Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej
20 lipca 2019
Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.
Ta technika objętościowej mikroskopii elektronowej służy do wykonywania badań biologicznych, które wymagają obserwacji struktury 3D. Oferuje widok pręta, fieldera i przechowywanie próbek przed ponownym wykonaniem obrazu. Fx2 Asan zaprojektował etapy ścieżki, które katalizują deabilację w celu zwiększenia testu elektronowego struktur docelowych i mogą być wykorzystane do zlokalizowania określonego celu zainteresowania.
Cząstki te łączą w sobie wykorzystanie światła korelacyjnego i techniki mikroskopii elektronowej 3D w celu zbadania interakcji między organellami błoniastymi a komórkami gospodarza. 16 do 24 godzin po transfekcji delikatnie umyj kulturę 250 mikrolitrami roztworu utrwalającego o temperaturze od 30 do 37 stopni Celsjusza. Szybko zastąpij pranie 1,5 mililitra świeżego roztworu utrwalającego i umieść kulturę na lodzie na 30 minut.
Pod koniec inkubacji przepłukać komórki trzema dziesięciominutowymi płukaniami w jednym mililitrze lodowatego 0,1-molowego buforu kakodylanu sodu na jedno przemycie. Po ostatnim umyciu dodaj jeden mililitr lodowatego roztworu glicyny o temperaturze od 0 do 4 stopni Celsjusza i 20 milimolowych roztworze glicyny do naczynia na dziesięciominutową inkubację na lodzie, a następnie trzy pięciominutowe płukanie jednym mililitrem świeżego, zimnego 0,1-molowego buforu kakodylanu sodu na mycie. Następnie oznacz komórki 500 mikrolitrami świeżo przygotowanego roztworu DAB.
I inkubuj komórki na lodzie przez około pięć do czterdziestu pięciu minut. Gdy jasnobrązowa plama jest widoczna pod mikroskopem odwróconego światła, przepłucz komórki trzykrotnie jednym mililitrem świeżego, zimnego 0,1-molowego buforu kakodylanu sodu przez dziesięć minut na pranie. Następnie użyj mikroskopu odwróconego z kontrastem fazowym, aby zobrazować barwienie DAB w powiększeniu 100 razy lub wyższym i zaznacz spód szkła, w którym znajduje się obszar zainteresowania.
W celu przygotowania próbki blokowej mikroskopu elektronowego, najpierw utrwal komórki jednym mililitrem 2% zredukowanego tetratlenku osmu przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec utrwalania przepłucz komórki trzema pięciominutowymi płukaniami i jednym mililitrem świeżej wody destylowanej na pranie. Przed potraktowaniem komórek jednym mililitrem przefiltrowanego roztworu TCH przez 20 minut.
Pod koniec inkubacji umyj komórki trzykrotnie w wodzie destylowanej, jak właśnie pokazano, i utrwal komórki za pomocą 30-minutowej inkubacji w 2% zredukowanym tetratlenku osmu. Pod koniec drugiego utrwalenia przemyj komórki trzykrotnie wodą destylowaną i przykryj kulturę jednym mililitrem wodnego 1% octanu uranylu przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. Następnego ranka umyj komórki trzy razy wodą destylowaną, a następnie zabarwij jednym mililitrem 60 stopni Celsjusza, podgrzej roztwór asparaginianu ołowiu Waltona przez 30 minut w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza.
Pod koniec inkubacji umyć komórki trzykrotnie w wodzie destylowanej. I inkubować kulturę w stopniowanej serii 20-minutowych 2-mililitrowych porcji etanolu. Po ostatniej ekspozycji na 100% etanol inkubuj komórki przez 30 minut w jednym mililitrze etanolu trzy do jednego do jednego do podłoża mieszankowego o niskiej lepkości w temperaturze pokojowej.
Pod koniec inkubacji zastąp pożywkę jednym mililitrem etanolu jeden do jednego do pożywki z mieszaniny o niskiej lepkości na kolejne 30 minut inkubacji w temperaturze pokojowej. Następnie zastąp pożywkę jednym mililitrem od jednego do trzech etanolu na pożywkę z mieszaniną o niskiej lepkości na dodatkowe 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zastąp pożywkę jednym mililitrem pożywki do zatapiania o 100% niskiej lepkości przez noc, a następnie zanurz próbkę w mieszaninie do zatapiania o 100% niskiej lepkości na 24 godziny w temperaturze 60 stopni Celsjusza.
Do analizy transmisyjnej mikroskopii elektronowej, następnego dnia użyj ultramikrotomu, aby uzyskać skrawki o grubości 90 nanometrów i obserwuj siatkę pod transmisyjną mikroskopią elektronową przy 200 kilowoltach. Przed rozpoczęciem przygotowywania próbki szkiełka nakrywkowe pokryte tlenkiem indu i cyny należy delikatnie mieszać w izopropanolu przez 30 do 60 sekund. Pod koniec mieszania odcedź nadmiar alkoholu i umieść szkiełka nakrywkowe w miejscu wolnym od kurzu.
