Name: Ekspresja, oczyszczanie, krystalizacja i oznaczanie enzymatyczne białek zawierających hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Poznaj ekspresję i oczyszczanie białek z domeną FAH, w tym FAHD1, w E. coli przy użyciu chromatografii afinitetycznej Ni-NTA i FPLC. Metody te umożliwiają badanie aktywności enzymatycznej i struktury białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są bardzo wdzięczni za fachową pomoc techniczną Annabelli Pittl i opracowanie metody pilotażowej przez Haymo Pircera.

<ol><li>Brouns, S. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Insight+into+Substrate+Binding+and+Catalysis+of+a+Novel+2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate+Dehydratase+Illustrates+Common+Mechanistic+Features+of+the+FAH+Superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily.</a> Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).</li>
<li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Structure+%28London%2C+England%3A+1993%29%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure (London, England: 1993). 7, 1023-1033 (1999).</li>
<li>Weiss, A. K. H., Loeffler, J. R., Liedl, K. R., Gstach, H., Jansen-Dürr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fumarylacetoacetate+hydrolase+%28FAH%29+superfamily+of+enzymes%3A+multifunctional+enzymes+from+microbes+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) superfamily of enzymes: multifunctional enzymes from microbes to mitochondria.</a> Biochemical Society Transactions. 46, 295(2018).</li>
<li>Guimarães, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structures+of+Apo+and+Liganded+4-Oxalocrotonate+Decarboxylase+Uncover+a+Structural+Basis+for+the+Metal-Assisted+Decarboxylation+of+a+Vinylogous+%CE%B2-Keto+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous β-Keto Acid.</a> Biochemistry. 55, 2632(2016).</li>
<li>Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nag+genes+of+Ralstonia+%28formerly+Pseudomonas%29+sp.+strain+U2+encoding+enzymes+for+gentisate+catabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism.</a> Journal of Bacteriology. 183, 700(2001).</li>
<li>Izumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Mechanism+of+HpcG%2C+a+Hydratase+in+the+Homoprotocatechuate+Degradation+Pathway+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure and Mechanism of HpcG, a Hydratase in the Homoprotocatechuate Degradation Pathway of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 370, 899-911 (2007).</li>
<li>Manjasetty, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structure+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+family+member+Homo+sapiens+FLJ36880%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880.</a> Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).</li>
<li>Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+HpcE%2C+a+bifunctional+decarboxylase%2Fisomerase+with+a+multifunctional+fold%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of HpcE, a bifunctional decarboxylase/isomerase with a multifunctional fold.</a> Biochemistry. 41, 2982-2989 (2002).</li>
<li>Ran, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+Cg1458+reveal+a+catalytic+lid+domain+and+a+common+catalytic+mechanism+for+the+FAH+family%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of Cg1458 reveal a catalytic lid domain and a common catalytic mechanism for the FAH family.</a> The Biochemical Journal. 449, 51-60 (2013).</li>
<li>Ran, T., Wang, Y., Xu, D., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+crystallization+and+preliminary+crystallographic+analysis+of+Cg1458%3A+A+novel+oxaloacetate+decarboxylase+from+Corynebacterium+glutamicum%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3A+Structural+Biology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Cg1458: A novel oxaloacetate decarboxylase from Corynebacterium glutamicum.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 67, 968-970 (2011).</li>
<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+%28FAHD1%29+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 36500-36508 (2011).</li>
<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+%28FAHD1%29+as+oxaloacetate+decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290, 6755-6762 (2015).</li>
<li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li>
<li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+%E2%80%93+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 – a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).</li>
<li>Taferner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAH+domain-containing+protein+1+%28FAHD-1%29+Is+required+for+mitochondrial+function+and+locomotion+activity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans.</a> PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).</li>
<li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).</li>
<li>Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+Inferences+from+the+Crystal+Structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+Bound+Phosphorus-based+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).</li>
<li>Zeng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+strategy+for+introducing+large+and+multiple+changes+in+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA.</a> Scientific Reports. 8, 1714(2018).</li>
<li>Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+of+in+vitro+preparation+and+specific+mutagenesis+of+DNA+fragments%3A+study+of+protein+and+DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions.</a> Nucleic Acids Research. 16, 7351-7367 (1988).</li>
<li>Jansen-Duerr, P., Pircher, H., Weiss, A. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FAH+Fold+Meets+the+Krebs+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Enzymology+and+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">The FAH Fold Meets the Krebs Cycle.</a> Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).</li>
<li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+use+of+crystallization+phase+diagrams%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Origin and use of crystallization phase diagrams.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).</li>
<li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRupp%2C+B+%22Biomolecular+Crystallography%3A+Principles%2C+Practice%2C+and+Application+to+Structural+Biology%22">Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology</a>. , Garland Science. (2010).</li>
<li>Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enol+oxalacetic+acid+exists+in+the+Z+form+in+the+crystalline+state+and+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enol oxalacetic acid exists in the Z form in the crystalline state and in solution.</a> The Journal of Organic Chemistry. 57, 7270-7274 (1992).</li>
<li>Pogson, C. I. I., Wolfe, R. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxaloacetic+acid+tautomeric+and+hydrated+forms+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Oxaloacetic acid tautomeric and hydrated forms in solution.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 46, 1048-1054 (1972).</li>
<li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L., Kost, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).</li>
<li>Steinberger, R., Westheimer, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+Ion-catalyzed+Decarboxylation%3A+A+Model+for+an+Enzyme+System+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1.</a> Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).</li>
<li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability+constants+of+the+magnesium+complexes+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).</li>
<li>Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acid+dissociations+of+the+keto+and+enol+isomers+of+oxaloacetic+acid+at+25%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25.</a> Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).</li>
<li>Brecker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+2%2C4-diketoacids+and+their+aqueous+solution+structures%5BTitle%5D)+AND+%22New+Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures.</a> New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia i deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych. H. G. jest dyrektorem generalnym w MoleculeCrafting.HuGs e.U. i dostarczył acylopirogroniany do tego badania poprzez niestandardową syntezę. Prace w laboratorium P. J. D. były wspierane przez Austriacki Fundusz Naukowy (FWF): numer projektu P 31582-B26. Opłaty za publikację tego manuskryptu zostały częściowo pokryte przez Austriacki Fundusz Naukowy (FWF) w ramach projektu o numerze P 31582-B26. A. N. i B. R. są wspierani przez Austriacki Fundusz Naukowy (FWF) w ramach projektu P28395-B26.

