Name: Amputacja i regeneracja palców dorosłych myszy : prosty model do badania powstawania blastemy i kostnienia śródbłoniastego u ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Poznaj metodę amputacji P3 u dorosłych myszy CD-1 do badania powstawania blastemy i kostnienia śródbłoniastego. Protokół wykorzystuje fluorescencyjną immunohistochemię i mikro-CT do analizy regeneracji ssaków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom Laboratorium Muneoka i Texas Institute for Genomic Medicine (TIGM). Prace te były wspierane przez Texas A&M University.

<ol><li>Douglas, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservative+management+of+guillotine+amputation+of+the+finger+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Paediatric+Journal%22%5BJournal%5D)">Conservative management of guillotine amputation of the finger in children.</a> Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).</li>
<li>Illingworth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapped+fingers+and+amputated+finger+tips+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Trapped fingers and amputated finger tips in children.</a> Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).</li>
<li>Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+regrow+the+tips+of+their+foretoes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mice regrow the tips of their foretoes.</a> Science. 217, 747-750 (1982).</li>
<li>Neufeld, D. A., Zhao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phalangeal+regrowth+in+rodents%3A+postamputational+bone+regrowth+depends+upon+the+level+of+amputation%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Clinical+and+Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).</li>
<li>Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+regeneration+of+the+neonatal+digit+tip+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice.</a> Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).</li>
<li>Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+activation+in+nail+epithelium+couples+nail+growth+to+digit+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration.</a> Nature. 499, 228-232 (2013).</li>
<li>Chamberlain, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Level-specific+amputations+and+resulting+regenerative+outcomes+in+the+mouse+distal+phalanx%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+repair+and+Regeneration%3A+Official+Publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx.</a> Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).</li>
<li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analogous+cellular+contribution+and+healing+mechanisms+following+digit+amputation+and+phalangeal+fracture+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice.</a> Regeneration. 3, 39-51 (2016).</li>
<li>Seifert, A. W., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blastema+and+epimorphic+regeneration+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The blastema and epimorphic regeneration in mammals.</a> Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).</li>
<li>Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarlson%2C+BM+%22Principles+of+Regenerative+Biology%22">Principles of Regenerative Biology</a>. , Elsevier. Burlington, MA. (2007).</li>
<li>Fernando, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+and+blastema+formation+in+regenerating+digit+tips+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice.</a> Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).</li>
<li>Simkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+closure+regulates+histolysis+during+mammalian+%28Mus%29+digit+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration.</a> Regeneration. 2, 106-119 (2015).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+is+inhibitory+for+mammalian+digit+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration.</a> Regeneration. 1, 33-46 (2014).</li>
<li>Dolan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+regrowth+is+impaired+during+digit+tip+regeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice.</a> Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).</li>
<li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastema+formation+and+periosteal+ossification+in+the+regenerating+adult+mouse+digit%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%3A+Official+Publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).</li>
<li>Sammarco, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+bone+regeneration+is+dependent+upon+a+dynamic+oxygen+event%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%3A+The+Official+Journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event.</a> Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).</li>
<li>Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+of+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Trauma%22%5BJournal%5D)">The science of fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).</li>
<li>Shapiro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+development+and+its+relation+to+fracture+repair.+The+role+of+mesenchymal+osteoblasts+and+surface+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts.</a> European Cells & Materials. 15, 53-76 (2008).</li>
<li>Ilizarov, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tension-stress+effect+on+the+genesis+and+growth+of+tissues.+Part+I.+The+influence+of+stability+of+fixation+and+soft-tissue+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+And+Related+Research%22%5BJournal%5D)">The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation.</a> Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).</li>
<li>Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+intramembranous+ossification+during+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%3A+Official+Publication+of+the+Orthopaedic+Research+Society%22%5BJournal%5D)">A model for intramembranous ossification during fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).</li>
<li>Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digit+Tip+Regeneration%3A+Merging+Regeneration+Biology+with+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDF-1alpha%2FCXCR4+signaling+mediates+digit+tip+regeneration+promoted+by+BMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2.</a> Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).</li>
<li>Doube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BoneJ%3A+Free+and+extensible+bone+image+analysis+in+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ.</a> Bone. 47, 1076-1079 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje ustandaryzowaną procedurę amputacji dystalnej części P3 u dorosłych myszy myszy, fluorescencyjne barwienie immunohistochemiczne w celu wizualizacji i zbadania powstawania blastema i kostnienia wewnątrzbłoniastego oraz sekwencyjne skanowanie μCT in vivo w celu identyfikacji zmian morfologicznych, objętościowych i długości kości po amputacji. Amputacja P3 jest unikalnym, proceduralnie prostym i powtarzalnym modelem do analizy proregeneracyjnego środowiska rany, które wyzwala powstawanie blastemy. Co wi...

