Name: Pan-lyssavirus RT-PCR w czasie rzeczywistym do diagnozowania wścieklizny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Poznaj metodę RT-PCR w czasie rzeczywistym do diagnozowania wścieklizny Lyssavirus w próbkach klinicznych. Ta czuła technika molekularna umożliwia wykrywanie nawet 10 pikogramów wirusa w próbkach przed- i pośmiertnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Pannomie Wise i Pannie Megan Golding za pomoc w ukończeniu eksperymentów. Opracowanie tego protokołu było wspierane finansowo przez brytyjski Departament Środowiska, Żywności i Spraw Wiejskich (Defra), rząd Szkocji i rząd walijski poprzez granty [SV3500 i SE0431] oraz przez projekt European Virus Archive global (EVAg), który otrzymał finansowanie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr 653316.

Próbki z materiału diagnostycznego otrzymanego w APHA po naturalnym zakażeniu, lub uzyskane przez inokulację myszy przy użyciu protokołów ocenionych przez komisję etyki i statystyki APHA zgodnie z przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych na podstawie licencji 70/7394.
1. Kwantyfikacja RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego
<ol>
	<li>Upewnij się, że ustawienia spektrofotometru są ustawione na RNA.</li>
	<li>Użyj 1-2 μl wody molekularnej, aby zainicjować maszynę i ustawić linię bazową.</li>
	<li>Użyj 1-2 μl każdej badanej próbki RNA, aby ocenić ilość RNA.</li>
	<li>Zapisz odczyty i dokumentuj.</li>
	<li>W razie potrzeby dostosować RNA do 1 μg/μl. 
	nuta: RNA musi być przez cały czas przechowywane na lodzie (lub w chłodnym bloku). Jeśli RNA jest otrzymywany przy użyciu metody kolumnowej lub perełkowej, RNA jest zwykle mniejszy niż 1 μg/μL. W takiej sytuacji użyj RNA schludnie.</li>
</ol>
2. Przygotowanie serii rozcieńczeń RNA w celu określenia czułości punktu końcowego
<ol>
	<li>Wykonaj 10-krotne seryjne rozcieńczenie RNA.
	<ol>
		<li>Oznaczyć probówki serią rozcieńczeń (np. 10-1, 10-2 itd.) i szczegółami RNA.</li>
		<li>Do każdej probówki dodać 45 μl wody molekularnej.</li>
		<li>Dodać 5 μl RNA (uprzednio rozcieńczonego do 1 μg/μl) i dobrze wymieszać.</li>
		<li>Wyrzuć końcówkę pipety do odpowiedniego środka dezynfekującego i zastąp ją świeżą końcówką.</li>
		<li>Weź 5 μl z 10-1 probówki i dodaj do 10-2 probówki i dobrze wymieszaj.</li>
		<li>Powtórzyć czynności 2.1.3-2.1.5 z pozostałymi rozcieńczeniami. 
		nuta: RNA musi być przez cały czas przechowywane na lodzie (lub w chłodnym bloku).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie reakcji RT-PCR w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Korzystając z arkusza kalkulacyjnego, zaplanuj układ płytek zgodnie z liczbą próbek testowych i próbek kontrolnych, zarówno dla testów na wirusa lyssa, jak i ß-aktyny. 
	nuta: Jeżeli 4 próbki mają być badane podwójnie z kontrolą dodatnią i ujemną, odpowiada to 10 reakcjom dla obu testów.</li>
	<li>W "pomieszczeniu czystym" lub obszarze oddzielonym od matrycy RNA przed użyciem przetrzyj powierzchnie odpowiednim środkiem dezynfekującym lub przygotuj stację roboczą do PCR (jeśli używasz). Aby przygotować stanowisko pracy, należy przetrzeć powierzchnię szafy odpowiednim środkiem dezynfekującym i umieścić potrzebne przedmioty na stanowisku pracy i zamknąć drzwi. Włącz światło UV na 10 minut</li>
	<li>Wyjmij regenty i startery z zamrażarki i rozmroź (odczynniki wymienione w tabeli 1 i startery w tabeli 2). 
	nuta: Mieszanina enzymów jest przechowywana w glicerolu, więc nie wymaga rozmrażania i musi być przez cały czas przechowywana na lodzie (lub w chłodnym bloku). Wszystkie inne odczynniki można rozmrażać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po rozmrożeniu wymieszaj odczynniki i krótko odwiruj, aby zebrać płyn. 
	nuta: Nie mieszaj mieszanki enzymów, tylko krótko odwiruj.</li>
	<li>Przygotować oddzielne mieszanki wzorcowe dla lizsywirusa i ß-aktyny. Do każdej reakcji dodać 7,55 μl wody molekularnej, 10 μl 2x uniwersalnej zielonej mieszanki reakcyjnej SYBR, 0,6 μl startera do przodu, 0,6 μl startera odwrotnego, 0,25 μl mieszanki enzymatycznej iTaq RT.
	<ol>
		<li>Użyj arkusza kalkulacyjnego do obliczenia prawidłowych objętości, aby uniknąć błędów w ręcznym obliczaniu. Upewnij się, że przygotowana jest wystarczająca ilość mieszanki wzorcowej, aby skompensować błąd pipetowania. Dlatego, jeżeli wymaganych jest 10 reakcji (patrz UWAGA w ppkt 3.1), należy przygotować 12 reakcji</li>
		<li>Przygotuj mieszankę wzorcową na lodzie (lub w chłodnym bloku) i pozostań na lodzie do momentu umieszczenia w maszynie czasu rzeczywistego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymieszać przygotowane mieszanki wzorcowe, krótko odwirować i dozować 19 μl do odpowiednich dołków w probówkach paskowych lub na 96-dołkowej płytce kompatybilnej z używaną maszyną działającą w czasie rzeczywistym. 
	nuta: Zminimalizuj wytwarzanie pęcherzyków powietrza w studzienkach podczas pipetowania.</li>
	<li>W oddzielnym pomieszczeniu lub w komorze UV przygotowanej zgodnie z opisem w ppkt 3.2, ostrożnie dodać 1 μl RNA uprzednio dostosowanego do 1 μg/μl (patrz krok 1.5) poniżej powierzchni odpowiedniej studzienki wzorcowej i delikatnie wymieszać. Wyrzuć końcówkę pipety do środka dezynfekującego bezpośrednio po użyciu (pod powierzchnią).
	<ol>
		<li>Dodać kontrole po próbkach testowych, z kontrolą pozytywną dodaną jako następną i kontrolą bez matrycy (NTC – woda o jakości cząsteczkowej) dodaną na końcu. Ilość użytego RNA może być zmieniona w zależności od rodzaju próbki i zastosowanej ekstrakcji RNA. Użyta ilość musi zostać zweryfikowana, aby zapewnić optymalizację reakcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uszczelnić płytkę za pomocą wieczek paskowych lub zgrzewarki, zwracając uwagę, aby upewnić się, że wszystkie pokrywki są szczelnie zamknięte i wystarczająco oznaczone, aby można było zorientować próbki. Oznacz krawędź rurki z płytą/paskiem.</li>
	<li>Odwiruj próbki za pomocą wirówki, aby zebrać całą ciecz na dnie studzienek.</li>
	<li>Przenieś płytkę do maszyny do PCR w czasie rzeczywistym, otwórz drzwi i umieść w uchwycie, zapewniając prawidłowe położenie/orientację próbek zgodnie z układem płytki. 
	nuta: Jeśli używane są paski rurowe, upewnij się, że uchwyt jest na swoim miejscu.</li>
	<li>Otwórz program maszyny do PCR w czasie rzeczywistym i wybierz opcję eksperymentu SYBR w czasie rzeczywistym z krzywą dysocjacji. Zaprogramować maszynę do PCR w czasie rzeczywistym, korzystając z warunków cykli termicznych określonych w tabeli 3, w tym punktów gromadzenia danych.</li>
	<li>Wybierz SYBR jako barwnik fluorescencyjny i wybierz nieznany jako typ próbki i wstaw nazwę w odpowiednim polu nazwy próbki. 
	nuta: Rozróżnij między powtórzeniami, a także między studzienkami lyssawirusa i ß-aktyny.</li>
	<li>Wybierz lokalizację pliku, aby zapisać dane eksperymentalne, upewnij się, że lampa zostanie wyłączona po zakończeniu przebiegu, a następnie rozpocznij uruchamianie. 
	nuta: Ponieważ pierwszym krokiem jest stage RT, w tym czasie nie są zbierane żadne dane, dlatego jeśli lampa wymaga okresu nagrzewania, może to nastąpić podczas etapu RT. Maszyna i oprogramowanie działające w czasie rzeczywistym będą wyświetlać krzywe wzmocnienia w czasie rzeczywistym, podczas gdy krzywa topnienia zostanie wygenerowana pod koniec cyklu.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Po zakończeniu przebiegu przeprowadź analizę danych w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Najpierw przeanalizuj wyniki wykresu amplifikacji próbek testowych wraz z próbkami kontrolnymi. Próbki dodatnie wykazują rampy wykładnicze, po których zwykle następuje plateau i wartość Ct. Próbki ujemne mają płaskie wykresy amplifikacji bez wartości Ct (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Wartość Ct jest automatycznie obliczana przez oprogramowanie, chociaż należy ją sprawdzić i w razie potrzeby ręcznie zmienić.</li>
