Name: Uniwersalny uchwyt na próbki do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej z minimalnym rozpraszaniem tła (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj nowy uniwersalny uchwyt na próbki do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej, który umożliwia wzrost kryształów i zbieranie danych dyfrakcyjnych bez manipulacji próbką.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować BESSY II, obsługiwanemu przez Helmholtz-Zentrum Berlin za dostęp i wsparcie w zakresie czasu wiązki, a także działom Sample Environment i Technical Design za pomoc w projektowaniu i budowie oraz dostęp do urządzeń drukarki 3D.

UWAGA: Dla wszystkich późniejszych prac, bardzo ważne jest, aby żółta folia poliimidowa nie była dotykana niezabezpieczonymi palcami, ze względu na możliwe zanieczyszczenie uchwytu próbki. Zaleca się również stosowanie chronionych kleszczy.
1. Posiadacz próbki
<ol>
	<li>Użyj jednego z trzech typów uchwytu na próbki. 
	UWAGA: Trzy różne wersje nowo opracowanego uchwytu na próbki są pokazane w Rysunek 1. Wszystkie zawierają czarną plastikową konstrukcję nośną, hermetyczną folię COC na zewnątrz i mikroporowatą strukturalną folię poliimidową od wewnątrz. Typ 1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A) zawiera stały zewnętrzny pierścień z tworzywa sztucznego, podczas gdy dla typów 2 i 3 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B,1C) zewnętrzny pierścień może być odłamywany mechanicznie w wyznaczonych odpowiednich punktach przerwania do stosowania w automatycznych systemach przenoszenia próbek (patrz czerwone strzałki w <silna klasa="xfig">Rysunek 1B)). Konstrukcja uchwytów na próbki pozwala na ustawienie wielu kropli krystalizacji na żółtej folii poliimidowej. Nie wpływa to negatywnie na monitorowanie eksperymentu z krystalizacją, ponieważ materiał jest wysoce przezroczysty dla światła widzialnego. Folia poliimidowa o grubości 21 μm ma również pory 5 μm, co umożliwia prostą manipulację kryształami poprzez późniejsze nasączanie. Ponieważ transmisja promieniowania rentgenowskiego jest bliska 1,0 we wszystkich powszechnie stosowanych energiach zbierania danych dyfrakcyjnych w krystalografii makromolekularnej, udział folii w rozpraszaniu tła w eksperymencie dyfrakcyjnym jest znikomy28.</li>
</ol>
2. Ustawianie kropli krystalizacji
<ol>
	<li>Stwórz czystą i wolną od kurzu powierzchnię za pomocą adamp niestrzępiąca się szmatka. Wyjmij jeden uchwyt na próbkę z pudełka i delikatnie umieść go żółtą folią skierowaną do góry na czyszczonej powierzchni, aby uniknąć uszkodzenia lub niepożądanego przebicia tylnej folii COC.</li>
	<li>Krople krystalizacyjne o maksymalnej zalecanej objętości 2 μl należy ustawić na żółtej folii, tak jak miałoby to miejsce na powszechnie stosowanych szkiełkach podstawowych. Krople należy rozmieszczać delikatnie, aby uniknąć pęknięcia lub przebicia folii za pomocą pipety. Na uchwycie próbki typu 1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A) można umieścić do trzech kropli, podczas gdy na uchwytach próbek typu 2 i 3 zalecane maksimum to dwie krople (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Odwróć uchwyt na próbkę i umieść go we wstępnie nasmarowanej wnęce 24-dołkowej płytki typu Linbro. Użyj pomocy pozycjonujących (patrz czerwone strzałki w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A) uchwytu na próbkę, aby poprowadzić go do optymalnej pozycji.</li>
	<li>Upewnij się, że uchwyt na próbkę jest prawidłowo ustawiony, aby uniknąć niepożądanego parowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
</ol>
3. Obserwacja wzrostu kryształów
<ol>
	<li>Umieszczając płytkę krystalizacyjną pod mikroskopem światła transmisyjnego, z polaryzatorami lub bez, monitoruj wzrost kryształów bez żadnych zakłóceń eksperymentu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>W przypadku korzystania z mniejszych, 18-milimetrowych uchwytów na próbki typu 3 (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1C), które zostały zaprojektowane do stosowania na płytkach SBS, należy użyć robota obrazującego zdolnego do obsługi płytek SBS, aby monitorować wzrost kryształów w bardziej zautomatyzowany sposób.</li>
</ol>
4. Manipulacja kryształami
UWAGA: Zaleca się wykonywanie wszystkich kolejnych kroków pod mikroskopem światła transmisyjnego.
<ol>
	<li>Krioochrona
	<ol>
		<li>Delikatnie przekłuj zewnętrzną folię COC za pomocą cienkiej kaniuli. Upewnij się, że wewnętrzna żółta folia pozostaje nietknięta. Nakłucie powinno znajdować się tuż obok kropli, która ma być manipulowana (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A,3C).</li>
		<li>Użyj cienkiego papierowego i włóż go do wybitego otworu. Ostrożnie popchnij do przodu, aż dotknie żółtej folii poliimidowej. Utrzymuj w kontakcie z perforowaną folią. odessie cały nadmiar roztworu. Czas potrzebny do całkowitego usunięcia cieczy zależy od lepkości roztworów i składu ługu macierzystego (<klasa silna = "xfig">Rysunek 3B).</li>
		<li>Po odessaniu całego płynu delikatnie cofnij papierowy. Należy pamiętać o położeniu kropli, ponieważ może ona nie być widoczna po usunięciu ługu macierzystego.</li>
		<li>Weź standardową pipetę, aby nałożyć niewielką objętość roztworu krioochronnego, maksymalnie 3 μl, za pomocą wytłaczanej końcówki (np. końcówki do ładowania żelem) przez ten sam otwór. Po dozowaniu płynu wycofaj końcówkę. Porowatość żółtej folii pozwala na dyfuzję po folii. Czas uzyskania krioochrony kryształów w dużym stopniu zależy od zastosowanego roztworu i jego składników.</li>
		<li>Aby ponownie uszczelnić samonaprawiającą się folię COC, delikatnie przyłóż chroniony palec do otworu na około 1 s i przesuń go po nakłuciu. Niewielki nacisk w połączeniu z podwyższoną temperaturą będzie sprzyjał ponownemu uszczelnianiu nakłuć, które nie są zbyt duże.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Moczenie ligandów 
	 