Ssaki, w tym ludzie i myszy, mają zdolność do regeneracji końcówek swoich palców po dystalnej amputacji paliczka końcowego (P3)1,2,3. U myszy reakcja regeneracyjna jest zależna od poziomu amputacji; Coraz częściej proksymalne amputacje palców wykazują stopniowo osłabioną odpowiedź regeneracyjną, aż do całkowitego niepowodzenia regeneracyjnego przy amputacjach przechodzących i proksymalnych do macierzy paznokcia P34,5,6,7,8. W regeneracji P3 pośredniczy tworzenie blastemy, definiowanej jako populacja proliferujących komórek, które ulegają morfogenezie w celu regeneracji amputowanych struktur9. Tworzenie blastemy w celu regeneracji struktur utraconych w wyniku amputacji, proces określany jako regeneracja epimorficzna, odróżnia wielotkankową odpowiedź regeneracyjną P3 od tradycyjnej naprawy tkanek po urazie6,10. Regeneracja P3 to powtarzalny i proceduralnie prosty model do badania złożonych procesów regeneracyjnych, w tym gojenia się ran11,12, histoliza kości11,12, rewaskularyzacja13, regeneracja nerwów obwodowych14, oraz blastemalna konwersja do kości poprzez śródbłoniaste kostnienie15.
Poprzednie badania z użyciem immunohistochemii wykazały, że blastema jest niejednorodna, awaskularna, niedotleniona i wysoce proliferacyjna11,13,15,16. Po dystalnej amputacji P3 wczesna blastema jest początkowo związana z okostną P3 i śródkrwistym i charakteryzuje się silną proliferacją i rodzącą się osteogenezą w sąsiedztwie powierzchni kości15. Po degradacji kości i zamknięciu rany, niejednorodna blastema powstaje w wyniku połączenia komórek związanych z okostną i endokostną, a następnie różnicowania składników blastemalnych, w tym kości, poprzez śródbłoniaste kostnienie15.
Naprawa kości w odpowiedzi na uraz zazwyczaj następuje przez kostnienie śródchrzęstne, tj. przez początkowy chrzęstny kalus, który tworzy szablon do późniejszego tworzenia kości17,18. Śródbłoniaste kostnienie kości długiej, tj. tworzenie kości bez chrzęstnego elementu pośredniego, jest zwykle wywoływane za pomocą złożonych urządzeń rozpraszających lub chirurgicznej fiksacji19,20. Reakcja na regenerację palców jest modelem przedklinicznym, który oferuje zalety w porównaniu z konwencjonalnymi modelami kostnienia śródbłonowego: 1) nie wymaga zewnętrznej lub wewnętrznej fiksacji po urazie w celu stymulacji kostnienia błoniastego, 2) jest wykonywana przy użyciu 4 cyfr od każdego zwierzęcia, maksymalizując w ten sposób próbki przy jednoczesnej minimalizacji wykorzystania przez zwierzęta, oraz 3) sekwencyjną analizę mikrotomografii komputerowej in vivo (μCT) można przeprowadzić z łatwością i szybkością.
W obecnym badaniu pokazujemy standaryzowaną płaszczyznę amputacji P3, aby uzyskać powtarzalną i solidną odpowiedź regeneracji. Dodatkowo demonstrujemy zoptymalizowany protokół immunohistochemii fluorescencji wykorzystujący skrawki parafiny do wizualizacji powstawania blastemy, rewaskularyzacji w kontekście regeneracji i konwersji blastemalnej do kości poprzez kostnienie śródbłoniaste. Demonstrujemy również zastosowanie sekwencyjnego μCT in vivo do identyfikacji zmian w morfologii, objętości i długości kości w tej samej palcu w trakcie regeneracji. Celem tego protokołu jest zbadanie powstawania blastemy u ssaków po amputacji oraz zademonstrowanie 2 technik, immunohistochemii fluorescencji i sekwencyjnej symulacji μCT in vivo, do badania wewnątrzbłoniastej regeneracji kości.

