Uniwersalny uchwyt na próbki do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej z minimalnym rozpraszaniem tła
6 lipca 2019
Przedstawiono nowatorski uchwyt na próbki do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej wraz z odpowiednim protokołem postępowania. System umożliwia wzrost kryształów, wygrzewanie kryształów i gromadzenie danych dyfrakcyjnych in situ zarówno w temperaturze otoczenia, jak i kriogenicznej, bez konieczności jakiejkolwiek manipulacji kryształami lub montażu.
Ten uchwyt na próbki może być używany do hodowli kryształów i zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej. Ten uchwyt na próbki został stworzony do użytku na płytkach 24-dołkowych, które są szeroko stosowane w społeczności MX. Bardzo ważnym aspektem jest to, że nie jest potrzebna żadna manipulacja.
Uchwyt na próbkę z opisanymi tutaj aspektami wcześniej nie istniał. Zobaczenie czegoś jest zawsze o wiele lepsze niż tylko czytanie o tym. Oglądając film, potencjalny użytkownik może natychmiast zrozumieć funkcje i zawiłości nowego uchwytu na próbki.
Na początek stwórz czystą i wolną od kurzu powierzchnię za pomocą wilgotnej, niestrzępiącej się szmatki. Wyjmij jeden uchwyt na próbkę z pudełka i delikatnie umieść go żółtą folią skierowaną do góry na czystej powierzchni, aby uniknąć uszkodzenia lub niepożądanego przebicia tylnej folii COC. Umieść krople krystalizacji na żółtej folii, tak jak robiłoby się to na powszechnie używanych szkiełkach ochronnych.
Krople należy rozmieszczać delikatnie, aby uniknąć pęknięcia lub przebicia folii za pomocą pipety. W przypadku uchwytów na próbki typu 2 i typu 3 zalecane są dwie krople. Na uchwycie na próbkę typu 1 można umieścić do trzech kropli.
Odwróć uchwyt próbki i umieść go na wstępnie nasmarowanej wnęce 24-dołkowej płytki typu Linbro. Użyj pomocy pozycjonujących uchwytu na próbkę, aby poprowadzić go do optymalnej pozycji. Upewnij się, że uchwyt na próbkę znajduje się w prawidłowym położeniu, aby uniknąć niepożądanego parowania.
Umieszczając płytkę krystalizacyjną pod mikroskopem światła transmisyjnego, bez polaryzatorów lub bez, monitoruj wzrost kryształów bez żadnych zakłóceń eksperymentu. Wykonaj krioochronę pod mikroskopem światła transmisyjnego. Delikatnie przekłuj zewnętrzną folię COC za pomocą drobnej kaniuli.
Upewnij się, że wewnętrzna żółta folia pozostaje nietknięta. Nakłucie powinno znajdować się tuż obok kropli, która ma być manipulowana. Włóż cienki papierowy do wybitego otworu.
Ostrożnie popchnij do przodu, aż dotknie żółtej folii poliimidowej. Utrzymuj w kontakcie z perforowaną folią. odessie cały nadmiar roztworu.
Czas potrzebny do całkowitego usunięcia cieczy zależy od lepkości roztworów i składu ługu macierzystego. Po odessaniu całego płynu delikatnie cofnij papierowy. Należy pamiętać o położeniu kropli, ponieważ może ona nie być widoczna po usunięciu ługu macierzystego.
Weź standardową pipetę, aby nałożyć niewielką objętość roztworu krioochronnego, używając wytłaczanej końcówki przez ten sam otwór. Aby ponownie uszczelnić samonaprawiającą się folię COC, delikatnie przyłóż chroniony palec do otworu na około jedną sekundę i przesuń go po nakłuciu. Niewielki nacisk w połączeniu z podwyższoną temperaturą sprzyja ponownemu uszczelnianiu nakłuć, które nie są zbyt duże.
Rozpuścić ligand w ługu macierzystym w pożądanym stężeniu w probówce reakcyjnej. Wirować roztwór przez 10 minut z prędkością 12 000 g w celu usunięcia nierozpuszczalnych cząstek. W razie potrzeby użyj wirówki o kontrolowanej temperaturze.
