Name: Rozpoznawanie sekwencji DNA za pomocą prymazy DNA przy użyciu wysokoprzepustowego profilowania prymazów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj metodę wysokoprzepustowego profilowania prymazów DNA w celu analizy rozpoznawania sekwencji DNA przez prymazę. Technika łączy mikromacierze wiążące białko-DNA z biochemicznymi testami aktywności enzymatycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania były wspierane przez IZRAELSKĄ FUNDACJĘ NAUKOWĄ (grant nr 1023/18).

1. Projektowanie mikromacierzy
UWAGA: Sondy DNA reprezentują niestandardowe sekwencje 36-nukleotydowe, składające się z miejsca rozpoznania dla prymazy DNA T7 (GTC) znajdującego się pomiędzy dwoma zmiennymi regionami flankującymi, po którym następuje stała sekwencja 24-nukleotydowa przywiązana do szkiełka elementarnego3. Użyliśmy formatu mikromacierzy 4 x 180 000, który umożliwił wykrycie każdej sekwencji DNA w sześciu powtórzeniach, losowo rozmieszczonych na szkiełku.
<ol>
	<li>Projektowanie biblioteki DNA dla prymazów ze znanymi sekwencjami rozpoznawczymi 
	<ol>
		<li>Upewnij się, że każda sekwencja składa się z 60 nukleotydów. Utrzymuj pierwsze 24 nukleotydy na stałym poziomie (do przymocowania do szkiełka podstawowego). Regiony zmienne powinny mieć następującą postać ogólną: (N)16GTC(N)17; gdzie N reprezentuje dowolny pożądany nukleotyd.</li>
		<li>Zaprojektuj obszar flankujący w taki sposób, aby odpowiadał na konkretne pytanie naukowe (przykład projektu przedstawiono w poniższym tekście). Obszary flankujące mogą być zaprojektowane tak, aby zawierały określone cechy, takie jak powtarzające się elementy lub określona symetria. 
		UWAGA: Stworzyliśmy osiem kategorii różnych sekwencji flankujących złożonych z dwóch lub trzech specyficznych nukleotydów: T i G (grupa 1); T i C (grupa 2); C i A (grupa 3); A i G (grupa 4); G, C i T (grupa 5); C, T i A (grupa 6); G, A i T (grupa 7); G, A i C (grupa 8). Dla każdej grupy zaprojektowano 2000 różnych sekwencji. Każda grupa miała podgrupy sekwencji o różnych typach i różnej liczbie powtórzeń sekwencji.</li>
		<li>Dołącz zestaw sekwencji kontroli ujemnej (bez określonego miejsca wiązania)4. Obecność takich sekwencji pozwala na walidację występowania specyficznego wiązania w eksperymencie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Projektowanie biblioteki DNA dla prymatów o nieznanych sekwencjach rozpoznających 
	<ol>
		<li>Jeśli sekwencja rozpoznawania jest nieznana, utwórz bibliotekę DNA, wybierając sekwencje (z lub bez specyficznych cech wymienionych wcześniej) z genomu pożądanego organizmu (bakterii, grzybów itp.).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Projekt szkiełka mikromacierzowego 
	<ol>
		<li>Kup niestandardowe slajdy (np. 4x180K, AMADID #78366) od komercyjnego dostawcy (więcej informacji znajdziesz w Tabeli materiałów). Uporządkuj każdą sekwencję w sześciu powtórzeniach, z których każda powinna być dołączona do losowo wybranego miejsca na szkiełku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Eksperyment z wiązaniem DNA prymusu
UWAGA: Dzień przed (lub co najmniej 2 godziny przed) PBM, przygotuj roztwór blokujący [2% w/v odtłuszczonego mleka w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS)] i wymieszaj go na mieszadle magnetycznym. Przed użyciem przefiltrować roztwór filtrem 0,45 μM. Aby wykryć wiązanie prymazy z niciami DNA, należy wykonać kilka kroków w następującej kolejności.
<ol>
	<li>Procedura blokowania 
	<ol>
		<li>Wstępnie zwilż szkiełko do mikromacierzy w słoiku Coplin 0,01% v/v Triton X-100 w PBS (5 minut przy 125 obr./min na rotatorze laboratoryjnym).</li>
		<li>Krótko umyj szkiełko uszczelki (zwane również szkiełkiem nakrywkowym) wodą i etanolem i wysusz sprężonym powietrzem.</li>
		<li>Zamontuj dolną część stalowej komory hybrydyzacyjnej (komora PBM) z suwakiem uszczelki skierowanym do góry (etykieta handlowa skierowana do góry). Więcej informacji na temat montażu można znaleźć w Tabeli materiałów.</li>
		<li>Roztwór blokujący pipety (2% w/v odtłuszczonego mleka w PBS) do każdej komory.</li>
		<li>Wyjmij szkiełko z mikromacierzy ze słoika Coplin, a następnie osusz stronę niezawierającą DNA (DNA powinno znajdować się po tej samej stronie co etykieta firmy) i krawędzie za pomocą drobnej ściereczki. Powoli umieść mikromacierz na suwaku uszczelki, unikając pęcherzyków powietrza (etykieta firmowa skierowana w dół). Natychmiast zmontuj i dokręć stalową aparaturę komory hybrydyzacyjnej. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Napełnij jedno naczynie do barwienia (naczynie "PBS") 800 ml świeżego PBS. Napełnij drugie naczynie do barwienia (naczynie "WASH") 800 ml świeżo przygotowanego 0.5% v/v Tween-20 w PBS.</li>
		<li>Odkręć komorę PBM i wyjmij "kanapkę" z szkiełkiem nakrywkowym do mikromatrycy, uważając, aby nie naruszyć uszczelki. Zdemontuj go pod wodą w naczyniu do mycia, umieszczając kleszcze między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym.</li>
