Ekspresja, oczyszczanie, krystalizacja i oznaczanie enzymatyczne białek zawierających hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu

Nasz protokół opisuje metody efektywnej ekspresji i oczyszczania białek zawierających domenę FAH, ale także białek w ogóle. Białko FHD-1 odgrywa rolę regulacyjną w cyklu TCA i metabolizmie energetycznym mitochondriów. Udało nam się powiązać regulację w dół FHD-1 ze starzeniem się komórek, a informacje na temat aktywności enzymu i struktury białka są ogólnie potrzebne do zrozumienia mechanizmów molekularnych stojących za obserwowanymi fenotypami.

Główną zaletą ekspresji białek za pomocą indukowalnych systemów wektorowych IPTG jest to, że wszystkie metody są stosunkowo tanie i łatwe do ustalenia w dowolnym laboratorium. Dzięki zastosowaniu białek typu polihistydynowego w połączeniu z niklowo-agarozowymi żywicami NTA, można zastosować ogromną selektywność chromatografii powinowactwa przy niskich kosztach. Do większości celów białko uzyskane w tej jakości może już wystarczyć.

Z drugiej strony FPLC jest dobrze ugruntowaną i ogólną metodą z kilkoma zaletami w porównaniu z innymi metodami. Najpierw włóż od pięciu do 10 nanogramów plazmidu do 100 mikrolitrów kompetentnych bakterii BL21-DE3 pLysS E.coli na lodzie. Lekko postukaj w tubkę, aby wymieszać zawartość.

Trzymaj bakterie na lodzie przez 30 minut, delikatnie stukając w rurkę co kilka minut. Podgrzej wytrząsarkę do 42 stopni Celsjusza. Umieść probówkę zawierającą bakterie w aparacie i podgrzewaj przez 90 sekund.

Następnie natychmiast umieść probówkę na lodzie. Po pięciu do 10 minutach na lodzie dodaj 600 mikrolitrów pożywki NZCYM i umieść probówkę w inkubatorze bakterii. Potrząsaj probówką ze średnią prędkością skierowaną wzdłuż kierunku wytrząsania w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Po inkubacji rozłóż 200 mikrolitrów kultury bakteryjnej na 10-centymetrowej płytce agarowej LB zawierającej wybrane antybiotyki. Hoduj bakterie na płytce agarowej LB w inkubatorze bakterii w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po udanym utworzeniu kolonii należy wybrać jedną pojedynczą rodzinę i rozproszyć ją w pięciu mililitrach NZCYM z wybranymi antybiotykami.

Hodowla w inkubatorze bakterii w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po pomyślnym wzroście bakterii należy je amplifikować w 250 mililitrach, 500 mililitrach lub jednolitrowych partiach pożywki, w zależności od zapotrzebowania na ilość białka. Następnie hoduj bakterie w inkubatorze bakterii w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do trzech godzin.

Po inkubacji pobrać próbkę do analizy fotometrycznej. Jeśli gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnęła 0,4, należy zastosować 200 mikromoli do jednego milimola izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozydu. Po kolejnych trzech do pięciu godzinach w inkubatorze bakterii w temperaturze 37 stopni Celsjusza ekspresja białka jest wyczerpana.

Zebrać osad bakteryjny przez odwirowanie w temperaturze 5 000 razy G przez pięć minut. Następnie wyrzuć supernatant i zamroź osad w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do krótkiego przechowywania. Na każde 250 mililitrów oryginalnej zawiesiny bakteryjnej nałóż pięć mililitrów wybranego buforu na osad bakteryjny.

Dodaj 10 mikrolitrów beta-merkaptoetanolu na pięć mililitrów zastosowanego buforu. Użyj 10-mililitrowej pipety Pasteura, aby mechanicznie wepchnąć granulki do zawiesiny poprzez drapanie i pipetowanie. Przenieś całe zawieszenie do 50-mililitrowej rurki.

Następnie wykonać sonifikację zawiesiny. Następnie wirować przez 30 minut na wysokich obrotach w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przefiltrować kolejno supernatant za pomocą jednostek filtrujących na lodzie.

Przygotuj pustą plastikową lub szklaną kolumnę, mocując ją do stabilnego elementu ustalającego i myjąc niklowym buforem roboczym NTA. Na każde 10 mililitrów zawiesiny białkowej nanieść 500 mikrolitrów zawiesiny agarozowej NTA niklu do kolumny. Całkowicie napełnij kolumnę niklowym buforem roboczym NTA, upewniając się, że nie zakłóci to żywicy agarozowej i pozwoli buforowi przepływać grawitacyjnie.

Następnie nałóż zawiesinę białkową na kolumnę i pozwól próbce przepłynąć grawitacyjnie. Po przejściu próbki napełnij kolumnę biegnącym buforem niklowym NTA. Umieść przezroczystą kuwetę UV pod kolumną i zbierz jeden mililitr niklowego buforu elucyjnego NTA.