		<li>Po drugie, przeanalizuj wyniki krzywej dysocjacji próbek testowych wraz z próbkami kontrolnymi. Próbka dodatnia będzie miała temperaturę topnienia (Tm) 77 – 80 °C i będzie pokrywać się z kontrolą pozytywną <silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Uzyskaj ogólny wynik diagnostyczny, upewniając się, że kontrole są prawidłowe. Tabelę 4 należy wykorzystać do interpretacji wyników w odniesieniu do wewnętrznej kontroli ß-aktyny. Jeżeli dodatnie próbki kontrolne są ujemne i/lub próbki ujemne są dodatnie, serię nie należy brać pod uwagę.</li>
		<li>Zapisać wartości Ct i Tm uzyskane dla kontrolnego RNA na "karcie kontrolnej", aby umożliwić analizę tendencji i pomóc w identyfikacji odchyleń czułości testu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>OIE. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OIE+Terrestrial+Manual+2018%22">OIE Terrestrial Manual 2018</a>. , 8-14 (2018).</li>
<li>Panning, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+rabies+virus+reverse+transcription-PCR+and+virus+isolation+using+samples+from+a+patient+infected+with+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of rabies virus reverse transcription-PCR and virus isolation using samples from a patient infected with rabies virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2960-2962 (2010).</li>
<li>Wakeley, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+real-time%2C+TaqMan+reverse+transcription-PCR+assay+for+detection+and+differentiation+of+lyssavirus+genotypes+1%2C+5%2C+and+6%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a real-time, TaqMan reverse transcription-PCR assay for detection and differentiation of lyssavirus genotypes 1, 5, and 6.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (6), 2786-2792 (2005).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SYBR-green+I+quantitative+real-time+reverse+transcription-PCR+assay+for+rabies+viruses+with+different+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Virologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">A SYBR-green I quantitative real-time reverse transcription-PCR assay for rabies viruses with different virulence.</a> Virologica Sinica. 29 (2), 131-132 (2014).</li>
<li>Wadhwa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pan-Lyssavirus+Taqman+Real-Time+RT-PCR+Assay+for+the+Detection+of+Highly+Variable+Rabies+virus+and+Other+Lyssaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">A Pan-Lyssavirus Taqman Real-Time RT-PCR Assay for the Detection of Highly Variable Rabies virus and Other Lyssaviruses.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (1), e0005258(2017).</li>
<li>Nadin-Davis, S. A., Sheen, M., Wandeler, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+real-time+reverse+transcriptase+polymerase+chain+reaction+methods+for+human+rabies+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Development of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction methods for human rabies diagnosis.</a> Journal of Medical Virology. 81 (8), 1484-1497 (2009).</li>
<li>Hoffmann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+safety+for+molecular+diagnosis+of+classical+rabies+viruses+by+use+of+a+TaqMan+real-time+reverse+transcription-PCR+%22double+check%22+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Improved safety for molecular diagnosis of classical rabies viruses by use of a TaqMan real-time reverse transcription-PCR "double check" strategy.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3970-3978 (2010).</li>
<li>Faye, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+sensitive+real-time+RT-PCR+assay+for+broad+detection+of+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and validation of sensitive real-time RT-PCR assay for broad detection of rabies virus.</a> Journal of Virological Methods. 243, 120-130 (2017).</li>
<li>Dacheux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Combined+Real-Time+Reverse+Transcription+Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+the+Diagnosis+of+Lyssavirus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Dual Combined Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Assay for the Diagnosis of Lyssavirus Infection.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), e0004812(2016).</li>
<li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Rabies.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091(2017).</li>
<li>Marston, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ikoma+lyssavirus%2C+highly+divergent+novel+lyssavirus+in+an+african+civet%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Ikoma lyssavirus, highly divergent novel lyssavirus in an african civet.</a> Emerging Infectious Diseases. 18 (4), 664-667 (2012).</li>
<li>ICTV. Virus Taxonomy: 2018 Release: Email ratification October 2018 (MSL #33). , Available from:
 <a target="_blank" href="https://talk.ictvonline.org/taxonomy/">https://talk.ictvonline.org/taxonomy/</a> (2018).</li>
<li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle%2C+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Disease. 24 (4), 782-785 (2018).</li>
<li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland%5BTitle%5D)+AND+%22Transboundary+and+Emerging+Diseases%22%5BJournal%5D)">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li>
<li>Hayman, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+real-time+assay+for+the+detection+of+Lyssaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).</li>
<li>Calisher, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+relationships+among+rhabdoviruses+from+vertebrates+and+hematophagous+arthropods%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Antigenic relationships among rhabdoviruses from vertebrates and hematophagous arthropods.</a> Intervirology. 30 (5), 241-257 (1989).</li>
<li>Aznar-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+rhabdovirus+viral+RNA+in+oropharyngeal+swabs+and+ectoparasites+of+Spanish+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Detection of rhabdovirus viral RNA in oropharyngeal swabs and ectoparasites of Spanish bats.</a> Journal of General Virology. 