<table><tbody><tr><td>Białkowa surowica blokowa bez</td><td>DAKO</td><td>X0909</td><td>Gotowy do użycia</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-PCNA</td><td>Abcam</td><td>ab29</td><td>1:2000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Szczurze przeciwciało anty-CXCR4</td><td>R& D Systems</td><td>MAB21651</td><td>rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Królik przeciwciało anty-ludzkie vWF XIII</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td>1:800 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Królik anty-osterix, przeciwciało SP7</td><td>Abcam</td><td>ab22552</td><td>1:400 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Królik przeciwciało anty-Runx2</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>HPA022040</td><td>Rozcieńczenie 1:250</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-sprzężona koza anty-mysie IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-sprzężony kozioł anty-królik IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568-sprzężony kozioł anty-szczurzy IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Prolong Gold odczynnik</td> <td>zapobiegający blaknięciuInvitrogen</td><td>P36930</td><td>Gotowy do użycia</td></tr><tr><td>Dekalifikator Surgipath 1</td><td>Leica Biosystems</td><td>3800400</td><td>Gotowy do użycia</td></tr><tr><td>Z-Fix, Wodny utrwalacz cynkowo-formalinowy</td><td>Anatech LTD</td><td>174</td><td>Gotowy do użycia</td></tr><tr><td>CD-1 Mysz żeńska</td><td>Envigo</td><td>ICR(CD-1)</td><td>8-12-tygodniowy</td></tr><tr><td>vivaCT 40</td><td>SCANCO Medical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

amputacja i regeneracja palców dorosłych myszy : prosty model do badania powstawania blastemy i kostnienia śródbłoniastego u ssaków

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Tutaj prezentujemy protokół amputacji dystalnego paliczka końcowego (P3) dorosłej myszy, proceduralnie prosty i powtarzalny model regeneracji epimorficznej u ssaków, który obejmuje powstawanie blastema i kostnienie śródbłoniaste analizowane za pomocą immunohistochemii fluorescencyjnej i sekwencyjnej mikrotomografii komputerowej in vivo (μCT). Regeneracja ssaków ogranicza się do amputacji przecinających dystalną część paliczka końcowego (P3); Palce amputowane na bardziej proksymalnym poziomie nie regenerują się i ulegają zwłóknieniu i tworzeniu się blizn. W odpowiedzi regeneracyjnej pośredniczy tworzenie proliferacyjnej blastemy, po której następuje regeneracja kości poprzez kostnienie śródbłoniaste w celu przywrócenia amputowanej długości szkieletu. Amputacja P3 jest modelem przedklinicznym do badania regeneracji epimorficznej u ssaków i jest potężnym narzędziem do projektowania strategii terapeutycznych mających na celu zastąpienie gojenia zwłóknienia skuteczną reakcją regeneracyjną. Nasz protokół wykorzystuje immunohistochemię fluorescencyjną do 1) identyfikacji wczesnych i późnych populacji komórek blastema, 2) badania rewaskularyzacji w kontekście regeneracji oraz 3) badania kostnienia wewnątrzbłoniastego bez konieczności stosowania skomplikowanych urządzeń do stabilizacji kości. Demonstrujemy również zastosowanie sekwencyjnego μCT in vivo do tworzenia obrazów o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania zmian morfologicznych po amputacji, a także ilościowego określenia zmian objętości i długości tej samej cyfry w trakcie regeneracji. Uważamy, że protokół ten oferuje ogromną użyteczność w badaniu zarówno epimorficznych, jak i regeneracyjnych reakcji tkanek u ssaków.

