Name: Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Poznaj metodę korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej do badania przestrzennego rozmieszczenia mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w komórkach po modyfikacjach genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez podstawowy program badawczy KBRI przez Korea Brain Research Institute finansowany przez Ministerstwo Nauki i ICT (19-BR-01-08), oraz grant National Research Foundation of Korea (NRF) finansowany przez rząd Korei (MSIT)(No. 2019R1A2C1010634). Plazmidy SCO1-APEX2 i HRP-KDEL zostały udostępnione dzięki uprzejmości Hyun-Woo Rhee (Seoul National University). Dane TEM uzyskano w Brain Research Core Facilities w KBRI.

1. Hodowla komórkowa z wzorzystą siatkową miską hodowlaną i transfekcją komórek za pomocą wektora plazmidowego SCO1-APEX2 i HRP-KDEL
<ol>
	<li>Wysiewaj 1 x 105 HEK293T komórek, umieszczając je w 35-milimetrowych szklanych naczyniach hodowlanych z siatką w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 w temperaturze 37 °C w zmodyfikowanej pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 U/ml penicyliny i 100 U/ml streptomycyny.</li>
	<li>Dzień po wysianiu komórek, gdy osiągną one 50%-60% konflufluencji, należy wprowadzić do komórek plazmid SCO1-APEX210 i HRP-KDEL12 za pomocą odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcją producenta (SCO1-APEX2 cDNA 0,5 μg + HRP-KDEL plazmidowe DNA 0,5 μg na 3 μL odczynnika do transfekcji).</li>
</ol>
2. Mikroskopia świetlna komórek rosnących na wzorzystych szalkach hodowlanych i barwienie DAB dla APEX2 i HRP
<ol>
	<li>Po 16-24 godzinach od transfekcji usunąć wszystkie podłoża hodowlane i natychmiast dodać 250 μl ciepłego (30-37 °C) roztworu utrwalającego (Tabela 1) poprzez delikatne pipetowanie. Natychmiast usunąć roztwór utrwalający i zastąpić go 1,5 ml świeżego roztworu utrwalającego. Inkubować na lodzie przez 60 minut, a następnie przemywać trzykrotnie przez 10 minut każdy w 1 ml lodowatego 0,1 M buforu kakodylanu sodu (Tabela 1). 
	UWAGA: Opary aldehydów są niezwykle toksyczne. Wszystkie prace należy wykonywać pod wentylowanym wyciągiem.</li>
	<li>Dodać 1 ml zimnego (0-4 °C) 20 ml roztworu glicyny i inkubować przez 10 minut na lodzie, a następnie trzy płukania po 5 minut każde w 1 ml zimnego 0,1 M buforu kakodylanu sodu.</li>
	<li>Przygotuj świeży 1x roztwór DAB (3,33 ml 0,3 M roztworu kakodylanu + 10 μL 30% H2O2 + 5,67 ml zimnej wody + 1 ml 10 x roztwór DAB).</li>
	<li>Dodać 500 μl świeżo przygotowanego roztworu 1x DAB (krok 2.3) i inkubować na lodzie przez około 5-45 minut, aż pod mikroskopem światła odwróconego pojawi się jasnobrązowe zabarwienie (Rysunek 1A).</li>
	<li>Delikatnie usunąć roztwór DAB i spłukać trzykrotnie 1 ml zimnego 0,1 M buforu kakodylanu sodu przez 10 minut każdy.</li>
	<li>Użyj mikroskopu odwróconego z kontrastem fazowym (lub mikroskopu światła jasnego pola), aby zobrazować barwienie DAB przy powiększeniu 100x lub większym. Użyj markera, aby zaznaczyć spód szklanki, w której znajduje się obszar zainteresowania (ROI) (Rysunek 1B,C).</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki do bloku EM
<ol>
	<li>Wykonaj hodowlę komórkową i barwienie DAB zgodnie z opisem w krokach 2.1-2.6.</li>
	<li>Po utrwaleniu próbek 1 ml 2% zredukowanego OsO4 przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Opary OsO4 są wysoce toksyczne. Wszystkie prace należy wykonywać pod wentylowanym wyciągiem.</li>
	<li>Przygotować nowy roztwór TCH (Tabela 1) w kroku 3.2 i przepuścić przez filtr 0,22 μm. 
