Name: Mysi model przerzutowych guzów wątroby w warunkach uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 s
Description: Poznaj mysi model przerzutowych guzów wątroby w warunkach uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego. Ta metoda pozwala badać wpływ stresu chirurgicznego na wzrost przerzutów u myszy C57BL/6.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Sarze Minemyer i Alexandrowi Comerci za korektę językową.

Wszystkie protokoły dla zwierząt są zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt i przestrzegają wytycznych National Institutes of Health (NIH). Narzędzia używane do wszelkich zabiegów chirurgicznych były dokładnie sterylizowane.
1. Wstępne przygotowanie
<ol>
	<li>Przed wstrzyknięciem komórek rakowych do śledziony myszy należy sterylizować w autoklawie i sterylizować wszystkie narzędzia, które mają być używane podczas zabiegu.</li>
	<li>Wysterylizuj i/lub autoklaw w autoklawie poduszkę grzewczą, rękawiczki chirurgiczne, gazę, nożyczki, małe zaciski, rozszerzacz naczyń, kleszcze chirurgiczne i uchwyt na igłę.</li>
	<li>Przygotować pooperacyjny lek przeciwbólowy (0,1 mg/kg buprenorfiny) do podania po splenektomii i co 12 godzin przez 2 dni.</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Upewnij się, że komórki rakowe są wolne od zanieczyszczenia mykoplazmą, używając zestawu ELISA mycoplasma.</li>
	<li>Przygotować 500 ml roztworu pożywki do hodowli Dulbecco Modified Eagle (DMEM) w temperaturze 4 °C do hodowli mysich komórek raka jelita grubego (MC38). Pożywki hodowlane należy uzupełnić 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 j./ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 15 mM HEPES i 200 mM L-glutaminy.</li>
	<li>Hodowla komórek nowotworowych w kolbie wolnej od DNA i RNAzy (75 cm2). Inkubować kulturę komórkową w inkubatorze z nawilżaną komórką/tkanką zawierającym 5% CO2 . Utrzymywać temperaturę na poziomie 37 °C.</li>
	<li>Gdy proliferujące komórki osiągną 90-100% zbieżności, odessaj stare podłoże, umyj komórki 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), a następnie potraktuj je 1x trypsyną (0,25%), aby odłączyć komórki od kolby.</li>
	<li>Zebrać komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut przy 700 x g.</li>
	<li>Zassać pożywkę i przemyć dwukrotnie 1x PBS przez wielokrotne wirowanie.</li>
	<li>Kontynuuj potwierdzanie żywotności komórek, barwiąc je barwieniem błękitem trypanowym (0,4%).</li>
	<li>Zawiesić komórki do stężenia 1 x 106 komórek/ 100 μL w 1x PBS. Dokładnie pipetuj komórki, aby uniknąć grudek. Utrzymuj komórki rakowe na lodzie przed wstrzyknięciem.</li>
</ol>
3. Wstrzykiwanie komórek nowotworowych
<ol>
	<li>Znieczulenie 8-12-tygodniowych samców myszy (C57BL6) poprzez podanie ketaminy (150 mg/kg) i ksylazyny (12 mg/kg) dootrzewnowo za pomocą igły o pojemności 1 ml 25 G (0,5 mm x 16 mm).</li>
	<li>Ogol skórę brzucha myszy za pomocą maszynki do strzyżenia, aby uniknąć infekcji pooperacyjnych.</li>
	<li>Umieść myszy na systemie chowania stabilizatora magnetycznego. Upewnij się, że myszy są całkowicie pod wpływem znieczulenia, szczypiąc palec u nogi lub ogon.</li>
	<li>Dodaj krople soli fizjologicznej do oczu, aby uniknąć wysuszenia podczas zabiegu.</li>
	<li>Wyszoruj roztwór jodu powidonu (7,5%) do ogolonej ściany brzucha, aby zdezynfekować skórę przed wykonaniem nacięcia chirurgicznego.</li>
	<li>Najpierw podnieś skórę za pomocą kleszczy zębatych i wykonaj nacięcie w linii środkowej za pomocą nożyczek chirurgicznych. Następnie unieś mięsień brzucha i otrzewną, aby utworzyć nacięcie w linii środkowej o długości około 3 cm (proces od środkowego brzucha do mieczykowatego w celu odsłonięcia zawartości brzucha. Należy uważać, aby nie przedłużać nacięcia poza wyrostek mieczykowaty, aby uniknąć rozległego krwawienia.</li>
