Name: Eksperymentalna analiza apoptotycznego pochłaniania tymocytów przez makrofagi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Poznaj metodę przygotowania apoptotycznych tymocytów i makrofagów otrzewnowych do analizy efektozytozy. Protokół pozwala ocenić skuteczność pochłaniania komórek i wpływ inhibitorów na ten proces w badaniach immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania w Shao Lab są wspierane przez Research Innovative Award od College of Medicine i Junior Faculty Pilot Award od Department of Internal Medicine, University of Cincinnati oraz grant DK K01_095067 od NIDDK/NIH.

Eksperymentalne myszy były hodowane i utrzymywane w naszej kolonii myszy. Wszystkie prace na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu w Cincinnati.
1. Przygotowanie apoptotycznych tymocytów oznaczonych znakiem CFSE
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji dwie naiwne myszy C57 / B6 przez wdychanie CO2 przez 10 minut i przeprowadź sekcję w celu otwarcia jamy klatki piersiowej, usuń (wyciągnij) grasicę za pomocą zakrzywionych kleszczy z cienką końcówką na szalkę Petriego do hodowli tkankowej zawierającej 10 ml pożywki RPMI1640.</li>
	<li>Zawiesinę jednokomórkową należy uzyskać, mieląc całą grasicę na dwóch matowych końcach szkiełek mikroskopowych, a następnie przefiltrować zawiesinę przez sitko o wielkości 100 μm.</li>
	<li>Zebrać 10 ml zawiesiny grasicy do probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy sile 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant, ponownie zawiesić w 40 ml 1x PBS i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić w 20 ml 1x PBS w probówce 50 ml jako zawiesinę jednokomórkową z maksymalnie 2 x 108 komórek (jeśli więcej niż 2 x 108 komórek, ponownie zawieś resztę komórek w innych 20 ml 1 x PBS w innej probówce 50 ml).</li>
	<li>Przygotować 5 μM CFSE w równej objętości (20 ml) 1x PBS w oddzielnej probówce o pojemności 50 ml, pipetując 40 μl roztworu podstawowego CFSE (2,5 mM) do 20 ml 1x PBS i dobrze wymieszać, odwracając probówkę 2 - 3 razy.</li>
	<li>Dodaj 20 ml CFSE z kroku 1.7 do 20 ml zawiesiny komórek z kroku 1.6 (końcowe stężenie CFSE wynosi teraz 2,5 μM). 
	UWAGA: Na każde 20 ml zawiesiny komórek potrzebne jest 20 ml probówki CFSE.</li>
	<li>Odwrócić komórkę i probówkę z mieszaniną CFSE 2-3 razy i inkubować mieszaninę w ciemności w temperaturze pokojowej przez maksymalnie 2 minuty, a następnie zatrzymać reakcję przez dodanie 10 ml inaktywowanej termicznie surowicy końskiej.</li>
	<li>Odwirować mieszaninę probówek o pojemności 50 ml przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Jeśli oznakowanie CFSE się powiedzie, granulki komórek staną się jasnożółte.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 40 ml 1x PBS i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie przemyć osad komórkowy 40 ml RPMI1640 podłoża.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą pożywki do hodowli tkankowej RPMI1640 (RPMI1640, 20 mM HEPES, 10% FBS (inaktywowany termicznie), 20 mM glutaminy i 1x Pen/Strep) w stężeniu 7 x 106 komórek/ml w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm. 
	UWAGA: Jeśli uzyska się więcej komórek, potrzebne będzie oddzielne naczynie do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Dodać staurosporynę do hodowli zawiesiny komórkowej o końcowym stężeniu 1 μM i hodować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych zasilanym 5% CO2 .</li>
</ol>
2. Przygotowanie makrofagów otrzewnowych
<ol>