Hydrolaza fumaryloacetooctanu (FAH)1,2 nadrodzina enzymów opisuje grupę enzymów, które dzielą wysoce konserwatywną katalityczną domenę FAH3,4,5,6,7,8,9,10. Pomimo wspólnego centrum katalitycznego, enzymy te są wielofunkcyjne, a większość z nich znajduje się u prokariontów, gdzie są używane do rozkładania związków pobranych ze złożonych źródeł węgla3. Do tej pory u eukariontów zidentyfikowano tylko trzech członków tej rodziny: nazwę dającą FAH2, a także białko 1 zawierające domenę FAH (FAHD1)11,12,13,14,15 i białko zawierające domenę FAH 2 (FAHD2). Wyczerpanie FAHD1 wiąże się z upośledzeniem oddychania mitochondrialnego13,16 i wiąże się z odwracalnym typem fenenotypu starzenia się komórek14, który jest związany z pośrednimi potencjalnymi brakami w systemie transportu elektronów. Ludzki FAHD1 i jego ortologie w układach modelowych (myszy, nicienie, linie komórkowe raka, rośliny itp.), a także wybrane warianty mutacji punktowych, stały się potencjalnymi celami terapeutycznymi. Do tych badań niezbędne jest rekombinowane białko o wysokim poziomie czystości, a także informacje na temat mechanizmów katalitycznych kierowanych przez struktury krystaliczne i selektywne przeciwciała.
Ten manuskrypt opisuje metody ekspresji białka FAHD u E. coli, chromatografia powinowactwa, chromatografia jonowymienna, wytrącanie siarczanu amonu, preparatywna i analityczna filtracja żelowa, krystalizacja, dyfrakcja rentgenowska i testy fotometryczne. Celem opisanych tutaj metod i protokołów jest dostarczenie wskazówek dla naukowców pracujących w różnych dziedzinach, takich jak bakteriologia, biologia roślin, a także badania na zwierzętach i ludziach, w celu scharakteryzowania członków nadrodziny FAH, w tym niescharakteryzowanych członków nadrodziny, jeśli staną się oni istotni w określonej dziedzinie. Opisane tutaj protokoły mogą stanowić cenne wsparcie dla projektów mających na celu scharakteryzowanie innych prokariotycznych lub eukariotycznych członków nadrodziny FAH.
Uzasadnieniem dla opisanych tutaj metod jest fakt, że do charakterystyki słabo opisanych białek (w szczególności enzymów metabolicznych o nieznanym znaczeniu fizjologicznym), podejście polegające na rozpoczęciu od oczyszczonych białek rekombinowanych pozwala na opracowanie bezcennych, wysokiej jakości narzędzi badawczych, takich jak aktywne preparaty enzymatyczne in vitro, wysokiej jakości przeciwciała oraz silne i specyficzne inhibitory farmakologiczne dla wybranych enzymów. Opisane metody wymagają szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) i krystalografii rentgenowskiej. Alternatywne metody (np. do ekspresji białka bez indukcji chemicznej lub do przedstawienia oczyszczania białka przez odwirowanie po obróbce cieplnej, a następnie odsalanie i chromatografię wykluczania wielkości) można znaleźć gdzie indziej17. Chociaż dostępne jest szersze spektrum metod ekspresji i oczyszczania enzymów z nadrodziny FAH2,7,9,17,18, niniejsza praca koncentruje się w szczególności na ekspresji i oczyszczaniu białek FAHD.
W sekcji dyskusji tego manuskryptu, mechanizmy katalityczne zidentyfikowane dla białka FAHD1 (hydrolaza, dekarboksylaza)15 są opisane bardziej szczegółowo, aby zademonstrować chemiczny charakter katalizowanych reakcji. Dane uzyskane na podstawie poprzednich prac7,15,18 (PDB: 6FOG, PDB:6FOH) implikują trzecią aktywność enzymu jako izomerazę keto-enolową.

