Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej
July 20th, 2019
Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.
Ta technika objętościowej mikroskopii elektronowej służy do wykonywania badań biologicznych, które wymagają obserwacji struktury 3D. Oferuje widok pręta, fieldera i przechowywanie próbek przed ponownym wykonaniem obrazu. Fx2 Asan zaprojektował etapy ścieżki, które katalizują deabilację w celu zwiększenia testu elektronowego struktur docelowych i mogą być wykorzystane do zlokalizowania określonego celu zainteresowania.
Cząstki te łączą w sobie wykorzystanie światła korelacyjnego i techniki mikroskopii elektronowej 3D w celu zbadania interakcji między organellami błoniastymi a komórkami gospodarza. 16 do 24 godzin po transfekcji delikatnie umyj kulturę 250 mikrolitrami roztworu utrwalającego o temperaturze od 30 do 37 stopni Celsjusza. Szybko zastąpij pranie 1,5 mililitra świeżego roztworu utrwalającego i umieść kulturę na lodzie na 30 minut.
Pod koniec inkubacji przepłukać komórki trzema dziesięciominutowymi płukaniami w jednym mililitrze lodowatego 0,1-molowego buforu kakodylanu sodu na jedno przemycie. Po ostatnim umyciu dodaj jeden mililitr lodowatego roztworu glicyny o temperaturze od 0 do 4 stopni Celsjusza i 20 milimolowych roztworze glicyny do naczynia na dziesięciominutową inkubację na lodzie, a następnie trzy pięciominutowe płukanie jednym mililitrem świeżego, zimnego 0,1-molowego buforu kakodylanu sodu na mycie. Następnie oznacz komórki 500 mikrolitrami świeżo przygotowanego roztworu DAB.
I inkubuj komórki na lodzie przez około pięć do czterdziestu pięciu minut. Gdy jasnobrązowa plama jest widoczna pod mikroskopem odwróconego światła, przepłucz komórki trzykrotnie jednym mililitrem świeżego, zimnego 0,1-molowego buforu kakodylanu sodu przez dziesięć minut na pranie. Następnie użyj mikroskopu odwróconego z kontrastem fazowym, aby zobrazować barwienie DAB w powiększeniu 100 razy lub wyższym i zaznacz spód szkła, w którym znajduje się obszar zainteresowania.
W celu przygotowania próbki blokowej mikroskopu elektronowego, najpierw utrwal komórki jednym mililitrem 2% zredukowanego tetratlenku osmu przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec utrwalania przepłucz komórki trzema pięciominutowymi płukaniami i jednym mililitrem świeżej wody destylowanej na pranie. Przed potraktowaniem komórek jednym mililitrem przefiltrowanego roztworu TCH przez 20 minut.
Pod koniec inkubacji umyj komórki trzykrotnie w wodzie destylowanej, jak właśnie pokazano, i utrwal komórki za pomocą 30-minutowej inkubacji w 2% zredukowanym tetratlenku osmu. Pod koniec drugiego utrwalenia przemyj komórki trzykrotnie wodą destylowaną i przykryj kulturę jednym mililitrem wodnego 1% octanu uranylu przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. Następnego ranka umyj komórki trzy razy wodą destylowaną, a następnie zabarwij jednym mililitrem 60 stopni Celsjusza, podgrzej roztwór asparaginianu ołowiu Waltona przez 30 minut w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza.
Pod koniec inkubacji umyć komórki trzykrotnie w wodzie destylowanej. I inkubować kulturę w stopniowanej serii 20-minutowych 2-mililitrowych porcji etanolu. Po ostatniej ekspozycji na 100% etanol inkubuj komórki przez 30 minut w jednym mililitrze etanolu trzy do jednego do jednego do podłoża mieszankowego o niskiej lepkości w temperaturze pokojowej.
Pod koniec inkubacji zastąp pożywkę jednym mililitrem etanolu jeden do jednego do pożywki z mieszaniny o niskiej lepkości na kolejne 30 minut inkubacji w temperaturze pokojowej. Następnie zastąp pożywkę jednym mililitrem od jednego do trzech etanolu na pożywkę z mieszaniną o niskiej lepkości na dodatkowe 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zastąp pożywkę jednym mililitrem pożywki do zatapiania o 100% niskiej lepkości przez noc, a następnie zanurz próbkę w mieszaninie do zatapiania o 100% niskiej lepkości na 24 godziny w temperaturze 60 stopni Celsjusza.
