Uniwersalny uchwyt na próbki do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej z minimalnym rozpraszaniem tła

Ten uchwyt na próbki może być używany do hodowli kryształów i zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej. Ten uchwyt na próbki został stworzony do użytku na płytkach 24-dołkowych, które są szeroko stosowane w społeczności MX. Bardzo ważnym aspektem jest to, że nie jest potrzebna żadna manipulacja.

Uchwyt na próbkę z opisanymi tutaj aspektami wcześniej nie istniał. Zobaczenie czegoś jest zawsze o wiele lepsze niż tylko czytanie o tym. Oglądając film, potencjalny użytkownik może natychmiast zrozumieć funkcje i zawiłości nowego uchwytu na próbki.

Na początek stwórz czystą i wolną od kurzu powierzchnię za pomocą wilgotnej, niestrzępiącej się szmatki. Wyjmij jeden uchwyt na próbkę z pudełka i delikatnie umieść go żółtą folią skierowaną do góry na czystej powierzchni, aby uniknąć uszkodzenia lub niepożądanego przebicia tylnej folii COC. Umieść krople krystalizacji na żółtej folii, tak jak robiłoby się to na powszechnie używanych szkiełkach ochronnych.

Krople należy rozmieszczać delikatnie, aby uniknąć pęknięcia lub przebicia folii za pomocą pipety. W przypadku uchwytów na próbki typu 2 i typu 3 zalecane są dwie krople. Na uchwycie na próbkę typu 1 można umieścić do trzech kropli.

Odwróć uchwyt próbki i umieść go na wstępnie nasmarowanej wnęce 24-dołkowej płytki typu Linbro. Użyj pomocy pozycjonujących uchwytu na próbkę, aby poprowadzić go do optymalnej pozycji. Upewnij się, że uchwyt na próbkę znajduje się w prawidłowym położeniu, aby uniknąć niepożądanego parowania.

Umieszczając płytkę krystalizacyjną pod mikroskopem światła transmisyjnego, bez polaryzatorów lub bez, monitoruj wzrost kryształów bez żadnych zakłóceń eksperymentu. Wykonaj krioochronę pod mikroskopem światła transmisyjnego. Delikatnie przekłuj zewnętrzną folię COC za pomocą drobnej kaniuli.

Upewnij się, że wewnętrzna żółta folia pozostaje nietknięta. Nakłucie powinno znajdować się tuż obok kropli, która ma być manipulowana. Włóż cienki papierowy do wybitego otworu.

Ostrożnie popchnij do przodu, aż dotknie żółtej folii poliimidowej. Utrzymuj w kontakcie z perforowaną folią. odessie cały nadmiar roztworu.

Czas potrzebny do całkowitego usunięcia cieczy zależy od lepkości roztworów i składu ługu macierzystego. Po odessaniu całego płynu delikatnie cofnij papierowy. Należy pamiętać o położeniu kropli, ponieważ może ona nie być widoczna po usunięciu ługu macierzystego.

Weź standardową pipetę, aby nałożyć niewielką objętość roztworu krioochronnego, używając wytłaczanej końcówki przez ten sam otwór. Aby ponownie uszczelnić samonaprawiającą się folię COC, delikatnie przyłóż chroniony palec do otworu na około jedną sekundę i przesuń go po nakłuciu. Niewielki nacisk w połączeniu z podwyższoną temperaturą sprzyja ponownemu uszczelnianiu nakłuć, które nie są zbyt duże.

Rozpuścić ligand w ługu macierzystym w pożądanym stężeniu w probówce reakcyjnej. Wirować roztwór przez 10 minut z prędkością 12 000 g w celu usunięcia nierozpuszczalnych cząstek. W razie potrzeby użyj wirówki o kontrolowanej temperaturze.

Delikatnie umieścić maksymalnie trzy mikrolitry roztworu zawierającego ligand w szczelinie między folią COC a folią poliimidową za pomocą długiej, wytłaczanej końcówki pipety; Schowaj końcówkę. Aby ponownie uszczelnić samonaprawiającą się folię COC, delikatnie przyłóż chroniony palec do otworu na około jedną sekundę i przesuń go po nakłuciu. Inkubuj eksperyment przez jakiś czas, aby umożliwić dyfuzję przez błonę.