94 (1), 69-75 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany test RT-PCR w czasie rzeczywistym pan-lyssavirus jest jednoetapowym testem z zamkniętą probówką, który wykrywa lyssawirusy we wszystkich trzech filogrupach. Test został zwalidowany zarówno do diagnozy wścieklizny u zwierząt, jak i u ludzi, w tym pośmiertnej tkanki mózgowej (optymalnie pnia mózgu) oraz próbek przedśmiertnych, takich jak biopsja skóry, seryjnie pobierana ślina lub płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF). Startery użyte w tym teście zostały po raz pierwszy zaprojektowane i wykorzystane do testu opartego na sondzie w celu rozróżnienia między RABV, EBLV-1 i EBLV-23, który był używany w wielu laboratoriach OIE zajmujących się wścieklizną i działa konsekwentnie w schematach biegłości EURL. Następnie potwierdzono "pan-lyssawirusowy" charakter tych starterów za pomocą dwuetapowego testu w czasie rzeczywistym15. Opisany tutaj test wykorzystał startery do dalszej optymalizacji RT-PCR w jednoetapowym teście SYBR, umożliwiając szybki system z zamkniętą probówką. Co więcej, szkolenie w krajach endemicznych dla wścieklizny przy użyciu tego testu potwierdziło przydatność do wdrożenia w każdym laboratorium z podstawowymi środkami ochrony osobistej i systemami jakości w celu zmniejszenia zanieczyszczenia krzyżowego i śladowymi próbkami, obiektami do przechowywania odczynników i maszyną do wykrywania SYBR w czasie rzeczywistym. Test jest niezwykle solidny i ma 100% korelację z FAT, z lepszą czułością dla rozłożonych próbek3. Jedną z głównych zalet testu opartego na barwniku interkalacyjnym DNA w porównaniu z testem opartym na sondzie jest względny koszt. Dodatkową korzyścią jest to, że test wykorzystuje tylko dwa startery, dzięki czemu istnieje mniejsze ryzyko nieudanego wykrycia z powodu rozbieżności sekwencji, co było słabością wcześniej opublikowanych testów opartych na sondzie. Rzeczywiście, przedstawiciele wszystkich gatunków wirusów lyssa (z wyjątkiem TWBLV i KBLV) są wykrywani za pomocą tego testu, a analiza sekwencji TWBLV i KBLV w miejscach starterów nie ujawnia istotnych rozbieżności, co zdecydowanie sugeruje, że zostaną one również wykryte przy użyciu tej metody. Można uznać, że zakres graniczny wykrywalności obserwowany w analizowanych wirusach wynika z dwóch głównych czynników. Pierwszym z nich jest to, że RNA zostało wyizolowane z klinicznego materiału mózgu, dlatego liczba kopii genomu w każdej nierozcieńczonej próbce nie jest bezpośrednio porównywalna. RNA "znormalizowano" poprzez dostosowanie całkowitego RNA do 1 μg/μL; jednak proporcja RNA genomu wirusa w tej próbce będzie się różnić. Drugim jest różnorodność sekwencji lyssawirusa, pomimo tego, że miejsca starterów znajdują się w regionach konserwatywnych, pozostają pozycje zmienności. Nic więc dziwnego, że większość lyssawirusów o niższej czułości dla testu to wirusy filogrupy II i III. Analiza krzywej dysocjacji stanowi istotny parametr, minimalizujący wynik fałszywie dodatni, który w przeciwnym razie mógłby wystąpić z powodu tworzenia dimerów starterów lub amplifikacji niespecyficznego regionu w genomie gospodarza. W rzeczywistości jest to rzadkie zjawisko, a analiza krzywej dysocjacji jest równoważna uruchomieniu żelu agarozowego w celu wizualizacji konwencjonalnych amplikonów RT-PCR o prawidłowej wielkości. Zakres dopuszczalnych wartości Tm został podany (77-80 °C) na podstawie danych zebranych w naszym laboratorium. Zdecydowanie zaleca się, aby poszczególne laboratoria zestawiały dane wewnętrzne, aby zapewnić możliwość przeniesienia zakresu i odpowiednio je zmieniały. Interpretacja wyników zarówno z wykresów amplifikacji, jak i dysocjacji, wraz z kontrolami dodatnimi i ujemnymi oraz wynikami ß-aktyny, umożliwia uzyskanie solidnych i powtarzalnych wyników diagnostycznych.
Poza zakresem tego protokołu znajduje się metoda ekstrakcji RNA stosowana w celu uzyskania wysokiej jakości RNA. Wszystkie RNA analizowane w tym protokole zostały przygotowane przy użyciu TRIzolu; jednak dostępnych jest wiele odpowiednich protokołów ekstrakcji RNA na bazie guanidu, w tym zestawy do ekstrakcji na bazie kolumn i kulek. Obchodzenie się z próbkami dodatnimi (lub podejrzanymi dodatnimi) wirusem lizy musi odbywać się w licencjonowanych obiektach hermetyczności biologicznej zatwierdzonych w danym kraju. Jednak całkowity wyekstrahowany RNA jest niezakaźny, dlatego jest przetwarzany w laboratoriach o niskiej hermetyzacji. W zależności od zastosowanej metody ekstrakcji należy ocenić wymóg ilościowego oznaczania i rozcieńczania RNA. W przypadku ekstrakcji na bazie fenolu, w tym TRIzolu, etap ten jest wymagany i zapobiega zahamowaniu testu przed zanieczyszczeniem gDNA; jednak ekstrakcje kolumnowe i perełkowe (szczególnie te z etapem zubożenia DNA) nie wymagają rozcieńczania przed badaniem.
W całym protokole ważne jest, aby zachować ostrożność i staranność, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu i dokładnemu dodawaniu próbki do odpowiednich studzienek. Arkusz kalkulacyjny z obliczeniami odczynnika i układem płytki jest dostępny do pobrania jako plik uzupełniający. Dobra praktyka laboratoryjna, w tym czyste powierzchnie robocze, regularna zmiana rękawic, stosowanie końcówek barierowych i różnych pomieszczeń/szaf UV w celu oddzielenia każdego etapu, zminimalizuje ryzyko zanieczyszczenia. Aby upewnić się, że badanie przebiega z oczekiwanymi parametrami, należy uwzględnić kontrole dodatnie i ujemne, a wszystkie próbki do badań należy przeprowadzić w dwóch powtórzeniach (lub trzech egzemplarzach).
Włączenie kontroli jest istotną cechą każdego PCR, szczególnie w diagnostyce. RNA kontroli pozytywnej przygotowano z mózgów myszy zakażonych CVS (Challenge Virus Standard) w partiach, a następnie zwalidowano i skalibrowano w celu zapewnienia spójności między partiami. Kontrolny RNA oznaczono ilościowo i rozcieńczono do 1 μg/μl. RNA, dla którego uzyskano pozytywny wynik w seryjnym rozcieńczeniu do co najmniej 10-4 (równego 100 pg/μl) uznano za odpowiednie do celu. RNA kontroli dodatniej przechowywano w temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach 10-1 . W razie potrzeby podwielokrotność rozcieńczano w stosunku 1:100 w celu uzyskania zapasu roboczego w stężeniu 1 ng/μl i przechowywano w temperaturze -80 °C w 5 μl podwielokrotności jednorazowego użytku. Rozcieńczony RNA kontroli dodatniej użyto do przedstawienia próbek dodatnich o niskim poziomie i do zapewnienia, że wykryto jakiekolwiek zmniejszenie czułości testu. Dla każdej kontroli prowadzono "kartę kontrolną" w celu monitorowania wartości Ct i identyfikacji tendencji (tabela 5). W tabeli 5 wykazano dobrą porównywalność między cyklami dla wartości Ct i Tm próbki kontroli dodatniej CVS w wielu dniach i u operatorów, co daje pewność, że test jest solidny i powtarzalny. Wyniki, które odbiegają od tych pomiarów, należy zbadać i w razie potrzeby powtórzyć badania próbek. Woda molekularna została włączona do każdego cyklu jako NTC, aby potwierdzić, że odczynniki są wolne od zanieczyszczenia RNA wirusa lyssawirusa i potwierdzić ujemną próbkę. Ponadto, aby zapewnić skuteczność ekstrakcji RNA, ß-aktynę testowano wraz z próbkami testowymi w osobnej probówce. RNA kontroli pozytywnej wirusa lyssawirusa wykorzystano również do kontroli pozytywnej ß-aktyny. Można wykorzystać inne endogenne geny lub heterologiczne systemy kontroli wewnętrznej. Zastosowanie tych kontroli zapewniło, że wszystkie etapy były analizowane w tych samych warunkach, co próbki testowe. Czasami, jeśli próbka była wysoce zdegradowana lub nie zawierała wystarczającej ilości RNA gospodarza (takiego jak ślina lub płyn mózgowo-rdzeniowy), endogenny gen PCR może się nie powieść. W tym przypadku, gdy wynik RT-PCR lyssawirusa w czasie rzeczywistym był pozytywny, potwierdzenie niezależnej ekstrakcji RNA - w celu wykluczenia zanieczyszczenia podczas ekstrakcji RNA na oryginalnym teście lub przez test wtórny (molekularny, taki jak konwencjonalny RT-PCR) lub FAT. Wykorzystanie tabeli 4 podczas analizy próbki diagnostycznej zapewniło prawidłową interpretację.
Niezależnie od testu molekularnego zastosowanego do potwierdzenia zakażenia wścieklizną, należy również podjąć dalsze badania z wykorzystaniem sekwencjonowania Sangera w celu określenia gatunku wirusa lyssa i klasycznych technik wirusologicznych, takich jak FAT lub izolacja wirusa, aby umożliwić dalszą charakterystykę wirusa i wesprzeć powiadamianie o pozytywnych przypadkach do OIE i WHO.

