Name: Analiza interakcji między endobiotykami a mikrobiotą jelitową człowieka przy użyciu systemów fermentacji w kąpieli in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Poznaj metodę analizy interakcji endobiotyków z mikrobiotą jelitową człowieka przy użyciu systemów fermentacji in vitro. Protokół umożliwia szybki, tan i wysokoprzepustowy screening diagnostyczny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Narodową Fundację Nauk o Przyrodzie Chin (nr 31741109), Fundację Nauk Przyrodniczych Hunan (nr 2018JJ3200) oraz program konstrukcyjny stosowanej dyscypliny charakterystycznej na Uniwersytecie Nauki i Inżynierii w Hunan. Dziękujemy LetPub (www.letpub.com) za pomoc językową podczas przygotowywania tego manuskryptu.

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etyki Uniwersytetu Nauki i Inżynierii Hunan (Hunan, Chiny) oraz Uniwersytetu Zhejiang Gongshang (Zhejiang, Chiny).
1. Przygotowanie bakterii
<ol>
<li>Przygotowanie bulionu z pożywki bifidobacterium
<ol>
<li>Połączyć następujące składniki w 950 ml wody destylowanej: ekstrakt mięsny 5 g/l; ekstrakt drożdżowy 5 g/l; pepton kazeinowy 10 g/l; sojton 5 g/l; glukoza 10 g/l; K2HPO4, 2,04 g/l; MgSO4·7H2O, 0,22 g/L; MnSO4. H20, 0,05 g/l; NaCl, 5 g/l; Animacja 80, 1 mL; roztwór soli, 40 ml (CaCl 2,2H2O,0,25 g/L; KH2PO4, 1 g/L; NaHCO3, 10 g/l; NaCl, 2 g/l); i resazuryna, 0,4 ml (2,5 mg/l). Doprowadzić pH do 6,8 za pomocą 2 M NaOH.</li>
<li>Autoklawać w temperaturze 121 °C przez 15 minut i pozostawić bulion do ostygnięcia do temperatury pokojowej (RT) w warunkach beztlenowych (10% H2, 10 % CO2, 80% N2). Do pożywki dodać sterylizowaną przez filtr cysteinę-HCl (0,5 g/l) i mupirocynę (5 mg/l).</li>
</ol>
</li>
<li>Dodać podwielokrotność (50 μl) zamrożonego Bifidobacterium longum do probówki hodowlanej z 5 ml bulionu z pożywką bifidobacterium w warunkach beztlenowych, a następnie hodować w inkubatorze beztlenowym przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie bifidobakteryjnych styropianów
<ol>
<li>Przygotowanie podłoża agarowego PYG
<ol>
<li>Połącz następujące składniki: pepton, 20 g/l; ekstrakt drożdżowy, 10 g/l; glukoza, 5 g/l; NaCl, 0,08 g/l; CaCl2, 0,008 g/l; MgSO4·7H2O, 0,008 g/l; K2HPO4, 0,04 g/l; KH2PO4, 0,04 g/L; NaHCO3, 0,4 g/l; agar, 12 g/l. Doprowadzić pH do 7,2 za pomocą 10 M NaOH.</li>
<li>Autoklawować pożywkę w temperaturze 121 °C przez 15 minut i schłodzić do temperatury ~50 °C. Następnie na 1 l pożywki dodać 0,5 ml wysterylizowanego przez filtr roztworu witaminy K1 (1 g witaminy K1 rozpuszczonej w 99 ml 99% etanolu), 5 ml roztworu heminy (0,5 g heminy rozpuszczonej w 1 ml 1 mol/l NaOH, a następnie doprowadzonej do 100 ml wodą destylowaną) i 0,5 g cysteiny-HCl.</li>
<li>Przed rozlaniem płytek PYG do podłoża dodać wysterylizowany filtrem 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galaktopyranozyd (X-Gal, 0,06 g/L), LiCl·3H2O (5,7 g/L) i mupirocynę (5 mg/L).UWAGA: X-Gal i LiCl.3H2O umożliwiają identyfikację kolonii B. longum na płytkach poprzez zmiany ubarwienia.</li>
</ol>
</li>
<li>Zaszczepić 20 μl szczepów B. longum (krok 1.2) na płytki PYG i umieścić w inkubatorze beztlenowym w temperaturze 37 °C na 72 godziny.</li>
<li>Zebrać kolonie bakterii śluzowatych z płytek PYG za pomocą miarki wagowej, a następnie całkowicie ponownie zawiesić w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą oscylatora wirowego. UWAGA: Mieszaniny bakterii i EPS należy całkowicie zawiesić poprzez wielokrotne wirowanie lub pipetowanie w górę iw dół, aż włókna całkowicie rozpuszczą się w PBS.</li>
<li>Odwirować zawiesinę o stężeniu 6 000 x g przez 5 min.</li>
<li>Ostrożnie przenieść supernatanty do nowej probówki wirówkowej i całkowicie wymieszać z trzema objętościami zimnego 99% etanolu poprzez wielokrotne odwracanie i mieszanie.</li>
<li>Odwirować mieszaninę o stężeniu 6 000 x g przez 5 minut i całkowicie usunąć supernatanty.</li>
<li>Usunąć osady z probówek wirówkowych, zeskrobując i susząc ekstrakty EPS przez noc przy użyciu próżni o dużej prędkości.</li>
</ol>
3. Przygotowanie pożywki fermentacyjnej
<ol>
<li>Przygotowanie podstawowego podłoża hodowlanego VI
<ol>
<li>Połącz następujące składniki: pepton, 3 g/l, trypton, 3 g/l, ekstrakt drożdżowy, 4,5 g/l, mucyna, 0,5 g/l, sole żółciowe nr 3, 0,4 g/l; NaCl, 4,5 g/l; KCl, 2,5 g/L; MgCl2·6H2O, 4,5 g/L; 1 ml Tween 80; CaCl 2,6H2 O, 0,2 g/L; KH2PO4, 0,4 g/L; MgSO4·7H2O, 3,0 g/L; MnCl2·4H2O, 0,32 g/L; FeSO4·7H2O, 0,1 g/l; CoSO4·7H2O, 0,18 g/L; CaCl2·2H2O, 0,1 g/L; ZnSO4·7H2O, 0,18 g/L; CuSO4·5H2O, 0,01 g/L; i NiCl2·6H2O, 0,092 g/L. Doprowadzić pH do 6,5 za pomocą 1 M HCl.</li>
<li>Przygotować heminę i cysteinę, jak opisano w sekcji 2.1 i dodać po sterylizacji w autoklawie i schłodzeniu.</li>
</ol>
</li>
<li>Przygotować pożywki hodowlane zawierające różne źródła węgla z pożywką na bazie VI. Przed autoklawowaniem dodać 8 g/l włókien Bif EPS do podłoża VI, obejmującego grupę VI_Bif. Ponadto dodać 8 g/l skrobi do podłoża VI, aby reprezentowało grupę VI_Starch. Wreszcie jako kontrolę stosuje się pożywkę VI bez dodatku źródła węgla (grupa VI). UWAGA: Bif EPS i skrobia są najpierw rozpuszczane w gorącej wodzie za pomocą mieszadła magnetycznego, a następnie mieszane z przygotowanym podłożem VI.</li>
<li>Wszystkie media należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut i pozostawić do ostygnięcia do temperatury RT.</li>
<li>Przenieść podpróbkę (5 ml) z każdej pożywki do probówek hodowlanych w inkubatorze beztlenowym i przechowywać pozostałe pożywki w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbki kału ludzkiego
<ol>
