Name: Ocena żywotności i śmierci komórek w sferoidalnych kulturach 3D komórek nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Poznaj zoptymalizowane protokoły oceny żywotności i śmierci komórek nowotworowych w sferoidalnych kulturach 3D. Metody te poprawiają translację wyników in vitro na warunki in vivo w badaniach nad terapią przeciwnowotworową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Katrine Franklin, Mark i Annette Bartels za doskonałą pomoc techniczną oraz Asbjørn Nøhr-Nielsen za przeprowadzenie eksperymentów na rysunku 1D. Praca ta została sfinansowana przez Fundację Einara Willumsena, Fundację Novo Nordisk i Fundację Juchum (wszystkie na rzecz SFP).

1. Generacja sferoid
<ol>
	<li>Przygotowanie zawiesin komórkowych do tworzenia sferoidów 
	UWAGA: Różne linie komórkowe mają bardzo różne właściwości adhezyjne i w każdym przypadku należy ustalić najbardziej odpowiedni protokół tworzenia sferoidów. Odkryliśmy, że komórki MCF-7 i BxPC-3 są odpowiednie do spontanicznego tworzenia sferoidów, podczas gdy MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 i MiaPaCa wymagają dodania odtworzonej błony podstawnej, aby z powodzeniem utworzyć sferoidy. Tylko komórki MDA-MB-231 i BxPC-3 zostały wykorzystane w protokole wiszącej kropli, jednak inne linie komórkowe z pewnością mają zastosowanie.
	<ol>
		<li>Hoduj komórki jako monowarstwę aż do 70-80% zgryźnia.</li>
		<li>Przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (1x PBS, 5 ml dla kolby o średnicy 25 cm lub 10 ml dla kolby o średnicy 75cm2), dodać enzym dysocjujący komórki (0,5 ml dla kolby o średnicy 25 cm lub 1 ml dla kolby o średnicy 75cm2) i inkubować komórki przez 2-5 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i wilgotności 95%.</li>
		<li>Sprawdź oderwanie komórek pod mikroskopem i zneutralizuj enzym dysocjacji komórek, dodając pożywkę wzrostową (6-10% surowicy w zależności od linii komórkowej) do całkowitej objętości 5 ml w kolbie o długości 25 cm2 lub 10 ml w kolbie o długości75 cm 2.</li>
		<li>Użyj komory Bürker do policzenia komórek i policz 8 kwadratów w komorze na przygotowanie komórki, aby uzyskać wysoką powtarzalność wielkości sferoidów. 
		nuta: Poniżej przedstawiono trzy protokoły, z których każdy opisuje inną metodę tworzenia sferoidów. Protokoły 1.2 i 1.3 mogą być stosowane we wszystkich kolejnych przedstawionych protokołach analitycznych, podczas gdy protokół 1.4 najlepiej nadaje się do zatapiania i przygotowywania lizatu. W zależności od linii komórkowej tworzenie sferoid trwa 2-4 dni, niezależnie od zastosowanej metody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Spontaniczne tworzenie się sferoidów
	<ol>
		<li>Wykonaj kroki 1.1.1-1.1.4.</li>
		<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórek w probówce o pojemności 15 ml, aby uzyskać 0,5-2 x 104 komórek/ml (optymalna gęstość komórek musi być określona dla każdej linii komórkowej) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A (ii)).</li>
		<li>Napełnij zewnętrzny pierścień studzienek 1x PBS lub pożywką wzrostową, aby zmniejszyć parowanie z pozostałych studzienek. Przenieś zawiesinę komórek do sterylnego zbiornika i za pomocą pipety wielokanałowej dozuj 200 μl / studzienkę do 96-dołkowych okrągłych płytek dennych o bardzo niskim nasadce (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A (iii)).</li>
		<li>Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy wilgotności 5% CO2 i wilgotności 95%.</li>
		<li>Co 2-3 dni uzyskuj świetlne obrazy mikroskopowe sferoidów. 
		nuta: Obrazy w tym artykule zostały wykonane w powiększeniu 11,5x, co jest odpowiednie dla większości sferoid przygotowanych przy użyciu tych protokołów.</li>
		<li>Co 2-3 dni (po pobraniu obrazów) wymieniaj 100 μl pożywki (usuń 100 μl zużytej pożywki i zastąp 100 μl świeżej pożywki. 
		nuta: Aby uniknąć usuwania sferoid podczas wymiany podłoża, zaleca się lekkie przechylenie płytki podczas powolnego wyjmowania pożywki i sprawdzenie zasysanego medium w końcówkach pod kątem widocznych sferoid przed jego wyrzuceniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odtworzona formacja sferoidowa za pośrednictwem błony podstawnej. 
	UWAGA: Zastosowano błonę podstawną odtworzoną przez zredukowany czynnik wzrostu (rBM) wolną od dehydrogenazy laktozy podnoszącej poziom laktozy (LDEV). rBM jest wrażliwy na temperaturę i powinien być zawsze przechowywany na lodzie, ponieważ będzie krzepł, jeśli osiągnie 15 °C. Przed posiewem rozmrozić rBM na lodzie przez noc w temperaturze 4 °C lub 2-4 godziny w temperaturze pokojowej (RT).
	<ol>
		<li>Rozmrozić rBM na lodzie (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Talerze i zbiorniki (jeśli są owinięte pojedynczo) należy przechowywać na lodzie przed użyciem.</li>
		<li>Wykonaj kroki 1.1.1-1.1.4.</li>
		<li>Napełnij zewnętrzny pierścień studzienek 1x PBS lub pożywką wzrostową, aby zmniejszyć parowanie z pozostałych studzienek. Rozcieńczyć zawiesinę komórek w probówce o pojemności 15 ml, aby uzyskać 0,5-2 x 104 komórek/ml (optymalna gęstość komórek musi być określona dla każdej linii komórkowej) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A (ii)).</li>
		<li>Umieścić probówkę o pojemności 15 ml zawierającą rozcieńczoną zawiesinę komórek na lodzie (np. w szklanej zlewce) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A (iia)).</li>
		<li>Przenieś schłodzone płyty i zbiorniki do okapu. Opłucz plastikowe pojemniki, napełnij je lodem i przenieś do okapu, aby umożliwić umieszczenie płytek i zbiorników na lodzie podczas całej procedury.</li>
		<li>Delikatnie zawiesić rBM, aby uzyskać jednorodny żel.</li>
		<li>Dodaj 1-2% rBM (optymalne stężenie należy określić dla każdej linii komórkowej) do schłodzonych zawiesin komórkowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A (iib)).</li>
		<li>Odwrócić probówkę o pojemności 15 ml, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie rBM i zawiesiny komórek przed dozowaniem zawiesiny do płytki.</li>
		<li>Przenieś zawiesinę komórek zawierającą rBM do sterylnego zbiornika i dozuj 200 μl/studzienkę do schłodzonych 96-dołkowych płytek o bardzo niskim nasadce za pomocą pipety wielokanałowej (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1A (iii)). 
		nuta: W przypadku pracy z kilkoma zawiesinami komórkowymi (np. więcej niż jedną linią komórkową) konieczne jest dozowanie każdej zawiesiny komórkowej natychmiast po dodaniu rBM, aby zapobiec przedwczesnemu żelowaniu.</li>
		<li>Odwirować płytkę przez 15 minut przy stężeniu 750 x g, stosując "miękkie hamowanie" (jeśli to możliwe, odwirować w temperaturze 4 °C, aby utrzymać płyn rBM dłużej, ale nie jest to wymagane do pomyślnego wytworzenia sferoidy), aby zapewnić, że komórki są zgrupowane razem, gdy rBM stwardnieje, ułatwiając tworzenie jednej pojedynczej sferoidy.</li>
		<li>Inkubować płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności).</li>
		<li>Co 2-3 dni pobieraj świetlne obrazy mikroskopowe w celu oceny wzrostu sferoidów.</li>
		<li>Co 2-3 dni wymieniaj 100 μl pożywki (usuń 100 μl i zastąp 100 μl świeżej pożywki).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wiszące sferoidy kroplowe.
	<ol>
		<li>Wykonaj kroki 1.1.1-1.1.4.</li>
		<li>Rozcieńczyć komórki w celu uzyskania odpowiedniego rozcieńczenia. Praktyczne rozcieńczenie to 50 000 komórek/ml.</li>
		<li>Zdejmij pokrywkę naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 10 cmi umieść je tak, aby było skierowane do góry. Dodaj 6 ml 1x PBS do naczynia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B (i)).</li>
		<li>Wlej zawiesinę komórkową do sterylnego zbiornika i ostrożnie umieść do 30 kropli po 40 μl zawiesiny komórkowej na pokrywie naczynia do hodowli komórkowej za pomocą pipety wielokanałowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B (ii)), co daje stężenie 2 000 komórek / kroplę. Unikaj umieszczania kropli zbyt blisko krawędzi pokrywki, ponieważ jest bardziej prawdopodobne, że krople te stracą napięcie powierzchniowe podczas odwracania pokrywki w następnym kroku.</li>
		<li>Odwróć pokrywkę szybkim, ale kontrolowanym ruchem i umieść ją na wierzchu 1x naczynia do hodowli komórkowych zawierającego PBS (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B (iii)).</li>
		<li>Umieść naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 95% bez naruszania kropli i pozostaw je do wyrośnięcia na 4-6 dni.</li>
		<li>Jeśli mają być używane do lizatów białkowych lub zatapiania, należy zebrać sferoidy, zdejmując pokrywkę i przechylając ją, aby zmyć krople 1 ml podgrzanego podłoża. Przenieś otrzymaną pożywkę zawierającą sferoidy do probówki o pojemności 1,5 ml i pozwól im osiąść na dnie probówki. Postępować zgodnie z opisem w ppkt 4.4 i 6.2.2 odpowiednio dla lizatów białkowych i zatapiania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Leczenie farmakologiczne sferoid
UWAGA: Długotrwałe leczenie farmakologiczne może być stosowane do sferoid w celu sprawdzenia efektów działania interesującego leku. Przed rozpoczęciem leczenia farmakologicznego zaleca się przeprowadzenie eksperymentu z reakcją na dawkę leku (leków) w celu znalezienia odpowiedniej dawki dla leczenia eksperymentalnego. Dawki powinny być oparte na ustalonym IC50/Ki leku i wynosić od około 0,2x-10x tej wartości.
<ol>
	<li>Ustaw 6-12 sferoid na żądany stan, jak opisano w 1.2 lub 1.3 i umieść w inkubatorze (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności) na 2 dni.</li>
	<li>W dniu 2 wykonaj zdjęcia sferoid w mikroskopie.</li>
	<li>Przygotować pierwsze dawki lecznicze (po uzyskaniu obrazów). 
	nuta: Pierwsze stężenie poddane działaniu środka musi być dwukrotnie większe od pożądanego stężenia końcowego, ponieważ roztwór zostanie rozcieńczony w stosunku 1:2 po dodaniu do studzienki zawierającej 100 μl pożywki. Sugerowane odstępy między leczeniem (zależy od okresu półtrwania leku): Dzień 2, 4 i 7.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej delikatnie usuń 100 μl pożywki i zastąp ją 100 μl pożywki zawierającej lek.</li>