Diagnoza wścieklizny przy użyciu metodologii molekularnych została zaakceptowana przez OIE w 2018 roku1, uznając zalety tych technik w potwierdzaniu przypadków wścieklizny, szczególnie w sytuacjach, gdy próbki są nieoptymalne, lub do diagnozy przedśmiertnej, ponieważ nie ma wymogu żywego wirusa lub świeżych próbek. Testy PCR dla lyssawirusów wymagają odwrotnej transkrypcji (RT) przed rozpoczęciem PCR, ponieważ genom jest RNA. Testy RT-PCR, które wykrywają proksymalny region 3' genomu, są uważane za najbardziej czułe, ponieważ podczas replikacji wirusa lyssa występują gradienty transkrypcyjne. Powszechnie stosowane testy RT-PCR można ogólnie podzielić na dwie kategorie: punktowe końcowe (lub żelowe) i działające w czasie rzeczywistym. Oba podejścia są wrażliwe i specyficzne; Jednak test w czasie rzeczywistym ma pewne dodatkowe korzyści, takie jak uzyskiwanie wyników w czasie rzeczywistym i przeprowadzanie w całkowicie zamkniętym systemie probówkowym, co zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia operatora. Istnieją dwa główne podejścia do wykrywania amplikonów specyficznych dla wirusa lyssa uzyskanych za pomocą testów w czasie rzeczywistym. Pierwsza z nich wykorzystuje sondy hydrolizy (takie jak sondy TaqMan), które zawierają fluorofor i wygaszacz. Gdy sonda wiąże się z obszarem docelowym podczas amplifikacji, aktywność egzonukleazy polimerazy powoduje dysocjację fluoroforu i wygaszania, umożliwiając pomiar uzyskanej fluorescencji. Drugi wykorzystuje barwnik interkalacyjny DNA (fluorochrom, taki jak SYBR Green), który wiąże się z dwuniciowym DNA podczas amplifikacji. Związane fluorochromy emitują fluorescencję, która jest wykrywana w każdym cyklu, umożliwiając wykrywanie i kwantyfikację produktu w czasie rzeczywistym. Ze względu na niespecyficzny charakter wiązania z dowolnym dsDNA, przeprowadza się analizę krzywej dysocjacji w celu potwierdzenia swoistości reakcji. RT-PCR w czasie rzeczywistym są szybkie ze względu na małe rozmiary amplikonów, zwykle mniej niż 200 pz długości; Jednak zidentyfikowanie odpowiednich regionów do zaprojektowania starterów i sond w regionach chronionych może okazać się wyzwaniem, dlatego wyeliminowanie wymogu stosowania sondy jest wyraźną zaletą.
Wiele testów RT-PCR w czasie rzeczywistym zostało zaprojektowanych specjalnie do wykrywania poszczególnych szczepów lub linii RABV2, a także do wykrywania lyssawirusów w całym rodzaju3,4,5,6,7,8,9. Wszystkie testy będą miały granicę wykrywalności zależną od tego, jak konserwatywne są sekwencje starterów (i, jeśli to konieczne, sondy) w całym rodzaju. Rzeczywiście, pojawiające się lub nowe szczepy wirusa mogą sprawić, że wysoce specyficzne testy oparte na sondach staną się nieskuteczne. Wybór detekcji w czasie rzeczywistym (barwnik vs. sonda) będzie zależał od zamierzonego zastosowania. Dla laboratorium prowadzącego nadzór nad lokalnie pozyskiwanym materiałem mózgowym i spodziewającego się dużej liczby próbek ujemnych, użycie tańszego barwnika interkalacyjnego jest rozsądnym wyborem. Podejście SYBR Green byłoby również optymalne w przypadku prowadzenia nadzoru skaningowego, w którym obecność nowych lub rozbieżnych lyssawirusów nie zostałaby wykryta przez bardziej ograniczone testy oparte na sondach.
Wszyscy członkowie rodzaju Lyssavirus wywołują chorobę wścieklizny, która jest śmiertelna po pojawieniu się objawów. Zdecydowana większość przypadków wścieklizny u ludzi i zwierząt jest spowodowana wirusem wścieklizny (RABV), którego dominującym rezerwuarem jest pies domowy10. Nietoperze są ważnymi rezerwuarami żywicielskimi dla lyssawirusów i wszystkie scharakteryzowane gatunki lyssawirusa z wyjątkiem dwóch zostały zidentyfikowane bezpośrednio u nietoperzy - Ikoma lyssavirus (IKOV) i wirus Mokola (MOKV) - i spekuluje się, że z tych dwóch, IKOV ma rezerwuar gospodarza nietoperzy11. Oprócz 16 uznanych gatunków lyssawirusów12, istnieją dwa lyssawirusy, które zostały niedawno opisane: Taiwan bat lyssavirus (TWBLV)13 i Kotalahti bat lyssavirus (KBLV)14. Lyssawirusy można genetycznie podzielić na trzy filogrupy, przy czym większość lyssawirusów, w tym RABV, należy do filogrupy I. Jednak najbardziej rozbieżne lizsawirusy należą do filogrupy III i jest mało prawdopodobne, aby zostały wykryte przez RT-PCR przeznaczone do zwalczania sekwencji wirusa RABV lub filogrupy I.
Opisany tutaj test wykorzystuje parę starterów czasu rzeczywistego JW12-N165, po raz pierwszy opisaną w 20053. Startery zostały zaprojektowane jako pan-lyssawirus, chociaż pierwotne zastosowanie polegało na tym, że był to test TaqMan z sondami do różnicowania gatunków wirusa lyssa. Późniejsze potwierdzenie, że para starterów była specyficzna dla pan-lyssawirusa, uzyskano przy użyciu 2-etapowego testu SYBR w czasie rzeczywistym na wszystkich dostępnych gatunkach wirusa Lyssa, w tym WCBV15. Para starterów jest opisana tutaj w jednoetapowym teście RT-PCR w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem interkalującego fluorochromu, zwalidowanego przy użyciu przedstawicieli wszystkich 16 uznanych gatunków lyssawirusa. Ten jednoetapowy test w czasie rzeczywistym jest szybkim, czułym, specyficznym dla lyssawirusa testem i pokazuje, że solidność zestawu starterów do identyfikacji nawet bardzo rozbieżnych gatunków wirusa lyssa.