	UWAGA: Nadmiar ługu macierzystego można usunąć przed namoczeniem ligandów. W tym celu należy postępować zgodnie z krokami opisanymi w punktach od 4.1.1 do 4.1.3.
	<ol>
		<li>Rozpuścić ligand w ługu macierzystym w pożądanym stężeniu w probówce reakcyjnej.</li>
		<li>Wirować roztwór przez 10 minut w temperaturze 12 000 x g w celu usunięcia nierozpuszczalnych cząstek. W razie potrzeby użyj wirówki o kontrolowanej temperaturze.</li>
		<li>Delikatnie umieścić objętość maksymalnie 3 μl roztworu zawierającego ligand w szczelinie między folią COC a folią poliimidową za pomocą długiej, wytłaczanej końcówki pipety. Schowaj końcówkę.</li>
		<li>Aby ponownie uszczelnić samonaprawiającą się folię COC, delikatnie przyłóż chroniony palec do otworu na około 1 s i przesuń go po nakłuciu (patrz również 4.1.5).</li>
		<li>Inkubować eksperyment przez pewien czas, aby umożliwić dyfuzję przez błonę. Czas namaczania w dużym stopniu zależy od lepkości roztworu dyfuzyjnego i jego składników29.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 4.2.1 do 4.2.5 wiele razy, aby następnie namoczyć różne ligandy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Zbieranie danych dyfrakcyjnych in situ w temperaturze otoczenia
UWAGA: Aby zminimalizować rozproszenie rozpuszczalnika, usuń nadmiar roztworu przed zebraniem danych.
<ol>
	<li>Zapewnij stabilne środowisko linii badawczej o kontrolowanej wilgotności z wcześniej ustalonymi warunkami30.</li>
	<li>Delikatnie podnieś przezroczystą folię COC w wyznaczonym miejscu za pomocą kleszczy i oderwij ją tak, jak zdejmuje się pokrywkę z kubka po jogurcie ( <silna klasa = "xfig">Rysunek 6B).</li>
	<li>Delikatnie wyjmij uchwyt próbki z jego wnęki i natychmiast włóż go do wstępnie przygotowanej magnetycznej podstawy uchwytu na próbkę. Na tym etapie nie jest potrzebny klej (<silna klasa="xfig">Rysunek 6B).</li>
	<li>Zastosuj delikatny nacisk, aby zapewnić prawidłowe ustawienie uchwytu próbki w podstawie.</li>
	<li>Zamontuj uchwyt próbki na goniometrze linii badawczej i upewnij się, że uchwyt jest prawidłowo ustawiony. W zależności od geometrii goniometru, uchwyt próbki można obracać o maksymalnie 160° bez powodowania zacienienia podczas eksperymentu dyfrakcyjnego.</li>
	<li>Użyj papierowego i delikatnie dotknij żółtej folii poliimidowej od tyłu, aby usunąć nadmiar ługu macierzystego. Należy pamiętać, że na tym etapie można równie dobrze przeprowadzić namaczanie ligandów lub krioochronę. Próbka jest teraz gotowa do centrowania i zbierania danych dyfrakcyjnych.</li>
	<li>W przypadku korzystania z uchwytu na próbkę ze zdejmowanym pierścieniem zewnętrznym, należy delikatnie docisnąć, przytrzymując pierścień zewnętrzny i odłamać go w wyznaczonych punktach przerwania (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6C). Próbka jest teraz gotowa do centrowania i zbierania danych dyfrakcyjnych.</li>
</ol>
6. Zbieranie danych dyfrakcyjnych in situ w temperaturze kriogenicznej
UWAGA: Zaleca się usunięcie pozostałości ługu macierzystego z próbki, wykonując kroki od 4.1.1. do 4.1.3. przed przejściem do kolejnych kroków, aby zminimalizować rozpraszanie rozpuszczalnika. Większość próbek można przenieść do ciekłego azotu bez uprzedniej ochrony kriogenicznej31. Jeśli wymagana jest krioochrona, patrz kroki 4.1.1. zgodnie z pkt 4.1.5.
<ol>
	<li>Delikatnie podnieś folię COC w wyznaczonym miejscu za pomocą kleszczyków i zdejmij ją (patrz krok 5.1.2) (<silna klasa="xfig">Rysunek 6A).</li>
	<li>Wyjmij uchwyt na próbkę z wnęki i zamontuj go na magnetycznej podstawie uchwytu na próbkę. Można zastosować delikatny nacisk, aby zapewnić prawidłowe i szczelne dopasowanie (patrz krok 5.1.5, <silna klasa="xfig">Rysunek 6B). 
	UWAGA: Symetrycznie rozmieszczone wyznaczone punkty przerwania pozwalają na łatwe usunięcie zewnętrznego pierścienia uchwytu próbki poprzez delikatny nacisk (patrz krok 5.1.8., <silna klasa="xfig">Rysunek 6C). Teraz uchwyt na próbkę jest gotowy i można go zanurzyć w ciekłym azocie. Geometria uchwytów na próbki typu 2 i 3 (<klasa silna = "xfig" > Rysunek 1B,1C) umożliwia ich przeniesienie do standardowych fiolek na próbki SPINE, które mogą być używane do montażu próbek wspomaganych przez robota (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 6D).</li>
</ol>