<li>Pobrać świeże próbki kału natychmiast po świeżym wypróżnieniu od zdrowych dorosłych ochotników za pomocą pojemników na kał, a następnie użyć do przygotowania gnojowicy. UWAGA: Przed pobraniem próbki wszyscy ochotnicy powinni zostać przebadani, aby upewnić się, że nie otrzymają antybiotyków, probiotyków ani terapii prebiotycznych przez co najmniej 3 miesiące przed oddaniem próbek. Ponadto wszyscy dawcy muszą wyrazić świadomą, pisemną zgodę.</li>
<li>Przenieść świeżą próbkę kału (1 g) do 10 ml 0,1 M beztlenowego PBS (pH 7,0) do szklanych zlewek, a następnie użyć szklanych pałeczek do przygotowania 10% (w/v) zawiesiny.</li>
<li>Użyj sita 0,4 mM, aby przefiltrować gnojowicę kałową. Następnie należy użyć podpróbki przefiltrowanej zawiesiny do zaszczepienia eksperymentów fermentacji w kulturach okresowych, a pozostałą część przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszych analiz. UWAGA: Kroki 4.2–4.3 przeprowadza się w komorze beztlenowej.</li>
</ol>
5. Fermentacja okresowa in vitro
<ol>
<li>Dodać przefiltrowaną gnojowicę kałową (500 μl) do pożywki fermentacyjnej przygotowanej w kroku 3.2 w komorze beztlenowej, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C.</li>
<li>Zebrać 2 ml sfermentowanych próbek po 24 godzinach i 48 godzinach w komorze beztlenowej, a następnie odwirować na zewnątrz komory przy 6 000 x g przez 3 minuty.</li>
<li>Ostrożnie przenieść supernatanty do nowej probówki wirówkowej, która będzie używana do analizy degradacji polisacharydów i pomiarów krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA).</li>
<li>Przechowywać granulki wirowania w temperaturze -80 °C, a następnie użyć do ekstrakcji bakteryjnego genomowego DNA.</li>
</ol>
6. EPS degradacja przez ludzką mikrobiotę kałową
<ol>
<li>Załaduj 0,2 μl sfermentowanych supernatantów na wstępnie powlekane aluminiowe płytki z żelem krzemionkowym-60 TLC, a następnie wysusz w suszarce do włosów.</li>
<li>Rozwiń płytki w 20 ml roztworu kwasu mrówkowego/n-butanolu/wody (6:4:1, v:v:v) i wysusz za pomocą suszarki do włosów.</li>
<li>Namocz płytki w odczynniku orcinol do farbowania, a następnie wysusz za pomocą suszarki do włosów.
<ol>
<li>Przygotuj odczynniki orcinolu, rozpuszczając 900 mg lichenolu w 25 ml wody destylowanej, a następnie dodając 375 ml etanolu. Następnie należy powoli dodawać stężony kwas siarkowy i dokładnie wymieszać roztwór.</li>
</ol>
</li>
<li>Podgrzej płyty w temperaturze 120 °C przez 3 minuty w piecu do pieczenia i oceń degradację EPS, mierząc pasma TLC.</li>
</ol>
7. Wpływ EPS na mikrobiotę jelitową człowieka
<ol>
<li>Zamrozić i rozmrozić oryginalne próbki kału przygotowane w kroku 4.3 i próbki sfermentowane przygotowane w kroku 5.4.</li>
<li>Wyodrębnij bakteryjne genomowe DNA (gDNA) ze wszystkich próbek za pomocą zestawu do ekstrakcji genomowego DNA bakteryjnego kału zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
<li>Określ stężenia, integralność i rozkład wielkości DNA za pomocą mikrospektrofotometru i elektroforezy w żelu agarowym.</li>
<li>Przeprowadź PCR bakteryjnych genów 16S rRNA z wyekstrahowanego gDNA przy użyciu następujących wcześniej opisanych starterów do przodu i do tyłu12: -forward starter (starter z kodem kreskowym 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA-starter odwrotny (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT Użyj następujących warunków termocyklera:
<ol>
<li>94 °C przez 5 min.</li>
<li>94 °C przez 30 s.</li>
<li>55 °C przez 30 s.</li>
<li>72 °C przez 1 min.</li>
<li>Powtórz 2-4 przez 35 cykli</li>
<li>72 °C przez 5 min.</li>
<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu wyjęcia z termocyklera.</li>
</ol>
</li>
<li>Przeprowadzanie wysokoprzepustowego sekwencjonowania produktów PCR w firmie zajmującej się sekwencjonowaniem DNA przy użyciu ultraprzepustowej analizy społeczności drobnoustrojów.</li>
<li>Uzyskaj czyste, wysokiej jakości sekwencje, korzystając z potoku analizy sekwencji Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME), 13.</li>
<li>Zdefiniuj operacyjne jednostki taksonomiczne (OTU) dla sekwencji genu 16S rRNA z podobieństwem nukleotydów większym niż 97%, korzystając z narzędzi bioinformatycznych, takich jak pakiet oprogramowania Mothur14.</li>
<li>Wybierz reprezentatywną sekwencję z każdego OTU i użyj klasyfikatora RDP wraz z taksonomiczną bazą danych SILVA, aby sklasyfikować reprezentatywne sekwencje15.</li>
<li>Oblicz zasięg Gooda, wskaźniki różnorodności alfa (w tym indeks Simpsona i Shannona) oraz bogactwo (obserwowaną liczbę OTU) za pomocą narzędzi bioinformatycznych16.</li>
</ol>
8. Wpływ EPS na produkcję SCFA przez ludzką mikrobiotę jelitową
<ol>
<li>Dodać sfermentowane supernatanty (1 ml) przygotowane w kroku 5.3 do 2 ml probówek wirówkowych.</li>
<li>Dodać 0,2 ml 25% (w/v) kwasu metafosforowego do każdej z próbek i dokładnie wymieszać roztwory przez wirowanie.</li>
<li>Odwirować mieszaniny o stężeniu 13 000 x g przez 20 minut i przenieść supernatanty do świeżych probówek.</li>
<li>Jednocześnie należy przygotować roztwory 120 mM kwasów octowego, propionowego, masłowego, izomasłowego, walerianowego i izowalerianowego. Następnie dodaj 1 ml każdego przygotowanego kwasu do 1,2 ml 25% (w/v) kwasu metafosforowego i użyj jako standardowych koktajli.</li>
<li>Przefiltrować próbki za pomocą membrany 0,22 μM.</li>
<li>Wykrywanie stężeń SCFA za pomocą wysokosprawnej chromatografii gazowej zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami11,17. UWAGA: Do chromatografii gazowej (GC) stosuje się kolumnę InertCap FFAP (0,25 mM x 30 m x 0,25 μM). Stężenia SCFA są następnie oznaczane ilościowo na podstawie powierzchni pików przy użyciu jednopunktowej metody wzorca wewnętrznego w pakiecie oprogramowania GC Solution.</li>
</ol>