	<li>Wstrzyknąć dwóm myszom C57B6 (lub dowolnym myszom manipulowanym genami w laboratorium) dootrzewnowo 1 ml 3% dojrzałego tioglikolanu w dniu 0.</li>
	<li>Poddaj myszy eutanazji w 5 dniu, jak w kroku 1.1, odetnij i obierz skórę brzucha, pozostawiając nienaruszoną otrzewną. Przepłukać jamę otrzewnej, szybko wtłaczając 10 ml buforu do przemywania (RPMI1640, 2% FBS, 0,04% EDTA) do jamy otrzewnej za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml dołączonej do igły 18 G.</li>
	<li>Powoli pobrać bufor do przemywania za pomocą tej samej igły/strzykawki i zebrać bufor do płukania do probówki o pojemności 50 ml (szczegóły w artykule laboratorium Janssen15).</li>
	<li>Przemyć zgłębnik otrzewnowy dwukrotnie 1x PBS, ponownie zawiesić makrofagi otrzewnej w pożywce do hodowli tkankowych RPMI1640 gęstości 2 x 106 komórek/ml i podwielokrotności 500 μl do każdej studzienki płytki 24-dołkowej. Pozostawić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych na 2 godziny.</li>
	<li>Usunąć pływające komórki, dwukrotnie odsysając i zastępując 500 μl świeżej pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Opcjonalnie dodać inhibitor tyrozyny receptora TAM, RXDX-106, w stężeniach wskazanych na rysunku do każdej studzienki kultury makrofagów i inkubować przez kolejne 2 godziny.</li>
</ol>
3. Współhodowla makrofagów otrzewnowych z apoptotycznym tymocytami
<ol>
	<li>Zbierz apoptotyczne tymocyty z kroku 1 i przemyj trzy razy RPMI1640 pożywką. Skuteczność indukcji apoptotycznej można zmierzyć na tym etapie za pomocą zestawu Annexin V/7-AAD.</li>
	<li>Rozmieść 0 - 12 x 106 komórek (w pożywce 500 μl) do każdej studzienki kultur makrofagów z protokołu #2, zgodnie z układem eksperymentalnym (np. patrz rysunek 1). To sprawia, że cała objętość kultury wynosi 1 ml w każdym dołku 24-dołkowej płytki. Dodaj przeciwciało blokujące do kultury bezpośrednio przed dodaniem apoptotycznych tymocytów.</li>
	<li>Hodować mieszaninę komórek w temperaturze 37 °C przez 4 godziny w inkubatorze do hodowli tkankowych zasilanym 5%CO2</li>.
	<li>Przemyć każdą studzienkę hodowli 1x PBS (zawierającym 500 μM EDTA) dwukrotnie, aby usunąć swobodnie pływające komórki apoptotyczne.</li>
	<li>Na tym etapie wybarwić makrofagi związane z płytką CD11b-PE.
	<ol>
		<li>Makrofagi związane z płytką przemyć raz buforem barwiącym (1x PBS, 1% BSA).</li>
		<li>Do każdej studzienki dodać 200 μl buforu barwiącego zawierającego 2 μl CD11b-PE.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Umyj każdą studzienkę płytki trzykrotnie buforem barwiącym.</li>
		<li>Dodać 200 μl buforu barwiącego i przystąpić płytkę do analizy obrazu pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywnie, odłączyć makrofagi związane z płytką, dodając 1 ml 1% lidokainy do PBS i inkubując przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odłączyć makrofagi związane z płytką, powtarzając pipetowanie.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę makrofagów do pojedynczej okrągłodennej probówki FACS o pojemności 5 ml z każdej studzienki 24-dołkowej płytki.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i dodać 200 μl buforu barwiącego zawierającego 2 μl CD11b-PE (rozcieńczenie w buforze barwiącym w stosunku 1:200).</li>
	<li>Zawiesinę komórkową inkubować w buforze barwiącym w temperaturze 4 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Zawiesinę komórkową przemyć dwukrotnie buforem barwiącym.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu barwiącego i przystąpić do analizy FACS za pomocą cytometru przepływowego i przeanalizować pod kątem procentowej zawartości makrofagów CFSE.</li>
</ol>