	<li>Umieścić 96-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i wilgotności 95% i powtórzyć 2,3 i 2,4 w wybranych dniach leczenia, ale teraz bez podwajania dawki w celu uzyskania prawidłowej dawki końcowej.</li>
	<li>W ostatnim dniu protokołu/harmonogramu leczenia można wykonać jeden lub kilka z poniższych testów.</li>
</ol>
3. Test żywotności komórek dla sferoidów
<ol>
	<li>Ustawić 4-6 sferoid na żądany warunek, jak opisano w 1.2 lub 1.3 i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 95%. 
	nuta: W tym przypadku test żywotności komórek przeprowadzono w 7 lub 9 dniu, po monitorowaniu wzrostu sferoidów co 2-3 dni za pomocą mikroskopii świetlnej, jak opisano powyżej (pkt 1.2.5 i 1.3.13).</li>
	<li>Rozmrozić odczynnik do oznaczania żywotności (patrz tabela materiałów) i pozostawić go do zrównoważenia z RT przed użyciem.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać, odwracając do uzyskania jednorodnego roztworu.</li>
	<li>Przed wykonaniem testu należy usunąć 50% pożywki hodowlanej ze sferoid (100 μl).</li>
	<li>Dodaj odczynnik żywotności komórek do każdej studzienki w stosunku 1:3 do ilości pożywki obecnej w studzience (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A (i)) W przypadku płytki 96-dołkowej dodaj 50 μl odczynnika do 100 μl pożywki.</li>
	<li>Mieszaj zawartość energicznie przez 5 minut, aby wywołać lizę komórek (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A (ii)).</li>
	<li>Inkubować przez 25 minut w temperaturze pokojowej, aby ustabilizować sygnał luminescencyjny (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A (iii)).</li>
	<li>Nagraj sygnał luminescencyjny (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A (iv)).</li>
</ol>
4. Przygotowanie lizatów białkowych do Western Blotting z kultur sferoidalnych 3D
UWAGA: Podczas zbierania sferoid zaleca się użycie pipety P200 i odcięcie końcówki końcówki, aby umożliwić większy otwór, a tym samym łatwiejsze uchwycenie sferoid bez naruszania ich struktury.
<ol>
	<li>Dla każdego warunku zbierz co najmniej 12, najlepiej 18-24 sferoidy (w zależności od wielkości sferoidy) w probówce o pojemności 1,5 ml (unikaj probówek o pojemności 2 ml, ponieważ kolejne kroki staną się trudniejsze ze względu na ich mniej spiczaste dno). 
	UWAGA: Jeśli ilość pożywki przekracza 1,5 ml przed zebraniem wszystkich sferoid, pozwól zebranym sferoidom osiąść na dnie (dzieje się to bardzo szybko, wirowanie nie jest konieczne) i wyrzuć połowę objętości probówki przed kontynuowaniem zbierania pozostałych sferoidów.</li>
	<li>Umieść probówki na lodzie i pozwól, aby sferoidy osiadły na dnie probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Przenieś się z laboratorium komórek sterylnych do zwykłego laboratorium.</li>
	<li>Umyj sferoidy dwukrotnie w 1 ml lodowatego 1x PBS. Pozwól sferoidom osiąść przed wyjęciem 1x PBS między każdym etapem prania.</li>
	<li>Zassać jak najwięcej 1x PBS, nie naruszając ani nie usuwając sferoid.</li>
	<li>Dodać 5 μl podgrzanego buforu do lizy (LB) z inhibitorami fosfatazy i proteazy na sferoidę (np. 10 sferoidów = 50 μL LB).</li>
	<li>Powtarzaj interwały wiru, a następnie wirowanie w dół, aż sferoidy się rozpuszczą. Wykonuj cykl wirowania przez 30 s, a następnie wirowanie (wystarczy szybkie wirowanie za pomocą wirówki stołowej) przez 10 s przez ok. 5-10 minut, w zależności od wielkości i zwartości sferoid. 
	nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Utrzymuj lizaty w temperaturze -20 °C do czasu przystąpienia do sonikacji, homogenizacji i oznaczania białka, jak w standardowym protokole lizatu białkowego 2D, a następnie Western blot przy użyciu standardowych protokołów.</li>
</ol>
5. Barwienie sferoidów jodkiem propidyny (PI)
<ol>
	<li>Ustawić 3-6 sferoid na żądany stan, jak opisano w 1.2 lub 1.3 i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 95%.</li>
	<li>W sterylnym laboratorium hodowli komórkowych podgrzać 1x PBS do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór PI o objętości 4 μM, rozcieńczając roztwór podstawowy w 1x PBS: Rozcieńczyć 1 mg/ml wodnego roztworu PI 1:350 w 1x PBS. 
	nuta: Stężenie to zostanie zmniejszone o połowę po dodaniu roztworu do studzienek, co da końcowe stężenie 2 μM. Na każdą studzienkę zawierającą sferoidę potrzeba 100 μl tego roztworu. 
	ostrożność: Z jodkiem propidu (PI) należy obchodzić się pod wyciągiem i w rękawicach. PI jest światłoczuły. Chronić przed światłem podczas obsługi.</li>
	<li>Usunąć 100 μl pożywki z każdego dołka w płytce 96-dołkowej bez usuwania sferoid.</li>
	<li>Wypłukać pozostałą pożywkę, dodając 100 μl podgrzanego 1x PBS do wszystkich studzienek, a następnie usuwając 100 μl cieczy z dołków. Powtórz ten krok prania 3 razy.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu PI do każdej studzienki, przykryć płytkę folią aluminiową i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością 95% na 10-15 min.</li>
	<li>Powtórzyć 3 etapy płukania opisane w ppkt 4.5 w celu wypłukania roztworu PI, w celu zmniejszenia sygnału tła podczas obrazowania.</li>
	<li>Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego, aby zobrazować sferoidy. Aby ocenić żywotność komórek w rdzeniu sferoidalnym, należy użyć stosów z, aby uzyskać obrazy o różnej głębokości sferoidy. 
	nuta: Zalecany jest odstęp około 18-35 μm między każdym plasterkiem w zależności od wielkości sferoidy, co daje około 11-18 stosów na sferoidę. Stosy Z mogą być przetwarzane w ImageJ za pomocą funkcji projekcji z, która może połączyć wszystkie stosy Z w jeden ostateczny obraz, dając przegląd barwienia w całej sferoidzie (dalsze wskazówki dotyczące stosowania ImageJ w tym celu znajdują się w (https://imagej.net/Z-functions).</li>
</ol>
6. Osadzanie sferoid 3D
<ol>
	<li>Przygotuj żel agarozowy, w którym zanurzone są sferoidy (konieczne tylko przy pierwszym wykonywaniu protokołu).
	<ol>
		<li>Wymieszaj 1 g baktoagaru z 50 ml ddH2O.</li>
		<li>Podgrzewaj powoli w kuchence mikrofalowej, aż baktoagar się rozpuści i utworzy się jednorodny żel. Nie dopuścić do wrzenia żelu.</li>
		<li>Utrzymuj baktoagar w cieple w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C pomiędzy eksperymentami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie sferoid.
	<ol>
		<li>W dniu 1, dla każdego stanu, zbierz co najmniej 12 sferoid w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Umyj raz 1 ml lodowatego 1x PBS.</li>
		<li>Aby utrwalić sferoidy, dodaj 1 ml 4% paraformaldehydu. 
		nuta: Obchodzenie się z paraformaldehydem powinno odbywać się pod wyciągiem.</li>
		<li>Pozwól im inkubować przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>W dniu 2 ostrożnie podgrzej żel agarozowy, umieszczając go w zlewce wypełnionej wodą w kuchence mikrofalowej. Upewnij się, że żel się nie zagotuje! Przechowywać w cieple na stołowej płycie grzewczej w temperaturze 60 °C do momentu użycia.</li>
		<li>Umyj sferoidy dwukrotnie 1 ml lodowatego 1x PBS.</li>
		<li>Zassać większość 1x PBS (pozostawienie około 100 μl w tym miejscu jest praktyczne do obsługi sferoid).</li>
		<li>Przygotuj pipetę o pojemności 20 μl, przecinając końcówkę pipety pod kątem, aby uzyskać bardziej spiczastą końcówkę z większym otworem (patrz ilustracja). 
		nuta: Następna część musi być wykonana szybko, aby zapewnić optymalny transfer sferoidów i uniknąć zestalenia kropli żelu. Jeżeli blok grzewczy nie jest dostępny, zaleca się najpierw złapanie sferoid, a następnie spowodowanie spadku agarozy (tj. zamiana kolejności punktów 6.2.9 i 6.2.10).</li>
		<li>Zrób kroplę żelu agarozowego na szkiełku mikroskopowym. Umieść szkiełko na ciepłym bloku grzewczym, aby zapobiec zestaleniu się agarozy.</li>
		<li>Używając zmodyfikowanej końcówki pipety (patrz ppkt 6.2.8), złapać jak najwięcej sferoidów w objętości 15-20 μl.</li>
		<li>Ostrożnie wstrzyknąć 15-20 μl sferoidy zawierającej 1x PBS do środka kropli żelu agarozowego, nie dotykając szkiełka mikroskopowego. 
		nuta: Jest to nieco trudna kwestia. Sferoidy zostaną utracone, jeśli końcówka pipety dotknie szkiełka mikroskopowego podczas wstrzykiwania sferoid do kropli żelu. Wskazane jest przećwiczenie całego procesu wytwarzania kropli agarozy i wstrzykiwania sferoid poprzez wstrzykiwanie kolorowego płynu do kropli. Umożliwi to wizualizację potencjalnej penetracji przez kroplę, ponieważ kolorowa ciecz będzie wyciekać na szkiełko.</li>
		<li>Pozwól, aby kropla żelu agarozowego stwardniała, inkubując przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C. Gdy kropla żelu nieco zastygnie (ale nadal jest raczej miękka), ostrożnie wepchnij kroplę żelu ze szkiełka mikroskopowego do plastikowej kasety na chusteczki za pomocą skalpela.</li>
		<li>Przykryj plastikowe kasety na chusteczki higieniczne 70% etanolem. 
		nuta: W tym momencie sferoidy mogą być używane bezpośrednio lub przechowywane przez wiele miesięcy.</li>
		<li>Sferoidę zatopioną w agarozie zatopić w parafinie, podzielić na szkiełka warstwowe o grubości 2-3 μm i wybarwić hematoksyliną i eozyną lub poddać barwieniu immunohistologicznemu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+environment+interactions+in+tumor+microregions%3A+the+multicell+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model.</a> Science. 240 (4849), 177-184 (1988).</li>
<li>Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+glucose+and+oxygen+supply+conditions+on+the+oxygenation+of+multicellular+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids.</a> British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).</li>
