Rozpoznawanie sekwencji DNA za pomocą prymazy DNA przy użyciu wysokoprzepustowego profilowania prymazów
8 października 2019
Eksperymenty z mikromacierzą wiążącą białka (PBM) w połączeniu z testami biochemicznymi łączą właściwości wiązania i katalityczne primazy DNA, enzymu, który syntetyzuje startery RNA na matrycowym DNA. Metoda ta, określana jako wysokoprzepustowe profilowanie prymasowe (HTPP), może być stosowana do ujawniania wzorców wiązania DNA różnych enzymów.
Protokół ten opisuje zbiór ogromnych danych z mikromacierzy wiążącej białko-DNA dla prymazy, enzymu, który przejściowo wiąże się z określonymi sekwencjami DNA, a to z kolei katalizuje tworzenie starterów RNA. W tym filmie omówimy, w jaki sposób technologia mikromacierzy może pomóc w ponownym zdefiniowaniu miejsc rozpoznawania sekwencji prymasowych oraz w jaki sposób podejście o wysokiej przepustowości może uzupełnić klasyczną biochemię. Technika ta łączy w sobie dwa podejścia: mikromacierz wiążącą DNA prymazy i test aktywności prymazy.
Mikromacierz dostarcza ogromnych danych o wiązaniu prymazy z sekwencjami DNA, podczas gdy test biochemiczny dostarcza informacji na temat tworzenia starterów RNA przez prymazy DNA. Badana aktywność enzymatyczna zależy od wglądu w eksperyment z mikromacierzą i jej niższej przepustowości w swoim charakterze. Badany jest związek między efektywnością wiązania, selekcją sekwencji DNA a aktywnością enzymu.
Identyfikacja determinacji sekwencji za pomocą mikromacierzy pozwala nam na wyciąganie dokładnych wniosków na podstawie ogromnych danych z mikromacierzy. Podejście to było dotychczas stosowane do opisu sekwencji wiążących DNA czynników transkrypcyjnych. Czynniki transkrypcyjne to statyczne białka, które ściśle wiążą się z DNA.
Procedurę zademonstruje Stefan Ilic. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wstępnie zwilżyć szkiełko do mikromacierzy, umieszczając je w słoiku z kopiną zawierającym 0,01%Triton-X 100. I obracając się na rotatorze laboratoryjnym, dodaj 125 obr./min przez pięć minut.
Odpipetować roztwór blokujący do plastikowego pudełka. Następnie wyjmij szkiełko do mikromacierzy ze słoika coplin. Użyj drobnej chusteczki, aby naprowadzić stronę i krawędzie szkiełka bez DNA.
Powoli umieść mikromacierz w plastikowym pudełku. Inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę, powoli wstrząsając. Następnie umyj szkiełko raz za pomocą 0,01%Tween-20 w PBS.
Na rotatorze laboratoryjnym z prędkością 125 obr./min przez pięć minut. Wyjmij Tween-20 i przepłucz szkiełko raz 0,01%Triton-X 100 w PBS na rotatorze laboratoryjnym z prędkością 125 obr./min przez dwie minuty. Następnie szybko przenieś szkiełko do słoika z kopeliną zawierającego PBS.
Najpierw zmontuj komorę PMB zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść zjeżdżalnię w wyznaczonym miejscu. Użyj pęsety, aby popchnąć go w dół i w lewo.
Umieść silikonową uszczelkę na górze, upewniając się, że jest dobrze wyrównana z dolną częścią komory PBM. Następnie zamknij komorę i dokręć po przekątnej. Odpipetować mieszaninę wiążącą białka do każdego dołka uszczelki.
Następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Aby rozpocząć, odpipetuj 0,05% Tween-20 w PBS do komory PBM, aby na krótko umyć szkiełko. Za pomocą aspiratora próżniowego usuń roztwór z dołków komory, uważając, aby nie dotknąć plamek DNA.
Powtórz to, krótko umyj szkiełko PBS. I użyj próżni, aby usunąć roztwór z dołków komory, uważając, aby nie dotknąć plamek DNA. Następnie dodaj sprzężone przeciwciało anty-He Alexa 488 do każdej studzienki komory PBM.
Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie krótko umyj szkiełko w komorze PBM, dodając kilka kropli 0,05% Tween-20 w PBS do każdej studzienki. I użyj aspiratora próżniowego, aby usunąć roztwór z dołków komory, uważając, aby nie dotknąć plamek DNA.
Zdemontuj komorę PBM i wyjmij zamek. Wypłucz szkiełka dwukrotnie w 0,05% Tween-20 w PBS, przy czym każde płukanie trwa trzy minuty. Następnie przepłucz szkiełka dwa razy w PBS, przy czym każde płukanie trwa trzy minuty.
I jeden raz w podwójnie destylowanej wodzie przez trzy minuty. Osuszyć szkiełka sprężonym powietrzem. I przechowuj je w ciemnym pudełku na slajdy, aż będą gotowe do skanowania.