Paliczki P3 regenerujące się u dorosłych myszy w 6/7 DPA (Rysunek 2A-D), 9 DPA (Rysunek 2E-H) oraz 10 DPA (Rysunek 2I-L) poddano immunobarwieniu przeciwciałami przeciwko Runx2, OSX i PCNA w celu wizualizacji błonistej regeneracji kości, a także immunobarwieniu przeciwciałami przeciwko CXCR4 i vWF w celu wizualizacji formowania blastemy. Przedstawiono również reprezentatywne rendery ...

Tutaj prezentujemy protokół amputacji terminalnego paliczka dorosłej myszy w celu zbadania powstawania blastema u ssaków i kostnienia wewnątrzbłoniastego, analizowany za pomocą immunohistochemii fluorescencyjnej i sekwencyjnej tomografii mikrokomputerowej in vivo.

Amputacja i regeneracja palców dorosłych myszy : prosty model do badania powstawania blastemy i kostnienia śródbłoniastego u ssaków

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

Amputacja P3 jest przedklinicznym modelem do badania regeneracji epimorficznej ssaków i potężnym narzędziem do identyfikacji krytycznych populacji komórek i mechanizmów kontrolujących regenerację endogenną. Model P3 pozwala na identyfikację wczesnych i późnych populacji komórek blastemalnych, badanie rewaskularyzacji podczas regeneracji oraz badanie kostnienia śródbłoniastego bez skomplikowanych wymagań dotyczących urządzeń do stabilizacji kości. Procedurę zademonstrują ze mną Osama Qureshi, Alyssa Falck i Katherine Zimmel, technik, oraz Regina Brunaeur, adiunkt badawczy, wszyscy z naszego laboratorium.Po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca u ośmio- lub 12-tygodniowej myszy CD-1, nałóż maść na oczy zwierzęcia i umieść mysz pod 10-krotnym mikroskopem preparacyjnym. Użyj jodu powidonu chirurgicznego i 70% etanolu do sterylizacji palców każdej kończyny tylnej i użyj mikronożyczek, aby przyciąć włosy z dala od pola operacyjnego. Nałóż miejscowo jeden mikrolitr miejscowej bupiwakainy w celu znieczulenia miejsca operowanego i delikatnie rozchyl jedną tylną łapę, aby odsłonić przyśrodkową powierzchnię palca.Następnie trzymając skalpel pod kątem równoległym do poduszeczki tłuszczowej, użyj sterylnego skalpela numer 10, aby amputować dystalną końcówkę paliczka końcowego cyfr dwa i cztery. Nałożyć jeden dodatkowy mikrolitr bupiwakainy miejscowo na każdy amputowany palec i umieścić mysz z powrotem w czystej klatce, aby umożliwić zagojenie się ran bez opatrunku i monitorowania aż do pełnego leżenia. Aby zapewnić pomyślną płaszczyznę amputacji P3, trzymaj skalpel równolegle do poduszeczki tłuszczowej podczas amputacji i wykonaj badanie mikrotomografią komputerową, aby potwierdzić prawidłową długość amputacji.W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym użyć skalpela, aby przeciąć palec w połowie środkowej kości paliczka, w przybliżeniu w drugim wgłębieniu brzusznej poduszeczki tłuszczowej. Przenieś tkankę do 20-mililitrowej fiolki scyntylacyjnej zawierającej 10 mililitrów świeżego buforowanego utrwalacza cynkowo-formalinowego przez 24 do 48 godzin. I użyj mikrotomu, aby uzyskać odcinki każdej palca o grubości od czterech do pięciu mikrometrów, umieszczając plastry w łaźni wodnej o temperaturze od 38 do 41 stopni Celsjusza uzupełnionej histologicznym roztworem kleju w miarę ich uzyskania.Następnie chwyć plastry na szkiełkach samoprzylepnych i umieść je na podgrzewaczu do szkiełek o temperaturze 37 stopni Celsjusza do wyschnięcia. Po odparafiniowaniu szkiełek zanurzyć próbki w słoiku barwiącym z odpowiednim roztworem do pobierania antygenu i podgrzać szkiełka do 95 stopni Celsjusza przez 25 minut, upewniając się, że nie dochodzi do wrzenia. Pod koniec inkubacji pozwól, aby słoik osiągnął temperaturę pokojową i ułóż szkiełka płasko w plastikowym pudełku na szkiełka o głębokości jednego cala z zwilżoną bibułką u podstawy.Dodać 100 mikrolitrów wstępnie podgrzanej proteinazy K do każdej próbki. Przykryj każde szkiełko małym paskiem parafilmu, aby upewnić się, że sekcje nie wyschną. Po 12 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza ostrożnie usuń folię parafinową i delikatnie odcedź szkiełka na bibułce, aby usunąć nadmiar roztworu blokującego.Następnie dodaj od 100 do 200 mikrolitrów podstawowego roztworu przeciwciała, który Cię interesuje, do każdego szkiełka. Umieść miejsca z powrotem w komorze nawilżającej pokrytej folią parafinową na nocną inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka, po umyciu szkiełek