<table><tbody><tr><td>Końcówki do pipet Art Barrier (różne rozmiary)</td><td>Thermofisher</td><td>różne</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman</td><td>Allegra 21R</td><td>Rotor zdolny do przechowywania wymaganych 96 płytek dołkowych. Krok 3.8.</td></tr><tr><td>Wirówka (mico)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Finnpipety (do dozowania 0,5-1,000 &mikro; L)</td> <td>Thermofisher</td><td>różne</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Uniwersalny SYBR Zielony jednoetapowy zestaw RT-PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5150</td><td>Równoważne zestawy mogą być używane, jeśli są walidowane</td></tr><tr><td>MX3000P lub MX3005P systemie real-tme PCR</td><td>Stratagene</td><td>N/A</td><td>Maszyny eqivalent mogą być używane, jeśli są zatwierdzone</td></tr><tr><td>Podstawa płytki reakcyjnej MicroAmp</td><td>Dowolna odpowiednia</td><td></td><td>Służy do bezpiecznego trzymania paska rurki i płytek.</td></tr><tr><td>Optycznie przezroczyste płaskie przezroczyste paski (8)</td><td>ABgene</td><td>AB-0866</td><td></td></tr><tr><td>Idealnie dopasowana rama (w przypadku korzystania z pasków rurowych)</td><td>Stratagene</td><td>N/A</td><td>Specyficzne dla maszynowych</td></tr><tr><td>podkładów: szczegóły dotyczące podkładu znajdują się w Tabeli 2.</td><td></td><td></td><td>Zamówione po 0,05 &mikro; skala kretowa HPLC oczyszczona.</td></tr><tr><td>Płytki studzienne Thermo-Fast 96, bez listew przypodłogowych</td><td>ABgene</td><td>AB-600</td><td></td></tr><tr><td>Paski Thermo-Fast (8) Rurki termiczne</td><td>ABgene</td><td>AB-0452</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna wirowa / Whirlimixer</td><td>Fisons Aparatura naukowa</td><td>SGP-202-010J</td><td></td></tr><tr><td>O ile nie zaznaczono inaczej, można zastosować</td><td></td><td></td><td></td> alternatywny sprzęt</tr></tbody></table>