	<li>Umieść hemostat po obu stronach nacięcia i pod wyrostkiem mieczykowatym. Wyprostuj brzuch, ciągnąc ogon w dół i przyklejając go taśmą. Użyj 6-calowego aplikatora ze sterylną bawełnianą końcówką, aby oddzielić i odsłonić śledzionę od tkanki tłuszczowej trzustki.</li>
	<li>Przed wstrzyknięciem do śledziony należy przetrząsnąć komórki rakowe, aby uniknąć zbryleń komórek.</li>
	<li>Do wstrzykiwań należy użyć strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 ml 28 g (0,36 mm x 13 mm). Unikaj pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Powoli i ostrożnie wstrzyknij 100 μl komórek w końcówkę śledziony. Umieść bawełnianą końcówkę i delikatnie dociśnij, aby uniknąć cofania się do okolicy brzucha. Udane wstrzyknięcie można zaobserwować, identyfikując zmianę koloru wątroby podczas wstrzyknięcia.</li>
	<li>Zwilż sterylną gazę 1x PBS i umieść ją na wypreparowanym obszarze.</li>
	<li>Przenieś myszy na poduszkę grzewczą na 15 minut, aby umożliwić komórkom rakowym krążenie w systemie.</li>
	<li>Aby przejść do chirurgicznego niedokrwienia i uszkodzenia reperfuzyjnego, wykonaj kroki 5.3-5.10. 
	UWAGA: Ta procedura ma na celu zbadanie wpływu indukowanego przez I/R tworzenia ognisk przerzutowych.</li>
</ol>
4. Splenektomia
<ol>
	<li>Aby wykonać splenektomię, użyj ręcznego urządzenia do kauteryzacji. Ostrożnie podnieś śledzionę gładkimi kleszczami i kauteryzuj naczynia krwionośne śledziony, aby uniknąć nadmiernego krwawienia. Usuń śledzionę, przecinając naczynia w kauteryzowanym odcinku.</li>
	<li>Bezpośrednio po zabiegu należy zamknąć nacięcie w dwuwarstwowym wzorze, zszywając najpierw warstwę mięśniową, a następnie skórę. Używaj szwów polipropylenowych 4-0 zarówno na ścianę brzucha, jak i na skórę.</li>
	<li>Przed powtórzeniem procedury na innym zwierzęciu należy zdezynfekować wszystkie narzędzia, spryskując je 70% izopropanolem lub wkładając do kąpieli perełkowej.</li>
	<li>Umieść myszy z powrotem w oryginalnych klatkach i szukaj oznak niepokoju i bólu pooperacyjnego.</li>
	<li>Pooperacyjne leki przeciwbólowe (buprenorfina 0,1 mg/kg) należy wstrzykiwać co 12 godzin przez 2 dni, aby uniknąć bólu pooperacyjnego.</li>
</ol>
5. Uraz reperfuzyjny niedokrwienny
<ol>
	<li>Po 5 dniach od pierwszej laparotomii znieczulić myszy, podając ketaminę (150 mg / kg) i ksylazynę (12 mg / kg) dootrzewnowo za pomocą igły 1 ml 25 G (0,5 mm x 16 mm). Wykonaj kroki 3.3–3.4.</li>
	<li>Wyszoruj roztwór jodu powidonu (7,5%) na ogolonym brzuchu myszy, aby zdezynfekować skórę i wykonać laparotomię w linii środkowej, jak opisano powyżej w kroku 3.6.</li>
	<li>Za pomocą dwóch zwilżonych bawełnianych końcówek delikatnie wysuń jelito z jamy ustnej, aby odsłonić powiązane struktury, w tym żyłę wrotną. Wypreparuj wnękę wątroby z otaczającej tkanki.</li>
	<li>Podnieś środkowy i lewy płat boczny do przepony. Oddziel płat kwadratowy od lewego płata bocznego, wycinając wnękę wątroby nożyczkami sprężynowymi za pomocą mikroskopu operacyjnego, aby zapewnić wyraźną widoczność w kierunku struktury triady wrotnej.</li>
	<li>Umieść mały wilgotny bawełniany wacik między płatem środkowym a prawym płatem bocznym, aby stworzyć wystarczającą przestrzeń do zaciskania. Za pomocą kleszczyków rozszerzających naczynia ostrożnie przełóż 10 cm nić (szew polipropylenowy 4,0), aby podnieść triadę portalową. Zatkaj wszystkie struktury w triadzie wrotnej (tętnica wątrobowa, żyła wrotna i przewód żółciowy) po lewej i środkowych płatach wątroby, umieszczając zacisk mikronaczyniowy za pomocą aplikatora zaciskowego Micro-Serrefine z blokadą.</li>
	<li>Jeśli płaty nie wykazują znacznego zblednięcia, ponownie wyreguluj zacisk, zdejmując go i ponownie nakładając. 
	UWAGA: Jeśli natychmiastowe blanszowanie wątroby nie występuje nawet po ponownym wyregulowaniu zacisku, dokładnie rozważ, czy kontynuować I/R.</li>
	<li>Usuń mały bawełniany wacik umieszczony między środkowym a prawym płatem bocznym. Delikatnie włóż jelito do jamy brzusznej. Przykryj ścianę brzucha wilgotną gazą (nasączoną 1x PBS) i przykryj folią, aby zminimalizować utratę parowania.</li>