Czas namaczania w dużym stopniu zależy od lepkości roztworu dyfuzyjnego i jego składników. Powtórz etapy namaczania ligandów wiele razy, aby następnie namoczyć różne ligandy. Aby zminimalizować rozproszenie rozpuszczalnika, przed zebraniem danych należy usunąć nadmiar roztworu.

Zapewnij stabilne środowisko linii badawczej o kontrolowanej wilgotności z wcześniej ustalonymi warunkami. Aby przeprowadzić zbieranie danych dyfrakcyjnych in situ w temperaturze otoczenia, delikatnie podnieś przezroczystą folię COC w wyznaczonym miejscu za pomocą kleszczy i odklej ją. Teraz delikatnie wyjmij uchwyt próbki z wnęki i natychmiast włóż go do wstępnie przygotowanej magnetycznej podstawy uchwytu na próbkę.

Na tym etapie nie jest potrzebny klej. Zastosuj delikatny nacisk, aby zapewnić prawidłowe ustawienie uchwytu próbki w podstawie. W przypadku uchwytów na próbki ze zdejmowanym pierścieniem zewnętrznym należy delikatnie docisnąć, przytrzymując pierścień zewnętrzny, a następnie odłamać go w wyznaczonych punktach przerwania.

Próbka jest teraz gotowa do centrowania i zbierania danych dyfrakcyjnych. Zamontuj uchwyt próbki na goniometrze linii badawczej i upewnij się, że uchwyt jest prawidłowo ustawiony. W zależności od geometrii goniometru, uchwyt próbki można obrócić nawet o 160 stopni bez powodowania zacienienia podczas eksperymentu dyfrakcyjnego.

Użyj papierowego i delikatnie dotknij żółtej folii poliimidowej od tyłu, aby usunąć nadmiar ługu macierzystego. Próbka jest teraz gotowa do centrowania i zbierania danych dyfrakcyjnych. Przygotuj się do zbierania danych dyfrakcyjnych in situ w temperaturze kriogenicznej, tak jak w przypadku temperatury otoczenia, a następnie zanurz próbkę w ciekłym azocie i przenieś ją do fiolki kompatybilnej ze SPINE.

Geometria uchwytów na próbki typu 2 i 3 umożliwia ich przeniesienie do standardowych fiolek na próbki SPINE, które mogą być używane do montażu próbki wspomaganego przez robota. Uchwyt na próbkę typu 1 i typu 2 został zaprojektowany tak, aby pasował do studzienki 24-dołkowej płytki typu Linbro. Każdy pojedynczy uchwyt na próbkę zawiera pomoce pozycjonujące po obu stronach zewnętrznej krawędzi w celu zapewnienia optymalnego ustawienia na krawędzi studzienki.

Użyto 24-dołkowej płytki w stylu Linbro z uchwytem na próbkę typu 1, aby zrównoważyć spadek o temperaturze 293 kelwinów z 500 mikrolitrami ługu macierzystego. Kryształy o wielkości od 40 do 50 mikronów obserwowano po pięciu godzinach przy użyciu mikroskopu światła transmisyjnego z polaryzatorem lub bez. Uchwyt na próbkę z kryształami lizozymu z białka jaja kurzego umieszczono w strumieniu powietrza o kontrolowanej wilgotności na linii badawczej HZB-MX 14.3.

Pokazany jest tutaj typowy obraz dyfrakcyjny. Nie można wykryć zwiększonego rozproszenia tła na obrazie dyfrakcyjnym. Bardzo ważne jest, aby unikać zanieczyszczeń folii poliimidowej.

Ponadto ważne jest, aby uchwyt na próbkę był dokładnie ustawiony, a manipulacja kryształami przeprowadzona ostrożnie. Uchwyt na próbkę umożliwia manipulowanie bardzo delikatnymi kryształami, co jest jednym z najważniejszych etapów krystalografii mikromolekularnej. Jego użycie znacznie zmniejsza szansę na zniszczenie próbki.