żelatyną, szklanych szkiełkach mikroskopowych i susz w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Przemyć skrawki przez trzy, 10 minut płukania w PBS i inkubować przez 24–96 godzin w pierwotnych surowicach odpornościowych [np. mysim anty-NGF (E12, 1:2000)] i króliczym produkcie genu antybiałkowego 9,9 (PGP 9,5, 1:2000) rozcieńczonym w PBS zawierającym 0,3% (w/v) Triton X-100 (PBS-T) PBS-T z 0,5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 0,5% poliwinylopirolidonem (PVP).</li>
	<li>Po pierwotnej inkubacji surowicy odpornościowej płukać skrawki trzykrotnie przez 10 minut w PBS i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w Alexa Fluor 488 przeciwko królikowi IgG (1:1000) i Alexa Fluor 555 przeciwko mysim osiołkom (1:1000) rozcieńczonym w PBS-T.</li>
	<li>Przepłukać skrawki trzy razy w PBS przez 10 minut i przymocować szkiełka nakrywkowe nieblaknącym medium mocującym, aby opóźnić blaknięcie immunofluorescencji.</li>
</ol>
5. Izolacja RNA i synteza cDNA
<ol>
	<li>Wykonaj standardową reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR) na próbkach skóry21. Wyizolować całkowite RNA za pomocą roztworu fenolu i izotiocyjanianu guanidyny.</li>
	<li>Przeprowadź komplementarną syntezę DNA przez odwrotną transkryptazę wirusa białaczki mysiej Moloneya.</li>
	<li>Użyj następujących sekwencji starterów do amplifikacji NGF i IL-6: 
	NGF (Sens) - GTGGACCCCAAACTGTTTAAGAAACGG 
	NGF (antysens) – GTGAGTCCTGTTGAAGGAGATTGTACCATG 
	IL-6 (Sense) - GCAATTCTGATTGTATGAACAGCGATGATGC; 
	IL-6 (Antysens) – GTAGAAACGGAACTCCAGAAGACCAGAG</li>
	<li>Porównaj poziomy mRNA NGF i IL-6 z genem porządkowym β-aktyny: 
	β-AKTYNA (sens) - TGCGTGACATTAAAGAGAAGCTGTGCTATG 
	β-AKTYNA (antysens) – GAACCGCTCATTGCCGATGATGA</li>
	<li>Ocena za pomocą jakościowego RT-PCR przy użyciu termocyklera i ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) przy użyciu systemu qRT-PCR.</li>
</ol>