Gdy szkiełka nakrywkowe wyschną, użyj powlekarki plazmowej, aby rozpalić szkiełka nakrywkowe przez jedną minutę. Następnie włóż szkiełka nakrywkowe do uchwytu podłoża i umieść uchwyt podłoża w łódce z nożem. Aby uzyskać próbki do skaningowej mikroskopii elektronowej, należy włożyć osadzony blok próbki do uchwytu próbki ultramikrotomu.
I umieść uchwyt w bloku przycinania. Użyj żyletki, aby odciąć nadmiar żywicy wokół pozycji docelowej, tak aby czoło bloku nabrało kształtu trapezu lub prostokąta. Krawędzie natarcia i spływu powinny być ściśle równoległe do siebie.
Nie jest łatwo zdobyć dużą liczbę sekcji seryjnych. Krawędzie natarcia i spływu muszą być jednak całkowicie równoległe. Następnie włóż uchwyt na próbkę do ramienia ultramikrotomu.
Umieść diamentowy nóż w uchwycie noża i napełnij łódkę noża przefiltrowaną wodą destylowaną. Następnie ostrożnie popchnij uchwyt uchwytu, aby wyregulować pozycję nośnika tak, aby krawędź szkiełek nakrywkowych znajdowała się blisko noża. Po pobraniu próbki przerwij proces cięcia, powoli odkręć mocującą rurkę i opróżnij łódkę z wodą.
Po zakończeniu procesu zbierania taśmy usuń podłoże za pomocą uchwytu urządzenia zaciskowego i wysusz taśmę. Zastosowanie genetycznie znakowanych plazmidów wykazujących ekspresję białek będących przedmiotem zainteresowania, pozwala na identyfikację transfekowanych komórek docelowych po barwieniu dla znakowanych białek. Korelacyjna, świetlna mikroskopia elektronowa może być następnie wykorzystana do dalszej wizualizacji znakowanej hodowli komórek.
Na przykład ciemne zabarwienie generowane przez SCO1-APEX2 obserwuje się wyłącznie w mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej, a nie w przestrzeni macierzy mitochondriów. Kodowane transfekowane komórki plazmidami zarówno SCO1-APEX2, jak i HRP-KDEL wyrażają bardzo gęsty sygnał elektronowy w mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej i retikulum endoplazmatycznym. Jednak nie obserwuje się barwienia retikulum endoplazmatycznego w komórkach, które są transfekowane tylko SCO1-APEX2.
W przypadku obrazowania szeregowego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej za pomocą detektora elektronów rozpraszania wstecznego tworzony jest przegląd całego obrazu matrycy na dużym obszarze. Następnie obszar zainteresowania jest umieszczany w pierwszej sekcji i propagowany do wszystkich pozostałych sekcji. Na koniec obszar zainteresowania zawierający pięć komórek docelowych jest obrazowany za pomocą pikseli obrazowanych w pięciu nanometrach.
Powiększenie ujawnia szczegółowe struktury subkomórkowe, takie jak aparat Golgiego, mitochondria i retikulum endpolasmiczne. Obrazowanie seryjne wyraźnie pokazuje, że kontakty retikulum endoplazmatycznego z mitochondriami występują na różnych płaszczyznach z. Powinieneś dobrze rozumieć, jak zlokalizować określoną strukturę docelową za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej w celu zbadania skutków określonej modyfikacji tożsamości.
Te techniki barwienia w połączeniu z objętościową mikroskopią elektronową mogą być wykorzystane do badania EM na większą skalę w celu zbadania interakcji komórkowych, szczególnie w eurowirusie. Pamiętaj, że aldehyd glutarowy, również enteterocyd i TCH są bardzo toksyczne, dlatego podczas korzystania z tych materiałów należy nosić odzież ochronną i pracować pod wyciągiem.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół badania rozmieszczenia mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej. Wykorzystuje on techniki korelacyjnej mikroskopii świetlnej i wolumetrycznej mikroskopii elektronowej do analizy struktur komórkowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Neuronauka
- Techniki mikroskopowe
Wstęp
- Mitochondria i retikulum endoplazmatyczne są kluczowymi organellami w funkcjonowaniu komórki.
- Zrozumienie ich rozmieszczenia może dostarczyć informacji na temat procesów komórkowych.
- Mikroskopia korelacyjna umożliwia szczegółową analizę strukturalną.
- Modyfikacje genetyczne mogą zmieniać rozmieszczenie i funkcję organelli.
Cel badania
- Zbadanie rozkładu przestrzennego organelli po modyfikacji genetycznej.
- Wykorzystanie zaawansowanych technik obrazowania w celu lepszej wizualizacji.
- Porównanie wpływu modyfikacji genetycznych na rozmieszczenie organelli.
Zastosowane metody
- Korelacyjna mikroskopia świetlna do wstępnego obrazowania.
- Wolumetryczna mikroskopia elektronowa do szczegółowej analizy strukturalnej.
- Techniki barwienia peroksydazą askorbinianową 2 oraz peroksydazą chrzanową.
- Seryjne cięcie komórek w celu pozyskania kompleksowych danych.
Główne wyniki
- Szczegółowe mapowanie rozmieszczenia mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego.
