Name: Ocena interakcji białko-białko przy użyciu techniki trawienia na błonie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Poznaj technikę trawienia na błonie do analizy interakcji białko-białko metodą spektrometrii masowej. Ta metoda eliminuje konieczność elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, zwiększając przepustowość badań proteomicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było częściowo wspierane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki KAKENHI Grant numer 17K09869 (do AM), Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki KAKENHI Grant numer 15K09418 (do TM), grant badawczy od Kanehara Ichiro Medical Science Foundation oraz grant badawczy od Suzuken Memorial Foundation (wszystkie dla TM).

1. Immunoprecypitacja
UWAGA: Użyliśmy buforu do lizy bez dodecylosiarczanu sodu (SDS) i elucji cytrynianu, jak opisano w poniższych sekcjach. Jednak zastosowanie alternatywnej techniki immunoprecypitacji we własnym zakresie może być również stosowane do przygotowania próbek LC-MS/MS.
<ol>
	<li>Transfekcja komórek hodowlanych z wektorami kodującymi sam znacznik epitopu lub białko fuzyjne. Aby uzyskać reprezentatywne dane, przenieś komórki J774 (1 x 106) z wektorami kodującymi samo białko zielonej fluorescencji (GFP) lub Capn6 (gen kalpainy-6) z fuzją GFP za pomocą liposomów kationowych.</li>
	<li>Sprzężone przeciwciało z kulkami magnetycznymi.
	<ol>
		<li>W tym celu należy zmieszać przeciwciało anty-GFP (2 μL/reakcję) z kulkami magnetycznymi (25 μL/reakcję) w 500 μL buforu fosforanu cytrynianu (24,5 mM kwasu cytrynowego, 51,7 mM dwuzasadowego fosforanu sodu; pH 5,0) w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Obracaj mieszaninę z prędkością 50 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie trzykrotnie przemyć kulki sprzężone z IgG buforem fosforanowo-cytrynianowym zawierającym 0,1% monolaurynianu polioksyetylenosorbitolu (20).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddać lizie transfekowane komórki przy użyciu odpowiedniego buforu do lizy. W celu uzyskania reprezentatywnych danych poddać transfekowane komórki lizie przez 30 minut na lodzie w 400 μl buforu do lizy (50 mM Tris-HCl; pH 7,5, 120 mM NaCl, 0,5% eteru poli(oksyetelenowego) oktylofenylowego) zawierającego 40 μmol/l fluorku fenylometylosulfonylu, 50 μg/ml leupeptyny, 50 μg/ml aprotyniny, 200 μmol/l ortowanadanu sodu, i 1 mM kwasu tetraoctowego glikolu etylenowego (EGTA) w probówkach o pojemności 1,5 ml 24 godziny po transfekcji.</li>
	<li>Oczyścić lizat przez odwirowanie przy 15 000 x g przez 5 minut i zebrać supernatant.</li>
	<li>Wstępnie oczyścić lizat. Dodaj nieoznakowane kulki magnetyczne (25 μl/reakcję) do probówki o pojemności 1,5 ml. Przemyć kulki trzykrotnie 500 μl buforu fosforanowo-cytrynianowego. Po usunięciu buforu fosforanu cytrynianu w końcowym płukaniu, dodać lizat komórkowy na kulki magnetyczne. Obracaj mieszaninę za pomocą rotatora z prędkością 50 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 5 minut w celu separacji magnetycznej i zbierz lizat komórkowy. Zaleca się stosowanie stojaka magnetycznego wyznaczonego przez producenta.</li>
	<li>Zwiąż docelowe białka ze sprzężonymi kulkami. Umieść kulki sprzężone z immunoglobuliną (Ig)G na stojaku magnetycznym na 5 minut w celu separacji magnetycznej, wyrzuć bufor cytrynianu, a następnie dodaj lizat komórkowy do oddzielonych kulek.</li>
	<li>Obracaj mieszaninę z prędkością 50 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Oddzielić białka docelowe od wolnych białek niebędących celem. Przemyć kulki trzykrotnie za pomocą 500 μl buforu fosforanowo-cytrynianowego zawierającego 0,1% monolaurynianu polioksyetylenosorbitolu (20). Po ostatnim płukaniu dodać 30 μl buforu cytrynianowego (pH 2-3) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu wymycia docelowych białek. 
	UWAGA: Jeśli rekonwalescencja po immunoprecypitacji jest niewystarczająca, zastosowanie alternatywnych znaczników epitopów, takich jak FLAG lub HIS, może poprawić skuteczność. Jeżeli skuteczność elucji jest niewystarczająca, zastosowanie innych eluantów, takich jak roztwór na bazie karty charakterystyki, może poprawić wydajność.</li>
</ol>
2. Trawienie białek na błonie