	<li>Umieść mysz na poduszce grzewczej i przyłóż zacisk na okres 60 minut.</li>
	<li>Przez cały okres niedokrwienny szukaj dowodów na uszkodzenie niedokrwienne, wizualizując blade blednięcie prawego przyśrodkowego oraz lewego przyśrodkowego i bocznego płata.</li>
	<li>Rozpocznij reperfuzję, zdejmując zaciski po upływie 60 minut. 
	UWAGA: Dowody reperfuzji można zaobserwować poprzez natychmiastową zmianę koloru środkowego i lewego płata bocznego.</li>
	<li>Bezpośrednio po reperfuzji zamknij nacięcie dwuwarstwowym wzorem szwów, najpierw zszywając warstwę mięśniową, a następnie skórę. Użyj nici polipropylenowej 4-0 za pomocą uchwytu na igłę, aby zamknąć ścianę brzucha i skórę.</li>
	<li>Przed powtórzeniem procedury na innym zwierzęciu należy zdezynfekować wszystkie narzędzia, spryskując je 70% izopropanolem lub wkładając do podgrzanej kąpieli perełkowej.</li>
	<li>Umieść myszy z powrotem w oryginalnych klatkach i szukaj oznak niepokoju i bólu pooperacyjnego.</li>
	<li>Pooperacyjne leki przeciwbólowe (0,1 mg/kg buprenorfiny) należy wstrzykiwać co 12 godzin przez 2 dni, aby uniknąć bólu pooperacyjnego.</li>
	<li>W przypadku myszy pozorowanych z wątrobą I/R należy wykonać laparotomię, rozwarstwienie wnęki i szwy brzuszne. 
	nuta: Rola stresu chirurgicznego wpływającego na powstawanie przerzutów do wątroby może być badana za pomocą dwóch różnych projektów eksperymentalnych. Powyższy protokół (Model-1) służy do ustalenia choroby wątroby z mikroprzerzutami i zbadania wpływu I/R wątroby na jej wzrost (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Alternatywnie, I/R wątroby i wstrzyknięcie guza mogą być wykonywane jednocześnie (Model-2) w celu zbadania wpływu uszkodzenia I/R na tworzenie nowych ognisk przerzutowych (<silna klasa = "xfig">Figura 1B). Aby to zrobić, wstrzyknij komórki rakowe do śledziony, jak opisano powyżej, i pozwól im krążyć przez 15 minut. Wykonać I/R wątroby lub pozorowaną operację wątroby po okresie krążenia przez 60 minut. Wykonaj boczną splenektomię 60 minut później, a następnie zamknij nacięcie laparotomii.</li>
</ol>
6. Ocena operowanych myszy
<ol>
	<li>Podczas zabiegu chirurgicznego należy upewnić się, że myszy są pod wpływem znieczulenia III stopnia, wykonując test odruchu powiekowego i rogówkowego. Dodatkowa dawka środka znieczulającego musi być podana w przypadku objawów odruchów.</li>
	<li>Pooperacyjne leki przeciwbólowe (buprenorfina 0,1 mg/kg) należy podawać bezpośrednio po zabiegu i co 12 godzin przez 2 dni, aby uniknąć bólu pooperacyjnego.</li>
	<li>Pozwól myszom na 30–60 minut rekonwalescencji po znieczuleniu. Stale monitoruj myszy i nie zostawiaj ich bez opieki aż do całkowitego wyzdrowienia.</li>
	<li>Szukaj oznak niepokoju, takich jak zgarbione plecy, zamknięte oczy, powolne ruchy i brak pielęgnacji. Traktuj odpowiednio, dopóki myszy nie powrócą do normalnej aktywności.</li>
	<li>Po operacji należy zapewnić opiekę uzupełniającą, w tym płyny, ciepło, środek odwracający działanie johimbiny na ksylazynę, miękką pościel ręcznikiem papierowym (w celu uniknięcia zachłyśnięcia), aby poprawić okres rekonwalescencji.</li>
</ol>
7. Ocena uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwienia wątroby
<ol>
	<li>Natychmiast po założeniu zacisku upewnij się, że występuje blade blednienie środkowego i lewego płata bocznego w porównaniu z płatami ogoniastymi i czworokątnymi.</li>
	<li>Oceń uszkodzenie niedokrwienne wątroby, mierząc poziom aminotransferazy alaninowej (sALT), aminotransferazy asparaginianowej w surowicy (sAST) i dehydrogenazy mleczanowej (sLDH) w surowicy. Krew można pobrać z żyły twarzowej w celu ekstrakcji surowicy po 3–6 godzinach od rozpoczęcia reperfuzji. Wykonaj histologię wątroby, aby przeanalizować procentowy obszar guza w płacie niedokrwiennym.</li>
</ol>