- Identyfikacja różnic w rozmieszczeniu organelli pomiędzy komórkami zmodyfikowanymi a niezmodyfikowanymi.
- Wgląd w interakcje między organellami a strukturami komórkowymi.
- Walidacja technik obrazowania na potrzeby przyszłych badań.
Wnioski
- Protokół skutecznie ujawnia zmiany w rozmieszczeniu organelli wynikające z modyfikacji genetycznych.
- Mikroskopia korelacyjna stanowi potężne narzędzie do analizy komórkowej.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia dynamiki organelli w komórkach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Korelacyjna mikroskopia świetlna i objętościowa mikroskopia elektronowa umożliwiają wysokorozdzielczą wizualizację 3D sieci organelli błoniastych, wypełniając krytyczną lukę w biologii strukturalnej w zakresie walidacji celu. Podejście to wspiera minimalizację ryzyka mechanistycznego poprzez ujawnianie oddziaływań subkomórkowych wpływających na lokalizację białek i funkcję organelli, co stanowi kluczowy aspekt we wczesnej fazie odkrywania leków. Metoda ta zwiększa pewność predykcyjną w przesiewaniu fenotypowym, dostarczając kontekstu w skali nanometrowej dla perturbacji genetycznych lub farmakologicznych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie miejsc kontaktu mitochondriów z ER jako funkcjonalnych centrów w szlakach sygnalizacyjnych i stresie komórkowym.
- Wartość operacyjna: Zapewnia bezpośrednią wizualizację morfologii organelli i ich relacji przestrzennych po perturbacjach genetycznych lub chemicznych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera minimalizację ryzyka związanego z celem poprzez potwierdzenie oczekiwanej lokalizacji subkomórkowej białek znakowanych, takich jak SCO1-APEX2 w przestrzeni międzybłonowej.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe dane ultrastrukturalne 3D, które mogą służyć jako punkt odniesienia dla powtarzalności testów w badaniach przesiewowych koncentrujących się na organellach.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację przygotowania próbek i procesów obrazowania kompatybilnych z tomografią tablicową oraz sekcjonowaniem seryjnym.
- Gotowość testu: Ułatwia korelację między sygnałami mikroskopii świetlnej a wzorami barwienia elektronowo-gęstego w celu weryfikacji celu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy modyfikacje genetyczne z mierzalnymi zmianami w architekturze organelli, wspierając translację fenotypu na mechanizm.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Ujawnia kontakty ER-mitochondria w płaszczyznach z, dostarczając danych do modeli sygnalizacji wapniowej i transferu lipidów istotnych dla modeli chorób.
- Znaczenie dla modeli przedklinicznych: Stosowane w systemach istotnych dla chorób, w których dynamika organelli przyczynia się do mechanizmów patofizjologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu po analizy mechanistyczne, zapewniając kontekst strukturalny, który uzupełnia testy funkcjonalne i wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o wierność fenotypową.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez wizualizację tego, czy modyfikacje genetyczne wywołują oczekiwane zmiany w architekturze organelli i kontaktach międzyorganellowych.
- Screening: Umożliwia generowanie powtarzalnych, wysokotreściowych odczytów strukturalnych w celu walidacji wyników w fenotypowych badaniach przesiewowych skoncentrowanych na organellach.
- Analityka: Dostarcza ilościowych pomiarów 3D morfologii organelli, częstotliwości ich kontaktów oraz rozkładu przestrzennego do analizy porównawczej w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy perturbacje molekularne z efektami strukturalnymi, pomagając w interpretacji aktywności biomarkerów lub szlaków w modelach chorób.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Tworzy ustandaryzowaną, skalowalną platformę do analizy ultrastrukturalnej, która może być stosowana w wielu projektach i klasach celów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności w danych dotyczących lokalizacji subkomórkowej i interakcji organelli.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne obrazowanie 3D o rozdzielczości nanometrycznej dzięki standaryzowanym protokołom fiksacji, barwienia i sekcjonowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia proces podejmowania decyzji w identyfikacji związków wiodących, dostarczając mechanistycznych wglądów w wpływ związków lub modyfikacji genetycznych na architekturę komórkową.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez potwierdzenie, czy obserwowane fenotypy są zgodne z oczekiwanymi zmianami strukturalnymi w systemach istotnych dla danej choroby.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii korelacyjnej, przygotowania próbek do mikroskopii elektronowej oraz strategii znakowania genetycznego.
- Zależne od dostępu do aparatury do elektronowej mikroskopii wolumetrycznej, ultramikrotomów oraz odczynników barwiących, takich jak DAB, tetroksyd osmu i octan uranylu.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa jednostek mikroskopii, biologii molekularnej i histologii w celu zapewnienia spójnego obchodzenia się z próbkami i interpretacji danych.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji podczas stosowania protokołu do różnych typów komórek lub warunków fiksacji, szczególnie w odniesieniu do przepuszczalności i wydajności barwienia.
- Ograniczone przez złożoność techniczną oraz czas wymagany do seryjnego cięcia i dopasowania obrazów, co może ograniczać przepustowość w kampaniach przesiewowych na dużą skalę.