<li>Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+reveals+differences+in+protein+expression+in+spheroid+versus+monolayer+cultures+of+low-passage+colon+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells.</a> Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).</li>
<li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS Genetics. 4 (12), 1000293(2008).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li>
<li>Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+create+the+correct+microenvironment%3A+three-dimensional+heterotypic+collagen+assays+for+human+breast+epithelial+morphogenesis+and+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia.</a> Methods. 30 (3), 247-255 (2003).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li>
<li>Jacobi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+three-dimensional+cancer+cell+cultures+mirror+drug+responses+in+vivo%3A+lessons+learned+from+the+inhibition+of+EGFR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling.</a> Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).</li>
<li>Rodriguez-Enriquez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+transition+in+multi-cellular+human+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids.</a> Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+intermediates+between+monolayer+culture+and+in+vivo+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor.</a> Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).</li>
<li>Andersen, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+acid-extruding+ion+transporters+in+regulation+of+breast+cancer+cell+growth+in+a+3-dimensional+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment.</a> Molecular Cancer. 15 (1), 45(2016).</li>
<li>Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+carbonic+anhydrase+9+in+regulating+extracellular+and+intracellular+ph+in+three-dimensional+tumor+cell+growths%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).</li>
<li>Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+imaging+in+multicellular+spheroids+of+oncogene-transfected+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+induces+novel+proliferative+and+metabolic+alterations+associated+with+oncogenic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation.</a> International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).</li>
<li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+pancreatic+cancer+spheroids+mimic+growth+pattern+of+circulating+tumor+cell+clusters+and+macrometastases%3A+displaying+heterogeneity+and+crater-like+structure+on+inner+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).</li>
<li>Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+cell+adhesion+and+the+extracellular+matrix+in+the+three-dimensional+growth+of+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29(2012).</li>
<li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li>
<li>Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neuroendocrine+tumor+cell+lines+as+a+three-dimensional+model+for+the+study+of+human+neuroendocrine+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy.</a> Journal of Visual Experiments. (66), e4218(2012).</li>
<li>Friedrich, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+tool+to+determine+cell+viability+in+complex+3-d+culture%3A+the+acid+phosphatase+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay.</a> Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).</li>
<li>Ivascu, A., Kubbies, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+cell-mediated+adhesions+in+breast+cancer+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids.</a> International Journal of Oncology. 31 (6), 1403-1413 (2007).</li>
<li>Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+ATP+bioluminescence+as+a+measure+of+cell+proliferation+and+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).</li>
<li>Andersen, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+net+acid+extruders+NHE1%2C+NBCn1+and+MCT4+promote+mammary+tumor+growth+through+distinct+but+overlapping+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">The net acid extruders NHE1, NBCn1 and MCT4 promote mammary tumor growth through distinct but overlapping mechanisms.</a> International Journal of Cancer. , (2018).</li>
<li>Vaupel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironmental+physiology+and+its+implications+for+radiation+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology.</a> Seminars in Radiation Oncology. 14 (3), 198-206 (2004).</li>
<li>Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+oxygen+partial+pressure+and+pH+distribution+in+C3H+mouse+mammary+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma.</a> Cancer Research. 41 (5), 2008-2013 (1981).</li>
<li>Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+pH+and+pO2+gradients+in+solid+tumors+in+vivo%3A+high-resolution+measurements+reveal+a+lack+of+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation.</a> Nature Medicine. 3 (2), 177-182 (1997).</li>
<li>Zhang, X., Lin, Y., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+pH+and+its+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor pH and its measurement.</a> Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1167-1170 (2010).</li>
<li>Gillies, R. J., Raghunand, N., Karczmar, G. S., Bhujwalla, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">MRI of the tumor microenvironment.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 16 (4), 430-450 (2002).</li>
<li>Vukovic, V., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+low+pH+on+cytotoxicity+of+paclitaxel%2C+mitoxantrone+and+topotecan%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Influence of low pH on cytotoxicity of paclitaxel, mitoxantrone and topotecan.</a> British Journal of Cancer. 75 (8), 1167-1172 (1997).</li>
<li>Song, C. W., Griffin, R., Park, H. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSong%2C+CW+%22Cancer+Drug+Resistance%22">Cancer Drug Resistance</a>. Teicher, B. A. , Humana Press. 21-42 (2006).</li>
<li>Lotz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+tumor+microenvironment+in+the+activity+and+expression+of+the+p-glycoprotein+in+human+colon+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells.</a> Oncology Reports. 17 (1), 239-244 (2007).</li>
<li>Sant, S., Johnston, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+3D+tumor+spheroids+for+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%3A+Technologies%22%5BJournal%5D)">The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery.</a> Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).</li>
<li>Stratmann, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+human+3D+lung+cancer+model+based+on+a+biological+tissue+matrix+combined+with+a+Boolean+in+silico+model%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model.</a> Molecular Oncology. 8 (2), 351-365 (2014).</li>
<li>Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+cell%2Ffibroblast+co-culture+induces+M2+like+macrophages+that+influence+therapeutic+response+in+a+3D+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model.</a> PLoS One. 12 (7), 0182039(2017).</li>
<li>Bochet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte-derived+fibroblasts+promote+tumor+progression+and+contribute+to+the+desmoplastic+reaction+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer.</a> Cancer Research. 73 (18), 5657-5668 (2013).</li>
<li>Amann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+3D+angiogenesis+model+to+study+tumour+-+endothelial+cell+interactions+and+the+effects+of+anti-angiogenic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of a 3D angiogenesis model to study tumour - endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2963(2017).</li>
<li>LaBonia, G. J., Ludwig, K. R., Mousseau, C. B., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iTRAQ+Quantitative+Proteomic+Profiling+and+MALDI-MSI+of+Colon+Cancer+Spheroids+Treated+with+Combination+Chemotherapies+in+a+3D+Printed+Fluidic+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">iTRAQ Quantitative Proteomic Profiling and MALDI-MSI of Colon Cancer Spheroids Treated with Combination Chemotherapies in a 3D Printed Fluidic Device.</a> Analytical Chemistry. 90 (2), 1423-1430 (2018).</li>
<li>Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+of+CO2%2FHCO3%28-%29+formula+buffer+in+the+regulation+of+intracellular+pH+of+three-dimensional+tumor+growths%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).</li>
<li>Wallace, D. I., Guo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+tumor+spheroid+growth+exhibited+by+simple+mathematical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Properties of tumor spheroid growth exhibited by simple mathematical models.</a> Frontiers in Oncology. 3, 51(2013).</li>
<li>Michel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+modeling+of+the+proliferation+gradient+in+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids.</a> Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).</li>
<li>Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+tumor+culture+systems+for+functional+drug+testing+and+therapy+response+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Science+OA%22%5BJournal%5D)">Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction.</a> Future Science OA. 3 (2), (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Zastosowanie sferoid 3D komórek rakowych okazało się cennym i wszechstronnym narzędziem nie tylko do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych, ale także do uzyskania mechanistycznego wglądu w regulację śmierci i żywotności komórek rakowych w warunkach naśladujących te w mikrośrodowisku guza. Jest to szczególnie istotne, ponieważ na dostępność, wychwyt komórkowy i wewnątrzkomórkowe efekty leków chemioterapeutycznych głęboki wpływ mają warunki fizykochemiczne w guzie, w tym pH, napięcie tlenu, krętość oraz fizyczne i...