Gdy będziesz gotowy, użyj skanera mikromatrycowego, aby zeskanować chip ze wzbudzeniem 495 nanometrów i emisją 19 nanometrów. I zbierz medianę intensywności fluorescencji. W tym badaniu profilowanie prymazy o przepustowości pi jest wykorzystywane do mapowania miejsc wiązania prymazy, w tym tych, które są trudne, jeśli nie niemożliwe do zaobserwowania przy użyciu klasycznych narzędzi.
Co ważne, profilowanie prymazy o przepustowości pi umożliwia ponowne przyjrzenie się tradycyjnemu rozumieniu miejsc wiązania prymów. Zwłaszcza profilowanie prymazy o przepustowości pi ujawnia specyficzność wiązania oprócz znanych sekwencji rozpoznawania 5'GTC3', co prowadzi do zmian w czynnościach funkcjonalnych prymazy DNA T7. Mianowicie, identyfikowane są dwie grupy sekwencji.
Silnie wiążące sekwencje DNA, które zawierały TG po bokach i słabe wiążące sekwencje DNA, które zawierały AG po bokach. Nie wykryto wiązania prymazy z matrycami DNA, w których brakowało 5'GTC3' w swoich sekwencjach. Miejsca rozpoznawania DNA prymasów, które zawierają specyficzne cechy, takie jak boki bogate w TG, zwiększają wiązanie DNA prymasów nawet 10-krotnie.
Co zaskakujące, zwiększają również długość nowo powstałego RNA. Co ważne, wysokoprzepustowe profilowanie prymazów pozwala nam obserwować i określać ilościowo zmienność długości starterów w stosunku do sekwencji matrycy DNA. Podczas wykonywania tej procedury etapy mycia powinny być subtelne.
A powinny zawierać składniki, które zarejestrowały prymazę na DNA. Biochemicznie określa się również próg daremnych zdarzeń wiązania. W związku z tym analiza mikromacierzy jest niewystarczająca.
Metody takie jak rezonans osocza powierzchniowego i testy przesunięcia żelu mogą określić powinowactwo wiązania prymazy w celu wybrania sekwencji DNA. Moje laboratorium wdraża modele predykcyjne uczenia maszynowego do wykrywania determinantów sekwencji prymaz, które dają produktywne startery, które można rozszerzyć za pomocą polimerazy DNA. W dobie big data, czyli implementacji metod statystycznych do analizy dużych zbiorów danych, technika ta z pewnością pomoże lepiej scharakteryzować konkretne sekwencje DNA i powiązać rozpoznawanie sekwencji z aktywnością prymazy.
Każdy, kto pracuje z promieniowaniem, powinien dokładnie zrozumieć przepisy i zagrożenia związane ze stosowaniem promieniowania jonizującego. Powinien przejść szkolenie i powinien pracować ze sprzętem ochronnym.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustową metodę analizy właściwości wiązania i katalitycznych primazy DNA z wykorzystaniem mikrotablic wiązania białko-DNA. Technika ta łączy technologię mikrotablic z testami biochemicznymi w celu uzyskania informacji na temat rozpoznawania sekwencji przez primazę oraz tworzenia starterów RNA.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Biologia molekularna
- Genetyka
Wstęp
- Primaza DNA syntetyzuje startery RNA na matrycy DNA.
- Zrozumienie wzorców wiązania primazy jest kluczowe dla wyjaśnienia jej funkcji.
- Metody wysokoprzepustowe mogą usprawnić tradycyjne podejścia biochemiczne.
- Technologia mikromacierzy umożliwia masowe gromadzenie danych na temat oddziaływań białko-DNA.
Cel badania
- Ponowne zdefiniowanie miejsc rozpoznawania sekwencji przez prymazę.
- Powiązanie wydajności wiązania z aktywnością enzymatyczną.
- Wykorzystanie profilowania wysokoprzepustowego do przeprowadzenia kompleksowej analizy.
Zastosowane metody
- Eksperymenty z mikroarrayami wiązania białko-DNA.
- Analizy biochemiczne w celu pomiaru tworzenia starterów RNA.
- Metodyka wysokoprzepustowego profilowania prymazy (HTPP).
- Analiza danych w celu skorelowania wzorców wiązania z aktywnością enzymu.
Główne wyniki
- Identyfikacja specyficznych sekwencji DNA wiązanych przez primazę.
- Korelacja między wydajnością wiązania a syntezą starterów RNA.
- Masowe gromadzenie danych zwiększa zrozumienie funkcji primazy.
- Wnioski dotyczące zależności między doborem sekwencji DNA a aktywnością enzymu.
Wnioski
- Metody wysokoprzepustowe dostarczają cennych informacji na temat zachowania enzymów.
- Powiązanie danych o wiązaniu z aktywnością katalityczną jest niezbędne do zrozumienia prymazy.