<ol><li>Shao, W. H., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbances+of+apoptotic+cell+clearance+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202(2011).</li>
<li>Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+death+and+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Springer+Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell death and lupus.</a> Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).</li>
<li>Wong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+cancer%3A+from+pathogenesis+to+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+and+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87(2011).</li>
<li>Baig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+apoptotic+pathway-targeted+cancer+therapeutic+research%3A+Where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand.</a> Cell Death and Disease. 7, 2058(2016).</li>
<li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+clearance%3A+basic+biology+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).</li>
<li>Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+clearance+of+apoptotic+cells+induces+the+activation+of+autoreactive+anti-Sm+marginal+zone+and+B-1+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).</li>
<li>Hawkins, L. A., Devitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+mechanisms+for+clearance+of+apoptotic+cells-a+fine+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance.</a> Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).</li>
<li>Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+TAM+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Biology of the TAM receptors.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076(2013).</li>
<li>Stitt, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anticoagulation+factor+protein+S+and+its+relative%2C+Gas6%2C+are+ligands+for+the+Tyro+3%2FAxl+family+of+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 80 (4), 661-670 (1995).</li>
<li>Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptor+tyrosine+kinases%3A+biologic+functions%2C+signaling%2C+and+potential+therapeutic+targeting+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer.</a> Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).</li>
<li>van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptors%2C+Gas6%2C+and+protein+S%3A+roles+in+inflammation+and+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis.</a> Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).</li>
<li>Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptors+and+the+clearance+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annal+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">TAM receptors and the clearance of apoptotic cells.</a> Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).</li>
<li>Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mer+receptor+tyrosine+kinase+is+expressed+on+discrete+macrophage+subpopulations+and+mainly+uses+Gas6+as+its+ligand+for+uptake+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells.</a> Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).</li>
<li>Scott, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+clearance+of+apoptotic+cells+is+mediated+by+MER%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER.</a> Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).</li>
<li>Klarquist, J., Janssen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bm12+Inducible+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+%28SLE%29+in+C57BL%2F6+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice.</a> Journal of Visualized Experiment. (105), e53319(2015).</li>
<li>Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+expression+of+tyro3%2C+axl%2C+and+mer+receptors+in+macrophage+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Macrophage+%28Houst%29%22%5BJournal%5D)">Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny.</a> Macrophage (Houst). 3, (2016).</li>
<li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+a+review+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: a review of programmed cell death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li>
<li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Find-me+and+eat-me+signals+in+apoptotic+cell+clearance%3A+progress+and+conundrums%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).</li>
<li>Rock, K. L., Kono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+response+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+in+Pathology%22%5BJournal%5D)">The inflammatory response to cell death.</a> Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).</li>
<li>Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+inducing+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Methods for inducing apoptosis.</a> Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).</li>
<li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+seeing+to+believing%3A+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001(2013).</li>
<li>Stijlemans, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+pHrodo-based+assay+for+the+assessment+of+in+vitro+and+in+vivo+erythrophagocytosis+during+experimental+trypanosomosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561(2015).</li>
<li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+the+dead%3A+apoptotic+cell+sensing%2C+recognition%2C+engulfment%2C+and+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748(2013).</li>
<li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).</li>
<li>Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+recovery+of+macrophages+and+cell+lines+from+tissue+culture-treated+and+-untreated+plastic+dishes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes.</a> Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).</li>
<li>Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Human+and+Mouse+Neutrophil+Phagocytosis+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).</li>
<li>Summers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+kinetics+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil kinetics in health and disease.</a> Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).</li>
<li>Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagocytes%3A+neutrophils+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The phagocytes: neutrophils and monocytes.</a> Blood. 112 (4), 935-945 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Apoptoza to wysoce konserwatywny proces śmierci komórki, który obejmuje wiele kaskad sygnałowych i indukuje ekspresję, wydzielanie i transport białek. Apoptoza jest często związana ze zmianami morfologii komórek17. Komórki apoptotyczne aktywnie uwalniają cytokiny i chemokiny, które przyciągają fagocyty do migracji do miejsca i inicjują proces pochłaniania, niezwykle złożoną ścieżkę pod ścisłąkontrolą. Z drugiej strony, martwicza śmierć komórki uwalnia sygnały niebezpieczeńs...