		<li>Potrząśnij szkiełkiem z mikromacierzą pod wodą i szybko przenieś do słoika z koplinu.</li>
		<li>Umyć raz 0,1% v/v Tween-20 w PBS (5 min przy 125 obr./min na rotatorze laboratoryjnym).</li>
		<li>Umyć raz 0,01% v/v Triton X-100 w PBS (2 min przy 125 obr./min na rotatorze laboratoryjnym).</li>
		<li>Szybko przenieś szkiełko do słoika Coplin zawierającego PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Białkami 
	<ol>
		<li>Zamontuj komorę PBM zgodnie z wcześniejszym opisem (kroki 2.1.2–2.1.3).</li>
		<li>Mieszanina wiążąca białka pipety zawierająca 5 μM prymazy DNA T7, 30 mM Tris-HCl pH 7,5, 6,5 mM MgCl2, 30 mM K-glutaminianu, 6 mM ditiotreitolu (DTT), trifosforan rybonukleozydu 65 μM (rNTP), 2% w/v odtłuszczonego mleka, 100 ng/μL albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 50 ng/μL DNA jąder łososia i 0,02% v/v Triton X-100 (TX-100) do każdej komory szkiełka uszczelniającego (bez dotykania gumowych boków i bez wprowadzania bąbelki).</li>
		<li>Krótko przepłukać szkiełko do mikromacierzy, zanurzając je w naczyniu PBS, które usuwa nadmiar detergentu z powierzchni szkiełek. Przetrzyj powierzchnie szkiełka niebędące DNA drobną ściereczką.</li>
		<li>Powoli opuść suwak mikromacierzy (skierowany w dół) na suwak uszczelki, uważając, aby zapobiec wyciekom z jednej komory do drugiej. Natychmiast zmontować i dokręcić aparaturę komorową PBM bez wprowadzania pęcherzyków. Jeśli pojawią się bąbelki, można je usunąć, delikatnie stukając stalową komorą o twardą powierzchnię.</li>
		<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przyłączanie przeciwciał fluorescencyjnych
	<ol>
		<li>Odkręć komorę PBM i wyjmij "kanapkę" z szkiełkiem nakrywkowym do mikromatrycy, uważając, aby nie naruszyć uszczelki. Zdemontuj pod wodą w naczyniu WASH za pomocą kleszczy. Potrząśnij zjeżdżalnią pod wodą i szybko przenieś do słoika Coplin zawierającego PBS.</li>
		<li>Zamontuj komorę PBM z suwakiem uszczelki zgodnie z wcześniejszym opisem (kroki 2.1.2–2.1.3).</li>
		<li>Dodaj przeciwciało anty-his sprzężone z Alexa 488 (10 ng / μL w buforze wiążącym) do szkiełka uszczelki.</li>
		<li>Krótko przepłucz szkiełko, zanurzając je w naczyniu PBS jak poprzednio, a następnie powoli wyjmij szkiełko z PBS, wytrzyj powierzchnię niezawierającą DNA i umieść ją skierowaną w dół na szkiełku uszczelniającym.</li>
		<li>Inkubuj 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności (sonda fluorescencyjna jest wrażliwa na światło), aby zmniejszyć fotowybielanie.</li>
		<li>Zdemontuj komorę PBM i szkiełko nakrywkowe jak poprzednio, wyjmując szkiełko nakrywkowe pod wodą w naczyniu do mycia.</li>
		<li>Krótko opłucz szkiełka, zanurzając je w naczyniu PBS. Osuszyć szkiełka sprężonym powietrzem. Przechowuj w ciemności w pudełku na slajdy, aż będzie gotowy do skanowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skanowanie szkiełka z mikromacierzą 
	<ol>
		<li>Zeskanuj chip za pomocą skanera mikromacierzowego (patrz Tabela materiałów) o wzbudzeniu 495 nm i emisji 519 nm i zbierz medianę intensywności fluorescencji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza danych z mikromacierzy
UWAGA: Wszystkie dane zostały przetworzone za pomocą niestandardowych skryptów w MATLAB.
<ol>
	<li>Wykonaj początkowe przetwarzanie danych PBM przy użyciu wartości p testu sumy rang Wilcoxona, jak opisano wcześniej4.</li>
	<li>Do dalszej analizy należy wykorzystać medianę intensywności wiązania dla każdej sekwencji DNA.</li>
	<li>Następnie, korzystając z jednoczynnikowych wartości p ANOVA, porównaj istotność statystyczną zaobserwowanych różnic w intensywności wiązania prymasyz-DNA uzyskanych dla różnych grup sond DNA, jak wyjaśniono powyżej w sekcji projektowania biblioteki DNA3.</li>
</ol>
4. Synteza RNA sterowana przez matrycę katalizowana przez prymazę DNA T7
<ol>
	<li>Przygotowanie denaturującego żelu poliakryloamidowego
	<ol>
		<li>Aby przygotować 100 ml mieszaniny żelu, połącz 62,5 ml 40% bisakryloamidu akryloamidu (19:1), 42 g mocznika, 1,1 g zasady Tris (2-amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiolu), 0,55 g kwasu borowego i 0,4 ml 0,5 M roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).</li>
		<li>Podzielić mieszaninę na 14 ml porcji (ilość potrzebna na jeden żel o wymiarach 16,5 cm x 26 cm x 0,03 cm) i chronić je przed światłem w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
		<li>Aby przygotować jeden denaturujący żel poliakrylamidowy, należy dodać 4 μl TEMED i 40 μl 10% w/v nadsiarczanu amonu do 14 ml wcześniej przygotowanej mieszaniny, odlać go i pozostawić do polimeryzacji na co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej. Żel można przechowywać przez jeden dzień w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbki 
	UWAGA: Odczynniki, mieszaninę reakcyjną i próbki należy przechowywać na lodzie.
	<ol>