Wykorzystanie wielokomórkowych modeli sferoidalnych w biologii nowotworów ma już kilkadziesiąt lat1,2, ale w ostatnich latach nabrało znacznego rozpędu. W dużej mierze odzwierciedla to zwiększoną świadomość tego, jak silnie fenotyp komórek nowotworowych jest zależny od ich mikrośrodowiska i określonych warunków wzrostu. Mikrośrodowisko w guzach litych zasadniczo różni się od tego w odpowiadających im normalnych tkankach. Obejmuje to warunki fizykochemiczne, takie jak pH, ciśnienie tlenu, a także ciśnienie śródmiąższowe, gradienty stężeń rozpuszczalnych czynników, takich jak składniki odżywcze, produkty przemiany materii i wydzielane związki sygnałowe (czynniki wzrostu, cytokiny). Ponadto obejmuje organizację macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), interakcje komórka-komórka i sygnalizację międzykomórkową, a także inne aspekty szczególnej trójwymiarowej (3D) architektury nowotworu3,4,5,6. Specyficzne warunki mikrośrodowiskowe, w których żyją komórki nowotworowe, głęboko wpływają na ich profil ekspresji genów i właściwości funkcjonalne, i jasne jest, że w porównaniu z komórkami hodowanymi w 2D, fenotyp sferoidów 3D znacznie bardziej naśladuje guzy in vivo7,8,9,10,11. Modele 2D, nawet jeśli wykorzystują niedotlenienie, kwaśne pH i wysokie stężenia mleczanu do naśladowania znanych aspektów mikrośrodowiska guza, nadal nie są w stanie uchwycić gradientów parametrów fizykochemicznych powstających w obrębie guzów, a także ich architektury 3D. Z drugiej strony, modele zwierzęce są kosztowne, powolne i etycznie problematyczne, a także mają braki w swojej zdolności do rekapitulacji ludzkich stanów nowotworowych. W związku z tym sferoidy 3D zostały zastosowane jako model o średniej złożoności w badaniach szerokiego zakresu właściwości większości nowotworów litych9,11,12,13,14,15,16,17.
Szeroko stosowanym zastosowaniem sferoid 3D jest badanie przesiewowe skuteczności terapii przeciwnowotworowej9,18,19,20. Odpowiedzi na leczenie są szczególnie wrażliwe na mikrośrodowisko guza, odzwierciedlając zarówno wpływ krętości, ograniczonej dyfuzji, wysokiego ciśnienia śródmiąższowego i kwaśnego pH środowiska na dostarczanie leku, jak i wpływ niedotlenienia i innych aspektów mikrośrodowiska na odpowiedź na śmierć komórki9,17. Ponieważ środowisko w sferoidach 3D z natury rozwija wszystkie te właściwości7,8,9,10,11, zastosowanie hodowli komórkowych 3D może znacznie poprawić translację wyników na warunki in vivo, umożliwiając jednocześnie wydajne i niedrogie wysokoprzepustowe badania przesiewowe wzrostu netto. Jednak zdecydowana większość badań nad odpowiedzią komórek nowotworowych na leki jest nadal prowadzona w warunkach 2D. Prawdopodobnie odzwierciedla to fakt, że podczas gdy niektóre testy można stosunkowo łatwo wdrożyć w hodowlach komórek 3D, wiele z nich, takich jak testy żywotności, western blotting i analiza immunofluorescencyjna, jest znacznie wygodniej wykonywanych w 2D niż w 3D.
Celem obecnej pracy jest dostarczenie łatwo dostępnych testów i precyzyjnych protokołów do analiz wpływu leczenia lekami przeciwnowotworowymi na żywotność i przeżycie komórek rakowych w warunkach 3D naśladujących guz. W szczególności przedstawiamy i porównujemy trzy różne metody tworzenia sferoidów, a następnie metody jakościowych i ilościowych analiz wzrostu, żywotności i odpowiedzi na leki.