UWAGA: Używanie materiałów i sprzętu bez białek jest konieczne, aby uniknąć zanieczyszczenia białkami egzogennymi. Ponadto zaleca się, aby operator nosił maskę chirurgiczną i rękawice, aby uniknąć zanieczyszczenia ludzkimi białkami.
<ol>
	<li>Pokrój membrany PVDF na kawałki o wymiarach 3 mm x 3 mm za pomocą nożyczek chirurgicznych, które zostały przetarte metanolem i wysuszone bezpośrednio przed użyciem.</li>
	<li>Dodaj 2–5 μl etanolu na kawałki membrany PVDF na czystej folii aluminiowej.</li>
	<li>Przed całkowitym wyschnięciem dodaj eluant (po 2–5 μl, 4–6 sztuk na próbkę) na hydrofilowe membrany PVDF, a następnie wysusz membrany na powietrzu, aż powierzchnia membrany stanie się matowa. Wysuszone membrany można przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieś wszystkie membrany do plastikowych probówek o pojemności 1,5 ml, dodaj 20–30 μl etanolu, aby membrany stały się hydrofilowe, a następnie usuń etanol za pomocą pipety.</li>
	<li>Zanim membrana całkowicie wyschnie, dodać 200 μl roztworu reakcyjnego na bazie ditiotreitolu (DTT) (80 mM NH4HCO3, 10 mM DTT i 20% acetonitrylu) i inkubować w temperaturze 56 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Zastąp roztwór reakcyjny 300 μl roztworu jodoacetamidu (80 mM NH4HCO3, 55 mM jodoacetamidu i 20% acetonitrylu) i inkubuj przez 45 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Przemyć membrany dwukrotnie 1 ml wody destylowanej i raz 1 ml 2% acetonitrylu przez mieszanie wirowe przez >10 s.</li>
	<li>Rozpuścić liofilizowaną trypsynę klasy MS (tabela materiałów) bezpośrednio w roztworze reakcyjnym (30 mM NH4HCO3 zawierającym 70% acetonitrylu). Dodać 100 μl roztworu reakcyjnego zawierającego 1 μg trypsyny (tabela materiałów) (30 mM NH4HCO3 zawierającego 70% acetonitrylu) i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Przenieść roztwór reakcyjny zawierający trawienie tryptyczne do czystej probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu do przemywania (70% acetonitrylu/1% kwasu trifluorooctowego) do membrany i inkubować w temperaturze 60 °C przez 2 godziny. Zebrać roztwór do przemywania i wymieszać go z roztworem reakcyjnym. Dodaj kolejne 100 μl roztworu myjącego do membrany i poddaj ją sonikacji przez 10 minut. Następnie zebrać roztwór do przemywania i wymieszać z roztworem reakcyjnym.</li>
	<li>Przykryj probówkę kawałkiem folii laboratoryjnej i wykonaj kilka małych otworów igłą. Wysuszyć roztwór za pomocą koncentratora próżniowego.</li>
	<li>Pozostałość rozpuścić w 10 μl 0,2% kwasu mrówkowego. Po odwirowaniu (12 000 × g, 3 min w temperaturze pokojowej) przenieść supernatant do probówki z próbką. 
	UWAGA: Pranie jest krytycznym etapem tej sekcji. Podczas trawienia białek na błonie, płukanie błon zawierających unieruchomione białka po redukcji i alkilacji wodą destylowaną, a następnie 2% acetonitrylem, przez ponad 10 sekund każde, ma kluczowe znaczenie dla usunięcia odczynników.</li>
</ol>
3. Analiza LC–jonizacja elektronatryskowa (ESI)-MS/MS
<ol>
	<li>Aktywuj instrument ESI-MS/MS (Tabela materiałów) sprzężony z systemem nano-LC HPLC (Tabela materiałów). Połącz kolumnę wstępną (Tabela materiałów) i kolumnę analityczną (Tabela materiałów).</li>
	<li>Przed analizą należy skalibrować spektrometr masowy przy użyciu tryptycznych trawień albuminy surowicy bydlęcej rozpuszczonej w 0,2% kwasie mrówkowym, który dostarcza standardowych peptydów.</li>
	<li>Analizuj próbki w trybie jonów dodatnich i w zakresie masowym 400–1 250 m/z, a następnie uzyskaj do 10 widm MS/MS (100 ms każde) o zakresie masowym 100–1600 m/z i gradientzie liniowym 2%–80% acetonitrylu i 0,2% kwasu mrówkowego przez 80 minut przy natężeniu przepływu 300 nL/min.</li>
	<li>Przeanalizuj dane wyjściowe za pomocą oprogramowania do identyfikacji białek (Tabela materiałów) w celu zidentyfikowania potencjalnych białek stowarzyszonych. W celu pozytywnej identyfikacji białka kandydującego wymagane jest wykrycie co najmniej jednego fragmentu peptydu o wysokiej wierności (> 95% wierności).</li>
	<li>Pomiń białka, które są podobnie wytrącone w lizatach eksprymujących GFP (transfekcja wektora wyrażającego sam znacznik GFP) z listy białek kandydujących. 
	UWAGA: Jeśli w analizie bazy danych zostanie zidentyfikowanych kilka białek, modyfikacja warunków akwizycji MS/MS (np. zmiana czasu z 100 ms każde na 50 ms każdy) może zwiększyć liczbę zidentyfikowanych białek.</li>
</ol>

