Rozpoznawanie sekwencji DNA za pomocą prymazy DNA przy użyciu wysokoprzepustowego profilowania prymazów
October 8th, 2019
Eksperymenty z mikromacierzą wiążącą białka (PBM) w połączeniu z testami biochemicznymi łączą właściwości wiązania i katalityczne primazy DNA, enzymu, który syntetyzuje startery RNA na matrycowym DNA. Metoda ta, określana jako wysokoprzepustowe profilowanie prymasowe (HTPP), może być stosowana do ujawniania wzorców wiązania DNA różnych enzymów.
Protokół ten opisuje zbiór ogromnych danych z mikromacierzy wiążącej białko-DNA dla prymazy, enzymu, który przejściowo wiąże się z określonymi sekwencjami DNA, a to z kolei katalizuje tworzenie starterów RNA. W tym filmie omówimy, w jaki sposób technologia mikromacierzy może pomóc w ponownym zdefiniowaniu miejsc rozpoznawania sekwencji prymasowych oraz w jaki sposób podejście o wysokiej przepustowości może uzupełnić klasyczną biochemię. Technika ta łączy w sobie dwa podejścia: mikromacierz wiążącą DNA prymazy i test aktywności prymazy.
Mikromacierz dostarcza ogromnych danych o wiązaniu prymazy z sekwencjami DNA, podczas gdy test biochemiczny dostarcza informacji na temat tworzenia starterów RNA przez prymazy DNA. Badana aktywność enzymatyczna zależy od wglądu w eksperyment z mikromacierzą i jej niższej przepustowości w swoim charakterze. Badany jest związek między efektywnością wiązania, selekcją sekwencji DNA a aktywnością enzymu.
Identyfikacja determinacji sekwencji za pomocą mikromacierzy pozwala nam na wyciąganie dokładnych wniosków na podstawie ogromnych danych z mikromacierzy. Podejście to było dotychczas stosowane do opisu sekwencji wiążących DNA czynników transkrypcyjnych. Czynniki transkrypcyjne to statyczne białka, które ściśle wiążą się z DNA.
Procedurę zademonstruje Stefan Ilic. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wstępnie zwilżyć szkiełko do mikromacierzy, umieszczając je w słoiku z kopiną zawierającym 0,01%Triton-X 100. I obracając się na rotatorze laboratoryjnym, dodaj 125 obr./min przez pięć minut.
Odpipetować roztwór blokujący do plastikowego pudełka. Następnie wyjmij szkiełko do mikromacierzy ze słoika coplin. Użyj drobnej chusteczki, aby naprowadzić stronę i krawędzie szkiełka bez DNA.
Powoli umieść mikromacierz w plastikowym pudełku. Inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę, powoli wstrząsając. Następnie umyj szkiełko raz za pomocą 0,01%Tween-20 w PBS.
Na rotatorze laboratoryjnym z prędkością 125 obr./min przez pięć minut. Wyjmij Tween-20 i przepłucz szkiełko raz 0,01%Triton-X 100 w PBS na rotatorze laboratoryjnym z prędkością 125 obr./min przez dwie minuty. Następnie szybko przenieś szkiełko do słoika z kopeliną zawierającego PBS.
Najpierw zmontuj komorę PMB zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść zjeżdżalnię w wyznaczonym miejscu. Użyj pęsety, aby popchnąć go w dół i w lewo.
Umieść silikonową uszczelkę na górze, upewniając się, że jest dobrze wyrównana z dolną częścią komory PBM. Następnie zamknij komorę i dokręć po przekątnej. Odpipetować mieszaninę wiążącą białka do każdego dołka uszczelki.
Następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Aby rozpocząć, odpipetuj 0,05% Tween-20 w PBS do komory PBM, aby na krótko umyć szkiełko. Za pomocą aspiratora próżniowego usuń roztwór z dołków komory, uważając, aby nie dotknąć plamek DNA.
Powtórz to, krótko umyj szkiełko PBS. I użyj próżni, aby usunąć roztwór z dołków komory, uważając, aby nie dotknąć plamek DNA. Następnie dodaj sprzężone przeciwciało anty-He Alexa 488 do każdej studzienki komory PBM.
Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie krótko umyj szkiełko w komorze PBM, dodając kilka kropli 0,05% Tween-20 w PBS do każdej studzienki. I użyj aspiratora próżniowego, aby usunąć roztwór z dołków komory, uważając, aby nie dotknąć plamek DNA.
Zdemontuj komorę PBM i wyjmij zamek. Wypłucz szkiełka dwukrotnie w 0,05% Tween-20 w PBS, przy czym każde płukanie trwa trzy minuty. Następnie przepłucz szkiełka dwa razy w PBS, przy czym każde płukanie trwa trzy minuty.
I jeden raz w podwójnie destylowanej wodzie przez trzy minuty. Osuszyć szkiełka sprężonym powietrzem. I przechowuj je w ciemnym pudełku na slajdy, aż będą gotowe do skanowania.
Gdy będziesz gotowy, użyj skanera mikromatrycowego, aby zeskanować chip ze wzbudzeniem 495 nanometrów i emisją 19 nanometrów. I zbierz medianę intensywności fluorescencji. W tym badaniu profilowanie prymazy o przepustowości pi jest wykorzystywane do mapowania miejsc wiązania prymazy, w tym tych, które są trudne, jeśli nie niemożliwe do zaobserwowania przy użyciu klasycznych narzędzi.
Co ważne, profilowanie prymazy o przepustowości pi umożliwia ponowne przyjrzenie się tradycyjnemu rozumieniu miejsc wiązania prymów. Zwłaszcza profilowanie prymazy o przepustowości pi ujawnia specyficzność wiązania oprócz znanych sekwencji rozpoznawania 5'GTC3', co prowadzi do zmian w czynnościach funkcjonalnych prymazy DNA T7. Mianowicie, identyfikowane są dwie grupy sekwencji.
Silnie wiążące sekwencje DNA, które zawierały TG po bokach i słabe wiążące sekwencje DNA, które zawierały AG po bokach. Nie wykryto wiązania prymazy z matrycami DNA, w których brakowało 5'GTC3' w swoich sekwencjach. Miejsca rozpoznawania DNA prymasów, które zawierają specyficzne cechy, takie jak boki bogate w TG, zwiększają wiązanie DNA prymasów nawet 10-krotnie.
Co zaskakujące, zwiększają również długość nowo powstałego RNA. Co ważne, wysokoprzepustowe profilowanie prymazów pozwala nam obserwować i określać ilościowo zmienność długości starterów w stosunku do sekwencji matrycy DNA. Podczas wykonywania tej procedury etapy mycia powinny być subtelne.
A powinny zawierać składniki, które zarejestrowały prymazę na DNA. Biochemicznie określa się również próg daremnych zdarzeń wiązania. W związku z tym analiza mikromacierzy jest niewystarczająca.
Metody takie jak rezonans osocza powierzchniowego i testy przesunięcia żelu mogą określić powinowactwo wiązania prymazy w celu wybrania sekwencji DNA. Moje laboratorium wdraża modele predykcyjne uczenia maszynowego do wykrywania determinantów sekwencji prymaz, które dają produktywne startery, które można rozszerzyć za pomocą polimerazy DNA. W dobie big data, czyli implementacji metod statystycznych do analizy dużych zbiorów danych, technika ta z pewnością pomoże lepiej scharakteryzować konkretne sekwencje DNA i powiązać rozpoznawanie sekwencji z aktywnością prymazy.
Każdy, kto pracuje z promieniowaniem, powinien dokładnie zrozumieć przepisy i zagrożenia związane ze stosowaniem promieniowania jonizującego. Powinien przejść szkolenie i powinien pracować ze sprzętem ochronnym.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę wysokowydajnościową do analizy właściwości wiązania i katalitycznych DNA primazy za pomocą mikroarrayów wiązania białko-DNA. Technika łączy technologię mikroarray z analizami biochemicznymi, aby zapewnić wgląd w rozpoznawanie sekwencji przez primazę i tworzenie starterów RNA.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biochemia
- Biologia molekularna
- Genetyka
Tło
- DNA primaza syntetyzuje startery RNA na szablonie DNA.