<ol><li>Choi, J. E., Di Nardo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+neurogenic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Skin neurogenic inflammation.</a> Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).</li>
<li>Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neurotrophins+in+inflammation+and+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Vitamins+and+Hormones%22%5BJournal%5D)">The role of neurotrophins in inflammation and allergy.</a> Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).</li>
<li>Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Dermatologie%2C+Venerologie%2C+und+verwandte+Gebiete%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of psoriasis.</a> Zeitschrift für Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete. 67 (6), 422-431 (2016).</li>
<li>Zou, Y., Maibach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermal-epidermal+separation+methods%3A+research+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Dermatological+Research%22%5BJournal%5D)">Dermal-epidermal separation methods: research implications.</a> Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).</li>
<li>Baumberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+separation+of+epidermis+from+dermis+and+some+physiologic+and+chemical+properties+of+isolated+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis.</a> Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).</li>
<li>Felsher, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+adherence+of+the+epidermis+to+the+corium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Studies on the adherence of the epidermis to the corium.</a> Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).</li>
<li>Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal-dermal+separation+with+proteolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes.</a> Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).</li>
<li>Rakhorst, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+keratinocyte+isolation%3A+a+short+comparative+study+on+thermolysin+and+dispase%5BTitle%5D)+AND+%22International+Association+of+Oral+and+Maxillofacial+Surgeons%22%5BJournal%5D)">Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase.</a> International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).</li>
<li>Tschachler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sheet+preparations+expose+the+dermal+nerve+plexus+of+human+skin+and+render+the+dermal+nerve+end+organ+accessible+to+extensive+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).</li>
<li>Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermolysin+treatment-a+new+method+for+dermo-epidermal+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation.</a> Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).</li>
<li>Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+rat+epidermis+and+dermis+following+thermolysin+separation%3A+PGP+9.5+and+Nav+1.8+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Neuroscience+Abstract%22%5BJournal%5D)">Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization.</a> Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).</li>
<li>Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+corneal+epithelium+from+the+stroma+using+thermolysin%3A+evaluation+of+corneal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Neuroscience+Abstract%22%5BJournal%5D)">Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents.</a> Society for Neuroscience Abstract. , 584(2010).</li>
<li>Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-property+relationship+of+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Oklahoma+Center+for+Neuroscience+Symposium+Abstract%22%5BJournal%5D)">Structure-property relationship of skin.</a> Oklahoma Center for Neuroscience Symposium Abstract. , # 17 (2011).</li>
<li>Anderson, M. B., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-epidermal+nerve+fiber+reconstruction+and+quantification+in+three-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Neuroscience+Abstract%22%5BJournal%5D)">Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions.</a> Society for Neuroscience Abstract. 220, 23(2017).</li>
<li>Gujar, V. K. E., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+nerve+growth+factor+in+adjuvant-induced+arthritis+%28AIA%29%3A+A+temporal+study%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Neuroscience+Abstract%22%5BJournal%5D)">Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study.</a> Society for Neuroscience Abstract. 220, 23(2017).</li>
<li>Vinegar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((to+carrageenan-induced+inflammation+in+the+hind+limb+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat.</a> Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).</li>
<li>Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+inflammation%3A+Carrageenan-+or+complete+Freund%27s+Adjuvant+%28CFA%29-induced+edema+and+hypersensitivity+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.4 (2012).</li>
<li>Li, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((exerts+its+anti-inflammatory+effects+associated+with+suppressing+ERK%2Fp38+MAPK+and+Heme+Oxygenase-1+activation+in+lipopolysaccharide-stimulated+RAW+264.7+macrophages+and+carrageenan-induced+mice+paw+edema%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema.</a> International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).</li>
<li>Sammons, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carrageenan-induced+thermal+hyperalgesia+in+the+mouse%3A+role+of+nerve+growth+factor+and+the+mitogen-activated+protein+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway.</a> Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).</li>
<li>Hoffman, E. M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+inhibition+of+glutaminase+reduces+carrageenan+induced+Fos+expression+in+the+superficial+dorsal+horn+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat.</a> Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).</li>
<li>Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+glutaminase+and+vesicular+glutamate+transporter+type+2+immunoreactivity+in+rat+sacral+dorsal+root+ganglia+following+a+surgical+tail+incision%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacy+and+Pharmacology+International+Journal%22%5BJournal%5D)">Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision.</a> Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023(2015).</li>
<li>Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixative+composition+alters+distributions+of+immunoreactivity+for+glutaminase+and+two+markers+of+nociceptive+neurons+Nav1.8+and+TRPV1%2C+in+the+rat+dorsal+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).</li>
<li>Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutaminase+increases+in+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+after+unilateral+adjuvant-induced+hind+paw+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation.</a> Biomolecules. 6 (1), 10(2016).</li>
<li>van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+den+Burg%2C+B+%22Handbook+of+Proteolytic+Enzymes%22">Handbook of Proteolytic Enzymes</a>. , Volume 1, Chapter 111 540-553 (2013).</li>
<li>Matthews, B. W. Thermolysin. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatthews%2C+BW+%22Encyclopedia+of+Inorganic+and+Bioinorganic+Chemistry%22">Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry</a>. , (2011).</li>
<li>Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dissociation+of+keratinocytes+from+human+skin+biopsies+for+in+vitro+cell+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation.</a> Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).</li>
<li>Glade, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+flow+cytometric+characterization+of+epidermal+cell+suspensions+prepared+from+normal+and+hyperproliferative+human+skin+using+an+optimized+thermolysin-trypsin+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Dermatological+Research%22%5BJournal%5D)">Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol.</a> Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).</li>
<li>Sato, J. D., Kan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Media+for+culture+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Media for culture of mammalian cells.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1: Unit 1.2 (2001).</li>
<li>Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermolysin+in+human+cultured+keratinocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Biology%22%5BJournal%5D)">Thermolysin in human cultured keratinocyte isolation.</a> Brazilian Journal of Biology. 67 (1), 105-109 (2007).</li>
<li>Germain, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+human+keratinocyte+isolation+and+culture+using+thermolysin%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin.</a> Burns. 19 (2), 99-104 (1993).</li>
<li>Michel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+new+tissue-engineered+human+skin+equivalent+with+hair%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).</li>
<li>Fassina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autolysis+of+thermolysin.+Isolation+and+characterization+of+a+folded+three-fragment+complex%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex.</a> European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).</li>
<li>Petho, G., Reeh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+and+signaling+mechanisms+of+bradykinin%2C+eicosanoids%2C+platelet-activating+factor%2C+and+nitric+oxide+in+peripheral+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors.</a> Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).</li>
<li>Djouhri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+nerve+growth+factor+dependence+of+inflammation-induced+alterations+in+electrophysiological+membrane+properties+in+nociceptive+primary+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons.</a> Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).</li>
<li>Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+and+pain+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor and pain mechanisms.</a> Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).</li>
<li>Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+in+situ+localization+of+cutaneous+tumour+necrosis+factor+alpha+%28TNF-alpha%29+and+interleukin+6+%28IL-6%29+following+skin+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization.</a> Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).</li>
<li>Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+toxicity+of+the+analgesic+glutaminase+inhibitor+6-diazo-5-oxo-L-norleucine+in+vitro+and+on+rat+dermal+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22MOJ+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts.</a> MOJ Toxicology. 1 (1), 00005(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