<table><tbody><tr><td>BL21(DE3) pLysS kompetentny E. coli</td><td>Promega</td><td>L1195</td><td>Wysokowydajna ekspresja białka z genu z promotorem T7 i miejscem wiązania rybosomów</td></tr><tr><td>pET E. coli T7 Wektory ekspresji</td><td></td><td></td> <td>MERCK-http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav</td></tr><tr><td>0,45 i mikro; m jednostki filtracyjne</td><td>MERCK</td><td>SLHP033NS</td><td>Millex-HP, 0,45 &mikro; m, PES 33 mm, nie sterylne</td></tr><tr><td>0,22 &mikro; m jednostki filtracyjne</td><td>MERCK</td><td>SLGP033RS</td><td>Millex-HP, 0,22 i mikro; m, PES 33 mm, niesterylne</td></tr><tr><td>Probówki Eppendof 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>525-1042</td><td>probówki mikroodśrodkowe; autoklawizowane</td></tr><tr><td>15 ml Falcon</td><td>VWR</td><td>734-0451</td><td>probówki odśrodkowe</td></tr><tr><td>50 ml Falcon</td><td>VWR</td><td>734-0448</td> rurki <td>odśrodkowe</td></tr><tr><td>Spektrofotometr kuwetowy PS Semi-Micro</td><td>VWR</td><td>30622-758</td><td>VIS przezroczyste kuwety</td></tr><tr><td>Kuwety UV Spektrofotometr Semi-Micro</td><td>VWR</td><td>47727-024</td><td>Przezroczyste kuwety UV/VIS</td></tr><tr><td>izopropylo-&beta;-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>ROTH</td><td>2316</td><td>substancja chemiczna stosowana do indukcji ekspresji białek za pomocą systemu DE3/pET</td></tr><tr><td>imidazol</td><td>ROTH</td><td>X998</td><td>substancja chemiczna stosowana do elucji sekwencji polihistydyny (6xHis) z żywicy o powinowactwie naładowanej niklem</td></tr><tr><td>Szklane kolumny ekonokolumnowe</td><td>Bio-Rad</td><td>-</td><td>http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&pcp_loc=catprod</td></tr><tr><td>chloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>antybiotyk do selekcji wzrostu bakterii; oporność endi&oacute; w plazmidzie pLysS BL21(DE3) E. coli; 25 &mikro; g/ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>kanamycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>antybiotyk do selekcji wzrostu bakterii; do stosowania, jeśli oporność ta jest kodowana w zastosowanym wektorze pET; 50 &mikro; g/ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>ampicylina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1593</td><td>antybiotyk do selekcji wzrostu bakterii; do stosowania, jeśli oporność ta jest kodowana w zastosowanym wektorze pET; 100 &mikro; g/ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Ultra-15, MWCO 10 kDa</td> Filtry odśrodkowe <td>Sigma-Aldrich</td><td>Z706345</td><td>do wzbogacania białek; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de&reg;ion=AT</td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Ultra-0,5 Filtry odśrodkowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z677108</td><td>do wzbogacania białek; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&region=AT&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2</td></tr><tr><td>kwas szczawiooctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4126</td><td>Metabolit TCA</td></tr>, <tr><td>okklalanian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71800</td><td>, kompetycyjny inhibitor enzymów z nadrodziny FAH,</td></tr><tr><td>rurki do dializy, membrana celulozowa</td>, <td>Sigma-Aldrich,</td><td>D9277</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; lub porównywalna</td></tr><tr><td>agaroza Ni-NTA</td><td>Thermo-Fischer</td><td>R90101</td><td>żywica o powinowactwie naładowana niklem, która może być stosowana do oczyszczania rekombinowanych białek zawierających sekwencję polihistydyny (6xHis)</td></tr><tr><td>96-dołkowa mikropłytka UV</td><td>Thermo-Fischer</td><td>8404</td><td>UV/VIS przezroczyste płaskie dno 96-dołkowe</td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 do 180 kDa</td><td>Thermo-Fischer</td><td>26616</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616</td></tr><tr><td>&Auml; System KTA FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td> <td>-</td> <td>przy użyciu systemu FPLC firmy GE Healthcare; istnieją różne wersje niestandardowe; w tej pracy użyto "&Auml; System KTA pure"</td></tr><tr><td>HiTrap Kolumna Phenyl HP</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze-https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Mono S 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>-</td><td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723</td></tr><tr><td>Mono Q 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences-https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>HiLoad Kolumna Superdex 75 pg (G75)</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>-</td><td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800</td></tr><tr><td>Kolumna HiLoad Superdex 200 pg (G200)</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>-</td><td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek TECAN</td><td>Nauki przyrodnicze-https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>acetylopirogronian</td><td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td><td>-</td><td>niestandardowa synteza</td></tr><tr><td>benzoilopirogronianu</td><td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td><td>-</td><td>niestandardowa synteza</td></tr><tr><td>VDX i płytka handlowa (24 dołki)</td><td>Hampton</td><td>HR3-142</td><td>24-dołkowe płytki używane do krystalizacji za pomocą Hanging Drop Vapor Diffusion</td></tr><tr><td>olej parafinowy</td><td>Hampton</td><td>HR3-411</td><td>używany do krystalizacji za pomocą wiszących</td></tr><tr><td>szkiełek nakrywkowych Vapor Diffusion (22 mm)</td><td>Karl Hecht KG</td><td>14043</td><td>szkiełka nakrywkowe używane do krystalizacji za pomocą dyfuzji</td></tr> <tr><td>parowej Hanging DropBulion Luria (LB) pożywka</td><td>przygotowana samodzielnie</td> <td>-</td> <td>ogólna pożywka dla E. coli: 5 g/L ekstraktu drożdżowego; 10 g/L peptonu z kazeiny; 10 g/L chlorku sodu; 12 g/L agar-agar</td></tr><tr><td>NZCYM pożywka</td><td>samodzielnie przygotowana</td> <td>-</td> <td>lepsza pożywka dla E. coli, używana do amplifikacji: 10 g/L aminy NZ; 5 g/L NaCl; 5 g/L ekstraktu drożdżowego; 1 g/L casaminokwasy; 2 g/L MgSO4; dostosuj pH do 7,4</td></tr><tr><td>bulion Luria (LB) płytki agarozowe</td><td>samodzielnie przygotowane</td> <td>-</td> <td>autoklawowane płytki agarozowe zawierające pożywkę LB i antybiotyki do selekcji groth bakteryjnej; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/</td></tr> <tr><td>Bufor biegowy Ni-NTA</td> przygotowany <td>samodzielnie -</td><td></td> <td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazol; zakresy: optymalna wartość różni się w zależności od białek FAHD</td></tr><tr><td>Bufor elucyjny Ni-NTA</td><td>samodzielnie przygotowany</td><td>-</td><td>20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazolu; zakresy: optymalna wartość różni się w zależności od białek FAHD</td></tr><tr><td>bufor do biegania HIC</td><td>przygotowany</td> <td>samodzielnie-44</td> <td>mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM naziemna telewizja cyfrowa; dostosować do pH 7</td></tr><tr><td>bufor biegowy HIC AS</td> samodzielnie <td>przygotowany</td> <td>bufor</td> <td>biegowy HIC nasycony siarczanem amonu (AS); dostosować do pH 7: 70 g siarczanu amonu + 90 ml buforu, mieszać przez noc w chłodni; dostosować do pH 7,0</td></tr><tr><td>Bufor o niskiej zawartości soli Mono S</td><td>przygotowany samodzielnie</td><td>-</td><td>44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; zakresy: optymalna wartość różni się w zależności od białek FAHD</td></tr><tr><td>Bufor o wysokiej zawartości soli Mono S</td> przygotowany <td></td><td></td><td>samodzielnie-44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; zakresy: optymalna wartość różni się w zależności od białek FAHD</td></tr><tr><td>Bufor niskosolny Mono Q</td><td>przygotowany</td> <td>samodzielnie-20</td> <td>mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; dostosować do pH 8,0</td></tr><tr><td>Bufor o wysokiej zawartości soli Mono Q</td><td>przygotowany samodzielnie</td><td>-</td><td>20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glicerolu; dostosować do pH 8,0</td></tr><tr><td>G75 / G200 bufor do biegania</td> przygotowany <td></td><td>samodzielnie-15</td> <td>mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; dostosować do pH 7,4</td></tr><tr><td>bufor do oznaczania enzymów</td><td>przygotowany samodzielnie-50</td><td></td> <td>mM Tris-HCl pH7,4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>białkowy bufor krystalizacyjny</td><td>przygotowany samodzielnie -</td><td></td> <td>G75 / G200 działający bufor z 1 mM</td></tr><tr><td>roztworem zbiornikowym DTT do krystalizacji</td><td>samodzielnie przygotowany</td> <td>-</td> <td>100 mM Na-HEPES pH 7,5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2</td></tr></tbody></table>