pan-lyssavirus rt-pcr w czasie rzeczywistym do diagnozowania wścieklizny

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Testy molekularne są szybkie, czułe i specyficzne, i stały się kluczowe w diagnozowaniu wścieklizny. Testy oparte na PCR są stosowane od dziesięcioleci w celu potwierdzenia diagnozy wścieklizny, ale dopiero niedawno zostały zaakceptowane przez OIE (Światową Organizację Zdrowia Zwierząt) jako podstawowa metoda wykrywania zakażenia wścieklizną. Testy RT-PCR w czasie rzeczywistym dostarczają danych w czasie rzeczywistym i są systemami z zamkniętą probówką, minimalizując ryzyko zanieczyszczenia podczas konfiguracji. Testy RT-PCR z fluorochromem interkalującym DNA w czasie rzeczywistym nie wymagają drogich sond, co minimalizuje koszt na próbkę, a gdy startery są projektowane w konserwatywnych regionach, możliwe są testy, które są specyficzne dla różnych rodzajów wirusów, a nie tylko dla jednego gatunku wirusa. W tym miejscu opisujemy test RT-PCR w czasie rzeczywistym SYBR pan-lyssavirus, który wykrywa lyssawirusy z całego rodzaju Lyssavirus, w tym najbardziej rozbieżne wirusy IKOV, WCBV i LLEBV. W połączeniu z analizą krzywej dysocjacji, test ten jest czuły i specyficzny, a jego zaletą jest wykrywanie wszystkich gatunków wirusa lyssa. Test został przyjęty w wielu laboratoriach diagnostycznych ze środowiskami o gwarantowanej jakości, umożliwiając solidną, szybką i czułą diagnostykę przypadków wścieklizny u zwierząt i ludzi.

Ten RT-PCR w czasie rzeczywistym wykorzystujący barwnik interkalacyjny dsDNA jest odpowiedni do diagnozowania infekcji wirusem lyssa. Metoda rozpoczyna się od ekstrakcji RNA z próbek przedubojowych lub pośmiertnych z podejrzeniem wścieklizny, szczegółowo opisując przygotowanie mieszanki wzorcowej, dodanie RNA, ustawienie maszyny w czasie rzeczywistym i prawidłową interpretację wyników.