<ol><li>Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humans+as+holobionts%3A+implications+for+prevention+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Humans as holobionts: implications for prevention and therapy.</a> Microbiome. 6 (1), 81(2018).</li>
<li>Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+psychology+of+the+human+brain-gut-microbiome+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Social+and+Personality+Psychology+Compass%22%5BJournal%5D)">A psychology of the human brain-gut-microbiome axis.</a> Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309(2017).</li>
<li>Arora, T., Bäckhed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+and+metabolic+disease%3A+current+understanding+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives.</a> Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).</li>
<li>Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenobiotics+shape+the+physiology+and+gene+expression+of+the+active+human+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome.</a> Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).</li>
<li>Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbial+interactions+in+the+metabolism+of+therapeutic+and+diet-derived+xenobiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).</li>
<li>Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenobiotics%3A+interaction+with+the+intestinal+microflora%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora.</a> ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).</li>
<li>Taguer, M., Maurice, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+interplay+of+diet%2C+xenobiotics%2C+and+microbial+metabolism+in+the+gut%3A+implications+for+clinical+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes.</a> Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).</li>
<li>Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenobiotic+metabolism+and+gut+microbiomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Xenobiotic metabolism and gut microbiomes.</a> PLoS One. 11 (10), e0163099(2016).</li>
<li>Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+transformation+of+xenobiotics+by+the+human+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota.</a> Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).</li>
<li>Hidalgo-Cantabrana, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+overview+and+biological+functions+of+exopolysaccharide+biosynthesis+in+Bifidobacterium+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).</li>
<li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+bifidobacteria-produced+exopolysaccharides+on+human+gut+microbiota+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).</li>
<li>Tang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbial+profile+is+altered+in+primary+biliary+cholangitis+and+partially+restored+after+UDCA+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy.</a> Gut. 67 (3), 534-541 (2018).</li>
<li>Kuczynski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+QIIME+to+analyze+16S+rRNA+gene+sequences+from+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities.</a> Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).</li>
<li>Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy+mothur+Toolset+%28GmT%29%3A+a+user-friendly+application+for+16S+rRNA+gene+sequencing+analysis+using+mothur%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur.</a> GigaScience. , giy166 (2018).</li>
<li>Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%C3%AFve+Bayesian+classifier+for+rapid+assignment+of+rRNA+sequences+into+the+new+bacterial+taxonomy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).</li>
<li>Schloss, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+mothur%3A+open-source%2C+platform-independent%2C+community-supported+software+for+describing+and+comparing+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).</li>
<li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+the+in+vitro+effects+of+pseudomonas+aeruginosa+and+seaweed+alginates+on+human+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota.</a> Plos One. 12 (2), e0171576(2017).</li>
<li>Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatography+for+the+analysis+of+glycosaminoglycan+oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides.</a> Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).</li>
<li>Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbiota+interactions%3A+from+holobiont+theory+to+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis.</a> Microbiome. 7 (5), (2019).</li>
<li>Postler, T. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Holobiont%3A+how+microbial+metabolites+affect+human+health+and+shape+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system.</a> Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).</li>
<li>Kramer, P., Bressan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humans+as+superorganisms%3A+how+microbes%2C+viruses%2C+imprinted+genes%2C+and+other+selfish+entities+shape+our+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Perspectives+on+Psychological+Science%22%5BJournal%5D)">Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior.</a> Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).</li>
<li>Malfertheiner, P., Nardone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota%3A+the+forgotten+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota: the forgotten organ.</a> Digestive Diseases. 29 (6), (2011).</li>
<li>Andoh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota+is+a+new+organ+in+our+body%5BTitle%5D)+AND+%22The+Japanese+journal+of+Gastro-Enterology%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota is a new organ in our body.</a> The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).</li>
<li>Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+is+more+effective+at+altering+gut+microbial+composition+and+producing+stable+changes+in+lean+mass+in+juvenile+versus+adult+male+f344+rats%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats.</a> PLoS One. 10 (5), e0125889(2015).</li>
<li>Hugenholtz, F., de Vos, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+human+intestinal+microbiota+research%3A+a+critical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).</li>
<li>Takagi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-batch+fermentation+system+to+simulate+human+colonic+microbiota+for+high-throughput+evaluation+of+prebiotics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics.</a> PLoS One. 11 (8), e0160533(2016).</li>
<li>Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+analysis+in+rats+with+methamphetamine-induced+conditioned+place+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference.</a> Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620(2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów. Dane te zostały przytoczone w Yin i wsp.Rozdział 11.