<ol><li>Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-translational+protein+folding%3A+progress+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-translational protein folding: progress and methods.</a> Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+protein+catabolism+in+atherosclerotic+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79(2017).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+calpain+proteolytic+systems+underlies+degenerative+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Atherosclerosis+and+Thrombosis%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).</li>
<li>Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CWC22+connects+pre-mRNA+splicing+and+exon+junction+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly.</a> Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).</li>
<li>Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection+via+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).</li>
<li>Obama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+modified+apolipoprotein+B-100+structures+formed+in+oxidized+low-density+lipoprotein+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS.</a> Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).</li>
<li>Matsudaira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+from+picomole+quantities+of+proteins+electroblotted+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+method+for+N-terminal+sequencing+of+proteins+by+MALDI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).</li>
<li>Iwamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-carboxymethylation+of+proteins+transferred+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes+followed+by+in+situ+protease+digestion+and+amino+acid+microsequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing.</a> Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).</li>
<li>Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+specific+trypsin+digestion+of+microgram+to+nanogram+quantities+of+proteins+in+organic-aqueous+solvent+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems.</a> Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+calpain+proteolytic+systems+in+macrophage+cholesterol+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-6+confers+atherogenicity+to+macrophages+by+dysregulating+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).</li>
<li>Tonami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-6%2C+a+microtubule-stabilizing+protein%2C+regulates+Rac1+activity+and+cell+motility+through+interaction+with+GEF-H1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).</li>
<li>Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+elongation%2C+co-translational+folding+and+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein elongation, co-translational folding and targeting.</a> Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).</li>
<li>Bunai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+acrylamide+gel+separated+proteins+immobilized+on+polyvinylidene+difluoride+membranes+following+proteolytic+digestion+in+the+presence+of+80%25+acetonitrile%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile.</a> Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wcześniej opisaliśmy analizę oksydacyjnych modyfikacji apolipoproteiny B-100 w utlenionej lipoproteinie o niskiej gęstości przy użyciu LC-MS / MS poprzedzonej techniką trawienia na błonie6. W niniejszym badaniu połączyliśmy tę technikę z immunoprecypitacją i zidentyfikowaliśmy kilka białek związanych z kalpainą-6. Ta nowatorska technika stanowi wygodną metodę badań przesiewowych pod kątem potencjalnych białek stowarzyszonych. Calpain-6 jest nieproteolitycznym członkiem rodziny proteolitycznej kalp...