W badaniu stwierdzono, że naskórek nagiej skóry tylnej łapy szczura można było łatwo oddzielić od skóry właściwej za pomocą termolizyny (0,5 mG/ml) w PBS z 1 mM chlorku wapnia w temperaturze 4 °C przez 2,5 godziny. Ocena histologiczna wykazała, że naskórek był oddzielony od skóry właściwej na błonie podstawnej, a grzbiety naskórka były nienaruszone. Termolizyna jest zewnątrzkomórkową metaloendopeptydazą wytwarzaną przez Gram-dodatni (Geo)Bacillus thermoproteolyticus24. Jego aktyw...

Ocena mediatorów stanu zapalnego i czynników neurotroficznych ze skóry może być ograniczona ze względu na niejednorodność typów komórek występujących w stanie zapalnym skóry właściwej i naskórka1,2,3. Ostatnio dokonano przeglądu kilku enzymów, technik chemicznych, termicznych lub mechanicznych polegających na oddzieleniu dwóch warstw lub przeprowadzaniu dysocjacji komórek w celu oceny4. Kwasy, zasady, obojętna sól i ciepło mogą szybko oddzielić naskórek od skóry właściwej, ale często występuje obrzęk komórkowy i zewnątrzkomórkowy5,6. Trypsyna, pankreatyna, elastaza, keratynaza, kolagenaza, pronaza, dyspaza i termolizyna to enzymy, które zostały użyte do separacji naskórkowo-skórnej4,7. Trypsyna i inne enzymy proteolityczne o szerokim zakresie są aktywne w temperaturze 37–40 °C, ale muszą być uważnie monitorowane, aby zapobiec dysocjacji warstw naskórka. Dyspaza rozszczepia naskórek w blaszce gęstej, ale wymaga 24 godzin na separację w zimnym 4,8 lub krótsze punkty czasowe w temperaturze 37 °C4,9. Cechą ograniczającą wszystkich tych technik jest potencjalne zaburzenie morfologii tkanek i utrata integralności mRNA i białka.
Aby zachować integralność mRNA i białka, metoda separacji skóry powinna być przeprowadzana na zimno przez krótki okres czasu. Oceniając techniki separacji skóry w badaniach nad stanem zapalnym, termolizyna jest skutecznym enzymem do oddzielania naskórka od skóry właściwej w niskich temperaturach4. Termolizyna jest aktywna w temperaturze 4 °C, odcina hemidesmosomy naskórka od blaszki jasnej i oddziela naskórek od skóry właściwej w ciągu 1–3 godzin4,8,10. Celem tego raportu jest optymalizacja wykorzystania termolizyny do oddzielania naskórka szczura w stanie zapalnym od skóry właściwej w celu wykrycia poziomów mRNA i białek dla mediatorów stanu zapalnego i czynników neurotroficznych. Przedstawiono kilka wstępnych raportów11,12,13,14,15. Celem tego artykułu jest opisanie optymalnej techniki separacji skóry za pomocą termolizyny i wykazanie wykrywania 1) markerów stanu zapalnego, 2) mRNA interleukiny-6 (IL-6) oraz 3) mRNA i białka czynnika wzrostu nerwów (NGF) w naskórku szczurów ze stanem zapalnym wywołanym karagenem (C-II)16,17. Wstępny raport wykorzystujący kompletny model adiuwantowy Freunda wskazuje, że poziomy mRNA i białka NGF wzrastają wcześnie podczas stanu zapalnego15. U myszy uczulenie skóry przy miejscowym stosowaniu oksazolonu powoduje wczesny wzrost mRNA IL-6 przy użyciu hybrydyzacji in situ36. Zarówno IL-6, jak i NGF były związane z C-II18,19, ale nie było doniesień opisujących poziomy mRNA lub białka dla IL-6 lub NGF konkretnie z naskórka podczas ostrych stadiów C-II.
Technika termolizyny jest tania i prosta do wykonania. Ponadto oddzielenie termolizyny naskórka od skóry właściwej pozwala na analizę mRNA, western blot i immunohistochemiczną mediatorów stanu zapalnego i czynników neurotroficznych podczas procesu zapalenia15. Badacze powinni być w stanie łatwo zastosować tę technikę zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych dotyczących zapalenia skóry.

<table><tbody><tr><td>&lambda;-karagen</td><td>Millipore Sigma</td><td>22049</td><td>Podskórne wstrzyknięcie karagenu wywołuje stan zapalny</td></tr><tr><td>7500 Szybki system PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4351107</td><td>do analizy RT-PCR</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (CaCl2), bezwodny</td><td>Millipore Sigma</td><td>499609</td><td>Zapobiega autolizie termolizyny</td></tr><tr><td>Kryształowe wodne medium</td> <td>montażoweMillipore Sigma</td><td>C0612</td><td>Wodne podłoże montażowe po barwieniu błękitem toluidyny</td></tr><tr><td>Osioł anty-mysz Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-31570</td><td>Przeciwciało drugorzędowe do immunohistochemii</td></tr><tr><td>Osioł anty-królik IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td>Przeciwciało drugorzędowe do immunohistochemii</td></tr><tr><td>Zmodyfikowany orzeł Dulbecco Pożywka</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>11966-025</td><td>Aby utrzymać integralność tkanek</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Millipore Sigma</td><td>E6758</td><td>Zatrzymuje reakcję termolizyny</td></tr><tr><td>Wirus białaczki mysiej Moloneya (M-MLV) Odwrotna transkryptaza</td><td>Promega</td><td>M1701</td><td>Do komplementarnej syntezy DNA</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-NGF (E-12)</td> Santa <td>Cruz Biotechnology</td><td>sc-365944</td><td>Dla neurotrofiny immunohistochemia</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>Aby opóźnić wygaszanie immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Królik anty-PGP 9.5</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL7756AP</td><td>Do śródnaskórkowego barwienia nerwów</td></tr><tr><td>SAS Sprague Dawley Rat</td><td>Charles River</td><td>Strain Code 400</td><td>Zwierzę wykorzystywane do badań nad stanem zapalnym</td></tr><tr><td>Shandon M-1 Embedding Matrix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1310TS</td><td>Macierz do zatapiania tkanek do barwienia i immunohistochemii</td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A24811</td><td>Do analizy RT-PCR</td></tr><tr><td>SYBR Select Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472908</td><td>Do analizy RT-PCR</td></tr><tr><td>Thermolysin</td><td>Millipore Sigma</td><td>T7902</td><td>Z Geobacillus stearothermophilus</td></tr><tr><td>Toluidyna Blue</td><td>Millipore Sigma</td><td>89640</td><td>Do barwienia tinctorial do mikroskopii w jasnym polu</td></tr><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Do całkowitej ekstrakcji RNA do RTPCR</td></tr></tbody></table>