ekspresja, oczyszczanie, krystalizacja i oznaczanie enzymatyczne białek zawierających hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Białka zawierające domenę hydrolazy hydrolazy fumaryloacetooctanu (FAH) są zidentyfikowanymi członkami nadrodziny FAH u eukariontów. Enzymy z tej nadrodziny na ogół wykazują wielofunkcyjność, obejmującą głównie mechanizmy hydrolazy i dekarboksylazy. W artykule przedstawiono szereg następujących po sobie metod ekspresji i oczyszczania białek FAHD, głównie ortologów białka FAHD 1 (FAHD1) wśród gatunków (człowiek, mysz, nicienie, rośliny itp.). Omówione metody obejmują ekspresję białek w E. coli, chromatografię powinowactwa, chromatografię jonowymienną, preparatywną i analityczną filtrację żelową, krystalizację, dyfrakcję promieniowania rentgenowskiego i testy fotometryczne. Skoncentrowane białko o wysokim poziomie czystości (>98%) może być wykorzystane do krystalizacji lub produkcji przeciwciał. Białka o podobnej lub gorszej jakości mogą być stosowane w testach enzymatycznych lub wykorzystywane jako antygeny w systemach detekcji (Western-Blot, ELISA). W omówieniu tej pracy przedstawiono zidentyfikowane mechanizmy enzymatyczne FAHD1 w celu bardziej szczegółowego opisania jego dwufunkcyjności hydrolazy i dekarboksylazy.