Nasze ciało wytwarza codziennie 1-10 miliardów komórek apoptotycznych. Tak duża liczba komórek apoptotycznych musi zostać usunięta w taki sposób, aby odpowiedzi immunologiczne pozostały w stanie spoczynku. Aby zapewnić usuwanie komórek apoptotycznych w odpowiednim czasie, wiele typów komórek rezydujących w tkance i komórek krążących rozwija mechanizmy pochłaniania komórek apoptotycznych1. Dysfunkcyjna regulacja apoptozy jest związana z powstawaniem i progresją różnych chorób zapalnych i autoimmunizacji2. Apoptoza odgrywa również kluczową rolę w patogenezie rozwoju raka i jego późniejszej oporności na konwencjonalne metody leczenia3,4. Usunięcie komórek apoptotycznych na ogół sprzyja reakcji przeciwzapalnej, która może być związana z tolerancją immunologiczną5. Zaburzenie apoptotycznego klirensu komórek napędza samoimmunizację i przyczynia się do rozwoju ogólnoustrojowych chorób autoimmunologicznych zarówno u ludzi, jak i u myszy6.
Gdy komórki przechodzą apoptozę, wystawiają fosfatydyloserynę (PtdSer) z wewnętrznej ulotki na zewnętrzną listkę błony. PtdSer zostanie wtedy rozpoznany przez fagocyty poprzez receptory powierzchniowe. Zidentyfikowano ponad tuzin receptorów, które rozpoznają i/lub ułatwiają pochłanianie komórek apoptotycznych. Ogólnie rzecz biorąc, istnieją co najmniej trzy typy receptorów powierzchniowych zaangażowanych w apoptotyczne usuwanie komórek: receptory uwięziowe, rozpoznawanie komórek apoptotycznych; łaskotanie receptorów, inicjują pochłonięcie; receptory opiekuńcze, ułatwiają cały proces<klasa sup="xref">7. Kinazy tyrozynowe receptora TAM (TAM RTKs) składają się z Tyro-3, Axl i Mer i są głównie wyrażane przez komórki szpikowe układu odpornościowego8. Podstawową funkcją TAM RTK jest służenie jako receptory wiążące, ułatwiające fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych i zanieczyszczeń. Nasza grupa od wielu lat bada apoptotyczny klirens komórek za pośrednictwem TAM w warunkach autoimmunizacji. Zależne od witaminy K białko zatrzymuje wzrost specyficznego białka 6 (Gas6) i białka S (ProS) i aktywuje je i aktywuje receptory TAM9,10. Gas6 jest wytwarzany w sercu, nerkach i płucach. ProS jest produkowany głównie w klasie liver<sup="xref">11. TAM rozpoznaje komórki apoptotyczne w taki sposób, że N-koniec Gas6 / ProS wiąże się z PtdSer na komórce apoptotycznej, a C-koniec Gas6 / ProS wiąże się z receptorami TAM, które są zakotwiczone na powierzchni fagocytów. Wraz z innymi receptorami następuje pochłonięcie komórek apoptotycznych12. Chociaż Mer może wiązać się zarówno z ligandami ProS, jak i Gas6, odkryliśmy, że Gas6 wydaje się być jedynym ligandem dla fagocytozy komórek apoptotycznych makrofagów, w której pośredniczy Mer, które mogą być blokowane przez przeciwciało anty-Mer13. Makrofagi to profesjonalne fagocyty. Szybkie usuwanie komórek apoptotycznych przez makrofagi jest ważne dla hamowania stanu zapalnego i odpowiedzi autoimmunologicznych przeciwko antygenom wewnątrzkomórkowym. Kinaza tyrozynowa receptora Mer ma kluczowe znaczenie dla pochłaniania makrofagów i skutecznego usuwania komórek apoptotycznych14. W śledzionie myszy Mer ulega ekspresji głównie w strefie brzeżnej i namacalnym ciele makrofagów13.
Przedstawiony tutaj protokół opisuje podstawową metodę indukowania apoptozy komórek i demonstruje sposoby pomiaru procesu i skuteczności efferocytozy. Protokoły te można łatwo dostosować do badania efferocytozy przez inne typy komórek w pochłanianiu komórek apoptotycznych różnego pochodzenia.