Pan-lyssavirus RT-PCR w czasie rzeczywistym do diagnozowania wścieklizny

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Ten RT-PCR w czasie rzeczywistym jest odpowiedni do szybkiego diagnozowania wścieklizny w próbkach przedubojowych i pośmiertnych. Startery Pan-Lyssavirus zostały zoptymalizowane pod kątem identyfikacji wszystkich członków rodzaju Lyssavirus. Jest to szybki, czuły i zamknięty test probówkowy, który wykrywa wirusy z całego rodzaju Lyssavirus, w tym gatunki bardzo różniące się od próbek klinicznych.OIE niedawno zaakceptowała testy molekularne w celu zgłaszania zakażenia wścieklizną. Jest to szczególnie ważne w przypadku próbek rozłożonych, których nie zawsze można zdiagnozować za pomocą metod hodowli wirusa lub wykrywania antygenów. Ze względu na czułość tego testu, dobra praktyka laboratoryjna, w tym oddzielenie różnych etapów, ma zasadnicze znaczenie dla zminimalizowania ryzyka zanieczyszczenia.Procedurę zademonstruje Daisy Jennings, diagnosta z mojego laboratorium. Zacznij od ilościowego określenia RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego. Upewnij się, że maszyna jest ustawiona na RNA i użyj jednego do dwóch mikrolitrów wody molekularnej, aby znormalizować maszynę i ustalić linię bazową.Zmierz stężenie RNA i dostosuj je do jednego mikrograma na mikrolitr. Zaplanuj układ swojej płytki PCR za pomocą arkusza kalkulacyjnego, biorąc pod uwagę zarówno próbki testowe, jak i kontrolne. Przygotuj stację roboczą do PCR, dezynfekując powierzchnie, a jeśli używasz szafki UV, włącz światło UV 10 minut przed rozpoczęciem.Wyjmij odczynniki i startery z zamrażarki, aby się rozmroziły, ale przez cały czas trzymaj mieszankę enzymów na lodzie. Wymieszaj odczynniki i krótko odwiruj, aby zebrać płyn. Przygotować wzorcowe mieszaniny PCR dla Lyssawirusa i Beta-aktyny zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.Pozostaw mieszanki główne na lodzie, aż będą gotowe do użycia. Wymieszaj i odwiruj przygotowane mieszanki wzorcowe i dozuj 19 mikrolitrów do odpowiednich dołków kompatybilnej z maszyną do PCR płytki lub paska probówki. W osobnym pomieszczeniu lub komorze UV ostrożnie dodaj jeden mikrolitr przygotowanego RNA.Jeśli korzystasz z szafki UV, włącz światło UV 10 minut przed rozpoczęciem. Po pobraniu badanych próbek dodać kontrolę dodatnią i kontrolę bez matrycy. Dodając RNA do mieszanek głównych, upewnij się, że jest on dodany do właściwej studzienki.Użyj planu płyt, aby pomóc w tym kroku. Uszczelnij płytkę, sprawdzając, czy pokrywki są płaskie w poprzek płytki i obróć ją w dół, aby zebrać cały płyn na dnie studzienek. Upewnij się, że każda studzienka ma taką samą objętość płynu i nie są widoczne żadne pęcherzyki.Następnie przenieś próbki do maszyny do PCR. Otwórz program wybierając SYBR Green z dysocjacją. Wybierz studzienki do analizy, wybierając nieznane jako typ próbki i SYBR jako barwnik fluorescencyjny.Oznacz studzienki na układzie płytki informacjami o próbce, w tym informacją, czy test jest przeznaczony dla Lyssavirus L czy Beta-Actin. Kliknij ustawienia profilu termicznego i zmodyfikuj warunki cykli termicznych zgodnie z opisem w manuskrypcie. Kliknij start, a następnie wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać plik, i zaznacz pole, aby wyłączyć lampę po zakończeniu biegu.Gdy pojawi się opcja rozpoczęcia przed rozgrzaniem lampy, kliknij przycisk uruchom teraz, ale upewnij się, że lampa ma mniej niż 15 minut na rozgrzanie. Po zakończeniu przebiegu PCR przystąp do analizy danych. Najpierw przeanalizuj wykresy amplifikacji wirusa Lyssa.Próbki dodatnie wykazują rampy wykładnicze, podczas gdy próbki ujemne mają płaskie wykresy amplifikacji bez wartości CT. Następnie przeanalizuj wyniki krzywej dysocjacji wirusa Lyssa próbek testowych wraz z próbkami kontrolnymi. Próbka dodatnia na obecność wirusa Lyssa będzie miała temperaturę topnienia od 77 do 80 stopni Celsjusza i będzie nakładać się na kontrolę pozytywną.Następnie przeanalizuj wykresy amplifikacji beta-aktyny i krzywe dysocjacji w porównaniu z kontrolami, aby zinterpretować ogólny wynik. Wyświetl raport tekstowy i użyj szczegółów, aby zapisać wartości CT i TM uzyskane dla kontrolnego RNA na karcie kontrolnej, aby potwierdzić, że przebieg zakończył się powodzeniem i że wyniki próbki testowej mogą zostać zgłoszone. Protokół ten służy do wykazania czułości Pan-Lyssavirus RT-PCR na serię rozcieńczeń RNA standardowego wirusa kontrolnego.Krzywa amplifikacji wskazuje, że można wykryć zaledwie 10 pikogramów wirusa Lyssa, a krzywe dysocjacji weryfikują temperaturę topnienia produktu. Temperatura topnienia służy do potwierdzenia, że amplikon jest specyficzny dla Lyssavirus. Wyniki pokazują zakres temperatur topnienia w całym rodzaju Lyssavirus od 77,34 do 79,67 stopni Celsjusza.Wartości temperatury topnienia poniżej 76,8 lub powyżej 80,2 są uważane za niespecyficzne. Czułość tego testu RT-PCR jest również określana przez wykrycie RNA z trzech próbek mózgu z dodatnim wynikiem Lyssavirus. Zaledwie 0,1 pikograma na mikrolitr docelowego RNA można wykryć dla dwóch z trzech próbek.Warto zauważyć, że za pomocą tego testu wykrywa się przedstawicieli wszystkich uznanych gatunków Lyssavirus. W przypadku analizy ekstraktów RNA z próbek klinicznych, takich jak ślina lub płyn mózgowo-rdzeniowy, wyniki beta-aktyny mogą być ujemne z powodu braku kwasów nukleinowych gospodarza. Dodanie kontroli egzogenicznej może rozwiązać ten problem.Zaleca się sekwencjonowanie próbek dodatnich na obecność wirusa Lyssa w celu uzyskania dodatkowych informacji na temat geograficznego pochodzenia zakażenia wścieklizną i gospodarza. Postępowanie z próbkami dodatnimi lub podejrzanymi dodatnimi na obecność wirusa Lyssa musi odbywać się zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa. Wyekstrahowane RNA jest niezakaźne, dlatego można z nim obchodzić się w laboratoriach o niskim stopniu hermetyczności.