Zaczynając od przygotowanego wektora klonowania i zakupionego BL21(DE3) pLysS E. coli, plazmid jest wprowadzany do bakterii za pomocą szoku termicznego lub innej odpowiedniej alternatywnej metody (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Po krótkim okresie amplifikacji przekształcone bakterie są umieszczane na płytkach agarowych LB, aby rosły przez noc. Tablice w tym momencie mogą wyglądać inaczej, w zależności od różnych potencjalnych źródeł błędów. Płytki mogą być puste (tj. bez kolonii), całkowicie zarośnięte bakteriami lub czymś pomiędzy. Dwa przykłady płytek agarowych LB po optymalnej i nieoptymalnej transformacji przedstawiono na Rysunek 7A. Zbyt wiele kolonii bakteryjnych wskazuje, że albo zbyt wiele bakterii zostało posianych (prawdopodobnie), albo że stosowane antybiotyki mogą być przeterminowane (mało prawdopodobne). Zbyt mała liczba kolonii bakteryjnych może wskazywać, że albo do transformacji nie użyto wystarczającej ilości plazmidu (następnym razem użyj więcej), albo że do selekcji bakterii użyto zbyt dużej ilości antybiotyków. W każdym razie, jeśli kolonie są obecne, powinny być w porządku, ponieważ użycie dwóch selektywnych antybiotyków oznacza raczej znikomą szansę na wzrost nieprzekształconych bakterii. Brak kolonii w ogóle wskazuje, że albo bakterie utraciły swoją zdolność do transformacji (z powodu niewłaściwego przechowywania lub przechowywania przez dłuższy czas, powtarzającego się zamrażania i rozmrażania itp.), szok cieplny nie powiódł się (brak wychwytu plazmidu lub śmierć bakterii z powodu zbyt dużej temperatury), wektor klonowania jest uszkodzony lub przez pomyłkę zastosowano niewłaściwy zestaw selektywnych antybiotyków (sprawdź gen oporności na wektorze plazmidowym).</silna>
<img alt="Rysunek 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2.jpg"> 
Rysunek 7: Reprezentatywne wyniki dla transformacji bakterii i IMAC. 
(A) Reprezentatywne płytki agarowe LB z przekształconym BL21(DE3) E. coli, otrzymane zgodnie z krokiem 1.1 protokołu. Po lewej: Talerz z dobrze rozmieszczonymi koloniami (przykład pozytywny). Po prawej: Płytka z tylko jedną pojedynczą kolonią (przykład negatywny). Białe kółka oznaczają dobre kolonie. Czerwonym kółkiem oznaczono kolonie, które rosną zbyt blisko siebie i nie powinny być zbierane, o ile dostępne są izolowane kolonie. (B) 12,5% analiza SDS-PAGE akryloamidu w serii kontroli indukcyjnych ("-" oznacza przed indukcją IPTG; "+" oznacza po indukcji IPTG, przed zbiorem granulek), dostosowana do równych ilości białka całkowitego. Jest to opisane w kroku 1.2. (C) Przykładowa analiza 12,5% akrylamidu SDS-PAGE oczyszczania Ni-NTA z białka FAHD1 znakowanego His. Jest to opisane w sekcji 3 protokołu. W chromatografii powinowactwa uzyskuje się białko o wysokiej czystości (&gt;70%, strzałka), jednak obserwuje się również kilka niewielkich zanieczyszczeń (czerwone strzałki). Zanieczyszczenia te składają się z białek innych niż FAHD, które wiążą się z kolumną, oraz z białek, które wiążą się z białkiem FAHD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Zatwierdzone kolonie są wybierane i wybierane. Po amplifikacji w pożywce odżywczej ekspresja białka jest wyzwalana przez zastosowanie substancji chemicznej IPTG. Osad bakteryjny zawierający wyrażone białko w ilościach miligramowych jest zbierany, a jego ekspresja jest weryfikowana za pomocą SDS-PAGE (patrz na przykład Rysunek 7B). Podczas tego skądinąd prostego procesu mogą wystąpić pewne problemy. Po pierwsze, niektóre białka tworzą ciała inkluzyjne, ponieważ najwyraźniej w jakiś sposób zakłócają naturalny metabolizm bakterii gospodarza. Zaobserwowano to w przypadku niektórych mutacji punktowych ludzkich FAHD1 i FAHD2. W takich przypadkach inne systemy ekspresji, takie jak komórki owadów, mogą być bardziej odpowiednie i powinny być brane pod uwagę. Na przykład po zebraniu osadu z komórek owadów oczyszczanie białek przebiega zgodnie z tymi samymi krokami, które opisano w niniejszym protokole. Po drugie, czasami okazuje się, że system DE3-pET jest "nieszczelny" (tj. białko jest już do pewnego stopnia eksprymowane przed indukcją IPTG). Potencjalna przyczyna tego zjawiska nie jest dobrze poznana, ale może pomóc w powolnej ekspresji białka przez noc w inkubatorze w chłodni. Po trzecie, nie ulega ekspresji żadne białko. Jest to prawdopodobnie najgorszy scenariusz, ponieważ prawdopodobnie wskazuje na uszkodzony wektor plazmidu i dlatego zaleca się sekwencjonowanie plazmidu.
Jeśli do znakowania białka użyto znacznika His, chromatografia powinowactwa z agarozą Ni-NTA jest łatwą i tanią metodą wychwytywania, eliminującą większość zanieczyszczeń (<silna klasa="xfig">Rysunek 7C). Podobne metody istnieją dla innych systemów znaczników (np. STREP-II). Jeśli nie użyto żadnego znacznika, połączenie wytrącania siarczanu amonu i następującej po sobie hydrofobowej chromatografii wymiennej może również oddzielić białko od większości innych białek (<silna klasa="xfig">Rysunek 8A). Jednak porównując te dwie metody (<silna klasa="xfig">Rysunek 7C vs. <silna klasa="xfig">Rysunek 8A), wyższość metod Ni-NTA można wykazać za pomocą analizy SDS-PAGE. Dlatego zaleca się stosowanie białka znakowanego przez Hisa.</silna></silna></silna></silna>
<img alt="Rysunek 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2.jpg"> 
Rysunek 8: Reprezentatywne wyniki dla eksperymentów FPLC (HIC, wymiana jonowa, SEC). 
(A) Typowy chromatogram i 12,5% analiza SDS-PAGE akryloamidu chromatografii HIC-fenylowej po wytrąceniu siarczanu amonu (AS) nieznakowanego białka FAHD1, jak opisano w sekcji 4 protokołu. Zielona linia odzwierciedla gradient bufora B, który nie zawiera AS. Podczas tego procesu AS jest stopniowo wypłukiwany z systemu. Porównanie tego panelu z Rysunek 7C pokazuje moc chromatografii powinowactwa Ni-NTA w porównaniu z metodą HIC-phenyl oraz zalety stosowania systemu His-tag do oczyszczania białek. (B) Przykładowy chromatogram i analiza SDS-PAGE 12,5% akrylamidu w chromatografii kationowej wymiennej FAHD znakowanego Hisem po oczyszczeniu Ni-NTA. Za pomocą gradientu soli nałożona próbka jest rozdzielana na poszczególne białka. (C) Przykładowy chromatogram i analiza SDS-PAGE 12,5% akryloamidu SDS-PAGE chromatografii wykluczającej wielkości G75 FAHD znakowanego Hisa po chromatografii kationowej wymiennej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Kolejno, białko jest dalej oddzielane od resztek zanieczyszczeń przez chromatografię kationowo-anionowymienną (na przykład, zobacz Rysunek 8B), a następnie chromatografię wykluczającą rozmiar (na przykład zobacz Rysunek 8C). Zaleca się ustalenie początkowej strategii oczyszczania w tej kolejności; Jednakże kolumny te powinny być używane w połączeniu, następnie i w odmianie, aż białko będzie wystarczająco czyste.
Proste testy aktywności, w celu sprawdzenia decyzji "tak lub nie" dotyczących aktywnych substratów i/lub kofaktorów, mogą być wykonywane z białkami znakowanymi Hisem po oczyszczeniu Ni-NTA lub białkami nieoznakowanymi po kolumnie wymiany jonowej. Specyficzne działania i stałe kinetyczne muszą być określone dla białka o najwyższej czystości. Można próbować krystalizować białka po kolumnie jonowej, ale jakość kryształów prawie zawsze koreluje z czystością białka. Przeciwciała poliklonalne mogą być wytwarzane przeciwko białkom na każdym etapie protokołu oczyszczania; Jednak w tym przypadku jakość również koreluje z czystością białka.