Delikatnie umieścić maksymalnie trzy mikrolitry roztworu zawierającego ligand w szczelinie między folią COC a folią poliimidową za pomocą długiej, wytłaczanej końcówki pipety; Schowaj końcówkę. Aby ponownie uszczelnić samonaprawiającą się folię COC, delikatnie przyłóż chroniony palec do otworu na około jedną sekundę i przesuń go po nakłuciu. Inkubuj eksperyment przez jakiś czas, aby umożliwić dyfuzję przez błonę.
Czas namaczania w dużym stopniu zależy od lepkości roztworu dyfuzyjnego i jego składników. Powtórz etapy namaczania ligandów wiele razy, aby następnie namoczyć różne ligandy. Aby zminimalizować rozproszenie rozpuszczalnika, przed zebraniem danych należy usunąć nadmiar roztworu.
Zapewnij stabilne środowisko linii badawczej o kontrolowanej wilgotności z wcześniej ustalonymi warunkami. Aby przeprowadzić zbieranie danych dyfrakcyjnych in situ w temperaturze otoczenia, delikatnie podnieś przezroczystą folię COC w wyznaczonym miejscu za pomocą kleszczy i odklej ją. Teraz delikatnie wyjmij uchwyt próbki z wnęki i natychmiast włóż go do wstępnie przygotowanej magnetycznej podstawy uchwytu na próbkę.
Na tym etapie nie jest potrzebny klej. Zastosuj delikatny nacisk, aby zapewnić prawidłowe ustawienie uchwytu próbki w podstawie. W przypadku uchwytów na próbki ze zdejmowanym pierścieniem zewnętrznym należy delikatnie docisnąć, przytrzymując pierścień zewnętrzny, a następnie odłamać go w wyznaczonych punktach przerwania.
Próbka jest teraz gotowa do centrowania i zbierania danych dyfrakcyjnych. Zamontuj uchwyt próbki na goniometrze linii badawczej i upewnij się, że uchwyt jest prawidłowo ustawiony. W zależności od geometrii goniometru, uchwyt próbki można obrócić nawet o 160 stopni bez powodowania zacienienia podczas eksperymentu dyfrakcyjnego.
Użyj papierowego i delikatnie dotknij żółtej folii poliimidowej od tyłu, aby usunąć nadmiar ługu macierzystego. Próbka jest teraz gotowa do centrowania i zbierania danych dyfrakcyjnych. Przygotuj się do zbierania danych dyfrakcyjnych in situ w temperaturze kriogenicznej, tak jak w przypadku temperatury otoczenia, a następnie zanurz próbkę w ciekłym azocie i przenieś ją do fiolki kompatybilnej ze SPINE.
Geometria uchwytów na próbki typu 2 i 3 umożliwia ich przeniesienie do standardowych fiolek na próbki SPINE, które mogą być używane do montażu próbki wspomaganego przez robota. Uchwyt na próbkę typu 1 i typu 2 został zaprojektowany tak, aby pasował do studzienki 24-dołkowej płytki typu Linbro. Każdy pojedynczy uchwyt na próbkę zawiera pomoce pozycjonujące po obu stronach zewnętrznej krawędzi w celu zapewnienia optymalnego ustawienia na krawędzi studzienki.
Użyto 24-dołkowej płytki w stylu Linbro z uchwytem na próbkę typu 1, aby zrównoważyć spadek o temperaturze 293 kelwinów z 500 mikrolitrami ługu macierzystego. Kryształy o wielkości od 40 do 50 mikronów obserwowano po pięciu godzinach przy użyciu mikroskopu światła transmisyjnego z polaryzatorem lub bez. Uchwyt na próbkę z kryształami lizozymu z białka jaja kurzego umieszczono w strumieniu powietrza o kontrolowanej wilgotności na linii badawczej HZB-MX 14.3.