Do analizy transmisyjnej mikroskopii elektronowej, następnego dnia użyj ultramikrotomu, aby uzyskać skrawki o grubości 90 nanometrów i obserwuj siatkę pod transmisyjną mikroskopią elektronową przy 200 kilowoltach. Przed rozpoczęciem przygotowywania próbki szkiełka nakrywkowe pokryte tlenkiem indu i cyny należy delikatnie mieszać w izopropanolu przez 30 do 60 sekund. Pod koniec mieszania odcedź nadmiar alkoholu i umieść szkiełka nakrywkowe w miejscu wolnym od kurzu.
Gdy szkiełka nakrywkowe wyschną, użyj powlekarki plazmowej, aby rozpalić szkiełka nakrywkowe przez jedną minutę. Następnie włóż szkiełka nakrywkowe do uchwytu podłoża i umieść uchwyt podłoża w łódce z nożem. Aby uzyskać próbki do skaningowej mikroskopii elektronowej, należy włożyć osadzony blok próbki do uchwytu próbki ultramikrotomu.
I umieść uchwyt w bloku przycinania. Użyj żyletki, aby odciąć nadmiar żywicy wokół pozycji docelowej, tak aby czoło bloku nabrało kształtu trapezu lub prostokąta. Krawędzie natarcia i spływu powinny być ściśle równoległe do siebie.
Nie jest łatwo zdobyć dużą liczbę sekcji seryjnych. Krawędzie natarcia i spływu muszą być jednak całkowicie równoległe. Następnie włóż uchwyt na próbkę do ramienia ultramikrotomu.
Umieść diamentowy nóż w uchwycie noża i napełnij łódkę noża przefiltrowaną wodą destylowaną. Następnie ostrożnie popchnij uchwyt uchwytu, aby wyregulować pozycję nośnika tak, aby krawędź szkiełek nakrywkowych znajdowała się blisko noża. Po pobraniu próbki przerwij proces cięcia, powoli odkręć mocującą rurkę i opróżnij łódkę z wodą.
Po zakończeniu procesu zbierania taśmy usuń podłoże za pomocą uchwytu urządzenia zaciskowego i wysusz taśmę. Zastosowanie genetycznie znakowanych plazmidów wykazujących ekspresję białek będących przedmiotem zainteresowania, pozwala na identyfikację transfekowanych komórek docelowych po barwieniu dla znakowanych białek. Korelacyjna, świetlna mikroskopia elektronowa może być następnie wykorzystana do dalszej wizualizacji znakowanej hodowli komórek.
Na przykład ciemne zabarwienie generowane przez SCO1-APEX2 obserwuje się wyłącznie w mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej, a nie w przestrzeni macierzy mitochondriów. Kodowane transfekowane komórki plazmidami zarówno SCO1-APEX2, jak i HRP-KDEL wyrażają bardzo gęsty sygnał elektronowy w mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej i retikulum endoplazmatycznym. Jednak nie obserwuje się barwienia retikulum endoplazmatycznego w komórkach, które są transfekowane tylko SCO1-APEX2.
W przypadku obrazowania szeregowego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej za pomocą detektora elektronów rozpraszania wstecznego tworzony jest przegląd całego obrazu matrycy na dużym obszarze. Następnie obszar zainteresowania jest umieszczany w pierwszej sekcji i propagowany do wszystkich pozostałych sekcji. Na koniec obszar zainteresowania zawierający pięć komórek docelowych jest obrazowany za pomocą pikseli obrazowanych w pięciu nanometrach.
Powiększenie ujawnia szczegółowe struktury subkomórkowe, takie jak aparat Golgiego, mitochondria i retikulum endpolasmiczne. Obrazowanie seryjne wyraźnie pokazuje, że kontakty retikulum endoplazmatycznego z mitochondriami występują na różnych płaszczyznach z. Powinieneś dobrze rozumieć, jak zlokalizować określoną strukturę docelową za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej w celu zbadania skutków określonej modyfikacji tożsamości.
Te techniki barwienia w połączeniu z objętościową mikroskopią elektronową mogą być wykorzystane do badania EM na większą skalę w celu zbadania interakcji komórkowych, szczególnie w eurowirusie. Pamiętaj, że aldehyd glutarowy, również enteterocyd i TCH są bardzo toksyczne, dlatego podczas korzystania z tych materiałów należy nosić odzież ochronną i pracować pod wyciągiem.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół do badania dystrybucji mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej. Wykorzystuje skorelowane techniki mikroskopii świetlnej i objętościowej elektronowej do analizy struktur komórkowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Neuronauka
- Techniki mikroskopowe
Tło
- Mitochondria i retikulum endoplazmatyczne są kluczowymi organellami w funkcjonowaniu komórki.
