Analiza interakcji między endobiotykami a mikrobiotą jelitową człowieka przy użyciu systemów fermentacji w kąpieli in vitro
August 23rd, 2019
Opisany tutaj jest protokół do badania interakcji między endobiotykami a ludzką mikrobiotą jelitową za pomocą systemów fermentacji in vitro.
Nasz protokół może być szeroko stosowany do wysokowydajnych i szybkich badań przesiewowych interakcji między endobiotykami a ludzką mikrobiotą jelitową. Niski koszt i unikanie zakłóceń spowodowanych metabolizmem gospodarza. Procedura ta może być potencjalnie wykorzystana w diagnostyce.
Najpierw rozpuść BIF EPS i skrobię pojedynczo w gorącej wodzie na mieszadle magnetycznym, aby uzyskać stężenie ośmiu gramów na litr. Do przygotowanej podstawowej pożywki hodowlanej VI dodać 100 mililitrów roztworu BIF EPS, aby uzyskać roztwór BIF kultury VI. Dodaj 100 mililitrów roztworu skrobi, aby uzyskać roztwór skrobi kultury VI.
Autoklawować dwie pożywki ze źródłem węgla i pożywką bez źródła węgla jako kontrolą, w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut. Pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej i dodaj siano i cysteinę. Przenieść podpróbkę składającą się z pięciu mililitrów każdej pożywki do probówek hodowlanych.
I przechowywać w inkubatorze beztlenowym. Pozostałe nośniki przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przygotować ludzką próbkę kału, przenieś jeden gram świeżej próbki kału do 10 mililitrów 0,1 molowego beztlenowego PBS o pH siedem w szklanej zlewce.
Następnie użyj szklanego pręta, aby wymieszać, aby uzyskać zawiesinę. W komorze beztlenowej dodaj indywidualnie 500 mikrolitrów przefiltrowanej gnojowicy kałowej do trzech przygotowanych pożywek fermentacyjnych. Następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po 24 godzinach i 48 godzinach zebrać dwa mililitry sfermentowanych próbek w komorze beztlenowej. A następnie odwirować na zewnątrz komory przy 6000 razy G przez trzy minuty. Ostrożnie przenieść supernatanty do nowych probówek wirówkowych, które będą używane do analizy degradacji polisacharydów i pomiarów krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych.
Przechowuj granulki wirówki w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Załaduj 0,2 mikrolitra sfermentowanych supernatantów na każdą wstępnie pokrytą aluminiową płytkę z żelem krzemionkowym 60 TLC i zamieszaj, aby się rozprowadzić. Następnie użyj suszarki do włosów z gorącym powietrzem do wyschnięcia.
Zanurzyć jeden koniec pobranych płytek w 20 mililitrach roztworu kwasu mrówkowego: n-butanol: woda na kilka minut, aż elektroforeza rozszerzy się prawie na drugi koniec. Następnie wyjmij płytki kleszczami i wysusz suszarką do włosów. Następnie namocz płytki w odczynniku orcynolu na dwie minuty, aby zabarwić.
I znowu wysuszyć. Przełóż talerze do piekarnika w temperaturze 120 stopni Celsjusza, aby podgrzewały się przez trzy minuty. Następnie zrób zdjęcia płytki, aby ocenić degradację EPS poprzez pomiar pasm TLC.
Aby zbadać wpływ EPS na produkcję SCFA, dodaj jeden mililitr sfermentowanych supernatantów do dwumililitrowych probówek wirówkowych i dodaj 0,2 mililitra 25 procent wagowo-objętościowych kwasu metafosforowego do każdej próbki. Wirować, aby dokładnie wymieszać roztwory. Odwirować mieszaniny w temperaturze 13 000 razy G przez 20 minut.
W międzyczasie przygotuj w probówkach roztwory 120-milimolowych kwasów octowego, propionowego, masłowego, izomasłowego, walerianowego i izowalerianowego. Następnie dodaj jeden mililitr każdego przygotowanego kwasu do probówki zawierającej 1,2 mililitra kwasu metafosforowego o zawartości 25 procent wagowo-objętościowych. I załadować je do butelki na próbkę przyrządu do chromatografii gazowej jako standardowe koktajle.
Wyjąć probówki z wirówki i przenieść supernatanty do świeżych probówek. Za pomocą strzykawki wyposażonej w filtr 0,22 mikrona przefiltrować supernatanty do nowych probówek do analizy metodą chromatografii gazowej. W tym badaniu produkcję śluzowatego EPS zaobserwowano w kulturach Bifidobacterium longum na płytkach PYG, po inkubacji beztlenowej przez 72 godziny.
Odwirowanie skrawków hodowli, a następnie wytrącanie etanolu i suszenie, spowodowało zebranie styropianu podobnego do celulozy. Analiza TLC wykazała, że tempo degradacji skrobi przez ludzką mikrobiotę kałową było szybsze niż w przypadku BIF EPS. Główna analiza współrzędnych pokazuje, że grupy skrobi BIF kultury VI i kultury VI są zgrupowane oddzielnie od siebie, co wskazuje, że EPS i dostępność skrobi w różny sposób kształtują ludzkie społeczności bakterii kałowych.
Liniowa analiza dyskryminacyjna wielkości efektu pokazuje, że rodzaje collinsella, coprococcus, parabacteroides i rhodopseudomonas były znacznie liczniejsze w próbkach BIF hodowli VI niż w próbkach skrobi VI kultur. Ponadto pomiary GC pokazują, że SCFA, które zostały zmierzone z kultur fermentacyjnych, obejmowały kwas octowy, propionowy, izomasłowy, masłowy, izowalerynowy i walerianowy. Po fermentacji przez 24 godziny i 48 godzin, pięć z sześciu stężeń SCFA było podobnych i nie różniło się statystycznie między grupami kultur VI BIF, kultur VI skrobi i kultur VI.