<ol><li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Protein+Data+Bank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Protein Data Bank.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).</li>
<li>Mac Sweeney, A., D'Arcy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+method+for+mounting+protein+crystals+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid method for mounting protein crystals at room temperature.</a> Journal of Applied Crystallography. 36 (1), 165-166 (2003).</li>
<li>Kalinin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+sample+mounting+technique+for+room-temperature+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A new sample mounting technique for room-temperature macromolecular crystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 38 (2), 333-339 (2005).</li>
<li>Basavappa, R., Petri, E. T., Tolbert, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick+and+gentle+method+for+mounting+crystals+in+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A quick and gentle method for mounting crystals in capillaries.</a> Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1297-1298 (2003).</li>
<li>Pflugrath, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+cryocrystallography-methods+for+cooling+and+mounting+protein+crystals+at+cryogenic+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Macromolecular cryocrystallography-methods for cooling and mounting protein crystals at cryogenic temperatures.</a> Methods. 34 (3), 415-423 (2004).</li>
<li>Garman, E. F., Schneider, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+Cryocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Macromolecular Cryocrystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).</li>
<li>Gavira, J. A., Toh, D., Lopéz-Jaramillo, J., García-Ruiz, J. M., Ng, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ab+initio+crystallographic+structure+determination+of+insulin+from+protein+to+electron+density+without+crystal+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Ab initio crystallographic structure determination of insulin from protein to electron density without crystal handling.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (7), 1147-1154 (2002).</li>
<li>Martínez-Rodríguez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+crystallographic+studies+of+an+active-site+mutant+hydantoin+racemase+from+Sinorhizobium+meliloti+CECT4114%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3A+Structural+Biology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary crystallographic studies of an active-site mutant hydantoin racemase from Sinorhizobium meliloti CECT4114.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 64 (Pt 1), 50-53 (2007).</li>
<li>Hope, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryocrystallography+of+biological+macromolecules%3A+a+generally+applicable+method%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+B%3A+Structural+Science%22%5BJournal%5D)">Cryocrystallography of biological macromolecules: a generally applicable method.</a> Acta Crystallographica Section B: Structural Science. 44 (1), 22-26 (1988).</li>
<li>Teng, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mounting+of+crystals+for+macromolecular+crystallography+in+a+free-standing+thin+film%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film.</a> Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).</li>
<li>Thorne, R. E., Stum, Z., Kmetko, J., O'Neill, K., Gillilan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+mounts+for+high-throughput+macromolecular+cryocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Microfabricated mounts for high-throughput macromolecular cryocrystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 36 (6), 1455-1460 (2003).</li>
<li>Jian-Xun, Q., Fan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+loopless+mounting+method+for+cryocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Physics+B%22%5BJournal%5D)">An improved loopless mounting method for cryocrystallography.</a> Chinese Physics B. 19 (1), 010601(2010).</li>
<li>Kitatani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Technique+of+Manipulating+a+Protein+Crystal+Using+Adhesive+Material%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Express%22%5BJournal%5D)">New Technique of Manipulating a Protein Crystal Using Adhesive Material.</a> Applied Physics Express. 1 (3), 037002(2008).</li>
<li>Mazzorana, M., Sanchez-Weatherby, J., Sandy, J., Lobley, C. M. C., Sorensen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+adhesive+sample+holders+for+advanced+crystallographic+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">An evaluation of adhesive sample holders for advanced crystallographic experiments.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (Pt 9), 2390-2400 (2014).</li>
<li>Wierman, J. L., Alden, J. S., Kim, C. U., McEuen, P. L., Gruner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+as+a+protein+crystal+mounting+material+to+reduce+background+scatter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Graphene as a protein crystal mounting material to reduce background scatter.</a> Journal of Applied Crystallography. 46 (5), 1501-1507 (2013).</li>
<li>Parkin, S., Hope, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+Cryocrystallography%3A+Cooling%2C+Mounting%2C+Storage+and+Transportation+of+Crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Macromolecular Cryocrystallography: Cooling, Mounting, Storage and Transportation of Crystals.</a> Journal of Applied Crystallography. 31 (6), 945-953 (1998).</li>
<li>Papp, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+compact+and+precise+sample+holder+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).</li>
<li>Roedig, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micro-patterned+silicon+chip+as+sample+holder+for+macromolecular+crystallography+experiments+with+minimal+background+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering.</a> Scientific Reports. 5, 10451(2015).</li>
<li>Roedig, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+macromolecular+crystallography+using+a+micro-patterned+silicon+chip+with+minimal+background+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Room-temperature macromolecular crystallography using a micro-patterned silicon chip with minimal background scattering.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 968-975 (2016).</li>
<li>Zarrine-Afsar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallography+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Crystallography on a chip.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (3), 321-323 (2012).</li>
<li>Mueller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixed+target+matrix+for+femtosecond+time-resolved+and+in+situ+serial+micro-crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Structural+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Fixed target matrix for femtosecond time-resolved and in situ serial micro-crystallography.</a> Structural Dynamics. 2 (5), 054302(2015).</li>
<li>Feld, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Z+polymer+sample+supports+for+fixed-target+serial+femtosecond+X-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Low-Z polymer sample supports for fixed-target serial femtosecond X-ray crystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1072-1079 (2015).</li>
<li>le Maire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-plate+protein+crystallization%2C+in+situ+ligand+soaking+and+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (9), 747-755 (2011).</li>
<li>Soliman, A. S. M., Warkentin, M., Apker, B., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+high-performance+X-ray+transparent+crystallization+plates+for+in+situ+protein+crystal+screening+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Development of high-performance X-ray transparent crystallization plates for in situ protein crystal screening and analysis.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (7), 646-656 (2011).</li>
<li>Aller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+situ+diffraction+in+high-throughput+structure+determination+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Application of in situ diffraction in high-throughput structure determination platforms.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1261, 233-253 (2015).</li>
<li>Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrystalDirect%3A+a+new+method+for+automated+crystal+harvesting+based+on+laser-induced+photoablation+of+thin+films%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+D%2C+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68 (Pt 10), 1393-1399 (2012).</li>
<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+harvesting+and+processing+of+protein+crystals+through+laser+photoablation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).</li>
<li>Antimonov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-area+Kapton+x-ray+windows%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+X-Ray%2FEUV+Optics+and+Components+X%22%5BJournal%5D)">Large-area Kapton x-ray windows.</a> Advances in X-Ray/EUV Optics and Components X. 9588, 95880F(2015).</li>
<li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+dyes+into+protein+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3A+Structural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Penetration of dyes into protein crystals.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (2), 132-140 (2019).</li>
<li>Bowler, M. G., Bowler, D. R., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raoult%27s+law+revisited%3A+accurately+predicting+equilibrium+relative+humidity+points+for+humidity+control+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Raoult's law revisited: accurately predicting equilibrium relative humidity points for humidity control experiments.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (2), 631-638 (2017).</li>
<li>Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cryocooling+of+naked+crystals%3A+are+cryoprotection+agents+always+necessary%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary?</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 902-906 (2011).</li>
<li>Mueller, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macromolecular+crystallography+beamlines+at+BESSY+II+of+the+Helmholtz-Zentrum+Berlin%3A+Current+status+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Physical+Journal+Plus%22%5BJournal%5D)">The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives.</a> The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141(2015).</li>
<li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+and+Experience+of+Controlled+Crystal+Dehydration%3A+Results+from+the+European+Synchrotron+HC1+Collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22Crystal+Growth+%26+Design%22%5BJournal%5D)">Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration.</a> Crystal Growth & Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).</li>
<li>Yano, O., Yamaoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogenic+properties+of+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Cryogenic properties of polymers.</a> Progress in Polymer Science. 20 (4), 585-613 (1995).</li>
<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeshAndCollect%3A+an+automated+multi-crystal+data-collection+workflow+for+synchrotron+macromolecular+crystallography+beamlines%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+D%2C+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71 (Pt 11), 2328-2343 (2015).</li>
</ol>

Zgłoszenia patentowe dotyczące zgłoszonego posiadacza próbki zostały złożone przez Helmholtz-Zentrum Berlin z następującymi numerami rejestracyjnymi i datami rejestracji w Niemieckim Urzędzie Patentów i Znaków Towarowych: DE 10 2018 129 125.6, data rejestracji 20 listopada 2018r.; DE 10 2018 125 129.7, data rejestracji 11 października 2018r.; DE 10 2017 129 761.8, data rejestracji 13 grudnia 2017r. Kolejny międzynarodowy wniosek patentowy w ramach PCT, z pierwszeństwem DE 10 2017 129 761.8, został złożony PCT/DE2018/101007. Rejestracja wzoru użytkowego o numerze DE 20 2018 106 955.1 została dokonana w dniu 6 grudnia 2018r. Uchwyt na próbkę został udostępniony na rynku pod nazwami handlowymi XtalTool i XtalTool/HT przez Jena Bioscience, Jena, Niemcy.