oddzielenie naskórka i skóry właściwej szczura za pomocą termolizyny w celu wykrycia mrna i białka zapalnego specyficznego dla miejsca

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

Łatwe w użyciu i niedrogie techniki są potrzebne do określenia specyficznej dla danego miejsca produkcji mediatorów stanu zapalnego i neurotrofin podczas urazów skóry, stanów zapalnych i/lub uczulenia. Celem tego badania jest opisanie protokołu separacji naskórkowo-skórnej z wykorzystaniem termolizyny, proteinazy aktywnej w temperaturze 4 °C. Aby zilustrować tę procedurę, szczury Sprague Dawley są znieczulane, a prawe tylne łapy są wstrzykiwane karagenem. Sześć i dwanaście godzin po wstrzyknięciu szczury z zapaleniem i szczury naiwne są poddawane eutanazji, a kawałek tylnej łapy, nagiej skóry umieszcza się w zimnym zmodyfikowanym podłożu Dulbecco. Naskórek jest następnie oddzielany na błonie podstawnej od skóry właściwej za pomocą termolizyny w PBS z chlorkiem wapnia. Następnie skóra właściwa jest zabezpieczana kleszczykami mikrodyparacyjnymi, a naskórek jest delikatnie drażniony. Zabarwienie skrawków tkanek niebieskim toluidyną pokazuje, że naskórek jest czysto oddzielony od skóry właściwej na błonie podstawnej. Wszystkie warstwy komórek keratynocytów pozostają nienaruszone, a grzbiety rete naskórka wraz z wgłębieniami w brodawkach skórnych są wyraźnie widoczne. Jakościowy i rzeczywisty RT-PCR służy do określania poziomu czynnika wzrostu nerwów i ekspresji interleukiny-6. Western blot i immunohistochemia są ostatecznie wykonywane w celu wykrycia ilości czynnika wzrostu nerwów. Raport ten ilustruje, że trawienie termolizyną na zimno jest skuteczną metodą oddzielania naskórka od skóry właściwej w celu oceny zmian mRNA i białek podczas stanu zapalnego.

Wstrzyknięcie karagenianu do tylnej łapy szczura wywołało klasyczne objawy stanu zapalnego, takie jak zaczerwienienie i obrzęk16,17. Obrzęk tylnej łapy mierzono za pomocą suwmiarki mechanicznej20. Dla każdego szczura wyznaczono wartość bazową grubości łapy przed podaniem karagenianu, a następnie dokonano ponownych pomiarów po 6 h i 12 h. Odnotowano istotny wzrost grubości łapy w porównaniu z wartościami bazowymi (Rysun...

Prezentowany tutaj jest protokół oddzielania naskórka od skóry właściwej w celu oceny produkcji mediatorów stanu zapalnego. Po zapaleniu naskórek tylnej łapy szczura jest oddzielany od skóry właściwej za pomocą termolizyny w temperaturze 4 °C. Naskórek jest następnie wykorzystywany do analizy mRNA metodą RT-PCR oraz oceny białka metodą western blot i immunohistochemii.