Chociaż białka odgrywają istotną rolę w organizmach żywych, są one nieustannie syntetyzowane, przetwarzane i degradowane w środowisku wewnątrzkomórkowym. Co więcej, białka wewnątrzkomórkowe często oddziałują fizycznie i biochemicznie, co wpływa na funkcję jednego lub obu1,2,3. Na przykład bezpośrednie wiązanie homologu białka związanego ze spliceosomami CWC22 z eukariotycznym czynnikiem inicjacji translacji 4A3 (eIF4A3) jest niezbędne do złożenia kompleksu złączy eksonowych4. W związku z tym, mutant eIF4A3, który nie ma powinowactwa do CWC22, nie ułatwia splicingu mRNA sterowanego kompleksem złącza eksonowego4. W związku z tym badanie interakcji białek ma kluczowe znaczenie dla precyzyjnego zrozumienia regulacji fizjologicznej, a także funkcji komórkowych.
Ostatnie osiągnięcia w spektrometrii mas (MS) zostały zastosowane do kompleksowej analizy interakcji białko-białko. Na przykład współprecypitacja białek endogennych lub egzogennie wprowadzonych białek znakowanych wraz z powiązanymi z nimi białkami, a następnie analiza MS, umożliwia identyfikację nowych interakcji białkowych5. Jednak jednym z głównych wąskich gardeł w analizie stwardnienia rozsianego/stwardnienia rozsianego jest słaby odzysk próbek białek po tryptycznym trawieniu. Do przeprowadzania analiz proteomicznych na lizatach komórkowych stosuje się na ogół techniki trawienia w żelu i na błonie w celu przygotowania próbek MS/MS. Wcześniej porównaliśmy procedurę trawienia w żelu z techniką trawienia na błonie6 i wykazaliśmy, że ta ostatnia wiązała się z lepszym pokryciem sekwencji. Membrana z polifluorku winylidenu (PVDF) może być odpowiednia do tego celu, ponieważ jest mechanicznie wytrzymała i odporna na wysokie stężenia rozpuszczalników organicznych7,8, umożliwiając enzymatyczne trawienie unieruchomionych białek w obecności 80% acetonitrylu9. Co więcej, unieruchomienie błony może indukować zmiany konformacyjne w białkach docelowych, prowadząc do poprawy wydajności trawienia tryptycznego10. W związku z tym w tym artykule opisaliśmy zastosowanie analizy interakcji białek metodą immunoprecypitacji-LC/MS/MS przy użyciu techniki trawienia na błonie. Ta prosta metoda ułatwia wygodną analizę oddziaływań białko-białko nawet w niespecjalistycznych laboratoriach.

<table><tbody><tr><td>Acetonitryl</td><td>Wako</td><td>014-00386</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Wako</td><td>030-05525</td><td></td></tr><tr><td>DiNA</td><td>KYA Tech Co.</td><td></td><td>Wysokosprawna chromatografia cieczowa nanoflow</td></tr><tr><td>DiNa AI</td><td>KYA Tech Co.</td><td></td><td>Wysokosprawna chromatografia cieczowa nanoflow wyposażona w autosampler</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Nacalai tesque</td><td>14112-94</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads białko G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Wako</td><td>066-00461</td><td></td></tr><tr><td>HiQ Sil C18W-3</td><td>KYA Tech Co.</td><td>E03-100-100</td><td>0,10 mmID * 100 mm</td></tr><tr><td>L Jodoacetamid</td><td>Wako</td><td>095-02151</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Living Colors Przeciwciało monoklonalne AV (JL-8)</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>NH4HCO3</td><td>Wako</td><td>018-21742</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Sigma</td><td>N6507</td><td>poli(oksyetelen) eter oktylofenylowy (n = 9)</td></tr> <tr><td>peptyd</td><td>standard KYA Tech Co.</td><td>tBSA-04</td><td>tryptyczne trawienie albuminy surowicy bydlęcej</td></tr><tr><td>w fiolce PP</td><td>KYA Tech Co.</td><td>03100S</td><td>plastikowa probówka na próbkę</td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy Cooctail</td><td>Oprogramowanie Sigma</td><td>P8465</td><td></td></tr><tr><td>ProteinPilot</td><td>Oprogramowanie Sciex</td><td>5034057</td><td>do identyfikacji białek</td></tr><tr><td>Stopień sekwencjonowania Zmodyfikowana trypsyna</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>trypsyna</td></tr><tr><td>Ortowanadan sodu</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy dwuwodny</td><td>Sigma</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Wako</td><td>206-10731</td><td></td></tr><tr><td>kolumna syfonowa</td><td>KYA Tech Co.</td><td>A03-05-001</td><td>0,5 mm ID * 1 mm L</td></tr><tr><td>System TripleTOF 5600</td><td>Sciex</td><td>4466015</td><td>Hybrydowy kwadrupolowy tandemowy spektrometr masowy czasu przelotu</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Wako</td><td>207-06275</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Wako</td><td>160-21211</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena interakcji białko-białko przy użyciu techniki trawienia na błonie