<table><tbody><tr><td>Bufor elizujący</td><td>GIBCO</td><td>A10492</td><td></td></tr><tr><td>Aneksyna V/7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało antymerowe</td><td>R& D Systems</td><td>BAF591</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-PE (klon M1/70)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553311</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 mM)</td><td>GIBCO</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Rurki FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>352017</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szronione</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-343</td><td></td></tr><tr><td>Surowica końska (inaktywowana termicznie)</td><td>Invitrogen</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Lidokaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-5647</td><td>Przygotuj 1% bufor w 1x PBS</td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Corning</td><td>10040CV</td><td></td></tr><tr><td>RXDX-106</td><td>Selleck Chemicals</td><td>-40783</td><td></td></tr><tr><td>Staurosprine (100mg)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2541-100</td><td>Dodaj 214,3 ml DMSO do 100mg, aby uzyskać 1mM roztwór pończochowy</td></tr><tr><td>Tioglikolan Medium Brewer Modified</td><td>BD Biosciences</td><td>243010</td><td>Przygotuj 3% bufor tioglikolanowy w 1&acute; PBS, sterylizowany w autoklawie i przechowywany w ciemności przez 3 miesiące.</td></tr></tbody></table>

eksperymentalna analiza apoptotycznego pochłaniania tymocytów przez makrofagi

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Apoptoza komórek jest naturalnym procesem i odgrywa kluczową rolę w rozwoju embrionalnym, regulacji homeostazy, indukcji tolerancji immunologicznej i rozwiązywaniu stanów zapalnych. Nagromadzenie resztek apoptotycznych w organizmie może wywołać przewlekłe reakcje zapalne, które z czasem prowadzą do ogólnoustrojowych chorób autoimmunologicznych. Upośledzony klirens komórek apoptotycznych jest związany z różnymi chorobami autoimmunologicznymi. Klirens apoptotyczny jest złożonym procesem rzadko wykrywanym w warunkach fizjologicznych. Obejmuje obfite receptory powierzchniowe i cząsteczki sygnałowe. Badanie procesu apoptotycznego usuwania komórek dostarcza wnikliwych mechanizmów molekularnych i późniejszych odpowiedzi biologicznych, które mogą prowadzić do opracowania nowych terapii. W tym miejscu opisujemy protokoły indukcji apoptotycznych tymocytów, przygotowania makrofagów otrzewnowych oraz analizy apoptotycznego klirensu komórek za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii. Wszystkie komórki ulegną apoptozie na pewnym etapie, a wiele komórek mieszkalnych i krążących może wchłonąć resztki apoptozy. Dlatego opisany tutaj protokół może być używany w wielu aplikacjach do charakteryzowania apoptotycznego wiązania komórek i przyjmowania przez wiele innych typów komórek.

Analiza procesu pochłaniania apoptotycznych tymocytów przez makrofagi otrzewne. Makrofagi otrzewnowe oraz komórki apoptotyczne przygotowano i poddano współhodowli zgodnie z opisem w protokole. Makrofagi ododerwano i barwiono przeciwciałem anty-CD1b koniugowanym z PE przez 20 min w temperaturze 0°C. Następnie makrofagi przemyto i poddano analizie w cytometrze przepływowym. Jak widać, w prawym dolnym kwadrancie nie występuje żaden makrofag wykazujący pozytywny wynik dla CFSE w przypadku, gdy do hodowli nie...

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania apoptotycznych tymocytów i makrofagów otrzewnowych oraz analizy skuteczności efferocytozy i specyficznego blokowania apoptotycznych tymocytów za pośrednictwem inhibitorów. Protokół ten ma szerokie zastosowanie w usuwaniu innych cząstek, w tym sztucznych kulek i bakterii, za pośrednictwem komórek.