Ekspresja i oczyszczanie białek zawierających hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu jest opisane przykładami (ekspresja w E. coli, FPLC). Oczyszczone białka są używane do krystalizacji i produkcji przeciwciał oraz wykorzystywane do testów enzymatycznych. Przedstawiono wybrane testy fotometryczne w celu wykazania wielofunkcyjności FAHD1 jako dekarboksylazy szczawiooctanu i hydrolazy acylopirogronianowej.

Ekspresja, oczyszczanie, krystalizacja i oznaczanie enzymatyczne białek zawierających hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Nasz protokół opisuje metody efektywnej ekspresji i oczyszczania białek zawierających domenę FAH, ale także białek w ogóle. Białko FHD-1 odgrywa rolę regulacyjną w cyklu TCA i metabolizmie energetycznym mitochondriów. Udało nam się powiązać regulację w dół FHD-1 ze starzeniem się komórek, a informacje na temat aktywności enzymu i struktury białka są ogólnie potrzebne do zrozumienia mechanizmów molekularnych stojących za obserwowanymi fenotypami.Główną zaletą ekspresji białek za pomocą indukowalnych systemów wektorowych IPTG jest to, że wszystkie metody są stosunkowo tanie i łatwe do ustalenia w dowolnym laboratorium. Dzięki zastosowaniu białek typu polihistydynowego w połączeniu z niklowo-agarozowymi żywicami NTA, można zastosować ogromną selektywność chromatografii powinowactwa przy niskich kosztach. Do większości celów białko uzyskane w tej jakości może już wystarczyć.Z drugiej strony FPLC jest dobrze ugruntowaną i ogólną metodą z kilkoma zaletami w porównaniu z innymi metodami. Najpierw włóż od pięciu do 10 nanogramów plazmidu do 100 mikrolitrów kompetentnych bakterii BL21-DE3 pLysS E.coli na lodzie. Lekko postukaj w tubkę, aby wymieszać zawartość.Trzymaj bakterie na lodzie przez 30 minut, delikatnie stukając w rurkę co kilka minut. Podgrzej wytrząsarkę do 42 stopni Celsjusza. Umieść probówkę zawierającą bakterie w aparacie i podgrzewaj przez 90 sekund.Następnie natychmiast umieść probówkę na lodzie. Po pięciu do 10 minutach na lodzie dodaj 600 mikrolitrów pożywki NZCYM i umieść probówkę w inkubatorze bakterii. Potrząsaj probówką ze średnią prędkością skierowaną wzdłuż kierunku wytrząsania w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.Po inkubacji rozłóż 200 mikrolitrów kultury bakteryjnej na 10-centymetrowej płytce agarowej LB zawierającej wybrane antybiotyki. Hoduj bakterie na płytce agarowej LB w inkubatorze bakterii w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po udanym utworzeniu kolonii należy wybrać jedną pojedynczą rodzinę i rozproszyć ją w pięciu mililitrach NZCYM z wybranymi antybiotykami.Hodowla w inkubatorze bakterii w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po pomyślnym wzroście bakterii należy je amplifikować w 250 mililitrach, 500 mililitrach lub jednolitrowych partiach pożywki, w zależności od zapotrzebowania na ilość białka. Następnie hoduj bakterie w inkubatorze bakterii w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do trzech godzin.Po inkubacji pobrać próbkę do analizy fotometrycznej. Jeśli gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnęła 0,4, należy zastosować 200 mikromoli do jednego milimola izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozydu. Po kolejnych trzech do pięciu godzinach w inkubatorze bakterii w temperaturze 37 stopni Celsjusza ekspresja białka jest wyczerpana.Zebrać osad bakteryjny przez odwirowanie w temperaturze 5 000 razy G przez pięć minut. Następnie wyrzuć supernatant i zamroź osad w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do krótkiego przechowywania. Na każde 250 mililitrów oryginalnej zawiesiny bakteryjnej nałóż pięć mililitrów wybranego buforu na osad bakteryjny.Dodaj 10 mikrolitrów beta-merkaptoetanolu na pięć mililitrów zastosowanego buforu. Użyj 10-mililitrowej pipety Pasteura, aby mechanicznie wepchnąć granulki do zawiesiny poprzez drapanie i pipetowanie. Przenieś całe zawieszenie do 50-mililitrowej rurki.Następnie wykonać sonifikację zawiesiny. Następnie wirować przez 30 minut na wysokich obrotach w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przefiltrować kolejno supernatant za pomocą jednostek filtrujących na lodzie.Przygotuj pustą plastikową lub szklaną kolumnę, mocując ją do stabilnego elementu ustalającego i myjąc niklowym buforem roboczym NTA. Na każde 10 mililitrów zawiesiny białkowej nanieść 500 