<ol><li>Riihimäki, M., Hemminki, A., Sundquist, J., Hemminki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+metastasis+in+colon+and+rectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Patterns of metastasis in colon and rectal cancer.</a> Scientific Reports. 6 (1), 29765(2016).</li>
<li>Oki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+treatment+for+colorectal+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+gastroenterological+surgery%22%5BJournal%5D)">Recent advances in treatment for colorectal liver metastasis.</a> Annals of gastroenterological surgery. 2 (3), 167-175 (2018).</li>
<li>Wolpin, B. M., Mayer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+treatment+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Systemic treatment of colorectal cancer.</a> Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).</li>
<li>van Golen, R. F., Reiniers, M. J., Olthof, P. B., van Gulik, T. M., Heger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+inflammation+in+hepatic+ischemia%2Freperfusion+injury%3A+present+concepts+and+potential+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Sterile inflammation in hepatic ischemia/reperfusion injury: present concepts and potential therapeutics.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28 (3), 394-400 (2013).</li>
<li>Demicheli, R., Retsky, M. W., Hrushesky, W. J. M., Baum, M., Gukas, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+surgery+on+tumor+growth%3A+a+century+of+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">The effects of surgery on tumor growth: a century of investigations.</a> Annals of Oncology. 19 (11), 1821-1828 (2008).</li>
<li>Tohme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Promote+the+Development+and+Progression+of+Liver+Metastases+after+Surgical+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress.</a> Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).</li>
<li>Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> Journal of Visualized Experiments. (10), 484(2007).</li>
<li>Elkin, M., Vlodavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tail+vein+assay+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tail vein assay of cancer metastasis.</a> Current Protocols in Cell Biology. 19 (19.2), (2001).</li>
<li>Thalheimer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intraportal+injection+model%3A+A+practical+animal+model+for+hepatic+metastases+and+tumor+cell+dissemination+in+human+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The intraportal injection model: A practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer.</a> BMC Cancer. 9 (1), 29(2009).</li>
<li>Frampas, E., Maurel, C., Thedrez, P., Le Saëc, P. R. emaud-, Faivre-Chauvet, A., Barbet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intraportal+injection+model+for+liver+metastasis%3A+Advantages+of+associated+bioluminescence+to+assess+tumor+growth+and+influences+on+tumor+uptake+of+radiolabeled+anti-carcinoembryonic+antigen+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Medicine+Communications%22%5BJournal%5D)">The intraportal injection model for liver metastasis: Advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody.</a> Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).</li>
<li>Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Portal+Vein+Injection+Model+to+Study+Liver+Metastasis+of+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li>
<li>Limani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+portal+vein+injection+for+the+design+of+syngeneic+models+of+liver+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), G682-G688 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawniają żadnych konfliktów interesów, które miałyby związek z niniejszą pracą.