Pokazany jest tutaj typowy obraz dyfrakcyjny. Nie można wykryć zwiększonego rozproszenia tła na obrazie dyfrakcyjnym. Bardzo ważne jest, aby unikać zanieczyszczeń folii poliimidowej.
Ponadto ważne jest, aby uchwyt na próbkę był dokładnie ustawiony, a manipulacja kryształami przeprowadzona ostrożnie. Uchwyt na próbkę umożliwia manipulowanie bardzo delikatnymi kryształami, co jest jednym z najważniejszych etapów krystalografii mikromolekularnej. Jego użycie znacznie zmniejsza szansę na zniszczenie próbki.
Przegląd
Przedstawiono nowy uchwyt do próbek stosowany w makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej, który umożliwia wzrost kryształów oraz zbieranie danych dyfrakcyjnych in situ w różnych temperaturach bez konieczności manipulowania kryształem.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Krystalografia rentgenowska makrocząsteczek
- Techniki hodowli kryształów
- Zbieranie danych dyfrakcyjnych
Wstęp
- Tradycyjne metody wymagają manipulacji kryształami, co może prowadzić do błędów.
- Istniejące uchwyty na próbki nie umożliwiają łatwej obsługi podczas eksperymentów.
- W społeczności MX do krystalizacji powszechnie stosuje się płytki 24-dołkowe.
- Monitorowanie wzrostu kryształów bez ich zakłócania jest kluczowe dla uzyskania dokładnych wyników.
Cel badania
- Przedstawienie uchwytu na próbki, który upraszcza proces wzrostu kryształów oraz zbierania danych.
- Wyeliminowanie konieczności manipulowania kryształami podczas przeprowadzania eksperymentów.
- Zapewnienie protokołu efektywnego wykorzystania uchwytu na próbki.
Zastosowane metody
- Przygotowanie czystej powierzchni uchwytu na próbkę.
- Naniesienie kropel krystalizacyjnych na uchwyt.
- Monitorowanie wzrostu kryształów za pomocą mikroskopu świetlnego w świetle przechodzącym.
- Pomiar danych dyfrakcyjnych in situ w temperaturze otoczenia oraz w temperaturach kriogenicznych.
Główne wyniki
- Zaobserwowano pomyślny wzrost kryształów przy minimalnej manipulacji.
- Zbiór danych dostarczył wyraźnych obrazów dyfrakcyjnych bez rozproszenia tła.
- Uchwyty na próbki zaprojektowano pod kątem kompatybilności ze standardowymi płytkami 24-dołkowymi.
- Opracowano skuteczne protokoły krioprotekcji i nasączania ligandami.
Wnioski
- Nowy uchwyt na próbki znacznie ułatwia przeprowadzanie eksperymentów z zakresu krystalografii rentgenowskiej.
- Umożliwia on efektywne monitorowanie i manipulowanie procesami krystalizacji.
- Ta innowacja może poprawić jakość gromadzonych danych dyfrakcyjnych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Makcząsteczkowa krystalografia rentgenowska pozostaje fundamentem biologii strukturalnej o wysokiej rozdzielczości w procesie odkrywania leków, jednak manipulacja kruchymi kryształami wiąże się ze znacznym ryzykiem utraty próbki i degradacji danych. Ten kompleksowy uchwyt do próbek minimalizuje ingerencję mechaniczną podczas wzrostu kryształów, nasiąkania ligandami, krioprotekcji oraz zbierania danych, zwiększając tym samym prawdopodobieństwo uzyskania użytecznych danych dyfrakcyjnych z delikatnych kryształów makrocząsteczkowych. Dzięki ograniczeniu uszkodzeń wywołanych manipulacją, narzędzie to wspomaga bardziej niezawodne wyznaczanie struktury celu, co stanowi krytyczny wczesny etap w projektowaniu leków opartym na strukturze oraz optymalizacji związków wiodących.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia charakterystykę strukturalną delikatnych celów makromolekularnych bez wywoływania uszkodzeń sieci podczas manipulacji.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza utratę kryształów podczas etapów nasączania ligandem i krioprotekcji, co zwiększa wskaźnik sukcesu w początkowej fazie ograniczania ryzyka związanego z badanym celem.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Wspiera monitorowanie wzrostu kryształów i dyfuzji ligandów in situ w kontrolowanych warunkach, umożliwiając ocenę wiązania związków w czasie rzeczywistym.