- Zrozumienie ich dystrybucji może dostarczyć wglądu w procesy komórkowe.
- Korelacyjna mikroskopia umożliwia szczegółową analizę strukturalną.
- Modyfikacje genetyczne mogą zmieniać dystrybucję i funkcję organelli.
Cel badania
- Zbadanie przestrzennej dystrybucji organelli po modyfikacji genetycznej.
- Wykorzystanie zaawansowanych technik obrazowania dla lepszej wizualizacji.
- Porównanie efektów modyfikacji genetycznych na pozycjonowanie organelli.
Stosowane metody
- Korelacyjna mikroskopia świetlna do wstępnego obrazowania.
- Objętościowa mikroskopia elektronowa do szczegółowej analizy strukturalnej.
- Techniki barwienia peroksydazy askorbanowej 2 i peroksydazy chrzanowatej.
- Sekwencyjne cięcie komórek w celu uchwycenia kompleksowych danych.
Główne wyniki
- Szczegółowe mapowanie dystrybucji mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego.
- Identyfikacja różnic w pozycjonowaniu organelli między modyfikowanymi a niemodyfikowanymi komórkami.
- Wgląd w interakcje między organellami i strukturami komórkowymi.
- Walidacja technik obrazowania dla przyszłych badań.
Wnioski
- Protokół skutecznie ujawnia zmiany w dystrybucji organelli z powodu modyfikacji genetycznych.
- Korelacyjna mikroskopia dostarcza potężnego narzędzia do analizy komórkowej.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia dynamiki organelli w komórkach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Correlative light and volume electron microscopy enables high-resolution 3D visualization of membranous organelle networks, addressing a critical gap in structural biology for target validation. This approach supports mechanistic de-risking by revealing subcellular interactions that influence protein localization and organelle function, which are key considerations in early discovery. The method enhances predictive confidence in phenotypic screening by providing nanoscale context for genetic or pharmacological perturbations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mitochondrial-ER contact sites as functional hubs in cellular stress and signaling pathways.
- Operational Value: Provides direct visualization of organelle morphology and spatial relationships following genetic or chemical perturbation.
- Predictive Value: Supports target de-risking by confirming expected subcellular localization of tagged proteins such as SCO1-APEX2 in the intermembrane space.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative 3D ultrastructural data that can serve as a benchmark for assay reproducibility in organelle-focused screens.
- Operational Value: Enables standardized sample preparation and imaging workflows compatible with array tomography and serial sectioning.
- Assay Readiness: Facilitates correlation between light microscopy signals and electron-dense staining patterns for target verification.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links genetic modifications to measurable changes in organelle architecture, supporting phenotype-to-mechanism translation.
- Mechanistic De-risking: Reveals ER-mitochondria contacts across z-planes, informing models of calcium signaling and lipid transfer relevant to disease models.
- Preclinical Model Relevance: Applicable to disease-relevant systems where organelle dynamics contribute to pathophysiological mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow from early target validation through mechanistic follow-up, providing structural context that complements functional assays and supports go/no-go decisions based on phenotypic fidelity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing whether genetic modifications produce expected changes in organelle architecture and inter-organelle contacts.
- Screening: Enables generation of reproducible, high-content structural readouts for validating hits in organelle-focused phenotypic screens.
- Analytics: Delivers quantitative 3D measurements of organelle morphology, contact frequency, and spatial distribution for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects molecular perturbations to structural outcomes, aiding in the interpretation of biomarker or pathway activity in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable platform for ultrastructural analysis that can be applied across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing ambiguity in subcellular localization and organelle interaction data.
- Operational Value: Delivers reproducible, nanoscale-resolution 3D imaging through standardized fixation, staining, and sectioning protocols.
- Strategic Value: Improves decision-making in lead identification by providing mechanistic insights into compound or genetic effect on cellular architecture.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by confirming whether observed phenotypes align with expected structural changes in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in correlative microscopy, electron microscopy sample preparation, and genetic tagging strategies.
- Depends on access to volume electron microscopy instrumentation, ultramicrotomes, and staining reagents such as DAB, osmium tetroxide, and uranyl acetate.
- Necessitates cross-team standardization between microscopy, molecular biology, and histology units for consistent sample handling and data interpretation.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different cell types or fixation conditions, particularly regarding permeability and staining efficiency.
- Limited by the technical complexity and time required for serial sectioning and image alignment, which may constrain throughput in large-scale screening campaigns.