W ciągu ostatniej dekady poczyniono znaczne postępy w zrozumieniu składu i aktywności mikrobioty jelitowej człowieka. W wyniku tych badań pojawiła się koncepcja holobiontu, która reprezentuje interakcje między gospodarzami i powiązanymi społecznościami drobnoustrojów, na przykład między ludźmi a ich mikrobiotąjelitową 19,20. Co więcej, ludzie są nawet obecnie uważani za superorganizmy21, przy czym mikrobiota jelitowa została uznana za jede...

Mikrobiota jelitowa odgrywa ważną rolę w funkcjonowaniu ludzkich jelit i w zdrowiu gospodarza. W związku z tym mikrobiota jelitowa stała się ostatnio ważnym celem w profilaktyce i terapii chorób1. Co więcej, bakterie jelitowe wchodzą w interakcje z komórkami jelitowymi gospodarza i regulują podstawowe procesy gospodarza, w tym aktywność metaboliczną, dostępność składników odżywczych, modulację układu odpornościowego, a nawet funkcjonowanie mózgu i podejmowanie decyzji2,3. Endobiotyki mają znaczny potencjał wpływania na skład bakteryjny i różnorodność mikrobioty jelitowej. W związku z tym interakcje między endobiotykami a ludzką mikrobiotą jelitową przyciągają coraz większą uwagę badaczy4,5,6,7,8,9.
Trudno jest ocenić interakcje między endobiotykami a ludzką mikrobiotą jelitową in vivo ze względu na ograniczenia bioetyczne i ekonomiczne. Na przykład eksperymenty badające interakcje między endobiotykami a ludzką mikrobiotą jelitową nie mogą być przeprowadzane bez zgody Agencji ds. Żywności i Leków, a rekrutacja ochotników jest kosztowna. W związku z tym do takich badań często wykorzystuje się modele zwierzęce. Wykorzystanie modeli zwierzęcych jest jednak ograniczone ze względu na różny skład mikrobioty i różnorodność w społecznościach związanych ze zwierzętami i ludźmi. Alternatywną metodą in vitro do badania interakcji między endobiotykami a mikrobiotą jelitową człowieka jest wykorzystanie eksperymentów z hodowlami wsadowymi.
Egzopolisacharydy (EPS) to prebiotyki, które znacząco przyczyniają się do utrzymania zdrowia człowieka10. Odrębne EPS, które składają się z różnych kompozycji i struktur monosacharydowych, mogą wykazywać różne funkcje. Poprzednie analizy określiły skład Bif EPS, które są reprezentatywnym ksenobiotykiem docelowym w obecnym badaniu11. Nie wzięto jednak pod uwagę skutków metabolicznych związanych z gospodarzem w odniesieniu do składu i różnorodności EPS.
Opisany tutaj protokół wykorzystuje mikrobiotę kałową od 12 ochotników do fermentacji Bif EPS. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC), wysokoprzepustowe sekwencjonowanie genu 16S rRNA i chromatografia gazowa (GC) są następnie stosowane w połączeniu w celu zbadania interakcji między EPS a ludzką mikrobiotą jelitową. Wyraźnymi zaletami tego protokołu w porównaniu z eksperymentami in vivo są jego niski koszt i unikanie zakłócających efektów metabolizmu gospodarza. Ponadto opisany protokół może być wykorzystany w innych badaniach, które badają interakcje między endobiotykami a ludzką mikrobiotą jelitową.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m Filtry membranowe</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>Służy do filtrowania próbek</td></tr><tr><td>0,4 mm Sito</td><td>Thermo Fischer</td><td>308080-99-1</td><td>Służy do przygotowania próbek kału ludzkiego</td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl &beta;-D-galaktopiranozyd (X-Gal)</td><td>Solarbio</td><td>X1010</td><td>Służy do przygotowania płytki</td></tr><tr><td>kolorowej Acetic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71251</td><td>Próbka standardowa do agaru SCFA</td></tr><tr><td></td><td>Solarbio</td><td>YZ-1012214</td><td>Składnik średniej</td></tr><tr><td>komory beztlenowej</td><td>Electrotek&nbsp;</td><td>AW 400SG</td><td>Autoklaw do hodowli i fermentacji bakterii</td></tr><tr><td></td><td>SANYO</td><td>MLS-3750</td><td>Służy do autoklawowania</td></tr><tr><td>soi Bacto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70178</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>Piec do pieczenia</td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td><td>DHG-9240A</td><td>Służy do podgrzewania i pieczenia</td></tr><tr><td>ekstraktu z wołowiny</td><td>Solarbio</td><td>G8270</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>Bifidobacterium longum Reuter</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; 51870&trade;</td><td>bakteria</td></tr><tr><td>Sole żółciowe</td><td>Solarbio</td><td>YZ-1071304</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>Masłowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19215</td><td>Próbka wzorcowa do SCFA</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Solarbio</td><td>C7250</td><td>Roztwór soli średniej kolumny</td></tr><tr><td>kapilarnej</td><td>SHIMADZU-GL</td><td>InertCap FFAP (0,25 mm &times; 30 m &times; 0,25 &mu; m)</td> <td>Służy do wykrywania SCFA</td></tr><tr><td>Kazeina Pepton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39396</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall ST 8</td><td>Służy do