	UWAGA: Opary TCH są wysoce toksyczne. Wszystkie prace należy wykonywać pod wentylowanym wyciągiem.</li>
	<li>Usuń utrwalacz i spłucz trzy razy 1 ml wody destylowanej przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Umieścić komórki w 1 ml wcześniej przygotowanego i przefiltrowanego roztworu TCH na 20 minut w temperaturze pokojowej</li>
	<li>Przepłucz komórki trzy razy 1 ml wody destylowanej przez 5 minut każda w temperaturze pokojowej temperatury.</li>
	<li>Wystaw komórki po raz drugi na działanie 1 ml 2% tetratlenku osmu w wodzie destylowanej przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć utrwalacz i płukać trzy razy 1 ml wody destylowanej przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 1 ml 1% octanu uranylu (wodnego) i pozostawić na noc w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
	<li>Umyj komórki trzy razy w 1 ml wody destylowanej przez 5 minut w temperaturze pokojowej temperatury.</li>
	<li>Roztwór asparaginianu ołowiu Waltona (Tabela 1) podgrzać w piecu w temperaturze 60 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Wybarwić komórki roztworem asparaginianu ołowiu Waltona, dodając 1 ml wstępnie podgrzanego roztworu asparaginianu ołowiu, a następnie umieścić w piekarniku na 30 minut w temperaturze 60 °C.</li>
	<li>Przepłucz komórki trzy razy 1 ml wody destylowanej przez 5 minut każda w temperaturze pokojowej temperatury.</li>
	<li>Inkubować w stopniowanej serii 2-mililitrowych podwielokrotności etanolu (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) przez 20 minut każdy w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zdekantować etanol i inkubować przez 30 minut w 1 ml etanolu 3:1: pożywka do zatapiania o niskiej lepkości w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń pożywkę i dodaj 1 ml pożywki 1:1 etanolu: mieszaniny o niskiej lepkości. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń pożywkę i dodaj 1 ml pożywki w postaci etanolu o niskiej lepkości w proporcji 1:3. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń pożywkę i dodaj 1 ml pożywki do zatapiania w 100% o niskiej lepkości i inkubuj przez noc.</li>
	<li>Zanurzyć próbkę w 100% mieszaninie do zatapiania o niskiej lepkości i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 60 °C.</li>
	<li>Przygotuj skrawki o grubości 90 nm za pomocą ultramikrotomu.</li>
	<li>Obserwować sieć pod TEM przy napięciu 200 kV.</li>
</ol>
4. Seryjne cięcie i montaż na szkiełkach nakrywkowych pokrytych tlenkiem indu i cyny do obrazowania SEM
<ol>
	<li>Przygotowanie podłoża
	<ol>
		<li>Szkiełka nakrywkowe pokryte tlenkiem indu i cyny (ITO) należy czyścić przez delikatne mieszanie w izopropanolu przez 30-60 s.</li>
		<li>Usuń szkiełka nakrywkowe, odcedź nadmiar izopropanolu i pozostaw w miejscu wolnym od kurzu do wyschnięcia.</li>
		<li>Szkiełka nakrywkowe ze szkła powlekanego ITO należy traktować wyładowaniem jarzeniowym za pomocą powlekarki plazmowej przez 1 min. 
		UWAGA: Aktywacja plazmą nadaje powierzchni podłoża właściwości hydrofilowe. Tworzy bardzo cienką warstwę wody na podłożu, aby zapobiec tworzeniu się zmarszczek w sekcjach, gdy sekcja jest przymocowana do podłoża.</li>
		<li>Włóż szkiełka nakrywkowe ze szkła powlekanego ITO do uchwytu podłoża i umieść w łódce z nożem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przycinanie bloku próbki i cięcie seryjne
	<ol>
		<li>Włożyć blok próbki do uchwytu na próbkę ultramikrotomu i umieścić w bloku przycinania.</li>
		<li>Użyj żyletki, aby odciąć nadmiar żywicy wokół pozycji docelowej (określonej w kroku 2.6, Rysunek 1D-G). Kształt czoła bloku powinien być trapezowy lub prostokątny. Krawędź natarcia i krawędź spływu muszą być absolutnie równoległe (Rysunek 1H,I).</li>
		<li>Umieść uchwyt na próbkę na ramieniu ultramikrotomu i umieść nóż diamentowy w uchwycie noża. Włóż szklane szkiełka nakrywkowe ITO do nośnika taśmy i clamp nośnik za pomocą uchwytu (Rysunek 1J). Umieść nośnik wstążki w łodzi z nożem i napełnij łódkę noża przefiltrowaną wodą destylowaną (Rysunek 1K).</li>
		<li>Wyreguluj pozycję nośnika za pomocą suwaka noża, ostrożnie popychając uchwyt uchwytu, aby ustawić krawędź szkła ITO blisko noża (Rysunek 1L).</li>
		<li>Po przecięciu odcinka zatrzymaj proces cięcia i powoli odkręć mocującą rurkę i opróżnij łódkę wodną (natężenie przepływu jednej kropli wody na sekundę).</li>
		<li>Po zakończeniu procesu zbierania taśmy usuń podłoże za pomocą uchwytu urządzenia zaciskowego i wysusz taśmę (Rysunek 1M).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Obrazowanie w SEM i wyrównanie stosu obrazów SEM
<ol>
	<li>Zamontuj szkiełko nakrywkowe z powłoką ITO na aluminiowych króćcach za pomocą lepkiej taśmy węglowej. Uszczelnij powierzchnię szkła i powierzchnię w króćcu lepką taśmą węglową, a następnie pokryj warstwą węgla o grubości 10 nm (rysunek 1N).</li>
	<li>Obserwować szkiełko nakrywkowe z powłoką ITO w polu emisyjnym SEM przy niskim napięciu przyspieszenia wynoszącym 5 kV i w odpowiedniej odległości roboczej dla skutecznego zbierania BSE.</li>
	<li>Zaimportuj obrazy szeregowe do oprogramowania Image J (Fiji)13 za pomocą opcji stosu wirtualnego. Otwórz nowy TrakEM14 i zaimportuj stos obrazów do TrakEM. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz menu wyrównania.</li>
	<li>Następnie wybierz zakres obrazu (od pierwszego do ostatniego obrazu). Zakończ automatyczne wyrównywanie, zapisz wyrównany zestaw danych i wybierz opcję eksportuj, aby skompilować płaski obraz z wybranego zakresu obrazów (od pierwszego do ostatniego obrazu). Na koniec zapisz dane płaskiego obrazu w formacie AVI w menu głównym Image J. 