<table><tbody><tr><td>2-(4-amidinofenylo)-1H-indolo-6-karboksyamidyna (DAPI)</td><td>Witrogen</td><td># C10595&nbsp;</td><td>Do barwienia jąder</td></tr><tr><td>5-Fluorouracyl (5-FU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#F6627</td><td>Składnik chemioterapii</td></tr><tr><td>5-(N-etylo-izopropylo)amiloryd (EIPA)</td><td>Life Technologies</td><td>#E3111</td><td>Inhibitor przeciwciała NHE1</td></tr><tr><td>przeciwko PARP i cPARP</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>#9542</td><td>Stosowany w western blot</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko sygnalizacji komórkowej Ki-67</td><td></td><td>#9449</td><td>Używany do IHC</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko sygnalizacji komórkowej p53</td><td>&nbsp;</td><td>#2524&nbsp;</td><td>Używany do IHC</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko &beta;-aktynie</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A5441</td><td>Stosowany w western blotting</td></tr><tr><td>Bactoagar</td><td>BD Bioscience</td><td>#214010</td><td>Używany do przygotowania żelu agarozowego</td></tr><tr><td>Wzorcowa drabinka białkowa</td><td>Invitrogen</td><td>#10747-012</td><td>Używany do SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Bio-Rad DC Zestaw do oznaczania białek</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>#500-0113, #500-0114, #500-0115&nbsp; &nbsp;</td><td>Służy do oznaczania białek z lizatów</td></tr><tr><td>B&uuml; Komora rycerska</td><td>Marienfeld</td><td>610311</td><td>Do liczenia komórek&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny BX63</td><td>Olympus</td><td></td><td>Używany do obrazowania fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Test żywotności komórek CellTiter-Glo 3D</td><td>Promega</td><td>#G9681</td><td>Używany do oznaczania żywotności komórek</td></tr><tr><td>Cisplatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P4394&nbsp;</td><td>Składnik w leczeniu chemioterapeutycznym</td></tr><tr><td>Mikropłytka sferoidalna Corning, 96 dołków, z przezroczystym okrągłym dnem,&nbsp; Bardzo niska nasadka, z pokrywką, sterylna</td><td>Corning</td><td>#4520</td><td>Używana do uprawy sferoid z pomiarami luminescencji jako punkt końcowy</td></tr><tr><td>Corning 96 dobrze, przezroczyste okrągłe dno,&nbsp; Mikropłytka o bardzo niskim mocowaniu, z pokrywką, sterylna</td><td>Corning</td><td>#7007</td><td>Wystarczająca do wzrostu sferoidalnego bez pomiarów luminescencji jako punktu końcowego</td></tr><tr><td>Kryterium TGX Prefabrykowane żele</td><td>Bio-Rad</td><td>5671025</td><td>Stosowany do SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Doksorubicyna</td><td>Abcam</td><td>#120629</td><td>Składnik w leczeniu chemioterapeutycznym</td></tr><tr><td>FLUOStar Optima Czytnik mikropłytek</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>Służy do rejestracji luminescencji&nbsp;</td></tr><tr><td>Formaldehyd&nbsp;</td><td>Chemikalia VWR&nbsp;</td><td>#9713.1000&nbsp;</td><td>Służy do utrwalania komórek</td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td><td>Gibco</td><td>#A1413202</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C, aby zapobiec krzepnięciu. Określany w protokole jako rBM.</td></tr><tr><td>Inaktywowany termicznie FBS</td><td>Sigma</td><td>#F9665</td><td>Surowica do pożywek wzrostowych</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Scientific Analiza obrazu</td></tr><tr><td>Kaseta Medim Uni-safe</td><td>Medim Histotechnologie</td><td>10-0114</td><td>Służy do przechowywania osadzonych sferoid</td></tr><tr><td>Mini inhibitory proteazy w tabletkach koktajlowych</td><td>Roche Diagnostics GmBH&nbsp;</td><td># 11836153001</td><td>Służy do przygotowania buforu do lizy</td></tr><tr><td>Mikroskop MZ16</td><td>Leica</td><td></td><td>Służy do lekkich obrazów mikroskopowych</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS 4x Bufor próbki&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>#NP0007</td><td>Używany do western blotting</td></tr><tr><td>Pierce ECL Western blotting substrate</td><td>Thermo scientific</td><td>#32106</td><td>Używany do western blotting</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P7170-1L</td><td>Używany do barwienia pasm białkowych</td></tr><tr><td>Prism 6.0</td><td>Graphpad</td><td></td><td>Naukowe oprogramowanie do tworzenia wykresów i statystyk</td></tr><tr><td>Jodek propidyny (1 mg/ml roztwór w wodzie)</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>P3566</td><td>Światłoczuły&nbsp;</td></tr><tr><td>Zbiorniki sterylne, wielokanałowe</td><td>SPL lifesciences</td><td>21002</td><td>Służy do wysiewu komórek do tworzenia sferoidów</td></tr><tr><td>Szkiełko adhezyjne Superfrost Ultra-Plus&nbsp;</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>#J3800AMNZ</td><td>Szkiełko mikroskopowe używane do zatapiania</td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T5648</td><td>Stosowany jako chemioterapeutyk</td></tr><tr><td>Trans-blot Turbo 0,2 &micro; m membrany nitrocelulozowe</td><td>Bio-Rad</td><td>#170-4159</td><td>Stosowany do zachodniego blottingu</td></tr><tr><td>Tris/Glycine/SDS running buffer&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>#161 0732</td><td>Używany do roztworu SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>#T4174&nbsp;</td><td>Enzym dysocjacji komórek</td></tr></tbody></table>