wirowania</td></tr><tr><td>CoSO4.7H2O</td><td>Solarbio</td><td>C7490</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O</td><td>Solarbio</td><td>203165</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>Cysteina-HCl</td><td>Solarbio</td><td>L1550</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Służy do przygotowania witaminy K1</td></tr><tr><td>FeSO4.7H2O</td><td>Solarbio</td><td>YZ-111614</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>kwasu mrówkowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>399388</td><td>Używany do chromatografii</td></tr><tr><td>gazowej</td> TLC <td>Shimadzu Corporation</td><td>GC-2010 Plus</td><td>Używany do wykrywania SCFA</td></tr><tr><td>Szklana zlewka</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB10050</td><td>Używany do przygotowania gnojowicy</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Solarbio</td><td>G8760</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>Haemin</td><td>Solarbio</td><td>H8130</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721</td><td>Roztwór podstawowy stosowany do regulacji pH</td></tr><tr><td>Izomasłowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46935-U</td><td>Próbka wzorcowa dla SCFA</td></tr><tr><td>Kwasy izowaleriankowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>129542</td><td>Próbka wzorcowa dla SCFA</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Solarbio</td><td>D9880</td><td>Roztwór soli pożywki</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Solarbio</td><td>P9921</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Solarbio</td><td>P7392</td><td>Roztwór soli podłoża</td></tr><tr><td>LiCl.3H2O</td><td>Solarbio</td><td>C8380</td><td>Służy do przygotowania kolorowej płytki</td></tr><tr><td>Ekstrakt mięsny</td><td>Sigma-Aldrich-Aldrich</td><td>70164</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>Kwas metafosforowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7350</td><td>Próbka wzorcowa dla SCFA</td></tr><tr><td>MgCl2,6H2O</td><td>Solarbio</td><td>M8160</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>MgSO4,7H2O</td><td>Solarbio</td><td>M8300</td><td>Roztwór soli pożywki</td></tr><tr><td>systemu MISEQ</td><td>Illumina</td><td>MiSeq 300PE</td><td>sekwencjonowanie DNA</td></tr><tr><td>systemu MnSO4. H20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8179</td><td>Roztwór soli podłoża</td></tr><tr><td>Mupirocyna</td><td></td><td>Solarbio YZ-1448901</td><td>Antybiotyk</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Solarbio</td><td>YZ-100376</td><td>Roztwór soli podłoża</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792519</td><td>Roztwór soli podłoża</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-2000</td><td>NanoDrop Technologies</td><td>ND-2000</td><td>Oznaczanie stężeń DNA</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30620</td><td>Podstawowy roztwór stosowany do regulacji pH</td></tr><tr><td>n-butanol</td><td>ChemSpider</td><td>71-36-3</td><td>Używany do TLC</td></tr><tr><td>NiCl2</td><td>Solarbio</td><td>746460</td><td>Składnik podłoża</td></tr><tr><td>Orcinol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>447420</td><td>Służy do przygotowania odczynników</td></tr> <tr><td>orcynowychPropionic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94425</td><td>Standardowa próbka do SCFA</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Stool Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>51504</td><td>Ekstrakt z bakteryjnego genomowego DNA</td></tr><tr><td>Gotowy do użycia proszek PBS</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>A610100-0001</td><td>Służy do przygotowania zawiesiny lipidowej</td></tr><tr><td>Resazurin</td><td>Solarbio</td><td>R8150</td><td>Sprzęt beztlenowy</td></tr><tr><td>Szybki koncentrator próżni</td><td>LABCONCO</td><td>CentriVap</td><td>Służy do przygotowania styropianów</td></tr><tr><td>Skrobia</td><td>Solarbio</td><td>YZ-140602</td><td>Zastosowanie do źródła węgla</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>150692</td><td>Służy do przygotowania odczynników</td></tr> <tr>orcynowych<td>T100 PCR</td><td>BIO-RAD</td><td></td> 1861096 <td>Amplifikacja PCR</td></tr><tr><td>Arkusze aluminiowe TLC</td><td>MerckMillipore</td><td>116835</td><td>Używany do TLC</td></tr><tr><td>Tryptikaza Pepton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z699209</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7293</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Solarbio</td><td>T8360</td><td>Roztwór soli podłoża</td></tr><tr><td>Valeric</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75054</td><td>Standardowa próbka dla SCFA</td></tr><tr><td>Witamina K1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V3501</td><td>Składnik średniego</td></tr><tr><td>oscylatora Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>Vortex.Genie2</td><td>Służy do wirowania</td></tr><tr><td>ekstraktu drożdżowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0251</td><td>Składnik medium</td></tr></tbody></table>