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Liczne białka wewnątrzkomórkowe fizycznie oddziałują na siebie zgodnie z ich wewnątrzkomórkowymi i zewnątrzkomórkowymi warunkami. Rzeczywiście, funkcje komórkowe w dużej mierze zależą od wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko. Dlatego badania nad tymi interakcjami są niezbędne do ułatwienia zrozumienia procesów fizjologicznych. Współstrącanie powiązanych białek, a następnie analiza za pomocą spektrometrii mas (MS), umożliwia identyfikację nowych interakcji białkowych. W tym badaniu przedstawiliśmy szczegółowe informacje na temat nowej techniki analizy immunoprecypitacji z chromatografią cieczową (LC)-MS / MS w połączeniu z trawieniem na błonie w celu analizy interakcji białko-białko. Technika ta jest odpowiednia dla surowych leków immunoprecypitacyjnych i może poprawić wydajność analiz proteomicznych. Oznaczone białka rekombinowane wytrącono przy użyciu specyficznych przeciwciał; Następnie immunoprecypitanty osuszone na kawałkach membrany z polifluorku winylidenu poddano redukcyjnej alkilacji. Po trypsynizacji strawione reszty białkowe analizowano za pomocą LC-MS/MS. Korzystając z tej techniki, byliśmy w stanie zidentyfikować kilka potencjalnych białek powiązanych. W związku z tym metoda ta jest wygodna i przydatna do charakteryzowania nowych interakcji białko-białko.

Za pomocą powyższego opisanego procederu, immunoprecypitaty analizowano przy użyciu LC-MS/MS (Rycina 1). Po wykluczeniu białek pochodzących z zewnątrz (białek z innych gatunków oraz IgG) zidentyfikowano 17 białek w immunoprecypitatach związanych z kapałyną-6 (Tabela 1) oraz 15 białek w immunoprecypitatach związanych z GFP (Tabela 2). Spośród białek związanych z kapałyną-6 i GFP, 11 białek zidentyfikowano w obu immunoprecypita...

Tutaj prezentujemy protokół techniki trawienia na błonie do przygotowania próbek do spektrometrii mas. Technika ta ułatwia wygodną analizę oddziaływań białko-białko.