Model zwierzęcy opisany w tym manuskrypcie opiera się na dwóch głównych podejściach. Pierwszym z nich jest rozpoznanie zdolności komórek rakowych do lokalizacji i namnażania się w płatach wątroby. Drugim jest zbadanie wpływu uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwienia wątroby na wzrost guza i przerzuty. Model ten pozwala na odpowiednie badanie przerzutów do wątroby przy braku wtórnych przerzutów u myszy immunokompetentnej. Model jest przydatny w rozwiązywaniu problemów związanych ze skutecznością przerzutów, takich jak prze...

Wątroba jest jednym z najczęstszych miejsc rozwoju choroby przerzutowej1. Śmiertelność prawie zawsze można przypisać powikłaniom związanym ze wzrostem guza w wątrobie. U pacjentów z przerzutowymi guzami litymi w wątrobie zabieg chirurgiczny pozostaje kluczową interwencją w celu kontroli choroby i możliwego podejścia leczniczego. Jednak u zdecydowanej większości pacjentów ostatecznie występuje nawrót choroby, głównie w klasie wątroby<sup="xref">2,3. Podczas operacji wątroby często dochodzi do krwawienia śródoperacyjnego, co często wymaga transfuzji krwi i różnych podejść technicznych do tamowania krwawienia, w tym metod zaciskania naczyń krwionośnych. Jednak takie środki powodują niedokrwienie/reperfuzję wątroby (I / R) do tkanki wątroby. Niekorzystny wpływ I/R na czynność komórek wątrobowych został dobrze udokumentowany. Uszkodzenie I/R wątroby powoduje zapłon kaskad zapalnych podczas przywracania przepływu krwi przez szlaki zapalne4. Nie tylko uszkodzenie I/R wątroby przyczynia się do niewydolności wątroby, ale obecne dowody pokazują również, że uszkodzenie I/R stymuluje adhezję komórek nowotworowych i sprzyja występowaniu przerzutów i wzrostowi istniejącej choroby mikroprzerzutowej5. Wcześniej informowaliśmy, że stres chirurgiczny indukuje aktywację komórek odpornościowych, co nie tylko pomaga we wzroście guza pierwotnego, ale także ułatwia przerzuty poprzez wychwytywanie komórek rakowych w krążeniu6.
Tutaj szczegółowo opisujemy technikę tworzenia modelu guza myszy z przerzutami do wątroby. W tym modelu przedstawiono również metodę wywoływania uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego wątroby, która działa jako substytut stresu chirurgicznego występującego klinicznie podczas hepatektomii. Połączone metody iniekcji raka i I/R wątroby mogą z powodzeniem interpretować rozwój CRLM u pacjentów, którzy przeszli pierwotną resekcję guza.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Lonza</td><td>900-108</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin</td><td>Fisher scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Stretomysin</td><td>Fisher scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>SH3023701</tr><tr><td>Hyclon</td><td>trypsyny</td><td>sh30042.02</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych 75 cm</td><td>5 komórek Gwiazda</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>15 ml PP Rurki stożkowe</td><td>BioExcell</td><td>41021037</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Giibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Fisherbrand</td><td>1376152</td><td></td></tr><tr><td>Cautry</td><td>Bovie</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk mikronaczyniowy</td><td>Narzędzia Finescience</td><td>18055-03</td><td></td></tr><tr><td>Aplikator zaciskowy Micro-Serrefine z zamkiem</td><td>Fine science toosl</td><td>FST-18056-14</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Fine science toosl</td><td>FST-15021-15</td><td></td></tr><tr><td>Rozszerzacz naczyń</td><td>Fine science toosl</td><td>FST-00276-13</td><td></td></tr><tr><td>Stabilizator magnetyczny System wciągania</td><td>Fine science toosl</td><td>FST-18200020</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Micro-Adson</td><td>Fine science toosl</td><td>FST-11019-12</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Micro-Adson</td><td>Fine science toosl</td><td>FST-11018-12</td><td></td></tr><tr><td>4-0 szew polipropylenowy</td><td>Ethicon</td><td>K881H</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na igłę</td><td>Aparat Harvard</td><td>72-8826</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td></td>1443915</tr><tr><td>Clipper</td><td>Oster</td><td>559A</td><td></td></tr><tr><td>roztwór powidonu i jodu</td><td>Medline</td><td>MDS093945</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1ml 25G</td><td>BD bezpieczeństwo Glide</td><td>305903</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa 0,5 ml</td><td>BD Strzykawki insulinowe</td><td>32946</td><td></td></tr><tr><td>Aplikator z końcówką bawełnianą</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgiczny Mikroskop</td><td>Leica</td><td>LR92240</td><td></td></tr><tr><td>Mycoplasma Elisa Kit</td><td>Roche</td><td>11663925910</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Putney</td><td>#056344</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>NADA</td><td>#139-236</td><td></td></tr><tr><td>Pasek ALT</td><td>Heska</td><td>15809554</td><td></td></tr><tr><td>Pasek AST</td><td>Heska</td><td>15809542</td><td></td></tr><tr><td>LDH</td><td>Heska</td><td>15809607</td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model przerzutowych guzów wątroby w warunkach uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Niedokrwienie wątroby i uszkodzenie reperfuzyjne (I/R), powszechne wyzwanie kliniczne, pozostaje nieuniknionym procesem patofizjologicznym, który, jak wykazano, powoduje wiele uszkodzeń tkanek i narządów. Pomimo ostatnich postępów i podejść terapeutycznych, ogólna zachorowalność pozostaje niezadowalająca, zwłaszcza u pacjentów z podstawowymi nieprawidłowościami miąższu. W kontekście agresywnego wzrostu nowotworu i przerzutów podejrzewa się, że chirurgiczny I/R jest promotorem regulującym nawroty guza. Niniejszy artykuł ma na celu opisanie klinicznie istotnego mysiego modelu I/R wątroby i przerzutów do wątroby jelita grubego. W ten sposób staramy się pomóc innym badaczom w ustaleniu i udoskonaleniu tego modelu dla ich rutynowej praktyki badawczej, aby lepiej zrozumieć wpływ I/R wątroby na promowanie przerzutów do wątroby.