analiza interakcji między endobiotykami a mikrobiotą jelitową człowieka przy użyciu systemów fermentacji w kąpieli in vitro

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Mikroorganizmy jelitowe człowieka stały się ostatnio ważnym celem badań w zakresie promowania ludzkiego zdrowia i zapobiegania chorobom. W związku z tym badania nad interakcjami między endobiotykami (np. lekami i prebiotykami) a mikrobiotą jelitową stały się ważnym tematem badawczym. Jednak eksperymenty in vivo z udziałem ochotników nie są idealne do takich badań ze względu na ograniczenia bioetyczne i ekonomiczne. W rezultacie do oceny tych interakcji in vivo wykorzystano modele zwierzęce. Niemniej jednak badania na modelach zwierzęcych są nadal ograniczone względami bioetycznymi, a także różnymi składami i różnorodnością mikrobioty u zwierząt i ludzi. Alternatywną strategią badawczą jest wykorzystanie eksperymentów fermentacji okresowej, które umożliwiają ocenę interakcji między endobiotykami a mikrobiotą jelitową in vitro. Aby ocenić tę strategię, zastosowano egzopolisacharydy bifidobakteryjne (Bif) (EPS) jako reprezentatywny ksenobiotyk. Następnie zbadano interakcje między Bif EPS a ludzką mikrobiotą jelitową przy użyciu kilku metod, takich jak chromatografia cienkowarstwowa (TLC), analiza składu społeczności bakteryjnej z wysokoprzepustowym sekwencjonowaniem genu 16S rRNA oraz chromatografia gazowa krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA). Przedstawiono protokół badania interakcji między endobiotykami a mikrobiotą jelitową człowieka przy użyciu systemów fermentacji okresowej in vitro. Co ważne, protokół ten można również zmodyfikować w celu zbadania ogólnych interakcji między innymi endobiotykami a mikrobiotą jelitową.

Produkcję śluzowych EPS można było zaobserwować w kulturach B. longum na płytkach PYG po 72 h inkubacji beztlenowej (Rysunek 1A). Wirowanie zeskrobanych kultur, a następnie wytrącanie etanolem i suszenie, pozwoliło na zebranie EPS o strukturze przypominającej celulozę (Rysunek 1B). Wysuszone EPS oraz skrobia rozpuszczalna zostały następnie wykorzystane jako źródła węgla dla kultur fermentacyjnych. Do rozdzielania oligosacharydów i analizy czystości wyko...

Opisany tutaj jest protokół do badania interakcji między endobiotykami a ludzką mikrobiotą jelitową za pomocą systemów fermentacji in vitro.

Analiza interakcji między endobiotykami a mikrobiotą jelitową człowieka przy użyciu systemów fermentacji w kąpieli in vitro

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...