w roztworze soli fizjologicznej buforowanym TRIS oraz TWEEN lub TBST, należy oznaczyć szkiełka odpowiednim roztworem przeciwciał wtórnych do 45-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem.Pod koniec inkubacji umyć szkiełka w TBST i pozostawić do wyschnięcia. Następnie użyj 100 mikrolitrów środka montażowego zapobiegającego blaknięciu, aby ostrożnie umieścić szkiełka nakrywkowe na wysuszonych szkiełkach i przechowywać szkiełka płasko w temperaturze pokojowej przez noc, chronione przed światłem, aby umożliwić wyschnięcie podłoża montażowego. Do sekwencyjnej mikrotomografii komputerowej in vivo lub mikrotomografii komputerowej należy wyposażyć kamerę mikro-CT w rurki umożliwiające przepływ tlenu do i z komory zwierzęcia mikro-CT, upewniając się, że wypływający tlen jest wyposażony w filtr z węglem aktywnym do wychwytywania izofluranu.Ustaw Voxelsize na 10,5 mikrometra przy 55 kilonapięciu szczytowym i 145 mikroamperach z 1 000 projekcji na 180 stopni i ciągłym obrociem z czasem integracji 200 milisekund, co daje maksymalnie 213 warstw na skanowanie. Gdy skaner jest gotowy, delikatnie umieść znieczuloną mysz w komorze dla zwierząt mikro-CT z palcami kończyn tylnych ułożonymi na płasko, ściśle przylegającą brzuszną stroną do góry z lewą łapą po lewej stronie i prawą po prawej stronie platformy skanującej. Następnie nałóż taśmę chirurgiczną, aby delikatnie zabezpieczyć palce na miejscu.Nałóż maść okulistyczną na oczy zwierzęcia przed rozpoczęciem skanowania. Po skanowaniu należy umieścić zwierzę z powrotem w czystej klatce z monitorowaniem do momentu pełnego leżenia i odczekać do kilku godzin na rekonstrukcję obrazu mikrotomografii komputerowej. W celu analizy zrekonstruowanego obrazu kości 3D, za pomocą oprogramowania dostarczonego z mikrotomografią komputerową, należy przekonwertować pliki obrazów na serię plików DICOM.Gdy wszystkie pliki zostaną przekonwertowane, pobierz serię DICOM w jednym folderze za pomocą wsadowego pobierania plików w przeglądarce internetowej. Załaduj wtyczkę BoneJ do folderu wtyczki ImageJ. Przeciągnij i upuść folder serii plików DICOM na pasek ImageJ, aby otworzyć pliki.Zostanie otwarty 16-bitowy stos obrazów wyświetlający wszystkie wartości szarości. Aby wyświetlić tylko kość, kliknij opcję Image Adjustment and Threshold (Próg) obrazu. Przesuń górny pasek progu maksymalnie w prawo i dostosuj dolny pasek progu, aż tylko kość zostanie podświetlona na czerwono.Dolna wartość progowa będzie wynosić około 10 000 do 13 000 przy maksymalnym natężeniu sygnału 32 767. Kliknij przycisk Zastosuj, a następnie w nowym oknie dialogowym kliknij pozycję Czarne tło. Następnie kliknij przycisk OK. Zostanie wygenerowany ośmiobitowy obraz wyświetlający wartości czerni i bieli.Z bielą odpowiadającą kości. Narysuj prostokąt wokół kości P3, aby ją zaznaczyć i zduplikować stos. Aby wygenerować obraz 3D, kliknij Wtyczki i przeglądarka 3D i użyj narzędzia do zaznaczania odręcznego, aby zakreślić kość, która ma zostać usunięta.Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Wypełnij zaznaczenie, aby przyciąć niepotrzebną kość z obrazu. Aby określić ilościowo objętość kości na podstawie renderingu 3D, otwórz wtyczkę BoneJ i wybierz opcję Ułamek objętościowy. Pojawi się okno wyników, w którym objętość kości zostanie wyświetlona w milimetrach sześciennych.Aby określić ilościowo długość kości na podstawie renderingu 3D, należy użyć narzędzia ImageJ do tworzenia punktów wielopunktowych. Aby przechwycić obraz renderingu 3D, kliknij przycisk Widok i zrób migawkę. Następnie zapisz obraz jako plik TIF lub JPEG.Na tych obrazach skrawki dorosłej myszy regenerującej palce P3 zostały wybarwione immunologicznie przeciwciałami, aby uwidocznić wewnątrzbłoniastą regenerację kości i tworzenie blastema w dniach od 6 do 7, 9 i 10 po amputacji. Pokazano tu reprezentatywne renderingi mikro-tomografii komputerowej palców zeskanowanych przed amputacją i w różnych momentach w trakcie regeneracji z punktami orientacyjnymi używanymi do identyfikacji pomiarów długości. Mysi model palca to potężny system do analizy proregeneracyjnego środowiska rany, które wyzwala powstawanie blastema po amputacji na poziomie dystalnym.I odwrotnie, proksymalna amputacja palców służy jako modelowy system do badania awarii regeneracyjnych, a także jako miejsce testowania strategii poprawy regeneracji.