Ocena interakcji białko-białko przy użyciu techniki trawienia na błonie

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Badania nad interakcją białko-białko są niezbędne do zrozumienia procesów fizjologicznych w kilku dziedzinach. W tym filmie przedstawiamy technikę trawienia na błonie, która pozwala naukowcom w wygodny sposób przeprowadzić kompleksową analizę białek wiążących przez SM. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy poprawić wydajność analizy proteomicznej dla surowych immunoprecypitantów, ponieważ rozdzielanie białek za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym nie jest konieczne.Rozpocznij koniugację przeciwciała z kulkami magnetycznymi, mieszając przeciwciało anty-GFP z kulkami w 500 mikrolitrach buforu fosforanowego cytrynianu. Obracaj mieszaninę z prędkością 50 obr./min przez godzinę w temperaturze pokojowej. A następnie umyj sprzężone koraliki trzykrotnie buforem fosforanowo-cytrynianowym zawierającym 1% polisorbatu 20.Lizuj transfekowane komórki zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Zeskrob naczynie i przenieś lizat do 1,5 mililitrowej probówki. Następnie oczyścić lizat przez odwirowanie przy 15 000 x g przez pięć minut i zebrać supernatant.Przygotuj nieoznakowane kulki magnetyczne, myjąc je trzykrotnie 500 mikrolitrami buforu fosforanowego cytrynianu. Po ostatnim umyciu usuń bufor i dodaj lizat komórkowy do kulek. Obracaj mieszaninę z prędkością 50 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Wykonaj separację magnetyczną na stojaku magnetycznym i zbierz lizat komórkowy. Aby związać docelowe białka z kulkami sprzężonymi z immunoglobuliną, umieść kulki na stojaku magnetycznym na pięć minut. Odrzuć bufor cytrynianu i dodaj lizat komórkowy do kulek.Obracaj mieszaninę przez godzinę z prędkością 50 obr./min. Aby oddzielić białka docelowe od wolnych białek niedocelowych, należy trzykrotnie przemyć kulki 500 mikrolitrami buforu fosforanowego cytrynianowego zawierającego 1% polisorbat 20. Po ostatnim płukaniu dodaj 30 mikrolitrów buforu cytrynianowego i pozostaw kulki na pięć minut w temperaturze pokojowej, aby wymyć docelowe białka.Aby przygotować membranę, należy pociąć membrany PVDF na kawałki o wymiarach 3 milimetry na 3 milimetry za pomocą nożyczek chirurgicznych, które zostały oczyszczone bezpośrednio przed użyciem. Umieść kawałki membrany na folii aluminiowej i dodaj od dwóch do pięciu mikrolitrów etanolu do każdego kawałka. Zanim membrany całkowicie wyschną, dodaj od dwóch do pięciu mikrolitrów eluentu białkowego do każdego kawałka i wysusz je na powietrzu, aż powierzchnia membrany stanie się matowa.Następnie przenieś membrany do 1,5 mililitrowych probówek i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W przypadku natychmiastowego użycia dodaj od dwóch do 30 mikrolitrów etanolu, co sprawi, że będą hydrofilowe. Usuń etanol za pomocą pipety, ale zanim membrany wyschną, całkowicie dodaj 200 mikrolitrów roztworu reakcyjnego na bazie DTT do każdej probówki i inkubuj je w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez godzinę.Po inkubacji zastąp roztwór reakcyjny 300 mikrolitrami roztworu jodoacetamidu i inkubuj w ciemności przez 45 minut. Następnie przemyj membrany dwukrotnie wodą destylowaną i raz 2% acetonitrylem, wirując przez co najmniej dziesięć sekund. Praca z acetonitrylem związanym z przezroczystością może być bardzo niebezpieczna.Podczas wykonywania procedury trawienia na błonie należy zawsze nosić maskę, okulary i rękawiczki. Przygotuj trypsynę zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i dodaj 100 mikrolitrów roztworu reakcyjnego trypsyny do każdej membrany. Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu trawienia.Następnego dnia przenieś roztwór reakcyjny do czystej 1,5 mililitrowej probówki i dodaj 100 mikrolitrów roztworów myjących do membrany. Inkubować membranę w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez dwie godziny, następnie zebrać roztwór płuczący i wymieszać go z roztworem reakcyjnym. Dodaj kolejne 100 mikrolitrów roztworu myjącego do membrany i poddawaj go sonikacji przez 10 minut.Następnie zebrać roztwór do płukania i wymieszać go z roztworem reakcyjnym. Przykryj probówkę kawałkiem folii laboratoryjnej i wykonaj małe otwory w folii za pomocą igły. Wysuszyć roztwór za pomocą koncentratora próżniowego i rozpuścić pozostałość w 10 mikrolitrach 2% kwasu mrówkowego.Odwirować probówkę o stężeniu 12 000 x g przez trzy minuty i przenieść supernatant do probówki z próbką. Analizować próbkę za pomocą spektrometru mas połączonego z systemem nano LC/HPLC. Korzystając z tego protokołu, zidentyfikowano 17 białek w immunoprecypitencie związanym z Calpain-6, 15 w immunoprecypitencie związanym z GFP i 11 w obu.Ważne jest, aby pamiętać, że wykrycie co najmniej jednego fragmentu peptydu o wysokiej wierności jest wymagane do pozytywnej identyfikacji białka kandydującego. Białka, które wytrąciły się w lizacie wykazującym ekspresję GFP, a także histony, białka egzogenne i rybosomalne zostały pominięte w wykazie. Mycie błon przed mineralizacją tryptyczną wodą destylowaną i 2% acetonitrylem jest najważniejszym krokiem w procedurze trawienia na błonie białek.Stosując tę metodę, możliwe jest potwierdzenie współstrącania białka docelowego poprzez przeprowadzenie innych eksperymentów, takich jak immunoprecypitacja i analiza Western blot. Ta prosta metoda pozwala naukowcom badać nowe interakcje białko-białko za pomocą wygodnej i bardzo czułej analizy.