Nasz protokół może być szeroko stosowany do wysokowydajnych i szybkich badań przesiewowych interakcji między endobiotykami a ludzką mikrobiotą jelitową. Niski koszt i unikanie zakłóceń spowodowanych metabolizmem gospodarza. Procedura ta może być potencjalnie wykorzystana w diagnostyce.Najpierw rozpuść BIF EPS i skrobię pojedynczo w gorącej wodzie na mieszadle magnetycznym, aby uzyskać stężenie ośmiu gramów na litr. Do przygotowanej podstawowej pożywki hodowlanej VI dodać 100 mililitrów roztworu BIF EPS, aby uzyskać roztwór BIF kultury VI. Dodaj 100 mililitrów roztworu skrobi, aby uzyskać roztwór skrobi kultury VI.Autoklawować dwie pożywki ze źródłem węgla i pożywką bez źródła węgla jako kontrolą, w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut. Pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej i dodaj siano i cysteinę. Przenieść podpróbkę składającą się z pięciu mililitrów każdej pożywki do probówek hodowlanych.I przechowywać w inkubatorze beztlenowym. Pozostałe nośniki przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przygotować ludzką próbkę kału, przenieś jeden gram świeżej próbki kału do 10 mililitrów 0,1 molowego beztlenowego PBS o pH siedem w szklanej zlewce.Następnie użyj szklanego pręta, aby wymieszać, aby uzyskać zawiesinę. W komorze beztlenowej dodaj indywidualnie 500 mikrolitrów przefiltrowanej gnojowicy kałowej do trzech przygotowanych pożywek fermentacyjnych. Następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po 24 godzinach i 48 godzinach zebrać dwa mililitry sfermentowanych próbek w komorze beztlenowej. A następnie odwirować na zewnątrz komory przy 6000 razy G przez trzy minuty. Ostrożnie przenieść supernatanty do nowych probówek wirówkowych, które będą używane do analizy degradacji polisacharydów i pomiarów krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych.Przechowuj granulki wirówki w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Załaduj 0,2 mikrolitra sfermentowanych supernatantów na każdą wstępnie pokrytą aluminiową płytkę z żelem krzemionkowym 60 TLC i zamieszaj, aby się rozprowadzić. Następnie użyj suszarki do włosów z gorącym powietrzem do wyschnięcia.Zanurzyć jeden koniec pobranych płytek w 20 mililitrach roztworu kwasu mrówkowego: n-butanol: woda na kilka minut, aż elektroforeza rozszerzy się prawie na drugi koniec. Następnie wyjmij płytki kleszczami i wysusz suszarką do włosów. Następnie namocz płytki w odczynniku orcynolu na dwie minuty, aby zabarwić.I znowu wysuszyć. Przełóż talerze do piekarnika w temperaturze 120 stopni Celsjusza, aby podgrzewały się przez trzy minuty. Następnie zrób zdjęcia płytki, aby ocenić degradację EPS poprzez pomiar pasm TLC.Aby zbadać wpływ EPS na produkcję SCFA, dodaj jeden mililitr sfermentowanych supernatantów do dwumililitrowych probówek wirówkowych i dodaj 0,2 mililitra 25 procent wagowo-objętościowych kwasu metafosforowego do każdej próbki. Wirować, aby dokładnie wymieszać roztwory. Odwirować mieszaniny w temperaturze 13 000 razy G przez 20 minut.W międzyczasie przygotuj w probówkach roztwory 120-milimolowych kwasów octowego, propionowego, masłowego, izomasłowego, walerianowego i izowalerianowego. Następnie dodaj jeden mililitr każdego przygotowanego kwasu do probówki zawierającej 1,2 mililitra kwasu metafosforowego o zawartości 25 procent wagowo-objętościowych. I załadować je do butelki na próbkę przyrządu do chromatografii gazowej jako standardowe koktajle.Wyjąć probówki z wirówki i przenieść supernatanty do świeżych probówek. Za pomocą strzykawki wyposażonej w filtr 0,22 mikrona przefiltrować supernatanty do nowych probówek do analizy metodą chromatografii gazowej. W tym badaniu produkcję śluzowatego EPS zaobserwowano w kulturach Bifidobacterium longum na płytkach PYG, po inkubacji beztlenowej przez 72 godziny.Odwirowanie skrawków hodowli, a następnie wytrącanie etanolu i suszenie, spowodowało zebranie styropianu podobnego do celulozy. Analiza TLC wykazała, że tempo degradacji skrobi przez ludzką mikrobiotę kałową było szybsze niż w przypadku BIF EPS. Główna analiza współrzędnych pokazuje, że grupy skrobi BIF kultury VI i kultury VI są zgrupowane oddzielnie od siebie, co wskazuje, że EPS i dostępność skrobi w różny sposób kształtują ludzkie społeczności bakterii kałowych.Liniowa analiza dyskryminacyjna wielkości efektu pokazuje, że rodzaje collinsella, coprococcus, parabacteroides i rhodopseudomonas były znacznie liczniejsze w próbkach BIF hodowli VI niż w próbkach skrobi VI kultur. Ponadto pomiary GC pokazują, że SCFA, które zostały zmierzone z kultur fermentacyjnych, obejmowały kwas octowy, propionowy, izomasłowy, masłowy, izowalerynowy i walerianowy. Po fermentacji przez 24 godziny i 48 godzin, pięć z sześciu stężeń SCFA było podobnych i nie różniło się statystycznie między grupami kultur VI BIF, kultur VI skrobi i kultur VI.Jednak stężenia kwasu proprionowego były istotnie wyższe w grupie VI BIF niż w grupie VI kultury skrobi, po 48 godzinach fermentacji. Przeprowadzić to doświadczenie w warunkach beztlenowych, a następnie przenieść utrwalone próbki do inkubatora beztlenowego tak szybko, jak to możliwe. Niektóre odczynniki TLC są niebezpieczne.Powinieneś być ostrożny, aby z nich korzystać.

analysis-interactions-between-endobiotics-human-gut-microbiota-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Ahmadi, S. i in. Model hodowli partii in vitro do szacowania efektów reżimów interwencyjnych na ludzką mikrobiotę kałową. J. Vis. Exp. (2019).Ten film demonstruje metodę modelowania fermentacji mikroorganizmów jelitowych poprzez inkubację próbek kału z fermentowalnym błonnikiem w warunkach beztlenowych w celu badania produkcji metabolitów przez mikrobiotę jelitową.