Wszystkie myszy typu dzikiego (C57BL6) (n = 20) poddano modelowi przerzutów do wątroby zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Wszystkie myszy, którym wykonano wstrzyknięcia, z urazem niedokrwienno-reperfuzyjnym lub bez niego, przeżyły do dnia utylizacji. Schemat na Ryc. 1A przedstawiający wątrobę po wstrzyknięciu komórek nowotworowych ilustruje zaklemowanie triady wrotnej (tętnicy wątrobowej, żyły wrotnej i przewodu żółciowego), co indukuje częściowe niedokrwienie wątroby (70%) w obrębie pła...

Szczegółowo opisujemy klinicznie istotny model raka jelita grubego z przerzutami do wątroby (CRLM) oraz wpływ reperfuzji niedokrwienia wątroby (I/R) na wzrost guza i przerzuty. Model ten może pomóc w lepszym zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw indukowanego przez operację wzrostu przerzutów do wątroby.

Mysi model przerzutowych guzów wątroby w warunkach uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Dowody eksperymentalne i kliniczne pokazują, że reperfuzja niedokrwienna wątroby może zwiększać tworzenie ognisk przerzutowych przez krążące komórki rakowe i wzrost choroby mikroprzerzutowej. Ten powtarzalny model mysi pozwala na odpowiednie badanie zarówno tworzenia przerzutów, jak i wzrostu istniejącego wcześniej guza w wątrobie. Operacja wątroby, krwawienie i wstrząs septyczny są związane z reperfuzją niedokrwienia wątroby i mogą wpływać na rozwój choroby przerzutowej.Techniki te pozwalają na badanie tego zjawiska w celu lepszego diagnozowania i zapobiegania szkodliwemu wpływowi reperfuzji niedokrwiennej na wzrost guza w warunkach klinicznych. Po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonego ośmio- do 12-tygodniowego samca myszy C57 black 6, zdezynfekuj odsłoniętą skórę ściany brzucha peelingiem powidonowo-jodowym i użyj kleszczy zębatych do podniesienia skóry. Za pomocą skalpela chirurgicznego wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry i unieś mięsień brzucha i otrzewną, aby ułatwić utworzenie trzycentymetrowego nacięcia w linii środkowej w celu odsłonięcia zawartości brzucha.Po umieszczeniu hemostatu po obu stronach nacięcia i pod wyrostkiem mieczykowatym, pociągnij i przyklej ogon w dół, aby przedłużyć brzuch i użyj sześciocalowego sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką, aby oddzielić i odsłonić śledzionę od tkanki tłuszczowej trzustki. Następnie należy odwirować zawiesinę komórek rakowych, aby zdysocjować wszelkie grudki komórek i załadować komórki do 0,5-mililitrowej strzykawki insulinowej wyposażonej w igłę o rozmiarze 28. Powoli i ostrożnie wstrzyknij 100 mikrolitrów komórek do końcówki śledziony, umieszczając bawełnianą końcówkę przylegającą do boku nakłucia igły, aby wchłonąć ewentualny wyciek guza do jamy otrzewnej, jednocześnie delikatnie wywierając nacisk, aby ustabilizować śledzionę podczas wstrzykiwania.Udane wstrzyknięcie będzie widoczne przez zmianę koloru wątroby. Kiedy wszystkie komórki