ocena żywotności i śmierci komórek w sferoidalnych kulturach 3d komórek nowotworowych

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Trójwymiarowe sferoidy komórek nowotworowych są ważnymi narzędziami zarówno do badań przesiewowych leków na raka, jak i do uzyskania mechanistycznego wglądu w biologię komórek nowotworowych. Siła tego preparatu polega na jego zdolności do naśladowania wielu aspektów warunków in vivo nowotworów, a jednocześnie jest szybki, tani i wystarczająco wszechstronny, aby umożliwić stosunkowo wysokoprzepustowe badania przesiewowe. Warunki hodowli sferoidów mogą podsumować gradienty fizykochemiczne w guzie, w tym rosnącą kwasowość zewnątrzkomórkową, zwiększoną mleczan oraz zmniejszającą się dostępność glukozy i tlenu, od obrzeża sferoidu do jego rdzenia. Również właściwości mechaniczne i interakcje komórka-komórka nowotworów in vivo są częściowo naśladowane przez ten model. Specyficzne właściwości, a co za tym idzie optymalne warunki wzrostu sferoid 3D, różnią się znacznie między różnymi typami komórek nowotworowych. Co więcej, ocena żywotności i śmierci komórek w sferoidach 3D wymaga metod, które różnią się częściowo od tych stosowanych w przypadku kultur 2D. W tym miejscu opisujemy kilka protokołów przygotowania sferoid 3D komórek nowotworowych oraz wykorzystania takich kultur do oceny żywotności i śmierci komórek w kontekście oceny skuteczności leków przeciwnowotworowych.

Testy wzrostu sferoidów, oparte na protokole tworzenia sferoidów przedstawionym schematycznie na Rysunku 1A oraz Rysunku 1B, posłużyły jako punkt wyjścia do analizy wpływu leków przeciwnowotworowych w środowisku imitującym trójwymiarowy guzy. Łatwość tworzenia sferoidów zależy od linii komórkowej, a niektóre linie wymagają suplementacji rBM w celu uformowania spójnych sferoidów22. Stężenie dodanego rBM mo...

Tutaj prezentujemy kilka prostych metod oceny żywotności i śmierci w sferoidach komórek rakowych 3D, które znacznie lepiej naśladują gradienty fizykochemiczne guzów in vivo niż hodowla 2D. Model sferoidalny umożliwia zatem ocenę skuteczności leku przeciwnowotworowego z lepszą translacją do warunków in vivo.