In vitro Model hodowli partiowej naśladujący fermentację kolonową przez ludzką mikrobiotę jelita

Źródło: Hu, Y. i inni. Analiza interakcji między endobiotyką a ludzką mikrobiotą jelitową z wykorzystaniem systemów fermentacji w kąpielach in vitro. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje zastosowanie chromatografii cienkowarstwowej (TLC) do oceny degradacji egzopolisacharydów (EPS) przez ludzką mikrobiotę kałową. Fragmenty EPS w supernatantach fermentacyjnych są rozdzielane na podstawie rozmiaru i polaryzacji za pomocą TLC, a następnie wizualizowane jako kolorowe pasy po barwieniu...

Wykonywanie chromatografii cienkowarstwowej w celu oceny degradacji egzopolisacharydów bakterii

Źródło: Hu, Y. et.al., Analiza interakcji między endobiotyką a ludzką mikrobiotą jelitową z wykorzystaniem systemów fermentacji w kąpielach in vitro. J. Vis. Exp. (2019)Ten film pokazuje analizę produkcji krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych przez ludzką mikrobiotę jelitową w odpowiedzi na egzopolisacharydy. Podkreśla ono separację i ilościową identyfikację produktów fermentacji mikroorganizmów za pomocą chromatografii gazowej. Wyniki pokazują, że egzopolisacharydy modulują metabolity...

Badanie aktywności mikroorganizmów jelitowych na egzopolisacharydach

W tym filmie opisujemy metodologię tworzenia systemu hodowli narządów jelitowych ex vivo w celu zbadania interakcji między fragmentami tkanki jelitowej myszy a specyficznymi bakteriami jelitowymi. Urządzenie składa się z dwóch par portów wejścia-wyjścia, z których pierwszy łączy światło tkanki jelitowej i dostarcza do niej specyficzną zawiesinę bakteryjną, a drugi w sposób ciągły dostarcza pożywkę do studzienek urządzenia w celu utrzymania żywotności tkanek ex vivo.

System hodowli narządów jelitowych ex vivo do badania interakcji między gospodarzem a mikrobiotą

Opisujemy protokół in vitro do wspólnej hodowli mikrobiomu jelitowego i kosmków jelitowych przez dłuższy okres przy użyciu ludzkiego systemu mikrofizjologicznego typu gut-on-a-chip.

Współhodowla żywego mikrobiomu z mikroinżynieryjnymi kosmkami jelitowymi człowieka w urządzeniu mikroprzepływowym typu gut-on-a-chip

Interakcje między gospodarzem a mikroorganizmem jelitowym zostały ocenione przy użyciu nowatorskiego podejścia łączącego syntetyczną społeczność doustną, trawienie in vitro przewodu pokarmowego i model nabłonka jelita cienkiego. Przedstawiamy metodę, którą można zaadaptować do oceny inwazji komórek patogenów i biofilmów wielogatunkowych, a nawet do badania przeżywalności preparatów probiotycznych.

Ocena żywotności konsorcjum bakterii syntetycznych na granicy faz gospodarz-mikroorganizm w jelitach in vitro

Tutaj prezentujemy protokół hodowli mikrobioty jelitowej jelita grubego in vitro, przy użyciu szeregu bioreaktorów, które symulują warunki fizjologiczne przewodu pokarmowego.

Zastosowanie zaawansowanej technologii hodowli in vitro do badania mikrobioty jelitowej człowieka

Ten protokół opisuje system fermentacji in vitro mikroflory kałowej przy użyciu inuliny (dobrze znanego prebiotyku i jednego z najczęściej badanych modulatorów mikrobioty), aby zademonstrować użycie tego systemu do szacowania wpływu konkretnych interwencji na skład mikrobioty kałowej i aktywność metaboliczną.

Model hodowli okresowej in vitro w celu oszacowania wpływu schematów interwencyjnych na mikrobiotę kału ludzkiego

Ten artykuł przedstawia unikalną metodę analizy interakcji gospodarz-mikrobiom przy użyciu nowatorskiego systemu hodowli narządów jelitowych do eksperymentów ex vivo.

System hodowli jelit i narządów do analizy interakcji między gospodarzem a mikrobiotą

Ten protokół szczegółowo opisuje montaż układów mini-bioreaktorów, które mają być wykorzystane do hodowli złożonego przepływu złożonych zbiorowisk kałowych w warunkach beztlenowych. Omówiono również metody montażu, inokulacji i pobierania próbek z reaktorów do dalszej analizy.

Montaż bioreaktora do ciągłej hodowli złożonych zbiorowisk kałowych

Minibioreactor Array (MBRA) to wysokowydajny, konfigurowalny system hodowli o ciągłym przepływie, który umożliwia hodowlę złożonych społeczności drobnoustrojów, wspierając równoległe eksperymenty w celu badania dynamiki mikrobiomu, interakcji terapeutycznych i reakcji drobnoustrojów na czynniki środowiskowe.

Zaktualizowany protokół montażu i użytkowania macierzy minibioreaktorów (MBRA)

Poznaj metodę analizy interakcji endobiotyków z mikrobiotą jelitową człowieka przy użyciu systemów fermentacji in vitro. Protokół umożliwia szybki, tan i wysokoprzepustowy screening diagnostyczny.

Analiza interakcji między endobiotykami a mikrobiotą jelitową człowieka przy użyciu systemów fermentacji w kąpieli in vitro

Przeglądaj więcej filmów