adult-mouse-digit-amputation-regeneration-simple-model-to-investigate

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Modele zwierzęce są często wykorzystywane do naśladowania poważnych uszkodzeń kości w badaniach biomedycznych. Ze względu na ich niewielkie rozmiary, ustalenie ustabilizowanych zmian kostnych u myszy wykracza poza możliwości większości grup badawczych. W tym artykule opisujemy prostą metodę ustalania i analizowania eksperymentalnych wad kości udowej u myszy.

Prosty model ubytku kości udowej o krytycznej wielkości u myszy

Prezentujemy protokół do uchwycenia dynamiki regeneracji płetw ogonowych larw danio pręgowanego w skali całej tkanki za pomocą stereomikroskopii opartej na jasnym polu. Technika ta umożliwia uchwycenie dynamiki regeneracji z rozdzielczością pojedynczej komórki. Metodologię tę można dostosować do każdego mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w kamerę CCD i oprogramowanie do filmów poklatkowych.

Uchwycenie naprawy tkanek u larw danio pręgowanego za pomocą stereomikroskopii poklatkowej w jasnym polu

Model heterotopowego kostnienia tenotomii Achillesa i oparzeń pozwala na wiarygodne badanie ektopowego formowania się kości wywołanego urazem bez stosowania czynników egzogennych.