Ocena żywotności i śmierci komórek w sferoidalnych kulturach 3D komórek nowotworowych

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Przedstawione tutaj protokoły zostały zoptymalizowane pod kątem hodowli 3D i pozwalają na wydajne i niedrogie badanie procesów związanych ze wzrostem, proliferacją i śmiercią komórek rakowych w środowisku 3D. Główną zaletą stosowania hodowli 3D jest to, że stanowią one unikalną możliwość rekapitulacji kluczowych aspektów mikrośrodowiska guza in vitro. Sferoida 3D jest ważnym narzędziem do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych, które jest coraz częściej wykorzystywane do poprawy translacji między warunkami in vitro i in vivo w badaniach nad terapią raka.Niektóre z protokołów wymagają pewnej ilości praktyki i umiejętności. Dotyczy to w szczególności wytwarzania sferoid metodą kropli ręcznej oraz osadzania sferoid do celów immunohistochemicznych. Ponieważ kluczowe elementy tych procedur są trudne do opisania na piśmie, takie jak sposób wprowadzania sferoid do kropli agarozy, demonstracja wizualna pomoże naukowcom w wykonywaniu tych procedur.Przygotowaną zawiesinę komórkową rozcieńczyć w 15-mililitrowej probówce, aby uzyskać optymalną gęstość komórek. Rozcieńczoną zawiesinę komórkową przenieść do sterylnego zbiornika i za pomocą pipety wielokanałowej dozować 200 mikrolitrów do wcześniej przygotowanej płytki. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i wilgotnością 95%.Co dwa do trzech dni wykonuj świetlne obrazy mikroskopowe sferoid. Po uzyskaniu obrazów usuń 100 mikrolitrów zużytego podłoża z każdej studzienki i zastąp je 100 mikrolitrami świeżego podłoża. Najpierw rozmrozić odtworzoną błonę podstawną na lodzie.Przed użyciem przechowuj wszystkie indywidualnie zapakowane talerze i zbiorniki na lodzie. Następnie przygotowaną zawiesinę komórkową rozcieńczyć w 15-mililitrowej probówce, aby uzyskać optymalną gęstość komórek. Umieścić probówkę zawierającą rozcieńczoną zawiesinę komórkową na lodzie.Napełnij plastikowe pojemniki lodem i przenieś je do okapu. Przenieść schłodzone płytki i zbiorniki do okapu do hodowli komórkowych. Umieść talerze i zbiorniki z powrotem na lodzie.Delikatnie zawiesić rBM, aby uzyskać jednorodny żel. Dodać optymalne stężenie rBM do schłodzonych zawiesin komórek. Odwróć probówkę, aby upewnić się, że rBM i zawiesina komórek są prawidłowo wymieszane.Następnie przenieś tę mieszaninę do sterylnego zbiornika i za pomocą wielokanałowej pipety dozuj 200 mikrolitrów do każdej studzienki schłodzonej, 96-dołkowej płytki o bardzo niskim nasadce. Odwirować płytkę z prędkością 750 razy g przez 15 minut, aby upewnić się, że komórki są zgrupowane razem, gdy rBM stwardnieje. Użyj wirówki, łagodnego opadania lub minimalnej funkcji hamowania.Najpierw dodaj sześć mililitrów PBS do naczynia do hodowli komórkowej. Rozcieńczyć przygotowaną zawiesinę komórkową w celu uzyskania odpowiedniego rozcieńczenia. Praktyczne rozcieńczenie to 50 000 komórek na mililitr.Wlej zawiesinę komórkową do sterylnego zbiornika i za pomocą pipety wielokanałowej ostrożnie umieść do 30 kropli zawiesiny w pokrywie naczynia do hodowli komórkowej, uzyskując stężenie 2000 komórek na kroplę. Szybkim, ale kontrolowanym ruchem odwróć pokrywkę i umieść ją na naczyniu do hodowli komórkowych zawierającym PBS. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i 95% wilgotnością przez cztery do sześciu dni.Jeśli sferoidy mają być używane do lizatów białkowych lub zatapiania, pociągnij je, zdejmując pokrywkę, przechylając ją, a następnie spłukując krople jednym mililitrem podgrzanego podłoża. Przenieś powstałe medium zawierające sferoidę do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Pozwól sferoidzie osiąść na dnie probówki przed przystąpieniem do lizatów białkowych lub zatapiania.Odetnij końcówkę końcówki pipety P200, aby łatwiej uchwycić sferoidy bez naruszania ich struktury. Dla każdego warunku wyciągnij co najmniej 12, ale najlepiej od 18 do 24 sferoid w tubce o pojemności 1,5 mililitra. Umieść rurki na lodzie i pozwól sferoidom osiąść na dnie.Następnie przejdź z laboratorium komórek sterylnych do zwykłego laboratorium. Umyj sferoidy dwa razy w jednym mililitrze lodowatego jednego X PBS, upewniając się, że sferoidy osiądą przed wyjęciem PBS między każdym etapem mycia. Następnie odessaj jak najwięcej PBS, nie naruszając ani nie usuwając sferoid.Dodać pięć mikrolitrów podgrzanego buforu do lizy z inhibitorami fosfatazy i proteazy na sferoidę. Wiruj sferoidy przez 30 sekund, a następnie wykonuj szybkie wirowanie przez 10 sekund. Powtarzaj te interwały wirowania i wirowania przez pięć do 10 minut lub do momentu, gdy sferoidy się rozpuszczą.Po przygotowaniu roztworu PI usuń 100 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki na płytce 96-dołkowej, uważając, aby nie usunąć sferoid. Dodaj 100 mikrolitrów podgrzanego jednego X PBS do każdej studzienki, a następnie usuń 100 mikrolitrów cieczy z dołków. Powtórz ten krok prania trzy razy, aby wypłukać pozostałe medium.Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu PI do każdej studzienki. Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i wilgotnością 95% przez 10 do 15 minut. Następnie powtórzyć proces mycia z podgrzanym jednym X PBS trzy razy, jak opisano wcześniej, aby wypłukać roztwór PI i zmniejszyć sygnał tła podczas obrazowania.Za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego zobrazuj sferoidy. W oprogramowaniu do obrazowania otwórz menu wielokanałowe. Ustaw czas ekspozycji dla odpowiednich kanałów i naciśnij Ustawienia odczytu po dostosowaniu każdego kanału.Otwórz menu Z-stack i zdefiniuj początek i koniec, dostosowując ostrość obrazu. Początkowo nieostry sferoida, a następnie przesuwaj punkt ogniskowy przez całą sferoidę, aż obraz ponownie stanie się rozmyty. Następnie dostosuj rozmiar kroku tak, aby wynosił od 18 do 35 mikrometrów i naciśnij Start.Na początek zamocuj sferoidy w dygestoriach pierwszego dnia, jak opisano w protokole tekstowym. Drugiego dnia umieść żel agarozowy w zlewce wypełnionej wodą w kuchence mikrofalowej, aby go podgrzać i utrzymuj żel w cieple na stołowej płycie grzewczej ustawionej na 60 stopni Celsjusza, aż będzie potrzebny. Umyj sferoidy dwukrotnie w dygestorium, używając jednego mililitra lodowatego środka o natężeniu jednego X PBS na pranie.Następnie odessać większość PBS. Przygotuj końcówkę do pipety o pojemności 20 mikrolitrów, przecinając ją pod kątem, aby uzyskać bardziej spiczastą końcówkę z większym otworem. Następnie zrób kroplę żelu agarozowego na szkiełku mikroskopowym.Umieść szkiełko na ciepłym bloku grzewczym, aby zapobiec zestaleniu się agarozy. Za pomocą zmodyfikowanej końcówki pipety złap jak najwięcej sferoid w objętości od 15 do 20 mikrolitrów. Ostrożnie wstrzyknąć sferoidy w środek kropli żelu agarozowego, uważając, aby nie dotknąć szkiełka mikroskopowego.Inkubować w temperaturze pokojowej lub w czterech stopniach przez pięć do 10 minut, aby kropla żelu agarozowego stwardniała. Gdy kropla żelu nieco stwardnieje, ale nadal jest dość miękka, użyj skalpela, aby ostrożnie wepchnąć ją ze szkiełka mikroskopowego do plastikowej kasety na chusteczki. Przenieś kasetę z bibułkami do zlewki wypełnionej etanolem i przechowuj w temperaturze pokojowej.W niniejszej pracy przedstawiono szereg metod analizy wywołanych leczeniem przeciwnowotworowym zmian w żywotności i śmierci komórek nowotworowych w hodowli 3D. Stężenie dodanego rBM może głęboko wpływać na morfologię sferoid. Dodatek do 2,5% rBM umożliwia tworzenie sferoidów w komórkach raka piersi SKBr-3, bez dalszego wpływu przy wyższych stężeniach.Natomiast komórki raka trzustki BxPC-3 spontanicznie tworzą małe zwarte sferoidy. W tym typie komórek zwiększenie rBM do 1,5% lub więcej wywołuje wyraźną zmianę morfologiczną od sferoidalnych do bardziej zawiłych struktur z wypukłościami i wgłębieniami. Przedstawiono tutaj przykład zastosowania kultur sferoidalnych do badań przesiewowych skuteczności chemioterapii.Obrazy z mikroskopu świetlnego są pozyskiwane co dwa do trzech dni podczas eksperymentu z odpowiedzią na dawkę przeprowadzanego w celu określenia dawki niezbędnej do zmniejszenia o 50% żywotności komórek raka piersi MDA-MB-231. Przestrzenne rozmieszczenie martwych komórek przy rosnącym stężeniu inhibitora można uwidocznić za pomocą barwienia PI. Jak widać, sferoidy kontrolne wykazują ograniczony nekrotyczny, późny rdzeń apoptozy, podczas gdy martwe komórki są rozmieszczone w sferoidzie wraz ze wzrostem stężenia inhibitora.Przedstawiona tutaj technika sferoidalna może być stosowana do wielu innych testów, takich jak inwazja 3D, migracja lub analiza mikroforetyczna. Ma również zastosowanie do kokultur z fibroblastami, adipocytami lub komórkami odpornościowymi, które mogą dostarczyć ważnych informacji na temat interakcji komórkowych w mikrośrodowisku guza. Rozwój tej techniki był bardzo ważny w wyjaśnieniu roli mikrośrodowiska guza w wielu aspektach rozwoju raka, w tym ekspresji genów, inwazji i pomocy w leczeniu.