Przydatność do eksperymentów z krystalizacją. Nowe uchwyty na próbki mogą być używane do standardowych eksperymentów krystalizacji kropli w zawieszeniu przy użyciu 24-dołkowych płytek typu Linbro (typy 1 i 2) lub 24-dołkowych płytek SBS, w których każda studzienka ma średnicę 18 mm (typ 3). Można je stosować zamiast standardowych szkiełek nakrywkowych do mikroskopu. Amorficzna folia COC zapewnia szczelność systemu. Monitorowanie eksperymentu krystalizacji jest możliwe przy użyciu mikroskopu światła transmisyjnego, dzięki zastosowaniu folii o wysokiej przezroczystości. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nie istnieją żadne inne uchwyty na próbki dla 24-dołkowych płytek krystalizacyjnych, które pozwoliłyby na manipulację kryształami lub eksperymenty dyfrakcyjne, bez mechanicznego usuwania kryształu z kropli, w której jest hodowany. Ma to szczególne znaczenie, ponieważ wielu badaczy w tej dziedzinie nadal polega na takich płytkach do optymalizacji kryształów, ze względu na fakt, że można stosować większe objętości kropli w porównaniu z 96-dołkowymi płytkami z kroplą siedzącą. Przy tych większych objętościach kropli można uzyskać większe kryształy.
Przydatność do manipulacji kryształami. Ze względu na właściwości samoregenerujące zewnętrznej folii COC i mikroporowatą strukturę wewnętrznej żółtej folii poliimidowej, środowisko kryształów jest dostępne, a kryształami można manipulować bez mechanicznego przenoszenia ich do innych pojemników. To sprawia, że uchwyty na próbki są bardzo wygodne. Jedynym znanym nam systemem, który umożliwia ten pośredni i delikatny dostęp do kryształu, jest system CrystalDirect26. Jednak CrystalDirect jest mniej elastyczny, ponieważ konieczne jest użycie specjalnych 96-dołkowych płytek krystalizacyjnych. Folia, na której rosną kryształy, jest tą samą, która uszczelnia eksperyment krystalizacji i nie jest samonaprawiająca. Oznacza to, że otwór, który został przebity w folii przez ablację laserową w celu dostarczenia ligandu lub krioprotektoru do kryształów, pozostanie otwarty, zwiększając szansę na odparowanie cieczy. Jest to przeciwieństwo naszego projektu, w którym kryształy nie będą bezpośrednio narażone na działanie środowiska, nawet jeśli folia COC zostanie kilkakrotnie przebita.
Przydatność do eksperymentów dyfrakcji in situ w temperaturze otoczenia. Uchwyt na próbkę można w prosty sposób zdjąć z płytki krystalizacyjnej, przykleić do podstawy magnetycznej i umieścić na goniometrze linii badawczej. W przypadku eksperymentu dyfrakcyjnego w temperaturze pokojowej zaleca się umieszczenie próbki w strumieniu powietrza o określonej wilgotności33. Ług macierzysty wokół kryształu może zostać usunięty przed umieszczeniem uchwytu próbki na goniometrze w celu zmniejszenia rozpraszania tła. Taka konfiguracja jest stabilna przez wiele godzin.
Przydatność użytego materiału do pracy i przechowywania w temperaturze 100 K. Schłodzenie do niskich temperatur nie ma negatywnego wpływu na materiał użyty do produkcji uchwytu na próbkę ani na folię poliimidową34. W związku z tym praca z uchwytem próbki w niskiej temperaturze (np. 100 K) nie stanowi poważnego problemu.
Przydatność do eksperymentów dyfrakcji in situ w temperaturze 100 K. W celu zebrania danych w temperaturze 100 K w strumieniu azotu, uchwyt próbki należy wyjąć z płytki krystalizacyjnej, jak w poprzednim akapicie, nakleić na podłoże magnetyczne i umieścić w strumieniu azotu gazowego w temperaturze 100 K na goniometrze badawczym. W razie potrzeby próbka może być również zabezpieczona przed krioizolacją, chociaż jest prawdopodobne, że w większości przypadków może to nie być konieczne w przypadku próbeknagich 31. Do eksperymentów w temperaturze 100 K lepiej nadają się uchwyty na próbki typu 2 i 3, ponieważ zewnętrzny pierścień z tworzywa sztucznego można zdjąć. W związku z tym mają mniejsze rozmiary i dlatego powinny być mniej podatne na oblodzenie. Można jednak użyć nawet uchwytu na próbkę typu 1. Biorąc pod uwagę niezbyt wysoką wilgotność w eksperymentalnej klatce i odpowiednio ustawione oblodzenie kriosystemu uchwytu, nie stanowi to większego problemu.
Ograniczenia. Geometria uchwytu próbki pozwala na niezakłócone zbieranie danych dyfrakcyjnych metodą rotacji w całkowitym zakresie obrotu 160°. Jest to wystarczające, aby można było uzyskać kompletne zestawy danych dyfrakcyjnych dla większości układów krystalicznych. W przypadkach, gdy nie jest to możliwe, dane z więcej niż kryształu muszą zostać połączone ze sobą. Kiedy kryształy są hodowane razem, możliwe jest dostosowanie wielkości padającej wiązki promieniowania rentgenowskiego tak, aby odsłonięte były tylko części pojedynczych kryształów. W skrajnych przypadkach konieczne może być zastosowanie strategii gromadzenia danych podobnej do podejścia MeshAndCollect35. Podsumowując, chociaż istnieją pewne ograniczenia związane z uchwytami próbek, w większości przypadków można je przezwyciężyć. Oczywiście zawsze można napotkać sytuacje, w których nic z tego nie jest możliwe. W takich przypadkach może być konieczne skorzystanie z innych metod montażu kryształów.
Opisaliśmy nowy typ uchwytu na próbki do krystalografii makromolekularnej i wykazaliśmy przydatność uchwytów na próbki do różnych zastosowań. Biorąc pod uwagę prostą i powtarzalną obsługę kryształów białkowych, a także unikalne właściwości uchwytów na próbki, uważamy, że te uchwyty na próbki okażą się cennym dodatkiem do arsenału uchwytów na próbki do krystalografii makromolekularnej.

Wiedza o trójwymiarowej strukturze makromolekuł biologicznych stanowi ważny kamień węgielny we wszystkich podstawowych badaniach biologicznych, biochemicznych i biomedycznych. Dotyczy to nawet niektórych aspektów translacyjnych takich badań, takich jak na przykład odkrywanie leków. Spośród wszystkich metod uzyskiwania takich trójwymiarowych informacji w rozdzielczości atomowej, krystalografia rentgenowska jest najpotężniejszą i najbardziej znaczącą, o czym świadczy fakt, że 90% wszystkich dostępnych informacji strukturalnych pochodzi z krystalografii rentgenowskiej1. Głównym warunkiem krystalografii rentgenowskiej, który jest jednocześnie jej głównym ograniczeniem, jest to, że kryształy o jakości dyfrakcyjnej muszą zostać wyprodukowane i przygotowane do eksperymentu dyfrakcyjnego. Ten etap nadal stanowi jedno z głównych wąskich gardeł metody.
Historycznie, dane dyfrakcyjne z kryształów białkowych były zbierane w temperaturze otoczenia. Poszczególne kryształy zostały ostrożnie przeniesione do kapilar szklanych lub kwarcowych przed zebraniem danych, ług macierzysty został dodany do kapilarn, aby kryształy nie wyschły, a kapilary zostały uszczelnione2,3,4. Od lat osiemdziesiątych XX wieku stawało się coraz bardziej oczywiste, że ze względu na jonizujące właściwości promieniowania rentgenowskiego i zbliżającą się wrażliwość kryształów wielkocząsteczkowych na promieniowanie, gromadzenie danych w temperaturze otoczenia stanowi poważne ograniczenia dla tej metody. W związku z tym opracowano metody łagodzenia skutków uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem poprzez chłodzenie kryształów wielkocząsteczkowych do temperatury 100 K i zbierania danych dyfrakcyjnych w tak niskiej temperaturze5,6. W przypadku pracy w niskich temperaturach mocowanie próbek w kapilarnach stało się niepraktyczne ze względu na niską szybkość wymiany ciepła. Pomimo tego, trwają wysiłki, aby wykorzystać również kapilary, w szczególności z eksperymentów z krystalizacją przeciwdyfuzyjną, do prac dyfrakcyjnych w niskich temperaturach7,8, ale niezależnie od tego, standardowym podejściem w krystalografii makromolekularnej stało się montowanie kryształów makromolekularnych utrzymywanych przez cienką warstwę ługu macierzystego w cienkiej pętli przewodowej9,10. Mimo że z biegiem czasu wprowadzono szereg ulepszeń (np. wprowadzenie pętli litograficznych i podobnych struktur11) do tego montażu opartego na pętli, podstawowe zasady, które zostały opracowane na początku lat 90., są nadal w użyciu. Można śmiało stwierdzić, że większość zbiorów danych dyfrakcyjnych dotyczących kryształów makromolekularnych nadal opiera się na tym podejściu5.
Z biegiem czasu pojawiło się kilka interesujących nowych rozwiązań i modyfikacji metody montażu opartej na pętli, ale te podejścia do tej pory nie zostały powszechnie przyjęte w społeczności. Jednym z nich jest tak zwane bezpętlowe montowanie kryształów, które zostało opracowane w celu uzyskania mniejszego rozpraszania tła12,13,14. Kolejnym jest zastosowanie osłonek grafenowych do owijania próbek krystalicznych i zabezpieczania ich przed wysychaniem. Grafen jest materiałem dobrze nadającym się pod tym względem ze względu na bardzo niskie tło rozpraszające promieniowanie rentgenowskie15.
Ostatnio, rozwój w dziedzinie mocowań próbek skupiał się głównie na standaryzacji mocowań w celu zwiększenia przepustowości próbek16 lub na projektowaniu mocowań, które mogą pomieścić więcej niż jedną próbkę17, jak na przykład wzorzyste membrany na ramie krzemowej, które są w stanie pomieścić setki małych kryształów, głównie w dziedzinie krystalografii szeregowej18,19,20,21,22.
Wszystkie omówione do tej pory metody montażu próbki nadal wymagają pewnego stopnia ręcznej interwencji, co oznacza, że istnieje nieodłączne niebezpieczeństwo spowodowania mechanicznego uszkodzenia próbki. W związku z tym poszukuje się nowych podejść do inżynierii środowiska próbki w taki sposób, aby dane dyfrakcyjne kryształów mogły być zbierane w ich środowisku wzrostu. Jedna z takich metod jest określana jako in situ lub plate-screening23,24 i jest już zaimplementowana na wielu liniach badawczych krystalografii makromolekularnej w różnych źródłach synchrotronowych na całym świecie25. Zastosowanie tej metody jest jednak ograniczone parametrami geometrycznymi płytki krystalicznej oraz przestrzenią dostępną wokół punktu próbkowania przyrządu.
Jeszcze inne podejście jest realizowane w tak zwanym systemie CrystalDirect26. Tutaj całe krople krystalizacji są zbierane automatycznie. Folie, na których wyhodowano kryształy, są wycinane na zamówienie za pomocą lasera i bezpośrednio używane jako uchwyt na próbkę27.
W opisanej tutaj pracy, celem było opracowanie uchwytu na próbkę, który pozwoliłby użytkownikowi przenieść krystaliczną próbkę z komory wzrostu do urządzenia do zbierania danych bez dotykania jej i który pozwoliłby użytkownikowi łatwo manipulować próbką. Ponieważ wielu badaczy w dziedzinie krystalografii makromolekularnej nadal używa formatu 24-dołkowej krystalizacji do optymalizacji wzrostu kryształów poprzez modyfikację warunków zidentyfikowanych w dużych kampaniach przesiewowych, nowy uchwyt na próbki został zaprojektowany tak, aby był kompatybilny z tym formatem. W dalszej części opisana zostanie konstrukcja nowego uchwytu na próbkę oraz zademonstrowana zostanie obsługa i wydajność uchwytu próbki do zbierania danych in situ i namaczania ligandów. Na koniec omówiona zostanie przydatność tego nowego uchwytu na próbki, a także jego ograniczenia dla różnych etapów pracy.