Oddzielenie naskórka i skóry właściwej szczura za pomocą termolizyny w celu wykrycia mRNA i białka zapalnego specyficznego dla miejsca

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

Nasz protokół jest łatwą w użyciu i niedrogą techniką separacji naskórkowo-skórnej do określania specyficznej dla miejsca produkcji mediatorów stanu zapalnego i neurotrofin podczas zapalenia skóry. Główną zaletą tej techniki jest to, że enzymatyczne oddzielenie naskórka od skóry właściwej odbywa się w czterech stopniach Celsjusza, przy zachowaniu integralności mRNA i białka. Metoda ta zapewnia wgląd w typy mediatorów, które uwrażliwiają pierwotne zakończenia doprowadzające podczas ostrego i przewlekłego stanu zapalnego w celu opracowania nowych interwencji terapeutycznych.Gojenie się ran, choroby skóry, przewlekłe rany i oparzenia mogą skorzystać z tych badań. Metodę tę można zastosować do innych powierzchni nabłonkowych, takich jak przewód pokarmowy i rogówka. Optymalny czas separacji może się nieznacznie różnić w zależności od laboratorium.Zaleca się wstępny eksperyment porównujący różne punkty czasowe w połączeniu z oceną morfologii 2D w celu określenia jakości separacji. Po potwierdzeniu braku reakcji na odruch pedałowania u znieczulonego ośmio- do dziewięciotygodniowego szczura Sprague Dawley, wstrzyknij podskórnie w prawą nagą tylną łapę 100 mikrolitrów karagenu 1X Lambda rozcieńczonego w PBS. Za pomocą suwmiarki należy zmierzyć grubość śródstopia tylnej łapy bezpośrednio przed wstrzyknięciem oraz po 6 i 12 godzinach od wstrzyknięcia, aby określić objętość obrzęku w odpowiedzi na bodziec.W odpowiednim punkcie końcowym doświadczenia użyj ostrego skalpela, aby zebrać jeden na dwa milimetrowe kawałki nagiej skóry tylnej łapy z wstrzykniętej łapy i użyj kleszczy do mikrodysekcji, aby przenieść skórę do jednego mililitra zimnego DMEM w probówce mikrowirówkowej na lodzie przez 15 do 60 minut. Podczas inkubacji tkanki dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanej aktywowanej termolizyny do 10 dołków 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej na lodzie. Pod koniec inkubacji użyj kleszczy do mikrodysekcji, aby przenieść jedną próbkę skóry do każdej studzienki aktywowanej termolizyny, warstwą rogową rogówki do góry, bez zanurzania próbek w roztworze.Bardzo ważne jest, aby skóra nie była zanurzona w termolizynie i aby warstwa rogowa naskórka była skierowana do góry, aby uzyskać skuteczne oddzielenie. Po dwóch do trzech godzinach użyj kleszczy do mikrodysekcji, aby zanurzyć jedną próbkę skóry w siedmiu do ośmiu mililitrach DMEM o czterech stopniach Celsjusza na szalce Petriego, aby zapewnić więcej miejsca na oddzielenie się naskórka od skóry właściwej. Za pomocą kleszczy delikatnie przeczesuj naskórek na obwodzie skóry, aż na granicach próbki pojawi się prawie przezroczysty naskórek.Gdy naskórek zauważalnie oddzieli się od skóry właściwej, ostrożnie chwyć każdą warstwę skóry pojedynczą parą kleszczy i powoli wyciągnij naskórek ze skóry właściwej, a następnie oceń przezroczystość izolowanego naskórka za pomocą mikroskopii świetlnej, aby upewnić się, że jest optycznie spójny. Jeśli warstwy zostały odpowiednio oddzielone, umieść tkanki naskórka i skóry właściwej