		<li>Aby przygotować mieszaninę reakcyjną wymaganą do dziesięciu reakcji, połącz 11 μL 5x aktywnego buforu (200 mM Tris-HCl, pH = 7,5; 50 mM ditiotreitol, 250 mM glutaminianu potasu, 50 mM MgCl2), 5,5 μL mieszaniny 2,5 mM trifosforanu nukleotydów (NTP) i 5,5 μl znakowanego radioaktywnie rybonukleotydu [np. ATP, (α-32P) 3000 Ci/mmol]. 
UWAGA: Wszystkie ilości zostały zwiększone o 10% ze względu na możliwe błędy pipetowania. Rybonukleotydy znakowane radioaktywnie należy rozcieńczyć zgodnie z siłą sygnału radioaktywnego (początkowe rozcieńczenie wynosi zwykle 1:10 lub więcej).</li>
		<li>Przenieść 2 μl mieszaniny reakcyjnej do dziesięciu probówek PCR.</li>
		<li>Dodaj 1 μl 100 μM matrycy DNA do odpowiedniej probówki PCR i odwiruj.</li>
		<li>Dodaj 2 μl 16 μM prymazy DNA T7, odwiruj, delikatnie wymieszaj i ponownie odwiruj.</li>
		<li>Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
		<li>Zatrzymaj reakcję, dodając 5 μl roztworu hartującego (95% formamidu, 20 mM EDTA, 0,05% w/v cyjanolu ksylenowego i błękitu bromofenolowego), wymieszaj i odwiruj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Separacja produktów RNA za pomocą elektroforezy poprzez denaturację żelu poliakrylamidowego i późniejsza detekcja sygnału
	<ol>
		<li>Uruchom żel przez 1 godzinę (10 mA, 600 V) w 1x buforze TBE (90 mM Tris-boran, 2 mM EDTA).</li>
		<li>Załadować do 2 μl każdej próbki i przeprowadzić elektroforezę (20 mA, 1100 V) w 1x buforze TBE (90 mM Tris-boran, 2 mM EDTA).</li>
		<li>Suszyć żel przez 2 godziny w temperaturze 80 °C w próżni</li>.
		<li>Wystawić płytkę obrazowania luminoforowego na działanie radioaktywnego żelu przez kilka godzin do nocy, w zależności od siły sygnału radioaktywnego.</li>
		<li>Nagrać sygnał (luminescencja fotostymulowana) za pomocą luminowizora (patrz Tabela Materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+binding+microarrays+%28PBMs%29+for+rapid%2C+high-throughput+characterization+of+the+sequence+specificities+of+DNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).</li>
<li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li>
<li>Afek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Sequence+Context+Controls+the+Binding+and+Processivity+of+the+T7+DNA+Primase%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase.</a> iScience. 2, 141-147 (2018).</li>
<li>Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-DNA+binding+in+the+absence+of+specific+base-pair+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Nationaly+Academy+of+Sciences+of+the+Unitet+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).</li>
<li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+bacteriophage+T7+gene+4+primase+with+its+template+recognition+site%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).</li>
<li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template+recognition+sequence+for+RNA+primer+synthesis+by+gene+4+protein+of+bacteriophage+T7%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Nationaly+Academy+of+Sciences+of+the+Unitet+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).</li>
<li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).</li>
<li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNAse+footprinting%3A+a+simple+method+for+the+detection+of+protein-DNA+binding+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).</li>
<li>Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+protein-DNA+interactions+by+surface+plasmon+resonance+%28real+time+kinetics%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics).</a> Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788(1991).</li>
<li>Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+detection+of+DNA-binding+proteins+by+protein+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The detection of DNA-binding proteins by protein blotting.</a> Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).</li>
<li>Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+sequence+specificity+of+DNA-binding+proteins+by+selecting+binding+sites+from+random-sequence+oligonucleotides%3A+analysis+of+yeast+GCN4+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein.</a> Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).</li>
<li>Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+DNA-binding+domains+for+sequence-specific+DNA+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition.</a> Gene. 304, 1-12 (2003).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Metoda PBM jest szeroko stosowana do badania właściwości wiązania czynników transkrypcyjnych i może być również stosowana do enzymów przetwarzających DNA, takich jak prymaza DNA, które wiążą się z DNA o niskim powinowactwie. Wymagane są jednak pewne modyfikacje procedur eksperymentalnych. Eksperyment z mikromacierzą składa się z kilku etapów: zaprojektowania biblioteki DNA, przygotowania chipa, wiązania celu białkowego, znakowania fluorescencyjnego i skanowania. Łagodne etapy mycia mają kluczowe znaczenie, ponieważ długi...