evaluation-proteinprotein-interactions-using-an-on-membrane-digestion

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy materiał wideo przedstawia eksperymenty wraz z późniejszą analizą oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem powierzchni mikrowzorowanych. Podejście to umożliwia wykrywanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach, łącząc wysoką przepustowość z możliwością uzyskania informacji ilościowych.

In-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

Badanie oddziaływań białko-białko jest niezbędne do analizy funkcjonalności białek. W niniejszym materiale przedstawiamy test wiązania białko-białko in vitro, służący do badania interakcji między białkiem unieruchomionym w błonie a białkiem rozpuszczalnym. Test ten stanowi niezawodną metodę sprawdzania oddziaływań pomiędzy białkiem nierozpuszczalnym a białkiem w roztworze.

Analiza nakładkowa białek błonowych: protokół badania interakcji między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi in vitro

Tandemowa puryfikacja powinowactwa (TAP) jest skuteczną metodą identyfikacji białek wiążących. W ramach dowodu koncepcji metodologię tę zastosowano do dobrze scharakteryzowanego czynnika inicjacji translacji eIF4E w celu koprecypitacji czynników komórkowych gospodarza zaangażowanych w inicjację translacji. Metoda ta może być łatwo zaadaptowana do dowolnego białka komórkowego lub wirusowego.

Identyfikacja partnerów oddziaływań białkowych z wykorzystaniem tandemowej oczyszczania powinowactwa

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Ten film demonstruje koimmunoprecypitowane kompleksy białkowe na membranie PVDF do analizy interakcji białko-białko. Zredukowane białka z kompleksów potraktowano trypsyną w celu rozszczepienia poszczególnych białek na mniejsze peptydy, a następnie pozostałe peptydy wyekstrahowano z błony PVDF. Wyciągnięty peptyd pochodzący z obu białek w kompleksie został następnie wysuszony i ponownie zawieszony w niskim stężeniu kwasu mrówkowego w celu dalszej analizy.

Trawienie białek na błonie w celu przygotowania białek współimmunoprecypitowanych do badań interakcji

Opisano podejście biochemiczne do identyfikacji in vivo interakcji białko-białko (PPI) białek błonowych. Metoda łączy w sobie sieciowanie białek, oczyszczanie powinowactwa i spektrometrię mas i można ją dostosować do prawie każdego typu komórki lub organizmu. Dzięki takiemu podejściu możliwa staje się nawet identyfikacja przejściowych IPP.

Membrane-SPINE: narzędzie biochemiczne do identyfikacji interakcji białko-białko białek błonowych in vivo

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Jako przykład opisujemy protokół wykrywania wrażliwych na detergenty interakcji między białkami błonowymi za pomocą wiązania receptora sortującego, sortyliny, z pierwszą pętlą luminalną białka transportera glukozy, GLUT4.

Wykrywanie wrażliwych na detergenty interakcji między białkami błonowymi

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Prezentowany tutaj jest protokół do określania oligomerycznego stanu białek błonowych, który wykorzystuje natywny system nanocząstek błony komórkowej w połączeniu z mikroskopią elektronową.

System natywnych nanocząstek błony komórkowej do analizy interakcji białko-białko błonowe

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Poznaj technikę trawienia na błonie do analizy interakcji białko-białko metodą spektrometrii masowej. Ta metoda eliminuje konieczność elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, zwiększając przepustowość badań proteomicznych.

Ocena interakcji białko-białko przy użyciu techniki trawienia na błonie

Przeglądaj więcej filmów