w indywidualnych pojemnikach z pięciomilimolowym EDTA w DMEM w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 30 minut. Po dezaktywacji termolizyny utrwalić część naskórka w odpowiednim utrwalaczu na jedną godzinę w temperaturze pokojowej ze mieszaniem.Pod koniec inkubacji umieścić utrwaloną tkankę w 10% sacharozie w PBS na jedną godzinę w temperaturze pokojowej z mieszaniem, a następnie zamrozić próbkę w odpowiedniej matrycy do zatapiania tkanek w celu sekcji. Za pomocą kriostatu uzyskaj przekroje o grubości 14 mikrometrów i rozmroź je na szkiełkach mikroskopowych pokrytych żelatyną. Po wysuszeniu na podgrzewaczu do szkiełek należy zabarwić próbki roztworem roboczym błękitu toluidynowego przez 90 sekund.Następnie delikatnie zmyć błękit toluidynowy ze szkiełek za pomocą PBS i przeciwstawić szkiełka nakrywkowe wodnym podłożem montażowym, a następnie obserwować naskórek za pomocą mikroskopii Brightfield w powiększeniu od 50 do 250x. Wstrzyknięcie karagenu w tylną łapę szczura powoduje klasyczne objawy zapalenia, takie jak zaczerwienienie i obrzęk zarówno po 6, jak i 12 godzinach od wstrzyknięcia. Mikroskopia jasnego pola może być wykorzystana do oceny skuteczności separacji termolizyny naskórka i skóry właściwej nagiej skóry tylnej łapy szczura.Rzeczywiście, niebieskie zabarwienie przekrojów naskórka pokazuje, że naskórek jest oddzielony od skóry właściwej na błonie podstawowej, ale grzbiety Rete naskórka i wgłębienia z brodawki skórnej pozostają nienaruszone. Ponadto obserwuje się wszystkie warstwy komórek keratynocytów. Western blot naskórka oddzielonego termolizyną daje spójne wyniki, wskazując na stabilny poziom białka podczas techniki w temperaturze czterech stopni Celsjusza.W naiwnym naskórku szczura wykrywa się bardzo mało białka NGF, ale poziom białka NGF jest znacznie podwyższony po sześciu godzinach zapalenia wywołanego karagenem. 12 godzin po wstrzyknięciu poziomy NGF są zmniejszone w porównaniu z obserwowanymi po sześciu godzinach, ale pozostają podwyższone w porównaniu z grupą kontrolną. Zgodnie z oczekiwaniami wynikającymi z analizy Western blot, immunoreaktywność NGF nie jest wykrywana w naiwnych próbkach tkanki kontrolnej naskórka, ale po sześciu godzinach od zapalenia wywołanego karagenem immunoreaktywność NGF obserwuje się w większości keratynocytów warstwy ziarnistej i warstwy jasnej.Kilka komórek w warstwie kolczastej jest również immunoreaktywnych NGF. W przypadku stosowania termolizyny do izolacji nienaruszonego naskórka należy pamiętać, że optymalny czas separacji musi być empirycznie określony przez użytkownika końcowego. Różne techniki proteomiczne i molekularne mogą być stosowane do walidacji ekspresji określonych białek i/lub transkryptów genów pierwotnych, aby potwierdzić, że procedura ta nie zmienia ekspresji podstawowej.Ta technika separacji naskórkowo-skórnej pozwoli naukowcom odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące specyficznej dla miejsca ekspresji neurotrofin i mediatorów stanu zapalnego w różnych modelach zapalenia skóry. Kwas pikrynowy i paraformaldehyd są niebezpieczne. Pracuj z obiema substancjami chemicznymi w dygestorium, używaj osobistej odzieży ochronnej i rękawic, a po użyciu umyj twarz i ręce.