HTPP wykorzystuje technologię mikromacierzy wiążących DNA w połączeniu z analizą biochemiczną (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) do statystycznej identyfikacji specyficznych cech matryc DNA, które wpływają na aktywność enzymatyczną prymazy DNA. Dlatego HTPP zapewnia platformę technologiczną, która ułatwia skok wiedzy w tej dziedzinie. Klasyczne narzędzia używane do wyznaczania miejsc rozpoznawania prymasowego nie mają możliwości uzyskania ogromnych ilości danych, podczas gdy HTPP ma.
PBM jest techniką rutynowo używaną do określania preferencji wiązania czynników transkrypcyjnych z DNA1,2; jednak nie nadaje się do wykrywania słabego/przejściowego wiązania białek z DNA. W przeciwieństwie do uniwersalnego PBM, który dostarcza informacji o średniej specyficzności wiązania białek ze wszystkimi możliwymi sekwencjami składającymi się z ośmiu par zasad, HTPP opiera się na bibliotece jednoniciowych matryc DNA zawierających unikalne elementy sekwencji. Takie elementy sekwencji DNA obejmują dziesiątki tysięcy krótkich (kilkadziesiąt pz) sekwencji genomowych, a także obliczeniowo zaprojektowane sekwencje DNA wzbogacone o pewne powtarzalne elementy sekwencji DNA obecne w genomie, które mają różną średnią zawartość GC. Takie wysokoprzepustowe podejście pozwala na określenie, w sposób systematyczny, ilościowy i oparty na hipotezach, właściwości związanych z sekwencją, które są ważne dla wiązania prymazy i jej aktywności enzymatycznej3. W szczególności zidentyfikowano ważny związek między preferencjami wiązania prymazyny-DNA (modulowanymi przez sekwencje DNA flankujące określone miejsca wiązania trinukleotydów) a procesywnością prymów dla tego układu enzymatycznego4.
Nowa technologia została zastosowana do ponownego zbadania naszego rozumienia miejsc rozpoznawania prymazów, nawet dla prymazy DNA T7, która została gruntownie zbadana5. W szczególności ponowne zbadanie klasycznych koncepcji, takich jak miejsca rozpoznawania DNA prymazy DNA T7 (które zostały określone prawie cztery dekady temu 6) przy użyciu mikromacierzy wiążącej białko-DNA (PBM) doprowadziło do bezprecedensowego wglądu w cechy związane z sekwencją flankującą tych miejsc rozpoznawania3. Spodziewano się, że sekwencje flankujące miejsce rozpoznawania trinukleotydów prymazy DNA T7 (5'-GTC-3') będą losowe. Zamiast tego odkryliśmy, że bogate w TG sekwencje flankujące zwiększają szanse prymazy DNA T7 na syntezę dłuższych starterów RNA, co wskazuje na wzrost procesowości.
Inne metody, które mogą być użyte do badania właściwości wiązania DNA przez białka in vitro, to test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA)7, ślad DNazy I8, powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR)9, oraz Southwestern blotting10. Są to jednak metody niskoprzepustowe, które można zastosować tylko do badania niewielkiej liczby sekwencji DNA. Ponadto precyzja i czułość niektórych z tych technik (np. EMSA) jest niska. Z drugiej strony, selekcja in vitro11 to technika, która podobnie jak PBM może być stosowana do identyfikacji wielu sekwencji wiążących. Jednak sekwencje o niskim powinowactwie są zwykle wykluczane w większości zastosowań selekcji in vitro; W związku z tym podejście to nie jest odpowiednie do uzyskiwania porównawczych danych wiążących dla wszystkich dostępnych sekwencji. Uniwersalny PBM1,2 jest używany głównie do charakteryzowania specyficzności wiązania czynników transkrypcyjnych od prokariontów i eukariontów, a także specyficznych czynników (np. obecności niektórych ligandów, kofaktorów itp.), które mogą wpływać na tę interakcję12.
HTPP rozszerza zastosowanie PBM o enzymy przetwarzające DNA, łącząc bezprecedensową moc statystyczną o wysokiej przepustowości z wysoką precyzją, aby dostarczyć informacji o kontekście sekwencji wiązania. Takie dane nie zostały jeszcze uzyskane dla prymasów i pokrewnych enzymów (które mają słabe/przejściowe wiązanie z DNA) ze względu na wyżej wymienione ograniczenia techniczne innych dostępnych technik.