Eksperymentalna analiza apoptotycznego pochłaniania tymocytów przez makrofagi

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

Nasz organizm wytwarza od jednego do 10 miliardów komórek apoptotycznych każdego dnia. Skuteczny usuwa te komórki i pomaga w usuwaniu resztek komórkowych i utrzymywaniu zapasów. Metoda ta może być stosowana w wielu zastosowaniach do charakteryzowania wiązania i spożycia komórek apoptotycznych przez wiele innych typów komórek fagocytarnych.Tę procedurę zademonstruje Yuxuan Zhen, starszy technik w moim laboratorium. Aby zebrać tymocyty, po otwarciu jamy klatki piersiowej naiwnej myszy C57 black 6, użyj zakrzywionych kleszczyków z cienką końcówką, aby wyciągnąć grasicę. Umieść narząd w naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym 10 mililitrów pożywki RPMI 1640.Zmiel całą grasicę na oszronionych końcach dwóch szkiełek mikroskopowych i przefiltruj powstałą zawiesinę tkankową przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki. Zbierz tymocyty przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w 40 mililitrach. Po zliczeniu ponownie odwirować komórki i ponownie zawiesić do dwóch razy od 10 do ośmiu komórek w 20 mililitrach świeżego PBS na 50-mililitrową probówkę.Oznacz komórki pięcioma mikromolowymi CFSE w 20 mililitrach PBS na probówkę. Odwróć probówki dwa do trzech razy, aby wymieszać przed inkubacją tymocytów przez nie więcej niż dwie minuty w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. Pod koniec inkubacji zatrzymaj reakcję za pomocą 10 mililitrów inaktywowanej termicznie surowicy końskiej i zbierz komórki przez odwirowanie.Ponownie zawiesić oznakowane komórki w 40 mililitrach świeżego PBS w celu zliczenia i odwirowania, a następnie dodatkowego przemycia 40 mililitrami pożywki. Po przepłukaniu pożywki ponownie zawiesić tymocyty w stężeniu siedem razy 10 do sześciu komórek na mililitr pożywki do hodowli tkankowych i umieścić komórki w 100-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowych. Następnie dodać staurosporynę do hodowli komórkowej w końcowym stężeniu jednego mikromola i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych na cztery godziny.W celu izolacji makrofagów otrzewnowej wstrzyknij dootrzewnowo dwóm czarnym myszom C57 6 jeden mililitr 3% tioglikolanu w dniu zero przed otwarciem skóry brzucha bez naruszania otrzewnej w piątym dniu. Aby przepłukać jamę otrzewnej, użyj 10-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 18, aby szybko wepchnąć 10 mililitrów buforu do płukania do jamy przed powolnym zasysaniem buforu do przemywania w celu zebrania do 50-mililitrowej probówki. Przemyć płukanie otrzewnowej dwa razy za pomocą PBS.Zawiesić makrofagi otrzewnowe w stężeniu dwa razy 10 do sześciu komórek na mililitr pożywki do hodowli tkankowej. Następnie wysiewaj 500 mikrolitrów makrofagów do każdej studzienki 24-dołkowej płytki i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych na dwie godziny. Pod koniec inkubacji odessać supernatant w celu usunięcia pływających komórek i dodać 500 mikrolitrów pożywki do hodowli tkankowej do każdej studzienki.Natychmiast dodaj zero do 12 razy 10 do sześciu tymocytów w 500 mikrolitrach pożywki do każdego dołka kultury i umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych na cztery godziny. Pod koniec inkubacji przemyć każdą studzienkę dwa razy świeżym PBS w celu usunięcia wszelkich swobodnie pływających komórek apoptotycznych, a następnie przepłukać je buforem barwiącym. Następnie oznacz makrofagi związane z płytką 200 mikrolitrami buforu barwiącego uzupełnionego odpowiednim przeciwciałem anty-CD11b na dołek i umieść płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 20 minut.W tym reprezentatywnym eksperymencie do 30% makrofagów otrzewnowych stymulowanych tioglikolanem wykazało pozytywny sygnał w kanale CFSE, co wskazuje, że te fagocyty połknęły komórki apoptotyczne znakowane CFSE. Obserwacja mikroskopowa pochłaniania makrofagów przez komórki apoptotyczne jest niezbędna do zbadania zdolności makrofagów do przyjmowania komórek apoptotycznych, ponieważ makrofagi CFSE dodatnie rozprzestrzeniają się w prawym dolnym kwadrancie ze względu na różne intensywności wskazujące, że liczba komórek apoptotycznych w poszczególnych makrofagach jest różna. Wyższy stosunek komórek apoptotycznych do makrofagów nie tylko zwiększa liczbę makrofagów spożywających komórki apoptotyczne, ale także zwiększa zdolność makrofagów do przyjmowania większej liczby komórek apoptotycznych.W innym zestawie eksperymentów około 15% makrofagów stało się CFSE dodatnich, gdy tymocyty apoptotyczne znakowane CFSE zostały dodane do kultury makrofagów na cztery godziny, co wskazuje, że te makrofagi były makrofagami fagocytarnymi. Przeciwciało Mer blokuje efferocytozę makrofagów w sposób zależny od dawki, a ogólna blokada może odpowiadać za około 30% skuteczności efferocytozy w obecnym ustawieniu. Ponadto nowo zatwierdzony inhibitor receptora TAM osłabia efferocytozę makrofagów w sposób zależny od dawki do stężenia około 100 nanomolowych.Zawsze pamiętaj, aby sprawdzić procent komórek apoptotycznych, ponieważ liczba ta bezpośrednio wpływa na skuteczność efferocytozy. Makrofagi fagocytarne mogą być dalej analizowane za pomocą Western blot w celu zbadania cząsteczek sygnałowych regulowanych przez proces pochłaniania oraz za pomocą mikroskopii w celu zbadania dynamiki pochłaniania.

experimental-analysis-of-apoptotic-thymocyte-engulfment-by-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie demonstrujemy test efferocytozy do badania klirensu komórek apoptotycznych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Efferocytoza to wieloetapowy proces, w którym komórki apoptotyczne są pochłaniane przez fagocyty i degradowane w pęcherzykach zwanych efferosomami. Protokół ten zapewnia metodę wizualizacji zinternalizowanych i niezinternalizowanych części poszczególnych komórek apoptotycznych oraz ilościowego określenia efferocytozy.