separation-rat-epidermis-dermis-with-thermolysin-to-detect-site

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy artykuł opisuje prosty model stymulacji angiogenezy w krezce szczura. Model ten powoduje gwałtowny wzrost pączkowania naczyń włosowatych, powierzchni naczyniowej oraz gęstości naczyń w stosunkowo krótkim czasie, w tkance umożliwiającej wizualizację en face całych sieci mikronaczyniowych aż do poziomu pojedynczej komórki.

Eksterioryzacja krezki szczura: model do badania dynamiki komórkowej zaangażowanej w angiogenezę

Skóra jest domem dla złożonej sieci komórek odpornościowych. Opisujemy skuteczną metodologię trawienia skóry myszy z różnych części ciała zwierzęcia w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej i analizy różnych populacji leukocytów znajdujących się w skórze za pomocą cytometrii przepływowej.

Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych do analizy cytofluorymetrycznej z różnych obszarów skóry myszy

Ten protokół opisuje enzymatyczne trawienie skóry myszy w pożywce bogatej w składniki odżywcze, a następnie separację gradientową w celu wyizolowania leukocytów.  Uzyskane w ten sposób ogniwa mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań końcowych. Jest to skuteczna, ekonomiczna i ulepszona alternatywa dla maszyn do dysocjacji tkanek i ostrzejszych protokołów trawienia tkanek opartych na trypsynie i dyspazie.