<table><tbody><tr><td>AF Satetiss</td><td>RS Components</td><td>101-5738</td><td>niestrzępiący się papier, wielu sprzedawców</td></tr><tr><td>Cannula</td><td>Dispomed Neoject</td><td>25 G 5/8" 0,5 x 16, Ref:10026</td><td>wielu sprzedawców</td></tr><tr><td>Folia COC</td><td>HJ-Bioanalytik GmbH</td><td>900360</td><td></td></tr><tr><td>ComboPlate</td><td>Greiner Bio-one / Jena Bioscience</td><td>662050 / CPL-131</td><td>wstępnie nasmarowana płytka, wielu sprzedawców</td></tr><tr><td>detalicznych Cryo Fiolki</td><td>Jena Bioscience</td><td>CV-100</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td>0,1 - 2,5 &mikro; L objętość</td></tr><tr><td>Eppendorf Probówki</td><td>Eppendorf</td><td>30125150</td><td>1,5 mL g-Safe Eppendorf Quality, numer referencyjny producenta</td></tr><tr><td>Kleszcze Usbeck</td><td>FisherScientific</td><td>10750313</td><td></td></tr><tr><td>GELoader Eppendorf Quality</td><td>Eppendorf</td><td>30001222</td><td>końcówki wytłaczane&nbsp; (0,2 - 20 &mikro; L), numer referencyjny producenta</td></tr><tr><td>Kriofiolki magnetyczne</td><td>Wymiar molekularny</td><td>MD7-402</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge Thermo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R21</td><td></td></tr><tr><td>papierowe</td><td>dental2000</td><td>64460</td><td>Zestaw papierowych, wielu sprzedawców</td></tr><tr><td>Rotiprotect Nitril-eco&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>TC14.1</td><td>bezpudrowy, wielu sprzedawców</td></tr><tr><td>SuperClear Plates</td><td>Jena Bioscience</td><td>CPL-132</td><td>wstępnie nasmarowana płyta</td></tr><tr><td>UHU super glue</td><td>UHU GmbH & Co KG</td><td>45545</td><td>numer referencyjny producenta, wielu sprzedawców</td></tr><tr><td>VeroBlackPlus</td><td>Alphacam</td><td>OBJ-40963</td><td>numer referencyjny producenta</td></tr><tr><td>XtalTool&nbsp;</td><td>Zestaw uchwytów na próbki</td> <td>Jena Bioscience</td><td>X-XT-101</td></tr><tr><td>XtalTool HT</td><td>Jena Bioscience</td><td>X-XT-103 / X-XT-104</td><td>Zestaw uchwytów na próbki kompatybilny ze</td></tr><tr><td>SPINE XtalToolBases</td><td>Jena Bioscience</td><td>X-XT-105</td><td>Zestaw magnetycznych podstaw do uchwytów na próbki</td></tr></tbody></table>

uniwersalny uchwyt na próbki do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej z minimalnym rozpraszaniem tła

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Makromolekularna krystalografia rentgenowska (MX) jest najważniejszą metodą uzyskiwania trójwymiarowej wiedzy o makrocząsteczkach biologicznych w wysokiej rozdzielczości. Warunkiem wstępnym zastosowania tej metody jest wyhodowanie wysoce uporządkowanej próbki krystalicznej z badanej makrocząsteczki, która następnie musi zostać przygotowana do eksperymentu dyfrakcyjnego. Ta procedura przygotowania zazwyczaj polega na usunięciu kryształu z roztworu, w którym był hodowany, namoczeniu kryształu w roztworze liganda lub roztworze krioprotektantu, a następnie unieruchomieniu kryształu na mocowaniu odpowiednim do eksperymentu. Poważnym problemem dla tej procedury jest to, że kryształy wielkocząsteczkowe są często niestabilne mechanicznie i dość kruche. W związku z tym obchodzenie się z tak delikatnymi kryształami może łatwo stać się wąskim gardłem w próbie określenia struktury. Każda siła mechaniczna przyłożona do tak delikatnych kryształów może zaburzyć regularne upakowanie cząsteczek i może prowadzić do utraty zdolności dyfrakcyjnej kryształów. W tym miejscu przedstawiamy nowatorski uchwyt na próbki typu "wszystko w jednym", który został opracowany w celu zminimalizowania etapów obsługi kryształów, a tym samym maksymalizacji wskaźnika sukcesu eksperymentu z określaniem struktury. Uchwyt na próbkę wspomaga ustawianie kropli kryształów, zastępując powszechnie używane szkiełka nakrywkowe mikroskopu. Co więcej, umożliwia manipulację kryształami na miejscu, taką jak namaczanie ligandów, krioochrona i tworzenie kompleksów bez otwierania wnęki krystalizacyjnej i bez obsługi kryształów. Wreszcie, uchwyt na próbkę został zaprojektowany w celu umożliwienia zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej in situ zarówno w temperaturze otoczenia, jak i kriogenicznej. Dzięki zastosowaniu tego uchwytu na próbki, szanse na uszkodzenie kryształu w drodze od krystalizacji do zbierania danych dyfrakcyjnych są znacznie zmniejszone, ponieważ nie jest już wymagana bezpośrednia obsługa kryształów.