assessing-cell-viability-death-3d-spheroid-cultures-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Sferoidy to rodzaj modelu 3D hodowli komórkowej używany do dokładniejszego reprezentowania środowiska komórki w porównaniu do jednowarstwowych modeli hodowli komórkowych 2D. W przykładowym protokole zobaczymy, jak naukowcy generują sferoidy z linii komórkowej raka jelita grubego i stosują obrazowanie żywych komórek do śledzenia wzrostu sferoid.

Generowanie sferoidów z linii komórkowych: trójwymiarowa (3D) metoda hodowli komórek

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Tutaj opisana jest metoda przygotowania trójwymiarowej (3D) sferoidalnej kokultury komórek raka trzustki i fibroblastów, a następnie pomiaru funkcji metabolicznych za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Otrzymywanie i oznaczanie metaboliczne 3-wymiarowych sferoidalnych kokultur komórek raka trzustki i fibroblastów

Ten protokół jest przeznaczony do oceny immunoterapeutycznej cytotoksyczności przekierowanych komórek T (komórek CAR T) przeciwko komórkom rakowym (sferoidom) o strukturze 3D w czasie rzeczywistym.

Test zabijania sferoidów za pomocą limfocytów CAR T

Ten protokół opisuje generowanie sferoid pochodzących od pacjentów oraz dalszą analizę, w tym kwantyfikację proliferacji, testy cytotoksyczności, cytometrię przepływową, barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie konfokalne, w celu oceny potencjału kandydatów na leki jako terapii przeciwnowotworowych. Protokół ten wspiera medycynę precyzyjną w identyfikacji specyficznych leków dla każdego pacjenta i stadium choroby.

Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste

Tutaj przedstawiono metody pozwalające zrozumieć przeciwnowotworowe działanie bezkomórkowego supernatantu Lactobacillus (LCFS). Linie komórkowe raka jelita grubego wykazują śmierć komórek po leczeniu LCFS w hodowlach 3D. Proces generowania sferoid można zoptymalizować w zależności od rusztowania, a przedstawione metody analizy są przydatne do oceny zaangażowanych szlaków sygnałowych.

Ocena śmierci komórki przy użyciu bezkomórkowego supernatantu probiotyków w trójwymiarowych hodowlach sferoidalnych komórek raka jelita grubego

Przedstawione podejście jednocześnie ocenia inwazję komórek rakowych w testach sferoidalnych 3D i cytotoksyczność limfocytów T. Sferoidy są generowane w odlewie wielodołkowym z agarozy bez rusztowań. Kohodowla i osadzanie w macierzy kolagenu typu I są wykonywane w tym samym urządzeniu, które pozwala monitorować inwazję komórek rakowych i cytotoksyczność za pośrednictwem limfocytów T.

Monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D

Obecny protokół opisuje generowanie modeli hodowli 3D guzów z pierwotnych komórek nowotworowych i ocenę ich wrażliwości na leki za pomocą testów żywotności komórek i badań mikroskopowych.

Ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki

Przedstawiamy protokół do hodowli sferoidów o wysokiej powtarzalności i ich charakterystyki fenotypowej za pomocą przechwytywania obrazów i proteomiki.

Półautomatyczna analiza fenotypowa funkcjonalnych hodowli komórek sferoidalnych 3D

Ten artykuł demonstruje ustandaryzowaną metodę konstruowania trójwymiarowych sferoid nowotworowych. Opisano również strategię obserwacji sferoidy i analizy głębokiego uczenia opartego na obrazach przy użyciu zautomatyzowanego systemu obrazowania.

Generowanie sferoid 3D guza do badań oceny leków

Poznaj zoptymalizowane protokoły oceny żywotności i śmierci komórek nowotworowych w sferoidalnych kulturach 3D. Metody te poprawiają translację wyników in vitro na warunki in vivo w badaniach nad terapią przeciwnowotworową.

Ocena żywotności i śmierci komórek w sferoidalnych kulturach 3D komórek nowotworowych

Przeglądaj więcej filmów