Bezpośredni model kostnienia heterotopowego urazu/oparzenia myszy

Chociaż modele mysie są nieocenionymi narzędziami do inżynierii tkanki kostnej, modele długich wad kostnych są rzadkie. Ta potrzeba zmotywowała do opracowania obecnego protokołu, który wykorzystuje płytkę blokującą z czterema i dedykowanym przyrządem do wykonania i ustabilizowania powtarzalnego ubytku udowego o krytycznej wielkości przy niskiej zachorowalności.

Ustalenie segmentalnego modelu ubytku krytycznej wielkości kości udowej u myszy stabilizowanych przez osteosyntezę płytkową

Ten artykuł opisuje, jak przeprowadzić metodę chirurgiczną hamującą powstawanie naskórka ran podczas regeneracji kończyn aksolotla poprzez natychmiastowe zszycie skóry o pełnej grubości na płaszczyźnie amputacji. Metoda ta pozwala badać funkcjonalne role naskórka rany we wczesnych etapach regeneracji kończyn.

Hamowanie tworzenia się naskórka rany poprzez pełną operację płata skóry podczas regeneracji kończyn aksolotla

Ten protokół opisuje procedurę chirurgiczną mającą na celu wykrycie złamania trzonu w kości udowej myszy, która jest stabilizowana drutem śródszpikowym, do badań nad gojeniem złamań.

Ustalenie modelu złamania kości udowej trzonu u myszy

Ten protokół krok po kroku pokazuje, jak wydobyć pierwszy ząb trzonowy żuchwy u myszy. Stanowi alternatywną metodę dla badaczy zajmujących się gojeniem i regeneracją kości szczęki.

Opracowanie modelu gojenia zębodołu po ekstrakcji zębów trzonowych żuchwy u myszy

Przedstawiono protokół operacji osteotomii kości udowej z użyciem wewnętrznego mocowania płytki u dojrzałych aksolotlów. Zabieg może być wykorzystany do wykonywania badań porównawczych nad regeneracją kończyn i gojeniem złamań u wodnych.

Stabilizacja osteotomii kości udowej z mocowaniem płytki w Ambystoma mexicanum

W tym protokole pokazujemy, jak przygotować tkankę aksolotla do mikroskopii sił atomowych (AFM) i wykonać pomiary wgłębień w nienaruszonej i regenerującej się chrząstce kończyny.

Pomiary mikroskopii sił atomowych chrząstki w nienaruszonych i regenerujących się kończynach aksolotla

Model uszkodzenia szpiku kostnego u myszy jest użytecznym narzędziem do badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste. Ten uproszczony protokół chirurgiczny opisuje procedurę ablacji szpiku kostnego w celu dalszej oceny tworzenia się nowej kości i odpowiedzi komórkowych po urazie.

Ulepszona metodologia badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste w mysim modelu uszkodzenia szpiku kostnego

Celem niniejszej pracy było ujednolicenie bezpiecznego i powtarzalnego podejścia chirurgicznego do przeprowadzenia całkowitej poprzecznej amputacji żuchwy u Ambystoma mexicanum w celu badania regeneracji tkanki czaszkowo-twarzowej.

Projektowanie i standaryzacja modelu urazu żuchwy w celu badania regeneracji tkanek czaszkowo-twarzowych w modelu Ambystoma mexicanum

Poznaj metodę amputacji P3 u dorosłych myszy CD-1 do badania powstawania blastemy i kostnienia śródbłoniastego. Protokół wykorzystuje fluorescencyjną immunohistochemię i mikro-CT do analizy regeneracji ssaków.

Amputacja i regeneracja palców dorosłych myszy : prosty model do badania powstawania blastemy i kostnienia śródbłoniastego u ssaków (Wideo) | JoVE Journal

Amputacja i regeneracja palców dorosłych myszy : prosty model do badania powstawania blastemy i kostnienia śródbłoniastego u ssaków

Przeglądaj więcej filmów