- Wartość operacyjna: Eliminuje konieczność przenoszenia kryształów między płytkami lub uchwytami, usprawniając proces wysokoprzepustowego screeningu krystalizacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Dostarcza danych strukturalnych z kryształów w stanie natywnym, zachowanych dzięki minimalnej manipulacji, co zwiększa pewność modeli oddziaływań cel-ligand.
- Wartość operacyjna: Kompatybilna ze standardowymi płytkami Linbro z 24 dołkami oraz fiolkami SPINE, co ułatwia integrację z automatycznymi systemami montowania kryształów i liniami wiązki.
Integracja potoków i przepływów pracy
Uchwyt na próbki zapewnia płynny przebieg pracy – od przygotowania kropli krystalizacyjnych po pomiary dyfrakcji rentgenowskiej in situ w temperaturach pokojowych lub kriogenicznych, co redukuje liczbę etapów przenoszenia między fazą odkrywania a etapem walidacji strukturalnej.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez poprzez obserwację strukturalną stanów z wiązanym ligandem bez naruszania integralności kryształów podczas screeningu.
- Screening: Zapewnia zestandaryzowaną, wielokrotnego użytku platformę do przygotowania i monitorowania kropel, co poprawia powtarzalność w próbach krystalizacji.
- Analityka: Pozwala uzyskać obrazy dyfrakcyjne z niskim tłem, odpowiednie do ilościowego mapowania gęstości elektronowej i walidacji pozycji ligandu.
- Badania translacyjne: Pozwala zachować żywotność kryształów od screeningu w temperaturze otoczenia do kriogenicznego zbierania danych, co wspiera ciągłą analizę strukturalną.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Zaprojektowana do wielokrotnego użycia w odniesieniu do wielu celów i kampanii, co redukuje zużycie materiałów eksploatacyjnych i czas przygotowania w wspólnych pracowniach krystalograficznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa wiarygodność danych strukturalnych poprzez minimalizację artefaktów wywołanych manipulacją oraz zachowanie naturalnego upakowania kryształów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje etapy manipulacji kryształami, ograniczając zmienność oraz obciążenie związane z przeszkoleniem interdyscyplinarnych zespołów.
- Wartość strategiczna: Obniża wskaźnik niepowodzeń w projektach wyznaczania struktury, poprawiając zwrot z inwestycji w wysiłki związane z walidacją celu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji go/no-go w oparciu o wiarygodne dane strukturalne, ograniczając odrzuty na późnych etapach wynikające z błędnych założeń dotyczących celu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w technikach mikro-pipetowania oraz w mikroskopii fluorescencyjnej lub transmisyjnej w celu przygotowania i monitorowania kropel.
- Metoda jest zależna od dostępu do linii wiązek wyposażonych w możliwość dyfrakcji in situ oraz środowisk z kontrolowaną wilgotnością.
- Konieczne jest przeprowadzenie ustandaryzowanego szkolenia, aby zapewnić spójność procedur przebijania folii, stosowania knotów oraz ponownego uszczelniania przez wszystkich użytkowników.
- Podczas optymalizacji czasu namaczania w krioprotektancie i ligandach należy uwzględnić różnice w lepkości cieczy macierzystej.
- Metoda jest ograniczona do kompatybilnych formatów płytek (np. 24-dołkowych typu Linbro) i może wymagać adaptacji dla innych platform do screeningu krystalizacji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:37
Setting up Crystallization Drops and Observing Crystal Growth
1:56
Crystal Manipulation
4:23
In Situ Diffraction Data Collection at Ambient Temperature and at Cryogenic Temperature
6:20
Results: Novel Sample Holder in Macromolecular X-Ray Crystallography for Crystal Growth, Crystal Manipulation, and X-Ray Diffraction Data Collection
7:23
Conclusion
