Ocena interakcji białko-białko przy użyciu techniki trawienia na błonie

Badania nad interakcją białko-białko są niezbędne do zrozumienia procesów fizjologicznych w kilku dziedzinach. W tym filmie przedstawiamy technikę trawienia na błonie, która pozwala naukowcom w wygodny sposób przeprowadzić kompleksową analizę białek wiążących przez SM. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy poprawić wydajność analizy proteomicznej dla surowych immunoprecypitantów, ponieważ rozdzielanie białek za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym nie jest konieczne.

Rozpocznij koniugację przeciwciała z kulkami magnetycznymi, mieszając przeciwciało anty-GFP z kulkami w 500 mikrolitrach buforu fosforanowego cytrynianu. Obracaj mieszaninę z prędkością 50 obr./min przez godzinę w temperaturze pokojowej. A następnie umyj sprzężone koraliki trzykrotnie buforem fosforanowo-cytrynianowym zawierającym 1% polisorbatu 20.

Lizuj transfekowane komórki zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Zeskrob naczynie i przenieś lizat do 1,5 mililitrowej probówki. Następnie oczyścić lizat przez odwirowanie przy 15 000 x g przez pięć minut i zebrać supernatant.

Przygotuj nieoznakowane kulki magnetyczne, myjąc je trzykrotnie 500 mikrolitrami buforu fosforanowego cytrynianu. Po ostatnim umyciu usuń bufor i dodaj lizat komórkowy do kulek. Obracaj mieszaninę z prędkością 50 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Wykonaj separację magnetyczną na stojaku magnetycznym i zbierz lizat komórkowy. Aby związać docelowe białka z kulkami sprzężonymi z immunoglobuliną, umieść kulki na stojaku magnetycznym na pięć minut. Odrzuć bufor cytrynianu i dodaj lizat komórkowy do kulek.

Obracaj mieszaninę przez godzinę z prędkością 50 obr./min. Aby oddzielić białka docelowe od wolnych białek niedocelowych, należy trzykrotnie przemyć kulki 500 mikrolitrami buforu fosforanowego cytrynianowego zawierającego 1% polisorbat 20. Po ostatnim płukaniu dodaj 30 mikrolitrów buforu cytrynianowego i pozostaw kulki na pięć minut w temperaturze pokojowej, aby wymyć docelowe białka.

Aby przygotować membranę, należy pociąć membrany PVDF na kawałki o wymiarach 3 milimetry na 3 milimetry za pomocą nożyczek chirurgicznych, które zostały oczyszczone bezpośrednio przed użyciem. Umieść kawałki membrany na folii aluminiowej i dodaj od dwóch do pięciu mikrolitrów etanolu do każdego kawałka. Zanim membrany całkowicie wyschną, dodaj od dwóch do pięciu mikrolitrów eluentu białkowego do każdego kawałka i wysusz je na powietrzu, aż powierzchnia membrany stanie się matowa.

Następnie przenieś membrany do 1,5 mililitrowych probówek i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W przypadku natychmiastowego użycia dodaj od dwóch do 30 mikrolitrów etanolu, co sprawi, że będą hydrofilowe. Usuń etanol za pomocą pipety, ale zanim membrany wyschną, całkowicie dodaj 200 mikrolitrów roztworu reakcyjnego na bazie DTT do każdej probówki i inkubuj je w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez godzinę.

Po inkubacji zastąp roztwór reakcyjny 300 mikrolitrami roztworu jodoacetamidu i inkubuj w ciemności przez 45 minut. Następnie przemyj membrany dwukrotnie wodą destylowaną i raz 2% acetonitrylem, wirując przez co najmniej dziesięć sekund. Praca z acetonitrylem związanym z przezroczystością może być bardzo niebezpieczna.

Podczas wykonywania procedury trawienia na błonie należy zawsze nosić maskę, okulary i rękawiczki. Przygotuj trypsynę zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i dodaj 100 mikrolitrów roztworu reakcyjnego trypsyny do każdej membrany. Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu trawienia.

Następnego dnia przenieś roztwór reakcyjny do czystej 1,5 mililitrowej probówki i dodaj 100 mikrolitrów roztworów myjących do membrany. Inkubować membranę w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez dwie godziny, następnie zebrać roztwór płuczący i wymieszać go z roztworem reakcyjnym. Dodaj kolejne 100 mikrolitrów roztworu myjącego do membrany i poddawaj go sonikacji przez 10 minut.

Następnie zebrać roztwór do płukania i wymieszać go z roztworem reakcyjnym. Przykryj probówkę kawałkiem folii laboratoryjnej i wykonaj małe otwory w folii za pomocą igły. Wysuszyć roztwór za pomocą koncentratora próżniowego i rozpuścić pozostałość w 10 mikrolitrach 2% kwasu mrówkowego.

Odwirować probówkę o stężeniu 12 000 x g przez trzy minuty i przenieść supernatant do probówki z próbką. Analizować próbkę za pomocą spektrometru mas połączonego z systemem nano LC/HPLC. Korzystając z tego protokołu, zidentyfikowano 17 białek w immunoprecypitencie związanym z Calpain-6, 15 w immunoprecypitencie związanym z GFP i 11 w obu.

Ważne jest, aby pamiętać, że wykrycie co najmniej jednego fragmentu peptydu o wysokiej wierności jest wymagane do pozytywnej identyfikacji białka kandydującego. Białka, które wytrąciły się w lizacie wykazującym ekspresję GFP, a także histony, białka egzogenne i rybosomalne zostały pominięte w wykazie. Mycie błon przed mineralizacją tryptyczną wodą destylowaną i 2% acetonitrylem jest najważniejszym krokiem w procedurze trawienia na błonie białek.

Stosując tę metodę, możliwe jest potwierdzenie współstrącania białka docelowego poprzez przeprowadzenie innych eksperymentów, takich jak immunoprecypitacja i analiza Western blot. Ta prosta metoda pozwala naukowcom badać nowe interakcje białko-białko za pomocą wygodnej i bardzo czułej analizy.