pan-lyssavirus-real-time-rt-pcr-for-rabies-diagnosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje ilościową metodę wykrywania infekcji wirusowej za pomocą PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Krok odwrotnej transkrypcji przekształca RNA w cDNA, które jest następnie amplifikowane w cyklach PCR. Obecność wirusowego RNA w próbce potwierdza się analizując krzywe amplifikacji i dysocjacji DNA uzyskane z PCR.

Ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym do diagnozowania infekcji wirusowych

Ten protokół wprowadza standardową procedurę laboratoryjną do testowania diagnostycznego antygenów wirusa lyssa u nietoperzy na Tajwanie.

Standardowa procedura operacyjna nadzoru populacji nietoperzy na Tajwanie pod kątem wirusa Lyssa

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w pan-lyssavirus została opracowana w celu wykrywania wszystkich znanych lyssawirusów. Walidacja z wykorzystaniem próbek mózgu różnych gatunków zwierząt pod kątem wścieklizny wykazała, że metoda ta ma czułość i swoistość równoważną złotemu standardowi testu na przeciwciała fluorescencyjne i może być stosowana do rutynowej diagnostyki wścieklizny.

Ocena uniwersalnej zagnieżdżonej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w celu wykrycia lyssawirusów

Przedstawiamy kompletny protokół do pośmiertnej diagnozy wścieklizny zwierząt w warunkach polowych przy użyciu szybkiego immunochromatograficznego testu diagnostycznego (RIDT), od pobrania próbki z biopsji mózgu do ostatecznej interpretacji. Opisujemy również dalsze zastosowania urządzenia do analizy molekularnej i genotypowania wirusów.

Terenowy pośmiertny szybki immunochromatograficzny test diagnostyczny wścieklizny do zastosowań o ograniczonych zasobach z dalszymi zastosowaniami molekularnymi

Ten protokół przedstawia oparte na qRT-PCR podejście do określania liczby kopii genu nukleoproteiny (N) wirusa wścieklizny w różnych strukturach anatomicznych mózgu bydlęcego za pomocą transkrypcji in vitro.

Kwantyfikacja wirusa wścieklizny w różnych strukturach mózgu bydła

Tutaj prezentujemy szybki i ekonomiczny proces charakteryzowania genomów wirusa wścieklizny (RABV) za pomocą technologii nanoporowej. Przepływ pracy ma na celu wsparcie nadzoru opartego na genomice na poziomie lokalnym, dostarczając informacji na temat krążących linii RABV i ich umiejscowienia w regionalnych filogenezach w celu ukierunkowania środków kontroli wścieklizny.

Sekwencjonowanie całego genomu w celu szybkiej charakterystyki wirusa wścieklizny przy użyciu technologii nanoporowej

Protokół ten demonstruje test reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy (RT-PCR) pan-lizawirusa LN34 w czasie rzeczywistym od pobierania tkanek do interpretacji wyników, w tym aktualizacje sekwencji primerów i formuł poprawiających wydajność testu dla niektórych lizawirusów i zalegowców niezwiązanych z wścieklizną. Demonstrujemy także konfigurację testu dla multipleksowanego formatu LN34 z pojedynczym dołkiem (LN34M).

Diagnostyka pośmiertna wścieklizny u zwierząt za pomocą zaktualizowanego, multipleksowanego testu LN34 w czasie rzeczywistym reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy

Mikroglią są rezydentne makrofagi, które stanowią pierwszą linię obrony i nadzoru immunologicznego ośrodkowego układu nerwowego. MikroRNA to cząsteczki regulacyjne, które odgrywają istotną rolę w wielu procesach fizjologicznych, w tym w aktywacji i różnicowaniu makrofagów. W niniejszym artykule opisujemy metodę pomiaru mikroRNA w mikroglii.

Wykrywanie mikroRNA w mikrogleju za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w prawidłowym OUN oraz podczas neurostanu zapalnego

Opisujemy metodę obrazowania żywych komórek, która dostarcza wglądu w dynamikę białek podczas procesu aktywacji limfocytów T. Demonstrujemy połączone zastosowanie testu rozprzestrzeniania się komórek T, mikroskopii konfokalnej i analizy obrazowania w celu uzyskania wyników ilościowych w celu śledzenia tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego podczas aktywacji komórek T.

Obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego limfocytów T

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy test qRT-PCR do analizy sygnatur ekspresji IFN typu I i III. Test dyskryminuje różnice w pojedynczej parze zasad między bardzo podobnymi transkryptami tych genów. Dzięki montażowi wsadowemu i zrobotyzowanemu pipetowaniu testy są spójne i powtarzalne.

Wysokoprzepustowy ilościowy test RT-PCR w czasie rzeczywistym do określania profili ekspresji podtypów interferonu typu I i III

Poznaj metodę RT-PCR w czasie rzeczywistym do diagnozowania wścieklizny Lyssavirus w próbkach klinicznych. Ta czuła technika molekularna umożliwia wykrywanie nawet 10 pikogramów wirusa w próbkach przed- i pośmiertnych.

Pan-lyssavirus RT-PCR w czasie rzeczywistym do diagnozowania wścieklizny

Przeglądaj więcej filmów