Izolacja naciekających leukocytów ze skóry myszy za pomocą trawienia enzymatycznego i separacji gradientowej

Opisujemy izolację macierzy zewnątrzkomórkowej serca od myszy kontrolnych C57Bl/6J, myszy o napiętej skórze i myszy o napiętej skórze leczonych peptydem hamującym IRF5. Opisujemy również badania rozszerzenia naczyń krwionośnych na izolowanych naczyniach od C57Bl / 6J, myszy o napiętej skórze i myszy o napiętej skórze leczonych peptydem hamującym IRF5.

Rozszerzenie naczyń krwionośnych izolowanych naczyń krwionośnych i izolacja macierzy zewnątrzkomórkowej myszy o napiętej skórze

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczura za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Metoda ta nadaje się do badania profilu ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczura w kilku stanach patologicznych.

Wykrywanie ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczurów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Tutaj opisujemy protokół powtarzalnej mikrodysekcji laserowej (LCM) do izolowania siatki beleczkowej (TM) do dalszej analizy RNA. Możliwość analizowania zmian w ekspresji genów w TM pomoże w zrozumieniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw chorób oczu związanych z TM.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji siatki beleczkowej o wysokiej czystości z oczu myszy do analizy ekspresji genów

Ten manuskrypt opisuje oparty na FACS protokół izolacji brodawkowatych i siateczkowatych fibroblastów z ludzkiej skóry. Omija hodowlę in vitro, która była nieunikniona w przypadku powszechnie stosowanego protokołu izolacji za pomocą kultur eksplantatów. Emanujące podzbiory fibroblastów są funkcjonalnie odrębne i wykazują zróżnicowaną ekspresję i lokalizację genów w skórze właściwej.

Izolacja fibroblastów brodawkowatych i siatkowatych ze skóry ludzkiej za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Metoda rozdrabniania kriogenicznego do przetwarzania mysich łap za pomocą młyna zamrażającego ciekły azot została opracowana w celu poprawy wydajności i jakości RNA lub białka ekstrahowanego z tkanek i umożliwienia analizy profili molekularnych związanych z reakcjami zapalnymi.

Protokół krio-proszkowania do przetwarzania łap myszy w celu oceny molekularnych szlaków zapalenia tkanek w modelu zapalenia stawów wywołanego kolagenem

Ten protokół przedstawia dwie techniki izolowania subkomórkowych przedziałów fotoreceptorów mysich pręcików do analizy białek. Pierwsza metoda wykorzystuje żywe siatkówki i celulozową bibułę filtracyjną do oddzielenia zewnętrznych segmentów pręcika, podczas gdy druga wykorzystuje liofilizowane siatkówki i taśmę klejącą do odklejania wewnętrznych i zewnętrznych warstw segmentów pręcika.

Dwie metody peelingu do izolacji przedziałów komórek fotoreceptorowych w siatkówce myszy w celu analizy białek

Ten artykuł opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka z naczyń włosowatych limfatycznych skóry za pomocą kulek magnetycznych. Wyizolowane komórki śródbłonka limfatycznego można wykorzystać do dalszych eksperymentów in vitro i analizy ekspresji białek.

Mysia izolacja komórek śródbłonka limfatycznego skóry

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Poznaj metodę enzymatycznego rozdziału naskórka i skóry właściwej szczura przy użyciu termolizyny w temperaturze 4°C, zachowującą integralność mRNA i białek do analizy zapalnych mediatorów.

Oddzielenie naskórka i skóry właściwej szczura za pomocą termolizyny w celu wykrycia mRNA i białka zapalnego specyficznego dla miejsca (Wideo) | JoVE Journal

Oddzielenie naskórka i skóry właściwej szczura za pomocą termolizyny w celu wykrycia mRNA i białka zapalnego specyficznego dla miejsca

Przeglądaj więcej filmów