Sprawdź gęstość optyczną próbki przy 280 nanometrach w porównaniu z próbką ślepą. Optymalnie próbka wykazuje gęstość optyczną większą niż 2,5. Ponieważ białka FAHD i bufor elucyjny NTA niklu wytrącają się po zamrożeniu i rozmrożeniu, należy dializować białko w stosunku do innego buforu przez noc na lodzie, używając jednego mikrolitra DTT na 100 mililitrów buforu do dializy.

Skonfiguruj system FPLC i umyj kolumnę pięcioma objętościami kolumny 20% etanolu, a następnie pięcioma objętościami kolumny wody. Po zrównoważeniu kolumny nanieść dializowaną próbkę do kolumny i zebrać przez nią przepływ. Skonfiguruj elucję gradientu.

Po zakończeniu gradientu uruchom z buforem o wysokiej zawartości soli, aż nie zostaną wykryte żadne piki w zakresie objętości jednej kolumny. Uruchom czytnik mikropłytek i równoważ przez 30 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Przygotować jeden mililitr 20-milimolowego roztworu substratu do badania w buforze do oznaczania enzymów.

Zgodnie ze schematem pipetowania w protokole tekstowym, należy przygotować ślepą próbę enzymu i studzienki na próbki, pipetując 90 mikrolitrów buforu do oznaczania enzymów do studzienek z pięcioma mikrolitrami roztworu enzymatycznego. Następnie należy przygotować ślepą próbę substratu i dołki na próbki, pipetując 95 mikrolitrów buforu do oznaczania enzymów do studzienek. Tuż przed pomiarem nałóż pięć mikrolitrów buforu do oznaczania enzymów na sześć ślepych studzienek.

Nanieść pięć mikrolitrów 20-milimolowego roztworu substratu na dołki na próbki. Użyj pipety wielokanałowej o ustawieniu 50 mikrolitrów, aby delikatnie wymieszać studzienki. Następnie włóż płytkę do czytnika mikropłytek i zmierz każdą studzienkę z prędkością 255 nanometrów.

Na koniec przeprowadź analizę w arkuszu kalkulacyjnym. Przedstawiono tutaj dwa przykłady: płytki agarowe LB po optymalnej i nieoptymalnej transformacji. Zbyt wiele kolonii bakteryjnych wskazuje albo na to, że dwie bakterie zostały posiaczone, albo na to, że antybiotyki mogą być przeterminowane.

Zbyt mała liczba kolonii bakteryjnych może wskazywać, że albo do transformacji nie użyto wystarczającej ilości plazmidu, albo użyto zbyt dużej ilości antybiotyków do selekcji bakterii. Osad bakteryjny zawierający wyrażone białko w ilościach miligramowych jest zbierany, a ekspresja jest weryfikowana za pomocą karty charakterystyki. Podczas tego skądinąd prostego procesu mogą wystąpić pewne problemy, w tym białka tworzące ciała inkluzyjne lub białko nie ulega ekspresji.

Jeśli do znakowania białka używa się znacznika His, chromatografia powinowactwa z agarozą niklu NTA jest łatwą i tanią metodą wychwytywania, eliminującą większość zanieczyszczeń. Jeśli nie stosuje się znacznika, połączenie wytrącania siarczanu amonu i następującej po nim hydrofobowej chromatografii wymiennej może również oddzielić białko od większości innych białek. Białko jest następnie oddzielane od pozostałych zanieczyszczeń za pomocą chromatografii jonowymiennej, a następnie chromatografii wykluczającej wielkość w celu uzyskania wystarczająco czystego białka.

Żadna z opisanych metod nie jest szczególnie trudna. Ale wszystkie metody wymagają treningu. Pierwsze próby mogą się nie powieść, ale eksperymenty zakończą się sukcesem po kilku dodatkowych adaptacjach.

Wszystkie przedstawione tutaj metody są ogólnymi metodami oczyszczania białek. Chociaż protokół jest wyspecjalizowany w białkach FAHD, może być dostosowany do dowolnego białka, które chciałoby się oczyścić. Rekombinowany ludzki FAHD-1 został uzyskany opisanymi metodami, a struktury rentgenowskie o wysokiej rozdzielczości znacznie przyczyniły się do naszego zrozumienia FAHD-1 poprzez funkcjonalność działającą zarówno jako dekarboksylaza, jak i hydrolaza.

Bakterie używane w tej pracy są szczepami bezpiecznymi i nie są niebezpieczne. Ogólne wytyczne bezpieczeństwa dotyczą wszystkich chemikaliów, a z kolumnami FPLC należy obchodzić się ostrożnie.