Uchwyt na próbki typu 1 został zaprojektowany tak, aby pasował do dołka płytki 24-dołkowej typu Linbro. Każdy poszczególny uchwyt na próbki posiada pomoce pozycjonujące po obu stronach zewnętrznej krawędzi, aby zapewnić optymalne ustawienie na krawędzi dołka (Rycina 1A, Rycina 2A). Na żółtej folii polimidowej można umieścić do trzech poszczególnych kropli krystalizacyjnych o maksymalnej objętości 2 µL każda (Rycina 2B). W przypadku uchwytów na próbki typów 2 i 3 zaleca się naniesienie maksymalnie dwóch kropli o maksymalnej objętości 2 µL każda. Na jednej płytce 24-dołkowej Linbro można umieścić 24 uchwyty na próbki (Rycina 3D).
Przeprowadzono eksperyment krystalizacji na płytce Linbro z 24 dołkami, wykorzystując uchwyt na próbki typu 1. 1 µL roztworu lizozymu z białka jaja kurzego (15 mg/mL) zmieszano z 1 µL roztworu macierzystego składającego się z 50 mM NaAc pH 4.7, 50 mM NaCl oraz 25% (w/v) PEG-600 na żółtej folii polimidowej uchwytu na próbkę (Tabela 1). Kroplę wyrównano w temperaturze 293 K względem 50 µL roztworu macierzystego, a po 5 godzinach zaobserwowano kryształy o wielkości 40-50 µm (Rycina 4). Wzrost kryształów można obserwować za pomocą transmisyjnego mikroskopu świetlnego (Rycina 4) z polaryzatorem lub bez niego. Filmy o wysokiej przejrzystości zapewniają optymalną obserwację i monitorowanie warunków wzrostu kryształów zarówno przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu świetlnego, jak i zautomatyzowanego systemu obrazowania kryształów. Nie badano obserwacji wzrostu kryształów przy użyciu światła UV.
Po usunięciu ługu macierzystego z otoczenia kryształów, uchwyt z kryształami lizozymu z białka jaja kurzego wyjęto z płytki krystalizacyjnej i umieszczono w strumieniu powietrza o kontrolowanej wilgotności na linii wiązki 14.3 HZB-MX32. Dane dyfrakcyjne zebrano w temperaturze otoczenia w przyrostach 1°, używając wiązki o szerokości 150 μm przy energii 13,8 keV z natężeniem 4 x 1010 fotonów/s i czasie ekspozycji 5 s na obraz. Typowy obraz dyfrakcyjny przedstawiono na Rysunku 5. Na obrazie dyfrakcyjnym nie stwierdzono podwyższonego rozproszenia tła. Dalsze szczegóły eksperymentalne, jak również powiązane statystyki przetwarzania danych, zamieszczono w Tabeli 2.
<img alt="Schemat układu dynamicznej symulacji przepływu cieczy; konstrukcja tarczy obrotowej do analizy i optymalizacji przepływu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1Schematyczne przedstawienie nowych uchwytów na próbkiUchwyty na próbki składają się z czarnego plastikowego wspornika, który od zewnętrznej strony pokryty jest folią z amorficznego kopolimeru cyklicznego olefiny (COC). Folia ta (koloru niebieskiego) charakteryzuje się wysoką przejrzystością i zdolnością do samoregeneracji. Zapewnia ona również szczelność gazową eksperymentu. Wewnętrzna folia (koloru żółtego) wykonana jest z bioinertnego poliimidu, który wykazuje wysoką przejrzystość dla promieni Rentgena. Na tej folii można umieścić krople krystalizacyjne. Zewnętrzny brzeg uchwytu na próbki zawiera dwa elementy pozycjonujące wskazane czerwoną strzałką (panel A), co umożliwia dokładne umieszczenie uchwytu na próbkę w poszczególnych, uprzednio nasmarowanych wgłębieniach płytki krystalizacyjnej. (A) Uchwyt do próbek (typ 1) o średnicy 22 mm ze stałym zewnętrznym pierścieniem wspierającym. (B) Uchwyt do próbek (typ 2) o średnicy 22 mm z wyjmowanym zewnętrznym pierścieniem wspierającym. (C) Uchwyt do próbek (typ 3) o średnicy 18 mm z wyjmowanym zewnętrznym pierścieniem wspierającym. Te dwa ostatnie zostały opracowane do zastosowań wysokoprzepustowych z wykorzystaniem zautomatyzowanych robotów do montażu próbek zgodnych ze standardem SPINE. Wyznaczone punkty przełamania zaznaczono czerwonymi strzałkami na panelu BCzarna strzałka na panelu C oznacza znacznik pozycjonujący. Wypustki znajdujące się na zewnętrznym obwodzie żółtej folii są niezbędne do wyrównania folii poliimidowej podczas procesu produkcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj w celu wyświetlenia powiększonej wersji tej ryciny.</a>
<img alt="Konfiguracja chipów mikroprzepływowych do eksperymentu z manipulacją płynami, demonstrująca proces obsługi cieczy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2: Uchwyt na próbkę można stosować na płytce 24-dołkowej Linbro w ten sam sposób, co powszechnie używane szkiełka nakrywki do mikroskopu. Uszczelnia komorę, zapewniając szczelność powietrzną. Pomoce pozycjonujące zapewniają prawidłowe umieszczenie uchwytu próbki w komorze (czerwone strzałki w panelu A). Na uchwycie do próbek typu 1 można umieścić do trzech pojedynczych kropli (panel B), podczas gdy zalecana maksymalna liczba kropli naniesionych na uchwyt do próbek typu 2 lub 3 wynosi dwie. Maksymalna zalecana objętość każdej kropli wynosi 2 µL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego za pomocą wtryskiwania strzykawką; rozkład cieczy; układ doświadczalny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 324 uchwyty na próbki typu 1 pasują do płytki 24-dołkowej. Uchwyty na próbki można umieścić na płytce 24-dołkowej w dwóch orientacjach, zgodnie z oznaczeniem (panel D). Do przebicia tylnej folii COC używa się kaniuli, aby usunąć nadmiar cieczy z kropli krystalizacyjnej (panele A i C) poprzez delikatne wprowadzenie knotka papierowego w ten sam otwór (panel B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy, krystalizacja; małe kryształy w roztworze; skala 20 mikrometrów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4: Zdjęcie kryształów lizozymu z białka jaja kurzego obserwowane za pomocą mikroskopu transmisyjnego wyposażonego w polaryzator. Poszczególne kryształy można łatwo odróżnić od wytrąconego roztworu białek. Kryształy na tym obrazie mają średnią wielkość wynoszącą 40 µm Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz dyfrakcyjny krystalografii rentgenowskiej, przedstawiający analizę struktury atomowej i mapowanie gęstości elektronowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5Typowy obraz dyfrakcji rentgenowskiej kryształu lizozymu wyhodowanego na uchwycie do próbek. Przed naświetlaniem promieniami Rentgena z okolic kryształu usunięto cały nadmiar cieczy macierzystej. Dane dyfrakcyjne zebrano w temperaturze otoczenia na linii BL14.3 w pierścieniu akumulacji elektronów BESSY II.32 przy użyciu komory próbkowania z kontrolą wilgotności przy wilgotności względnej 97,5%. Nie zaobserwowano podwyższonego tła wynikającego z zastosowania uchwytów na próbki. Linie przerywane na obrazie wskazują pierścienie rozdzielczości. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig5large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces wytwarzania chipa mikrofluidycznego, schemat przedstawia etapy montażu i komponenty w układzie laboratoryjnym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 6"> 
Rysunek 6: Uchwyt na próbkę zostaje przygotowany do zbierania danych dyfrakcyjnych. Najpierw delikatnie podnosimy folię COC za pomocą pęsety, a następnie odrywamy ją (panel A). Następnie uchwyt próbki zostaje wyjęty z komory i włożony do otworu centralnego podstawy magnetycznej aż do osiągnięcia poziomu oznaczonego markerem (panel B). Trzymając za część centralną, należy wywrzeć delikatny nacisk na zewnętrzny pierścień, aby oddzielić część centralną, wykorzystując symetrycznie rozmieszczone, wyznaczone punkty przerwania (panel C). Po wyjęciu uchwyt próbki można zanurzyć w ciekłym azocie, a następnie przenieść do standardowych fiolek SPINE. Umieszczone, na przykład, w dyskach (pucks), mogą być transportowane do ośrodków synchrotronowych, gdzie zautomatyzowane roboty do montażu próbek rozpoznają je jako zwykłe próbki (panel D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Szczegóły krystalizacji</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metoda</td>
			<td>Metoda dyfuzji par w kropli wiszącej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typ płytki</td>
			<td>Płytki SuperClear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatura (K)</td>
			<td>293</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stężenie białka (mg mL⁻¹)-1)</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skład roztworu w zbiorniku</td>
			<td>50 mM NaAc pH 4,7, 50 mM NaCl, 25% (w/v) PEG-60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość i proporcje kropli</td>
			<td>2 µL łącznie, stosunek 1:1 (białko : ług macierzysty)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość zbiornika</td>
			<td>500 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas inkubacji</td>
			<td>12 godzin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Szczegóły eksperymentalne opisanego doświadczenia krystalizacji.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Gromadzenie i przetwarzanie danych</td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Długość fali (Å)</td>
			<td >0.89429</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Temperatura (K)</td>
			<td >293</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Detektor</td>
			<td >Rayonix MX25 CCD </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Odległość kryształ-detektor (mm)</td>
			<td >120</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Zakres obrotu na obraz (° )</td>
			<td >0.5</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Całkowity zakres obrotu (° )</td>
			<td >120</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Czas ekspozycji na obraz (s)</td>
			<td >5</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Grupa przestrzenna </td>
			<td >P43212</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Parametry komórki elementarnej (Å)</td>
			<td >a = 79.01, b = 79.01, c = 37.95</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Mozaikowość (° )</td>
			<td >0.07</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Zakres rozdzielczości (Å)</td>
			<td >39.50 - 1.35 (1.37 - 1.35)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Całkowita liczba refleksów</td>
			<td >191940 (8932)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Liczba unikalnych refleksów</td>
			<td >27020 (1292)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Kompletność (%)</td>
			<td >9.8 (9.20)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Multiplikatywność</td>
			<td >7.1 (6.9)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Średnie I/σ(I)</td>
			<td >15.0 (1.9)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Rmeas35 (%)</td>
			<td >6.3 (107.0)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Rpim36 (%)</td>
			<td >2.4 (40.4)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >CC1/237 </td>
			<td >9.9 (68.5)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >ISa38</td>
			<td > 16.1</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Współczynnik Wilsona B (Å2)</td>
			<td >17.0</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2: Statystyki zbierania i przetwarzania danych dyfrakcyjnych.