mikrolitrów zawiesiny agarozowej NTA niklu do kolumny. Całkowicie napełnij kolumnę niklowym buforem roboczym NTA, upewniając się, że nie zakłóci to żywicy agarozowej i pozwoli buforowi przepływać grawitacyjnie.Następnie nałóż zawiesinę białkową na kolumnę i pozwól próbce przepłynąć grawitacyjnie. Po przejściu próbki napełnij kolumnę biegnącym buforem niklowym NTA. Umieść przezroczystą kuwetę UV pod kolumną i zbierz jeden mililitr niklowego buforu elucyjnego NTA.Sprawdź gęstość optyczną próbki przy 280 nanometrach w porównaniu z próbką ślepą. Optymalnie próbka wykazuje gęstość optyczną większą niż 2,5. Ponieważ białka FAHD i bufor elucyjny NTA niklu wytrącają się po zamrożeniu i rozmrożeniu, należy dializować białko w stosunku do innego buforu przez noc na lodzie, używając jednego mikrolitra DTT na 100 mililitrów buforu do dializy.Skonfiguruj system FPLC i umyj kolumnę pięcioma objętościami kolumny 20% etanolu, a następnie pięcioma objętościami kolumny wody. Po zrównoważeniu kolumny nanieść dializowaną próbkę do kolumny i zebrać przez nią przepływ. Skonfiguruj elucję gradientu.Po zakończeniu gradientu uruchom z buforem o wysokiej zawartości soli, aż nie zostaną wykryte żadne piki w zakresie objętości jednej kolumny. Uruchom czytnik mikropłytek i równoważ przez 30 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Przygotować jeden mililitr 20-milimolowego roztworu substratu do badania w buforze do oznaczania enzymów.Zgodnie ze schematem pipetowania w protokole tekstowym, należy przygotować ślepą próbę enzymu i studzienki na próbki, pipetując 90 mikrolitrów buforu do oznaczania enzymów do studzienek z pięcioma mikrolitrami roztworu enzymatycznego. Następnie należy przygotować ślepą próbę substratu i dołki na próbki, pipetując 95 mikrolitrów buforu do oznaczania enzymów do studzienek. Tuż przed pomiarem nałóż pięć mikrolitrów buforu do oznaczania enzymów na sześć ślepych studzienek.Nanieść pięć mikrolitrów 20-milimolowego roztworu substratu na dołki na próbki. Użyj pipety wielokanałowej o ustawieniu 50 mikrolitrów, aby delikatnie wymieszać studzienki. Następnie włóż płytkę do czytnika mikropłytek i zmierz każdą studzienkę z prędkością 255 nanometrów.Na koniec przeprowadź analizę w arkuszu kalkulacyjnym. Przedstawiono tutaj dwa przykłady: płytki agarowe LB po optymalnej i nieoptymalnej transformacji. Zbyt wiele kolonii bakteryjnych wskazuje albo na to, że dwie bakterie zostały posiaczone, albo na to, że antybiotyki mogą być przeterminowane.Zbyt mała liczba kolonii bakteryjnych może wskazywać, że albo do transformacji nie użyto wystarczającej ilości plazmidu, albo użyto zbyt dużej ilości antybiotyków do selekcji bakterii. Osad bakteryjny zawierający wyrażone białko w ilościach miligramowych jest zbierany, a ekspresja jest weryfikowana za pomocą karty charakterystyki. Podczas tego skądinąd prostego procesu mogą wystąpić pewne problemy, w tym białka tworzące ciała inkluzyjne lub białko nie ulega ekspresji.Jeśli do znakowania białka używa się znacznika His, chromatografia powinowactwa z agarozą niklu NTA jest łatwą i tanią metodą wychwytywania, eliminującą większość zanieczyszczeń. Jeśli nie stosuje się znacznika, połączenie wytrącania siarczanu amonu i następującej po nim hydrofobowej chromatografii wymiennej może również oddzielić białko od większości innych białek. Białko jest następnie oddzielane od pozostałych zanieczyszczeń za pomocą chromatografii jonowymiennej, a następnie chromatografii wykluczającej wielkość w celu uzyskania wystarczająco czystego białka.Żadna z opisanych metod nie jest szczególnie trudna. Ale wszystkie metody wymagają treningu. Pierwsze próby mogą się nie powieść, ale eksperymenty zakończą się sukcesem po kilku dodatkowych adaptacjach.Wszystkie przedstawione tutaj metody są ogólnymi metodami oczyszczania białek. Chociaż protokół jest wyspecjalizowany w białkach FAHD, może być dostosowany do dowolnego białka, które chciałoby się oczyścić. Rekombinowany ludzki FAHD-1 został uzyskany opisanymi metodami, a struktury rentgenowskie o wysokiej rozdzielczości znacznie przyczyniły się do naszego zrozumienia FAHD-1 poprzez funkcjonalność działającą zarówno jako dekarboksylaza, jak i hydrolaza.Bakterie używane w tej pracy są szczepami bezpiecznymi i nie są niebezpieczne. Ogólne wytyczne bezpieczeństwa dotyczą wszystkich chemikaliów, a z kolumnami FPLC należy obchodzić się ostrożnie.