zostaną dostarczone, umieść kawałek sterylnej gazy nasączonej PBS na wypreparowanym obszarze i umieść mysz na poduszce grzewczej na 15 minut, aby umożliwić komórkom rakowym krążenie w systemie. Aby wywołać uraz niedokrwienny i reperfuzyjny, użyj dwóch zwilżonych bawełnianych końcówek, aby delikatnie przesunąć jelito z jamy, aby odsłonić żyłę wrotną i umieść mysz pod mikroskopem preparacyjnym.Podnieś środkowy i lewy boczny płat wątroby do przepony. Umieść mały wilgotny bawełniany wacik między płatem środkowym a prawym płatem bocznym, aby stworzyć wystarczającą przestrzeń do zaciskania i ostrożnie przełóż kleszcze rozszerzające naczynia za triadą wrotną i za pomocą kleszczyków rozszerzających naczynia użyj 10-centymetrowego kawałka nici polipropylenowego 4-0, aby przejść za i podnieść triadę wrotną. Użyj aplikatora zaciskowego z mikro-serrifine z zamkiem, aby umieścić zacisk mikronaczyniowy na lewym i środkowym płatie wątroby, aby zamknąć wszystkie struktury w triadzie wrotnej.Po zaobserwowaniu blanszowania usuń szew polipropylenowy 4-0 i mały wacik i ostrożnie włóż jelito z powrotem do jamy brzusznej. Przykryj ścianę brzucha nowym kawałkiem gazy nasączonej PBS i przykryj gazę folią, aby zminimalizować utratę parowania. Następnie umieść mysz z powrotem na poduszce grzewczej na 60 minut.Przez cały okres niedokrwienny wizualizuj blade blednięcie prawego przyśrodkowego, lewego przyśrodkowego i bocznego płata, aby potwierdzić dowody na uszkodzenie niedokrwienne. Pod koniec okresu urazu zdejmij zacisk. Aby wykonać splenektomię, ostrożnie podnieś śledzionę za pomocą gładkich kleszczy i użyj ręcznego urządzenia do kauteryzacji naczyń krwionośnych śledziony, aby uniknąć nadmiernego krwawienia.Przeciąć naczynia w sekcji kauteryzowanej, aby usunąć śledzionę i natychmiast użyć szwów polipropylenowych 4-0, aby zamknąć nacięcia mięśni i skóry w dwuwarstwowym wzorze szwu. Następnie umieść mysz z powrotem w klatce domowej z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia. Stres chirurgiczny znacznie zwiększa ilość wcześniej powstałych mikroprzerzutów w wątrobie.Różnicę tę obserwuje się nawet dwa tygodnie po reperfuzji niedokrwiennej w porównaniu z myszami bez niedokrwienia. Na reperfuzję niedokrwienia wątroby i wstrzyknięcie komórek nowotworowych może mieć wpływ temperatura pokojowa i żywotność komórek, dlatego należy zadbać o kontrolę tych zmiennych. Technika ta ułatwia badanie wpływu stresu chirurgicznego i uszkodzenia wątroby na wzrost choroby przerzutowej.Pomoże to naukowcom lepiej zrozumieć zjawisko wzrostu guza wywołanego operacją.

murine-model-metastatic-liver-tumors-setting-ischemia-reperfusion

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy artykuł opisuje procedurę indukcji ortotopowych bioluminescencyjnych guzów wątroby u myszy oraz późniejszą analizę wzrostu guza ograniczonego do wątroby przy użyciu obrazowania luminescencyjnego całego ciała żywych zwierząt.