Przedstawiono nowatorski uchwyt na próbki do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej wraz z odpowiednim protokołem postępowania. System umożliwia wzrost kryształów, wygrzewanie kryształów i gromadzenie danych dyfrakcyjnych in situ zarówno w temperaturze otoczenia, jak i kriogenicznej, bez konieczności jakiejkolwiek manipulacji kryształami lub montażu.

Uniwersalny uchwyt na próbki do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej z minimalnym rozpraszaniem tła

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Ten uchwyt na próbki może być używany do hodowli kryształów i zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej. Ten uchwyt na próbki został stworzony do użytku na płytkach 24-dołkowych, które są szeroko stosowane w społeczności MX. Bardzo ważnym aspektem jest to, że nie jest potrzebna żadna manipulacja.Uchwyt na próbkę z opisanymi tutaj aspektami wcześniej nie istniał. Zobaczenie czegoś jest zawsze o wiele lepsze niż tylko czytanie o tym. Oglądając film, potencjalny użytkownik może natychmiast zrozumieć funkcje i zawiłości nowego uchwytu na próbki.Na początek stwórz czystą i wolną od kurzu powierzchnię za pomocą wilgotnej, niestrzępiącej się szmatki. Wyjmij jeden uchwyt na próbkę z pudełka i delikatnie umieść go żółtą folią skierowaną do góry na czystej powierzchni, aby uniknąć uszkodzenia lub niepożądanego przebicia tylnej folii COC. Umieść krople krystalizacji na żółtej folii, tak jak robiłoby się to na powszechnie używanych szkiełkach ochronnych.Krople należy rozmieszczać delikatnie, aby uniknąć pęknięcia lub przebicia folii za pomocą pipety. W przypadku uchwytów na próbki typu 2 i typu 3 zalecane są dwie krople. Na uchwycie na próbkę typu 1 można umieścić do trzech kropli.Odwróć uchwyt próbki i umieść go na wstępnie nasmarowanej wnęce 24-dołkowej płytki typu Linbro. Użyj pomocy pozycjonujących uchwytu na próbkę, aby poprowadzić go do optymalnej pozycji. Upewnij się, że uchwyt na próbkę znajduje się w prawidłowym położeniu, aby uniknąć niepożądanego parowania.Umieszczając płytkę krystalizacyjną pod mikroskopem światła transmisyjnego, bez polaryzatorów lub bez, monitoruj wzrost kryształów bez żadnych zakłóceń eksperymentu. Wykonaj krioochronę pod mikroskopem światła transmisyjnego. Delikatnie przekłuj zewnętrzną folię COC za pomocą drobnej kaniuli.Upewnij się, że wewnętrzna żółta folia pozostaje nietknięta. Nakłucie powinno znajdować się tuż obok kropli, która ma być manipulowana. Włóż cienki papierowy do wybitego otworu.Ostrożnie popchnij do przodu, aż dotknie żółtej folii poliimidowej. Utrzymuj w kontakcie z perforowaną folią. odessie cały nadmiar roztworu.Czas potrzebny do całkowitego usunięcia cieczy zależy od lepkości roztworów i składu ługu macierzystego. Po odessaniu całego płynu delikatnie cofnij papierowy. Należy pamiętać o położeniu kropli, ponieważ może ona nie być widoczna po usunięciu ługu macierzystego.Weź standardową pipetę, aby nałożyć niewielką objętość roztworu krioochronnego, używając wytłaczanej końcówki przez ten sam otwór. Aby ponownie uszczelnić samonaprawiającą się folię COC, delikatnie przyłóż chroniony palec do otworu na około jedną sekundę i przesuń go po nakłuciu. Niewielki nacisk w połączeniu z podwyższoną temperaturą sprzyja ponownemu uszczelnianiu nakłuć, które nie są zbyt duże.Rozpuścić ligand w ługu macierzystym w pożądanym stężeniu w probówce reakcyjnej. Wirować roztwór przez 10 minut z prędkością 12 000 g w celu usunięcia nierozpuszczalnych cząstek. W razie potrzeby użyj wirówki o kontrolowanej temperaturze.Delikatnie umieścić maksymalnie trzy mikrolitry roztworu zawierającego ligand w szczelinie między folią COC a folią poliimidową za pomocą długiej, wytłaczanej końcówki pipety; Schowaj końcówkę. Aby ponownie uszczelnić samonaprawiającą się folię COC, delikatnie przyłóż chroniony palec do otworu na około jedną sekundę i przesuń go po nakłuciu. Inkubuj eksperyment przez jakiś czas, aby umożliwić dyfuzję przez błonę.Czas namaczania w dużym stopniu zależy od lepkości roztworu dyfuzyjnego i jego składników. Powtórz etapy namaczania ligandów wiele razy, aby następnie namoczyć różne ligandy. Aby zminimalizować rozproszenie rozpuszczalnika, przed zebraniem danych należy usunąć nadmiar roztworu.Zapewnij stabilne środowisko linii badawczej o kontrolowanej wilgotności z wcześniej ustalonymi warunkami. Aby przeprowadzić zbieranie danych dyfrakcyjnych in situ w temperaturze otoczenia, delikatnie podnieś przezroczystą folię COC w wyznaczonym miejscu za pomocą kleszczy i odklej ją. Teraz delikatnie wyjmij uchwyt próbki z wnęki i natychmiast włóż go do wstępnie przygotowanej magnetycznej podstawy uchwytu na próbkę.Na tym etapie nie jest potrzebny klej. Zastosuj delikatny nacisk, aby zapewnić prawidłowe ustawienie uchwytu próbki w podstawie. W przypadku uchwytów na próbki ze zdejmowanym pierścieniem zewnętrznym należy delikatnie docisnąć, przytrzymując pierścień zewnętrzny, a następnie odłamać go w wyznaczonych punktach przerwania.Próbka jest teraz gotowa do centrowania i zbierania danych dyfrakcyjnych. Zamontuj uchwyt próbki na goniometrze linii badawczej i upewnij się, że uchwyt jest prawidłowo ustawiony. W zależności od geometrii goniometru, uchwyt próbki można obrócić nawet o 160 stopni bez powodowania zacienienia podczas eksperymentu dyfrakcyjnego.Użyj papierowego i delikatnie dotknij żółtej folii poliimidowej od tyłu, aby usunąć nadmiar ługu macierzystego. Próbka jest teraz gotowa do centrowania i zbierania danych dyfrakcyjnych. Przygotuj się do zbierania danych dyfrakcyjnych in situ w temperaturze kriogenicznej, tak jak w przypadku temperatury otoczenia, a następnie zanurz próbkę w ciekłym azocie i przenieś ją do fiolki kompatybilnej ze SPINE.Geometria uchwytów na próbki typu 2 i 3 umożliwia ich przeniesienie do standardowych fiolek na próbki SPINE, które mogą być używane do montażu próbki wspomaganego przez robota. Uchwyt na próbkę typu 1 i typu 2 został zaprojektowany tak, aby pasował do studzienki 24-dołkowej płytki typu Linbro. Każdy pojedynczy uchwyt na próbkę zawiera pomoce pozycjonujące po obu stronach zewnętrznej krawędzi w celu zapewnienia optymalnego ustawienia na krawędzi studzienki.Użyto 24-dołkowej płytki w stylu Linbro z uchwytem na próbkę typu 1, aby zrównoważyć spadek o temperaturze 293 kelwinów z 500 mikrolitrami ługu macierzystego. Kryształy o wielkości od 40 do 50 mikronów obserwowano po pięciu godzinach przy użyciu mikroskopu światła transmisyjnego z polaryzatorem lub bez. Uchwyt na próbkę z kryształami lizozymu z białka jaja kurzego umieszczono w strumieniu powietrza o kontrolowanej wilgotności na linii badawczej HZB-MX 14.3.Pokazany jest tutaj typowy obraz dyfrakcyjny. Nie można wykryć zwiększonego rozproszenia tła na obrazie dyfrakcyjnym. Bardzo ważne jest, aby unikać zanieczyszczeń folii poliimidowej.Ponadto ważne jest, aby uchwyt na próbkę był dokładnie ustawiony, a manipulacja kryształami przeprowadzona ostrożnie. Uchwyt na próbkę umożliwia manipulowanie bardzo delikatnymi kryształami, co jest jednym z najważniejszych etapów krystalografii mikromolekularnej. Jego użycie znacznie zmniejsza szansę na zniszczenie próbki.