- Podejście to można zastosować do innych enzymów w celu przeprowadzenia podobnych analiz.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokoprzepustowe profilowanie primazy (HTPP) umożliwia skalowalną charakterystykę rozpoznawania sekwencji DNA przez primazę, łącząc specyficzność wiązania z funkcjonalnym wynikiem w syntezie starterów RNA. Podejście to wspiera walidację celu w enzymologii kwasów nukleinowych, dostarczając ilościowych i powtarzalnych danych na temat oddziaływań enzym-DNA, co pozwala na mechanistyczną redukcję ryzyka we wczesnej fazie odkrywania leków. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji związków wiodących poprzez korelację siły wiązania z procesywnością enzymatyczną, pomagając w selekcji projektów terapeutycznych ukierunkowanych na replikację.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez zdefiniowanie sekwencji rozpoznawanych przez primazę oraz wpływu kontekstu flankującego na siłę wiązania.
- Wartość operacyjna: Umożliwia biologiczną redukcję ryzyka dzięki ilościowej korelacji wydajności wiązania z długością startera RNA i procesywnością enzymu.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność przewidywań poprzez identyfikację determinantów sekwencji, które prowadzą do powstania produktywnych starterów mogących być przedłużanych przez polimerazę DNA.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów analizy poprzez mapowanie miejsc wiązania prymazy w tysiącach sekwencji DNA.
- Wartość operacyjna: Rozwiązanie problemu standaryzacji i powtarzalności testów dzięki zastosowaniu danych o wiązaniu opartych na mikromacierzach oraz jednoczesnym pomiarom aktywności.
- Skalowalność: Wykazanie gotowości do przesiewania i możliwości ponownego wykorzystania platformy poprzez połączenie metody PBM i testu aktywności prymazy w skalowalnym procesie HTPP.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Omówienie znaczenia w kontekście choroby poprzez powiązanie rozpoznawania sekwencji przez primazę z efektami funkcjonalnymi w tworzeniu fragmentów Okazaki.
- Zgodność z modelem przedklinicznym: Opis ciągłości od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez powiązanie specyficzności wiązania DNA z aktywnością syntezy starterów RNA.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Adresowanie minimalizacji ryzyka mechanistycznego poprzez wykorzystanie danych dotyczących wiązania i aktywności do podejmowania decyzji go/no-go w programach ukierunkowanych na replikację.
Integracja potoku i przepływu pracy
HTPP integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po badania przedkliniczne – dostarczając skalowalnych, ilościowych informacji na temat oddziaływań primaza-DNA, które rzucają światło na funkcję enzymatyczną.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób metoda ta wspiera testowanie hipotez, wyjaśnianie szlaków oraz ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki ogromnej ilości danych na temat wiązania prymazy z sekwencjami DNA.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość testu, powtarzalność oraz wyniki ilościowe poprzez korelację danych o wiązaniu z mikromacierzy z pomiarami tworzenia starterów RNA.
- Analityka: Wskazuje pomiary, odczyty i wyniki statystyczne, które pomagają zespołom porównywać siłę wiązania dla różnych wariantów sekwencji i wiązać je z aktywnością enzymatyczną.
- Badania translacyjne: Łączy metodę z ciągłością przedkliniczną, wykazując, w jaki sposób specyficzne dla sekwencji wiązanie wpływa na funkcjonalną syntezę starterów w replikacji DNA.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako wielokrotnie wykorzystywalną funkcjonalność, a nie technikę jednorazowego użytku, co umożliwia jej zastosowanie w różnych projektach z zakresu enzymologii kwasów nukleinowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w rozpoznawaniu kompleksu primaza-DNA.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność pomiarów wiązania oraz aktywności w obrębie zróżnicowanych sekwencji DNA.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje dotyczące kontynuacji lub przerwania badań (go/no-go), efektywność kapitałowa oraz zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach projektowania leków celujących w replikację.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja i decyzje o rozwoju skorygowane o ryzyko, oparte na ilościowym powiązaniu wydajności wiązania z aktywnością syntezy startera.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza naukowa w zakresie testów interakcji białko-DNA, obsługi mikromacierzy oraz detekcji fluorescencji.
- Potrzeby w zakresie aparatury i infrastruktury analitycznej, w tym skaner do mikromacierzy, komora PBM oraz system aspiracji próżniowej.
- Wymagania dotyczące standaryzacji międzyzespołowej w odniesieniu do składu buforów, rygorystyczności płukania i ustawiania progu fluorescencji.
- Kwestie adaptacyjne w różnych systemach modelowych, w szczególności dla prymaz z różnych organizmów lub wariantów modyfikowanych genetycznie.
- Praktyczne ograniczenia wynikające z materiałów źródłowych: etapy płukania muszą być delikatne, aby zachować sygnały wiązania, a bufory muszą zawierać komponenty utrzymujące interakcję prymazy z DNA podczas testu.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
1:29
Primase DNA Binding Experiment: Blocking Procedure
2:44
Primase DNA Binding Experiment: Protein Binding
3:22
Primase DNA Binding Experiment: Fluorescent Antibody Attachment
5:15
Results: Analysis of High-Throughput Primase Profiling
6:42
Conclusion