Mysi model bioluminescencyjnych guzów wątroby

Uraz chirurgiczny wywołuje odpowiedź zapalną. Wiadomo, że cytokiny i ligandy endogenne modulują wielkość zawału mięśnia sercowego po niedokrwieniu i reperfuzji. Przedstawiamy zmodyfikowany model niedokrwienia i reperfuzji u myszy z zamkniętą klatką piersiową, wykorzystujący obciążniki wiszące w celu zminimalizowania efektów torakotomii.

Mysi model zamkniętoklatkowy niedokrwienia i reperfuzji mięśnia sercowego

Opisujemy modele umiarkowanego i ciężkiego uszkodzenia nerek wywołanego niedokrwieniem i reperfuzją, w których myszy przechodzą jednostronne zaciskanie szypułki nerki, po którym następuje równoczesna lub opóźniona nefrektomia przeciwległa. Modele te konsekwentnie powodują dysfunkcję nerek i zwłóknienie pourazowe, ale ciężkość urazu i przeżycie zależą od pochodzenia myszy, wieku i sprzętu chirurgicznego.

Model niedokrwienno-reperfuzyjny ostrego uszkodzenia nerek i zwłóknienia pourazowego u myszy

Wprowadzamy metodę chirurgiczną do wywoływania eksperymentalnego uszkodzenia niedokrwienia/reperfuzji (I/R) symulującego zawał mięśnia sercowego (MI) w modelach mysich, co pozwala na większą przejrzystość w umiejscowieniu podwiązania na lewej tętnicy zstępującej przedniej (LAD) w celu zwiększenia powtarzalności eksperymentów MI u myszy.

Mysi model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego poprzez podwiązanie lewej tętnicy zstępującej przedniej

Przedkliniczny, mysi model przerzutów do wątroby wykonany techniką iniekcji hemispleen.

Przedkliniczny mysi model przerzutów do wątroby

Mysi model uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego nerek opisany tutaj składa się z prawej nefrektomii, która zapewnia tkankę kontrolną i zaciskania lewej szypułki nerki w celu wywołania niedokrwienia, które powoduje ostre uszkodzenie nerek. Model ten wykorzystuje laparotomię w linii środkowej, w której wszystkie kroki są wykonywane przez jedno nacięcie.

Uszkodzenie reperfuzyjne niedokrwienia nerek: mysi model urazu i regeneracji

Tutaj opisujemy szczegółową procedurę niedokrwienia jelit u myszy, która prowadzi do powtarzalnego uszkodzenia bez śmiertelności, aby zachęcić do standaryzacji tej techniki w całej dziedzinie. Ten model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego jelit może być wykorzystany do badania komórkowych i molekularnych mechanizmów uszkodzenia i regeneracji.

Mysi model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego jelit

Procedura chirurgiczna została opracowana w celu dostarczenia komórek guza sutka do mysiej wątroby poprzez wstrzyknięcie do żyły wrotnej. Model ten umożliwia badanie późnych stadiów przerzutów do wątroby u w pełni kompetentnego immunologicznie gospodarza, w tym wynaczynienia komórek nowotworowych, siewu, przeżycia i przerzutowego wzrostu w wątrobie.

Model iniekcji żyły wrotnej do badania przerzutów raka piersi do wątroby

Mysi model niedokrwienia i reperfuzji mózgu został stworzony w celu zbadania patofizjologii udaru. Podwiązujemy dystalnie prawą środkową tętnicę mózgową i prawą tętnicę szyjną wspólną i przywracamy przepływ krwi po 10 lub 40 minutach niedokrwienia.

Mysi model zamknięcia dwóch naczyń niedokrwienia mózgu-reperfuzji

Protokół przedstawia wykonalną, niezawodną i powtarzalną metodę zaciskania wnęki lewej płucy, która może być wykorzystana do badania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego płuc w modelach mysich.

Mysi lewy klamra płucny Hilar Clamp Urazu Reperfuzyjnego Niedokrwienia Płuc

Poznaj mysi model przerzutowych guzów wątroby w warunkach uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego. Ta metoda pozwala badać wpływ stresu chirurgicznego na wzrost przerzutów u myszy C57BL/6.

Mysi model przerzutowych guzów wątroby w warunkach uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego

Przeglądaj więcej filmów