- Rozumienie wzorców wiązania primazy jest kluczowe dla wyjaśnienia jej funkcji.
- Metody wysokowydajnościowe mogą ulepszać tradycyjne podejścia biochemiczne.
- Technologia mikroarray pozwala na masową kolekcję danych na temat interakcji białko-DNA.
Cel badania
- Aby na nowo zdefiniować miejsca rozpoznawania sekwencji przez primazę.
- Aby powiązać efektywność wiązania z aktywnością enzymatyczną.
- Aby wykorzystać wysokowydajnościowe profilowanie dla kompleksowej analizy.
Zastosowanie metod
- Eksperymenty związania białko-DNA na mikroarrayach.
- Analizy biochemiczne do pomiaru tworzenia starterów RNA.
- Wysokowydajnościowa metodologia profilowania primazy (HTPP).
- Analiza danych w celu skorelowania wzorców wiązania z aktywnością enzymatyczną.
Główne wyniki
- Identyfikacja specyficznych sekwencji DNA wiązanych przez primazę.
- Korelacja między efektywnością wiązania a syntezą starterów RNA.
- Masywna kolekcja danych poprawia rozumienie funkcji primazy.
- Wgląd w związek między selekcją sekwencji DNA a aktywnością enzymatyczną.
Wnioski
- Metody wysokowydajnościowe dostarczają cenny wgląd w zachowanie enzymów.
- Łączenie danych wiązania z aktywnością katalityczną jest niezbędne do zrozumienia primazy.
- To podejście można zastosować do innych enzymów w podobnych analizach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-throughput primase profiling (HTPP) enables scalable characterization of DNA sequence recognition by primase, linking binding specificity to functional output in RNA primer synthesis. This approach supports target validation in nucleic acid enzymology by providing quantitative, reproducible data on enzyme-DNA interactions that inform mechanistic de-risking in early discovery. The method enhances predictive confidence in lead identification by correlating binding strength with enzymatic processivity, aiding portfolio triage for replication-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by defining primase recognition sequences and flanking context effects on binding strength.
- Operational Value: Enables biological de-risking through quantitative correlation of binding efficiency with RNA primer length and enzyme processivity.
- Predictive Value: Supports predictive confidence by identifying sequence determinants that yield productive primers extendable by DNA polymerase.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by mapping primase binding sites across thousands of DNA sequences.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through microarray-based binding data and concurrent activity measurements.
- Scalability: Highlights screening readiness and platform reuse by combining PBM and primase activity assay in a scalable HTPP workflow.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance by linking primase sequence recognition to functional outcomes in Okazaki fragment formation.
- Preclinical Model Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by connecting DNA binding specificity to RNA primer synthesis activity.
- Risk-Adjusted Advancement: Addresses mechanistic de-risking by using binding and activity data to inform go/no-go decisions in replication-targeted programs.
Pipeline & Workflow Integration
HTPP integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical work by providing scalable, quantitative insights into primase-DNA interactions that inform enzymatic function.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking through massive data on primase binding to DNA sequences.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs by correlating microarray binding data with RNA primer formation measurements.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, and statistical outputs that help teams compare binding strength across sequence variants and link to enzymatic activity.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by demonstrating how sequence-specific binding influences functional primer synthesis in DNA replication.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, enabling cross-project application in nucleic acid enzymology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in primase-DNA recognition.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of binding and activity measurements across diverse DNA sequences.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in replication-targeted drug discovery.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative linking of binding efficiency to primer synthesis activity.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in protein-DNA interaction assays, microarray handling, and fluorescence detection.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including microarray scanner, PBM chamber, and vacuum aspiration system.
- Cross-team standardization requirements for buffer composition, washing stringency, and fluorescence threshold setting.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for primases from different organisms or engineered variants.
- Practical limitations supported by source material: washing steps must be subtle to preserve binding signals, and buffers must contain components that maintain primase-DNA interaction during assay.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:29
Primase DNA Binding Experiment: Blocking Procedure
2:44
Primase DNA Binding Experiment: Protein Binding
3:22
Primase DNA Binding Experiment: Fluorescent Antibody Attachment
5:15
Results: Analysis of High-Throughput Primase Profiling
6:42
Conclusion