expression-purification-crystallization-enzyme-assays

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Próby ekspresji regulatora przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR) w Saccharomyces cerevisiae przynosiły dotychczas stosunkowo niskie ilości białka. Niniejszy protokół oraz powiązane z nim odczynniki dystrybuowane przez Cystic Fibrosis Foundation powinny umożliwić przygotowanie miligramowych ilości tego „trudnego” eukariotycznego białka błonowego.

Ekspresja i oczyszczanie białka regulatora przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie w Saccharomyces cerevisiae

Opisujemy metodę oczyszczania białek rekombinowanych z użyciem znaczników powinowactwa przy wykorzystaniu robotyki do obsługi cieczy. Metoda ta znajduje ogólne zastosowanie w małoscale’owym oczyszczaniu rozpuszczalnych białek z znacznikiem His w formacie wysokoprzepustowym.

Wysokoprzepustowe oczyszczanie rekombinowanych białek z markerami powinowactwa

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

Tutaj opisujemy metodę ekspresji i oczyszczania wysokiej jakości domen wystających (P) norowirusa (P) w E. coli do wykorzystania w badaniach krystalografii rentgenowskiej. Metoda ta może być stosowana do innych domen kaliciwirusa P, a także białek niestrukturalnych, tj. białka wirusa sprzężonego z genomem (VPg), proteazy i polimerazy RNA zależnej od RNA (RdRp).

Wytwarzanie wystających domen ludzkiego norowirusa w E. coli do krystalografii rentgenowskiej

Interakcje białek są sercem funkcji komórki. Do ich scharakteryzowania powszechnie stosuje się techniki kalorymetryczne i spektroskopowe. Tutaj opisujemy anizotropię fluorescencji jako narzędzie do badania interakcji między białkiem zmutowanym w zespole Shwachmana-Diamonda (SBDS) a GTPazą podobną do czynnika elongacji 1 (EFL1).

Anizotropia fluorescencyjna jako narzędzie do badania oddziaływań białko-białko

Przedstawiono protokół ekstrakcji białka opiekuńczego z peryplazmatycznego metalu przejściowego w kontekście jego natywnych partnerów wiążących, oraz biofizyczną charakterystykę zawartości jego substratu za pomocą fluorescencji rentgenowskiej i wychwytu radiometalu.

Niezbędny wychwyt metali przez bakterie Gram-ujemne: fluorescencja rentgenowska, radioizotopy i frakcjonowanie komórek

Oczyszczanie kanałów jonowych jest często wyzwaniem, ale gdy już zostanie osiągnięte, może potencjalnie umożliwić badania in vitro funkcji i struktur kanałów. W tym miejscu opisujemy etapowe procedury ekspresji i oczyszczania białek bestrofiny ssaków, rodziny kanałów Cl- aktywowanych przezCa2+.

Ekspresja i oczyszczanie kanałów jonowych bestrofiny ssaków

Deacetylazy histonowe klasy 1 (HDAC), takie jak RpdA, zyskały na znaczeniu jako potencjalne cele w leczeniu infekcji grzybiczych. W tym miejscu przedstawiamy protokół specyficznego wzbogacania RpdA znakowanego TAP w połączeniu z testem aktywności HDAC, który umożliwia badanie skuteczności in vitro inhibitorów deacetylazy histonowej.

Jednoetapowe wzbogacanie deacetylazy histonowej znakowanej TAP grzyba nitkowatego Aspergillus nidulans do oznaczania aktywności enzymatycznej

Ten protokół opisuje, jak ekstrahować białko 1 zawierające hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu (FAHD1) z nerki świni i wątroby myszy. Wymienione metody mogą być dostosowane do innych białek będących przedmiotem zainteresowania i zmodyfikowane dla innych tkanek.

Ekstrakcja i oczyszczanie białka FAHD1 z nerki świń i wątroby myszy

Prezentowany protokół opisuje proste podejście do badania przesiewowego warunków krystalizacji białek i wzrostu kryształów przy użyciu 96-dołkowej płytki do dializy o wysokiej przepustowości. Zastosowanie probówek dializatorów do hodowli mikrokryształów na dużą skalę wykazano również w krystalografii seryjnej i zastosowaniach MicroED.

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy

Ten artykuł przedstawia procedurę oczyszczania powinowactwa ludzkiego białka rekombinowanego, endonukleazy płatowej 1 (FEN1), które zostało oznaczone znacznikiem 6X-histydyny. Protokół polega na wykorzystaniu dwóch odrębnych unieruchomionych kolumn jonów metalu do oczyszczania znakowanego białka.

Oczyszczanie powinowactwa białka oznaczonego 6X-His-His-Tagged przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek

Poznaj ekspresję i oczyszczanie białek z domeną FAH, w tym FAHD1, w E. coli przy użyciu chromatografii afinitetycznej Ni-NTA i FPLC. Metody te umożliwiają badanie aktywności enzymatycznej i struktury białek.

Ekspresja, oczyszczanie, krystalizacja i oznaczanie enzymatyczne białek zawierających hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu

Przeglądaj więcej filmów