<table><tbody><tr><td>40% roztwór akryloamidu i bisakryloamidu (19:1)</td><td>Merck</td><td>1006401000</td><td></td></tr><tr><td>95% formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-sprzężone przeciwciało anty-he</td><td>Qiagen</td><td>35310</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&alpha;-32P] &ndash; 3000 Ci/mmol</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td>NEG003H250UC</tr><tr><td>Kwas borowy, granulowany</td><td>Glentham Life Sciences</td><td>GE4425</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Roche</td><td>10735094001</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>Słoik</td><td></td><td></td><td></td>z kopliny</tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-25G</td><td></td></tr><tr><td>DNA mikromacierz</td><td>Agilent</td><td></td><td>4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Acros Organics</td><td>AC118430010</td><td></td></tr><tr><td>Fujifilm FLA-5100 luminowizator</td><td>FUJIFILM Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stojak do barwienia szkiełek</td><td>Thermo Scientific</td><td>12869995</td><td>Jeśli używanych jest kilka szkiełek</td></tr><tr><td>Rotator</td> <td>laboratoryjnyThermo Scientific</td><td>88880025</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63064-500G</td><td></td></tr><tr><td>Komora do hybrydyzacji mikromacierzy</td><td>Agilent</td><td>G2534A</td><td>https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf</td></tr><tr><td>Skaner mikromacierzy (GenePix 4400A)</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminian potasu</td><td>Alfa Aesar</td><td>A172232</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka roztworów rybonukleotydów (rNTPs)</td><td>New England BioLabs</td><td>N0466S Jądra</td><td></td></tr><tr><td>łososia DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626-1G</td><td></td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko w proszku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70166-500G</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie barwiące</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>12657696</tr><tr><td>Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610800</td><td></td></tr><tr><td>Tris zasada (2-Amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93362-500G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6504-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanol ksylenowy</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21530</td><td></td></tr></tbody></table>

