Pan-lyssavirus RT-PCR w czasie rzeczywistym do diagnozowania wścieklizny

Ten RT-PCR w czasie rzeczywistym jest odpowiedni do szybkiego diagnozowania wścieklizny w próbkach przedubojowych i pośmiertnych. Startery Pan-Lyssavirus zostały zoptymalizowane pod kątem identyfikacji wszystkich członków rodzaju Lyssavirus. Jest to szybki, czuły i zamknięty test probówkowy, który wykrywa wirusy z całego rodzaju Lyssavirus, w tym gatunki bardzo różniące się od próbek klinicznych.

OIE niedawno zaakceptowała testy molekularne w celu zgłaszania zakażenia wścieklizną. Jest to szczególnie ważne w przypadku próbek rozłożonych, których nie zawsze można zdiagnozować za pomocą metod hodowli wirusa lub wykrywania antygenów. Ze względu na czułość tego testu, dobra praktyka laboratoryjna, w tym oddzielenie różnych etapów, ma zasadnicze znaczenie dla zminimalizowania ryzyka zanieczyszczenia.

Procedurę zademonstruje Daisy Jennings, diagnosta z mojego laboratorium. Zacznij od ilościowego określenia RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego. Upewnij się, że maszyna jest ustawiona na RNA i użyj jednego do dwóch mikrolitrów wody molekularnej, aby znormalizować maszynę i ustalić linię bazową.

Zmierz stężenie RNA i dostosuj je do jednego mikrograma na mikrolitr. Zaplanuj układ swojej płytki PCR za pomocą arkusza kalkulacyjnego, biorąc pod uwagę zarówno próbki testowe, jak i kontrolne. Przygotuj stację roboczą do PCR, dezynfekując powierzchnie, a jeśli używasz szafki UV, włącz światło UV 10 minut przed rozpoczęciem.

Wyjmij odczynniki i startery z zamrażarki, aby się rozmroziły, ale przez cały czas trzymaj mieszankę enzymów na lodzie. Wymieszaj odczynniki i krótko odwiruj, aby zebrać płyn. Przygotować wzorcowe mieszaniny PCR dla Lyssawirusa i Beta-aktyny zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.

Pozostaw mieszanki główne na lodzie, aż będą gotowe do użycia. Wymieszaj i odwiruj przygotowane mieszanki wzorcowe i dozuj 19 mikrolitrów do odpowiednich dołków kompatybilnej z maszyną do PCR płytki lub paska probówki. W osobnym pomieszczeniu lub komorze UV ostrożnie dodaj jeden mikrolitr przygotowanego RNA.

Jeśli korzystasz z szafki UV, włącz światło UV 10 minut przed rozpoczęciem. Po pobraniu badanych próbek dodać kontrolę dodatnią i kontrolę bez matrycy. Dodając RNA do mieszanek głównych, upewnij się, że jest on dodany do właściwej studzienki.

Użyj planu płyt, aby pomóc w tym kroku. Uszczelnij płytkę, sprawdzając, czy pokrywki są płaskie w poprzek płytki i obróć ją w dół, aby zebrać cały płyn na dnie studzienek. Upewnij się, że każda studzienka ma taką samą objętość płynu i nie są widoczne żadne pęcherzyki.

Następnie przenieś próbki do maszyny do PCR. Otwórz program wybierając SYBR Green z dysocjacją. Wybierz studzienki do analizy, wybierając nieznane jako typ próbki i SYBR jako barwnik fluorescencyjny.

Oznacz studzienki na układzie płytki informacjami o próbce, w tym informacją, czy test jest przeznaczony dla Lyssavirus L czy Beta-Actin. Kliknij ustawienia profilu termicznego i zmodyfikuj warunki cykli termicznych zgodnie z opisem w manuskrypcie. Kliknij start, a następnie wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać plik, i zaznacz pole, aby wyłączyć lampę po zakończeniu biegu.

Gdy pojawi się opcja rozpoczęcia przed rozgrzaniem lampy, kliknij przycisk uruchom teraz, ale upewnij się, że lampa ma mniej niż 15 minut na rozgrzanie. Po zakończeniu przebiegu PCR przystąp do analizy danych. Najpierw przeanalizuj wykresy amplifikacji wirusa Lyssa.

Próbki dodatnie wykazują rampy wykładnicze, podczas gdy próbki ujemne mają płaskie wykresy amplifikacji bez wartości CT. Następnie przeanalizuj wyniki krzywej dysocjacji wirusa Lyssa próbek testowych wraz z próbkami kontrolnymi. Próbka dodatnia na obecność wirusa Lyssa będzie miała temperaturę topnienia od 77 do 80 stopni Celsjusza i będzie nakładać się na kontrolę pozytywną.

Następnie przeanalizuj wykresy amplifikacji beta-aktyny i krzywe dysocjacji w porównaniu z kontrolami, aby zinterpretować ogólny wynik. Wyświetl raport tekstowy i użyj szczegółów, aby zapisać wartości CT i TM uzyskane dla kontrolnego RNA na karcie kontrolnej, aby potwierdzić, że przebieg zakończył się powodzeniem i że wyniki próbki testowej mogą zostać zgłoszone. Protokół ten służy do wykazania czułości Pan-Lyssavirus RT-PCR na serię rozcieńczeń RNA standardowego wirusa kontrolnego.

Krzywa amplifikacji wskazuje, że można wykryć zaledwie 10 pikogramów wirusa Lyssa, a krzywe dysocjacji weryfikują temperaturę topnienia produktu. Temperatura topnienia służy do potwierdzenia, że amplikon jest specyficzny dla Lyssavirus. Wyniki pokazują zakres temperatur topnienia w całym rodzaju Lyssavirus od 77,34 do 79,67 stopni Celsjusza.

Wartości temperatury topnienia poniżej 76,8 lub powyżej 80,2 są uważane za niespecyficzne. Czułość tego testu RT-PCR jest również określana przez wykrycie RNA z trzech próbek mózgu z dodatnim wynikiem Lyssavirus. Zaledwie 0,1 pikograma na mikrolitr docelowego RNA można wykryć dla dwóch z trzech próbek.

Warto zauważyć, że za pomocą tego testu wykrywa się przedstawicieli wszystkich uznanych gatunków Lyssavirus. W przypadku analizy ekstraktów RNA z próbek klinicznych, takich jak ślina lub płyn mózgowo-rdzeniowy, wyniki beta-aktyny mogą być ujemne z powodu braku kwasów nukleinowych gospodarza. Dodanie kontroli egzogenicznej może rozwiązać ten problem.

Zaleca się sekwencjonowanie próbek dodatnich na obecność wirusa Lyssa w celu uzyskania dodatkowych informacji na temat geograficznego pochodzenia zakażenia wścieklizną i gospodarza. Postępowanie z próbkami dodatnimi lub podejrzanymi dodatnimi na obecność wirusa Lyssa musi odbywać się zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa. Wyekstrahowane RNA jest niezakaźne, dlatego można z nim obchodzić się w laboratoriach o niskim stopniu hermetyczności.