Jednak stężenia kwasu proprionowego były istotnie wyższe w grupie VI BIF niż w grupie VI kultury skrobi, po 48 godzinach fermentacji. Przeprowadzić to doświadczenie w warunkach beztlenowych, a następnie przenieść utrwalone próbki do inkubatora beztlenowego tak szybko, jak to możliwe. Niektóre odczynniki TLC są niebezpieczne.
Powinieneś być ostrożny, aby z nich korzystać.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół bada interakcje między endobiotykami a ludzką mikroflorą jelitową za pomocą in vitro systemów fermentacji wsadu. Jest zaprojektowany do przesiewowego i szybkiego badania, minimalizując interferencję z metabolizmem żywiciela.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Zdrowie jelit
- Metabolomika
Tło
- Endobiotyki odgrywają kluczową rolę w zdrowiu ludzkim.
- Mikroflora jelitowa znacząco wpływa na procesy metaboliczne.
- Rozumienie tych interakcji może pomóc w diagnostyce.
- Obecne metody mogą być ograniczone przez interferencję metabolizmu żywiciela.
Cel badania
- Opracowanie protokołu do badania interakcji endobiotyków z mikroflorą.
- Umożliwienie przesiewowego badania tych interakcji.
- Dostarczenie nisko kosztowej alternatywy dla badań.
Stosowane metody
- Rozpuszczanie BIF EPS i skrobi w gorącej wodzie.
- Przygotowywanie pożywki kulturowej do fermentacji.
- Wykorzystanie systemów fermentacji wsadu do badań interakcji.
- Monitorowanie wpływu endobiotyków na mikroflorę jelitową.
Główne wyniki
- Udana preparacja roztworów BIF EPS i skrobi.
- Ustanowienie niezawodnego protokołu fermentacji.
- Demonstracja potencjału protokołu w diagnostyce.
- Wgląd w interakcje między endobiotykami a mikroflorą.
Wnioski
- Protokół oferuje cennym narzędziem do badań nad mikroflorą.
- Może ułatwić zrozumienie interakcji metabolicznych.
- Przyszłe zastosowania mogą zwiększyć zdolności diagnostyczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput, low-cost in vitro screening of endobiotic-gut microbiota interactions, reducing reliance on animal models and minimizing host metabolism interference. It supports early-stage target validation by providing quantitative data on microbial community shifts and metabolite production, which are critical for de-risking microbiome-modulating therapeutics. The approach is directly applicable to preclinical discovery workflows where mechanistic understanding of compound-microbiota effects informs lead selection and portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of how endobiotics like prebiotics or drugs modulate human gut bacterial communities, supporting target hypothesis testing.
- Operational Value: Uses accessible methods such as 16S rRNA sequencing and SCFA quantification to generate reproducible, mechanistically informative data.
- Predictive Value: Differentiates microbial responses to structurally distinct carbohydrates (e.g., EPS vs. starch), aiding in structure-activity relationship assessments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides standardized anaerobic fermentation conditions for consistent evaluation of microbiota-mediated compound degradation.
- Operational Value: Compatible with high-throughput formats due to simple sample preparation and scalable readouts like TLC and GC.
- Assay Readiness: Generates quantifiable outputs (SCFA profiles, community shifts) that can be used to compare compound effects across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Uses human fecal inoculum, enhancing relevance to human physiology compared to animal models.
- Mechanistic De-risking: Identifies specific microbial responders (e.g., Collinsella, Coprococcus) to endobiotics, supporting biomarker-linked mechanism of action.
- Preclinical Continuity: Enables dose- and time-dependent profiling (24h/48h) to inform safety and efficacy windows in later models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, particularly for microbiome-active compounds where understanding microbiota-mediated metabolism is essential for predicting in vivo behavior.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening of endobiotics by linking compound exposure to measurable changes in microbial composition and function.
- Screening: Enables rapid assessment of microbiota interactions using TLC for polysaccharide degradation and GC for SCFA quantification as orthogonal readouts.
- Analytics: Generates multivariate data (16S sequencing, SCFA concentrations) that allow statistical comparison of treatment effects and identification of significant shifts.
- Translational Research: Uses human-derived microbiota, improving predictive confidence for clinical translation over murine models.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to various endobiotics (drugs, prebiotics, polysaccharides), making it a reusable platform across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in microbiota-endobiotic interactions through direct observation of degradation patterns and microbial responders.
- Operational Value: Low cost, anaerobic workflow, and standardized sampling improve reproducibility and cross-lab comparability.
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions by flagging microbiota-mediated metabolism that could alter drug efficacy or toxicity.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their impact on beneficial microbiota and SCFA profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in anaerobic microbiology and sterile technique to maintain sample integrity.
- Needs access to TLC plates, gas chromatography, and 16S rRNA sequencing infrastructure for full readout panel.
- Standardization across labs requires consistent fecal donor processing and anaerobic incubation conditions.
- Adaptation to other endobiotics necessitates solubility and stability testing under fermentation conditions.
- Practical limitations include variability in donor microbiota and the need for careful handling of hazardous TLC reagents (e.g., orcinol, formic acid).
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Preparation of Fermentation Medium and Human Fecal Sample
1:48
In Vitro Batch Fermentation
2:33
EPS Degradation by Human Fecal Microbiota
3:29
Effects of EPS on SCFA (Short-chain Fatty Acids) Production by Human Intestinal Microbiota
4:41
Results: Degradation by Fermentation
6:24
Conclusion