rozpoznawanie sekwencji dna za pomocą prymazy dna przy użyciu wysokoprzepustowego profilowania prymazów

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Prymas DNA syntetyzuje krótkie startery RNA, które inicjują syntezę DNA fragmentów Okazaki na opóźnionej nici przez polimerazę DNA podczas replikacji DNA. Wiązanie prokariotycznych prymazów podobnych do DnaG z DNA zachodzi w określonej sekwencji rozpoznawania trinukleotydów. Jest to kluczowy krok w tworzeniu się fragmentów Okazaki. Konwencjonalne narzędzia biochemiczne, które są używane do określania sekwencji rozpoznawania DNA prymazy DNA, dostarczają tylko ograniczonych informacji. Korzystając z wysokoprzepustowego testu wiązania opartego na mikromacierzach i kolejnych analiz biochemicznych, wykazano, że 1) specyficzny kontekst wiązania (sekwencje flankujące miejsce rozpoznania) wpływa na siłę wiązania prymazy DNA z jego matrycowym DNA, oraz 2) silniejsze wiązanie prymazy z DNA daje dłuższe startery RNA, co wskazuje na wyższą procesowość enzymu. Metoda ta łączy PBM i test aktywności prymazy i jest określana jako wysokoprzepustowe profilowanie prymasów (HTPP) i umożliwia scharakteryzowanie rozpoznawania specyficznych sekwencji przez prymazę DNA w niespotykanym dotąd czasie i skalowalności.