an-all-one-sample-holder-for-macromolecular-x-ray-crystallography

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiono protokół krystalografii rentgenowskiej z wykorzystaniem mikrokryształów białkowych. Porównano dwa przykłady analizujące mikrokryształy hodowane in vivo po oczyszczeniu lub w celulo.

Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

Przedstawiono uproszczony protokół do przeprowadzenia obszernej charakterystyki biochemicznej i strukturalnej białka wiążącego substrat węglowodanowy ze Streptococcus pneumoniae.

Charakterystyka biochemiczna i strukturalna białka wiążącego substrat transportu węglowodanów SP0092

Ta metoda opisuje klonowanie, ekspresję i oczyszczanie rekombinowanego Nsa1 do określania strukturalnego za pomocą krystalografii rentgenowskiej i rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS), i ma zastosowanie do hybrydowej analizy strukturalnej innych białek zawierających zarówno uporządkowane, jak i nieuporządkowane domeny.

Połączenie krystalografii rentgenowskiej z rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem w celu modelowania nieustrukturyzowanych obszarów Nsa1 z S. cerevisiae

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak wytwarzać i obsługiwać urządzenia mikroprzepływowe do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze pokojowej. Dodatkowo opisano, w jaki sposób monitorować krystalizację białek poprzez dynamiczne rozpraszanie światła oraz jak przetwarzać i analizować uzyskane dane dyfrakcyjne.

Chipy mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej kryształów in situ i dynamicznego rozpraszania światła in situ do krystalografii szeregowej

Opisujemy konfigurację linii badawczej przeznaczoną do przeprowadzania szybkiej dwuwymiarowej fluorescencji rentgenowskiej i mapowania mikrodyfrakcji rentgenowskiej próbek monokryształów lub proszków za pomocą dyfrakcji Laue (promieniowanie polichromatyczne) lub proszkowej (promieniowanie monochromatyczne). Wynikowe mapy dostarczają informacji o odkształceniu, orientacji, rozkładzie fazowym i odkształceniu plastycznym.

Synchrotronowe obrazowanie mikrodyfrakcji rentgenowskiej i fluorescencji próbek minerałów i skał

Prezentujemy użycie protokołu MeshAndCollect do uzyskania kompletnego zestawu danych dyfrakcyjnych, do wykorzystania w późniejszym określaniu struktury, składającego się z częściowych zestawów danych dyfrakcyjnych zebranych z wielu małych kryształów fluorescencyjnego białka Cerulean.

Roztwór strukturalny białka fluorescencyjnego Cerulean za pomocą MeshAndCollect

Tutaj opisujemy, jak korzystać z opcji automatycznego badania przesiewowego i zbierania danych dostępnych na niektórych liniach synchrotronowych. Naukowcy wysyłają próbki chłodzone kriogenicznie do synchrotronu, gdzie badane są właściwości dyfrakcyjne, zestawy danych są zbierane i przetwarzane, a tam, gdzie to możliwe, przeprowadzane jest rozwiązanie strukturalne – a wszystko to bez interwencji człowieka.

W pełni autonomiczna charakterystyka i zbieranie danych z kryształów makrocząsteczek biologicznych

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół wytwarzania mikroprzepływowych chipów opracowanych do krystalizacji białek na chipie metodą dializy i eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Proces mikroprodukcji umożliwia zintegrowanie półprzepuszczalnej membrany do dializy z regenerowanej celulozy z dowolnym odcięciem masy cząsteczkowej między dwiema warstwami chipa.

Krystalizacja białek na chipie za pomocą mikrodializy do badań dyfrakcji rentgenowskiej in situ

Stosunek sygnału do szumu danych jest jednym z najważniejszych czynników przy wykonywaniu pomiarów dyfrakcji rentgenowskiej z mikrokryształów. Linia badawcza VMXm zapewnia środowisko o niskim poziomie hałasu i mikrowiązkę do takich eksperymentów. W tym miejscu opisano metody przygotowania próbek do montażu i chłodzenia mikrokryształów dla VMXm i innych linii badawczych do krystalografii makromolekularnej mikrofokusowej.

Rurociąg przygotowania próbek mikrokryształów na linii badawczej VMXm

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek kriogenicznych i transferu kryształów do stacji końcowej próżni na linii badawczej I23 w Diamond Light Source, dla eksperymentów makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej o długich falach.

Protokół przygotowania i transferu próbki do krystalografii długofalowej w próżni na linii badawczej I23 przy diamentowym źródle światła

Ten artykuł opisuje cały proces XChem do badania fragmentów na bazie kryształów, począwszy od złożenia wniosku o dostęp i wszystkich kolejnych kroków do rozpowszechniania danych.

Osiągnięcie efektywnego przesiewania fragmentów w zakładzie XChem w Diamond Light Source

Poznaj nowy uniwersalny uchwyt na próbki do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej, który umożliwia wzrost kryształów i zbieranie danych dyfrakcyjnych bez manipulacji próbką.

Uniwersalny uchwyt na próbki do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej z minimalnym rozpraszaniem tła

Przeglądaj więcej filmów