Test esterocytozy utrwalonych: metoda badania wychwytu efferocytarnego komórek apoptotycznych przez makrofagi przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Ten film demonstruje procedurę analizy efferocytozy mysich tymocytów za pośrednictwem makrofagów otrzewnowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Analiza efferocytozy apoptotycznych tymocytów przez makrofagi otrzewnowe

Ten film prezentuje test apoptozy w komórkach nowotworowych indukowany przez wstępnie aktywowane efektorowe limfocyty T. Poprzez kokulturację tych komórek z komórkami rakowymi oznaczonymi jądrami fluorescencyjnymi, dodaje się substrat fluorogenny rozszczepialny przez kaspazę. Apoptotyczne komórki rakowe będą miały inny kolor w swoich jądrach, co prowadzi do podwójnej fluorescencji. Ta podwójna fluorescencja wskazuje na to, że komórki rakowe ulegają apoptozie.

Test in vitro do badania cytotoksyczności wstępnie aktywowanych limfocytów T CD8 + wobec komórek rakowych

Tutaj prezentujemy protokół do określania wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez fizyczną interakcję z sąsiednimi martwymi lub umierającymi komórkami. Protokół koncentruje się na zdarzeniach sygnalizacyjnych wywołanych przez rozpoznawanie martwych komórek za pośrednictwem receptora, w przeciwieństwie do ich wychwytu fagocytarnego lub uwalniania rozpuszczalnych mediatorów.

Identyfikacja wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez interakcję z sąsiednimi komórkami przechodzącymi apoptotyczną śmierć komórki

Opisujemy tutaj test fagocytozy z wykorzystaniem rozproszonych komórek embrionalnych Drosophila. Umożliwia nam łatwe i precyzyjne ilościowe określenie poziomów fagocytozy in vivo oraz identyfikację nowych cząsteczek wymaganych do fagocytozy komórek apoptotycznych.

Test fagocytozy na obecność komórek apoptotycznych w zarodkach Drosophila

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.

Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Opisujemy tutaj protokół badania cytotoksyczności wstępnie aktywowanych limfocytów T CD8+ przeciwko komórkom rakowym poprzez wykrywanie apoptotycznych komórek rakowych za pomocą mikroskopii w czasie rzeczywistym. Protokół ten może badać mechanizmy stojące za supresją limfocytów T indukowaną przez komórki szpikowe i oceniać związki mające na celu uzupełnienie limfocytów T poprzez blokadę immunologicznych komórek szpikowych.

Wykrywanie w czasie rzeczywistym apoptozy komórek nowotworowych in vitro indukowanej przez limfocyty T CD8 + w celu zbadania funkcji immunosupresyjnych komórek szpikowych naciekających nowotwór

Choroby neurodegeneracyjne są związane z rozregulowanymi funkcjami mikrogleju. W artykule przedstawiono test in vitro fagocytozy komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC. Odczyty z mikroskopii ilościowej opisano zarówno dla obrazowania poklatkowego żywych komórek, jak i obrazowania o wysokiej zawartości komórek stałych.

Test obrazowania ilościowego in vitro na fagocytozę martwych komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC

Ten protokół opiera się na indukowanej przez LPS i ATP śmierci makrofagów THP-1 zróżnicowanych PMA. Używamy cytometrii przepływowej do analizy podwójnego barwienia aneksyny V i 7-AAD w celu wykrycia śmierci komórki, wykorzystując całą komórkę i stosując skaningową mikroskopię elektronową do obserwacji morfologii błony komórkowej.

Śmierć makrofagów THP-1 różnicowanych przez PMA i ATP indukowana przez LPS i ATP i jej walidacja

Poznaj metodę przygotowania apoptotycznych tymocytów i makrofagów otrzewnowych do analizy efektozytozy. Protokół pozwala ocenić skuteczność pochłaniania komórek i wpływ inhibitorów na ten proces w badaniach immunologicznych.

Eksperymentalna analiza apoptotycznego pochłaniania tymocytów przez makrofagi

Przeglądaj więcej filmów