Ten postęp technologiczny w mapowaniu miejsc wiązania primazy pozwala na uzyskanie informacji o właściwościach wiązania DNA, które są trudne, jeśli nie niemożliwe, do zaobserwowania przy użyciu klasycznych narzędzi. Co ważniejsze, HTPP umożliwia ponowne przeanalizowanie tradycyjnego rozumienia miejsc wiązania primazy. W szczególności HTPP ujawnia specyficzność wiązania poza znanymi sekwencjami rozpoznawczymi 5'-GTC-3', co prowadzi do zmian w aktywnościach funkcjonalnych primazy DNA T7. Zi...

Eksperymenty z mikromacierzą wiążącą białka (PBM) w połączeniu z testami biochemicznymi łączą właściwości wiązania i katalityczne primazy DNA, enzymu, który syntetyzuje startery RNA na matrycowym DNA. Metoda ta, określana jako wysokoprzepustowe profilowanie prymasowe (HTPP), może być stosowana do ujawniania wzorców wiązania DNA różnych enzymów.

Rozpoznawanie sekwencji DNA za pomocą prymazy DNA przy użyciu wysokoprzepustowego profilowania prymazów

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Protokół ten opisuje zbiór ogromnych danych z mikromacierzy wiążącej białko-DNA dla prymazy, enzymu, który przejściowo wiąże się z określonymi sekwencjami DNA, a to z kolei katalizuje tworzenie starterów RNA. W tym filmie omówimy, w jaki sposób technologia mikromacierzy może pomóc w ponownym zdefiniowaniu miejsc rozpoznawania sekwencji prymasowych oraz w jaki sposób podejście o wysokiej przepustowości może uzupełnić klasyczną biochemię. Technika ta łączy w sobie dwa podejścia: mikromacierz wiążącą DNA prymazy i test aktywności prymazy.Mikromacierz dostarcza ogromnych danych o wiązaniu prymazy z sekwencjami DNA, podczas gdy test biochemiczny dostarcza informacji na temat tworzenia starterów RNA przez prymazy DNA. Badana aktywność enzymatyczna zależy od wglądu w eksperyment z mikromacierzą i jej niższej przepustowości w swoim charakterze. Badany jest związek między efektywnością wiązania, selekcją sekwencji DNA a aktywnością enzymu.Identyfikacja determinacji sekwencji za pomocą mikromacierzy pozwala nam na wyciąganie dokładnych wniosków na podstawie ogromnych danych z mikromacierzy. Podejście to było dotychczas stosowane do opisu sekwencji wiążących DNA czynników transkrypcyjnych. Czynniki transkrypcyjne to statyczne białka, które ściśle wiążą się z DNA.Procedurę zademonstruje Stefan Ilic. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wstępnie zwilżyć szkiełko do mikromacierzy, umieszczając je w słoiku z kopiną zawierającym 0,01%Triton-X 100. I obracając się na rotatorze laboratoryjnym, dodaj 125 obr./min przez pięć minut.Odpipetować roztwór blokujący do plastikowego pudełka. Następnie wyjmij szkiełko do mikromacierzy ze słoika coplin. Użyj drobnej chusteczki, aby naprowadzić stronę i krawędzie szkiełka bez DNA.Powoli umieść mikromacierz w plastikowym pudełku. Inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę, powoli wstrząsając. Następnie umyj szkiełko raz za pomocą 0,01%Tween-20 w PBS.Na rotatorze laboratoryjnym z prędkością 125 obr./min przez pięć minut. Wyjmij Tween-20 i przepłucz szkiełko raz 0,01%Triton-X 100 w PBS na rotatorze laboratoryjnym z prędkością 125 obr./min przez dwie minuty. Następnie szybko przenieś szkiełko do słoika z kopeliną zawierającego PBS.Najpierw zmontuj komorę PMB zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść zjeżdżalnię w wyznaczonym miejscu. Użyj pęsety, aby popchnąć go w dół i w lewo.Umieść silikonową uszczelkę na górze, upewniając się, że jest dobrze wyrównana z dolną częścią komory PBM. Następnie zamknij komorę i dokręć po przekątnej. Odpipetować mieszaninę wiążącą białka do każdego dołka uszczelki.Następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Aby rozpocząć, odpipetuj 0,05% Tween-20 w PBS do komory PBM, aby na krótko umyć szkiełko. Za pomocą aspiratora próżniowego usuń roztwór z dołków komory, uważając, aby nie dotknąć plamek DNA.Powtórz to, krótko umyj szkiełko PBS. I użyj próżni, aby usunąć roztwór z dołków komory, uważając, aby nie dotknąć plamek DNA. Następnie dodaj sprzężone przeciwciało anty-He Alexa 488 do każdej studzienki komory PBM.Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie krótko umyj szkiełko w komorze PBM, dodając kilka kropli 0,05% Tween-20 w PBS do każdej studzienki. I użyj aspiratora próżniowego, aby usunąć roztwór z dołków komory, uważając, aby nie dotknąć plamek DNA.Zdemontuj komorę PBM i wyjmij zamek. Wypłucz szkiełka dwukrotnie w 0,05% Tween-20 w PBS, przy czym każde płukanie trwa trzy minuty. Następnie przepłucz szkiełka dwa razy w PBS, przy czym każde płukanie trwa trzy minuty.I jeden raz w podwójnie destylowanej wodzie przez trzy minuty. Osuszyć szkiełka sprężonym powietrzem. I przechowuj je w ciemnym pudełku na slajdy, aż będą gotowe do skanowania.Gdy będziesz gotowy, użyj skanera mikromatrycowego, aby zeskanować chip ze wzbudzeniem 495 nanometrów i emisją 19 nanometrów. I zbierz medianę intensywności fluorescencji. W tym badaniu profilowanie prymazy o przepustowości pi jest wykorzystywane do mapowania miejsc wiązania prymazy, w tym tych, które są trudne, jeśli nie niemożliwe do zaobserwowania przy użyciu klasycznych narzędzi.Co ważne, profilowanie prymazy o przepustowości pi umożliwia ponowne przyjrzenie się tradycyjnemu rozumieniu miejsc wiązania prymów. Zwłaszcza profilowanie prymazy o przepustowości pi ujawnia specyficzność wiązania oprócz znanych sekwencji rozpoznawania 5'GTC3', co prowadzi do zmian w czynnościach funkcjonalnych prymazy DNA T7. Mianowicie, identyfikowane są dwie grupy sekwencji.Silnie wiążące sekwencje DNA, które zawierały TG po bokach i słabe wiążące sekwencje DNA, które zawierały AG po bokach. Nie wykryto wiązania prymazy z matrycami DNA, w których brakowało 5'GTC3' w swoich sekwencjach. Miejsca rozpoznawania DNA prymasów, które zawierają specyficzne cechy, takie jak boki bogate w TG, zwiększają wiązanie DNA prymasów nawet 10-krotnie.Co zaskakujące, zwiększają również długość nowo powstałego RNA. Co ważne, wysokoprzepustowe profilowanie prymazów pozwala nam obserwować i określać ilościowo zmienność długości starterów w stosunku do sekwencji matrycy DNA. Podczas wykonywania tej procedury etapy mycia powinny być subtelne.A powinny zawierać składniki, które zarejestrowały prymazę na DNA. Biochemicznie określa się również próg daremnych zdarzeń wiązania. W związku z tym analiza mikromacierzy jest niewystarczająca.Metody takie jak rezonans osocza powierzchniowego i testy przesunięcia żelu mogą określić powinowactwo wiązania prymazy w celu wybrania sekwencji DNA. Moje laboratorium wdraża modele predykcyjne uczenia maszynowego do wykrywania determinantów sekwencji prymaz, które dają produktywne startery, które można rozszerzyć za pomocą polimerazy DNA. W dobie big data, czyli implementacji metod statystycznych do analizy dużych zbiorów danych, technika ta z pewnością pomoże lepiej scharakteryzować konkretne sekwencje DNA i powiązać rozpoznawanie sekwencji z aktywnością prymazy.Każdy, kto pracuje z promieniowaniem, powinien dokładnie zrozumieć przepisy i zagrożenia związane ze stosowaniem promieniowania jonizującego. Powinien przejść szkolenie i powinien pracować ze sprzętem ochronnym.

dna-sequence-recognition-dna-primase-using-high-throughput-primase

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiamy metodę ukierunkowanego odzyskiwania sekwencji starożytnego DNA, którą wykorzystaliśmy do rekonstrukcji kompletnych genomów mitochondrialnych pięciu osobników neandertalczyków. Porównanie tych sekwencji z genomami współczesnych ludzi sugeruje, że neandertalczycy przez długi czas charakteryzowali się niską efektywną wielkością populacji.

Wychwyt poprzez elongację starterów: celowane odzyskiwanie sekwencji z silnie zdegradowanych źródeł DNA

Ten film demonstruje gradientową reakcję łańcuchową polimerazy w celu optymalizacji temperatury wyżarzania podkładów, która ustawia gradientową temperaturę wyżarzania wzdłuż studni. Wpływ różnych temperatur wyżarzania zależy od wydajności amplifikowanych produktów, co pomaga zoptymalizować warunki reakcji.

Gradientowa reakcja łańcuchowa polimerazy w celu określenia optymalnej temperatury wyżarzania

Wysokoprzepustowa selektywna acylacja hydroksylowa 2' analizowana przez rozszerzenie startera (SHAPE) wykorzystuje nowatorską technologię sondowania chemicznego, odwrotną transkrypcję, elektroforezę kapilarną i oprogramowanie do przewidywania struktury drugorzędowej do określenia struktur RNA od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu.

Przewidywanie struktury drugorzędowej RNA przy użyciu wysokoprzepustowego SHAPE

Pirosekwencjonowanie to wszechstronna technika, która ułatwia sekwencjonowanie genomu drobnoustrojów, które może być używane do identyfikacji gatunków bakterii, rozróżniania szczepów bakteryjnych i wykrywania mutacji genetycznych, które nadają odporność na środki przeciwdrobnoustrojowe. W tym filmie zostanie zademonstrowana procedura generowania amplikonów drobnoustrojów, pirosekwencjonowania amplikonów i analizy sekwencji DNA.

Pirosekwencjonowanie w celu identyfikacji i charakterystyki drobnoustrojów

Opisujemy tutaj metodę rozszerzania startera opartą na fluorescencji, aby określić punkty początkowe transkrypcji na podstawie bakteryjnych transkryptów i przetwarzania RNA in vivo za pomocą automatycznego sekwenatora żelowego.

Technika rozszerzania starterów oparta na fluorescencji w celu określenia punktów wyjściowych transkrypcji i miejsc cięcia RNaz in vivo

Opisujemy tutaj test polegający na sprzężeniu identyfikacji metylotransferazy adeninowej DNA (DamID) z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości (DamID-seq). Ta ulepszona metoda zapewnia wyższą rozdzielczość i szerszy zakres dynamiki oraz umożliwia analizowanie danych DamID-seq w połączeniu z innymi danymi sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, takimi jak ChIP-seq, RNA-seq itp.

DamID-seq: Mapowanie interakcji białko-DNA w całym genomie poprzez wysokoprzepustowe sekwencjonowanie fragmentów DNA metylowanych adeniną

Celem tego protokołu jest wykorzystanie kombinacji badań obliczeniowych i laboratoryjnych do znalezienia nowych sekwencji, które nie mogą być łatwo oddzielone od sekwencji współoczyszczającej, która może być tylko częściowo znana.

Odkrycie nowych sekwencji za pomocą genomiki subtraktywnej

Protokół zawiera instrukcję modyfikacji RNA za pomocą siarczanu dimetylu do eksperymentów z profilowaniem mutacji. Obejmuje ona sondowanie in vitro i in vivo z dwiema alternatywnymi metodami przygotowania biblioteki.

Sondowanie struktury RNA za pomocą siarczanu dimetylu Profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem in vitro i w komórkach

Nanomaszyny oparte na DNAzyme mogą być używane do wysoce selektywnego i czułego wykrywania kwasów nukleinowych. W artykule opisano szczegółowy protokół projektowania nanomaszyn opartych na DNAzyme z rdzeniem 10-23 przy użyciu wolnego oprogramowania i ich zastosowania w wykrywaniu fragmentu wirusa Epsteina-Barr jako przykładu.

DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

Opracowano wzbogacanie i sekwencjonowanie nowogenetycznego DNA (eSPAN) związanego z białkiem, aby wykryć względną obfitość białka związanego z chromatyną na dwóch replikujących się niciach DNA, co ujawniło molekularne wgląd w replikację chromatyny i jej sprzężone procesy. Protokół ten opisuje procedury eSPAN w komórkach macierzystych drożdży i myszy embrionalnych (ES).

Analiza białek specyficznych dla nici łańcuchowej w replikacji nici DNA poprzez wzbogacenie i sekwencjonowanie metody DNA powiązanego z białkiem

Poznaj metodę wysokoprzepustowego profilowania prymazów DNA w celu analizy rozpoznawania sekwencji DNA przez prymazę. Technika łączy mikromacierze wiążące białko-DNA z biochemicznymi testami aktywności enzymatycznej.

Rozpoznawanie sekwencji DNA za pomocą prymazy DNA przy użyciu wysokoprzepustowego profilowania prymazów

Przeglądaj więcej filmów