	UWAGA: Film uzupełniający 1 i Film uzupełniający 2 pokazują odpowiednio stos obrazów SEM i stos przyciętych obrazów.</li>
</ol>
6. Segmentacja mitochondriów i ER na podstawie obrazów seryjnych
<ol>
	<li>Uruchom 3dmod w oprogramowaniu IMOD15 i otwórz pliki obrazów.</li>
	<li>W oknie ZaP narysuj kontur mitochondriów i ER za pomocą środkowego przycisku myszy.</li>
	<li>Aby zwizualizować podzieloną na segmenty objętość, otwórz okno Widok modelu (film uzupełniający 3).</li>
</ol>

<ol><li>Krols, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-associated+membranes+as+hubs+for+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration.</a> Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).</li>
<li>Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+perspectives+on+restraint+during+medical+procedures+in+paediatric+care%3A+a+qualitative+interview+study+with+nurses+and+physicians%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Qualitative+Studies+on+Health+and+Well-being%22%5BJournal%5D)">Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians.</a> International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623(2017).</li>
<li>Shim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
<li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).</li>
<li>Kremer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+3D+SEM+in+a+broad+biological+context%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Developing 3D SEM in a broad biological context.</a> Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).</li>
<li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure.</a> Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li>
<li>Burel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+3D+EM+and+correlative+microscopy+method+using+SEM+array+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography.</a> Development. 145 (12), (2018).</li>
<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li>
<li>Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+staining+method+%28OTO%29+for+enhancing+contrast+of+lipid--containing+membranes+and+droplets+in+osmium+tetroxide--fixed+tissue+with+osmiophilic+thiocarbohydrazide%28TCH%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH).</a> The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).</li>
<li>Lee, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APEX+Fingerprinting+Reveals+the+Subcellular+Localization+of+Proteins+of+Interest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest.</a> Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li>
<li>Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horseradish+peroxidase+cDNA+as+a+marker+for+electron+microscopy+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS ONE. 7 (6), 38011(2012).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells%2C+tissues%2C+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLOS Biology. 9 (4), 1001041(2011).</li>
<li>Kijanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+immuno-gold+labeling+protocol+for+nanobody-based+detection+of+HER2+in+breast+cancer+cells+using+immuno-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).</li>
<li>Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light+and+electron+microscopic+detection+of+GFP-labeled+proteins+using+modular+APEX%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX.</a> Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).</li>
<li>Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-volume+en-bloc+staining+for+electron+microscopy-based+connectomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics.</a> Nature Communications. 6, 7923(2015).</li>
<li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells%2C+Tissues%2C+and+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> PLOS Biology. 9 (4), 1001041(2011).</li>
<li>Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photooxidation-Guided+Ultrastructural+Identification+and+Analysis+of+Cells+in+Neuronal+Tissue+Labeled+with+Green+Fluorescent+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein.</a> PLOS ONE. 8 (5), 64764(2013).</li>
<li>Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+using+the+genetically+encoded+APEX2+tag+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li>
<li>Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+target+protein+localization+in+3D+using+the+combination+of+FIB-SEM+and+APEX2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Określenie lokalizacji komórkowej określonych białek w rozdzielczości nanometrowej za pomocą EM ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia funkcji komórkowych białek. Ogólnie rzecz biorąc, istnieją dwie techniki badania lokalizacji białka docelowego za pomocą EM. Jedną z nich jest technika immunogold, która jest stosowana w EM od 1960 roku, a druga to technika wykorzystująca niedawno opracowane genetycznie kodowane znaczniki16. Tradycyjne techniki immunogold wykorzystywały cząsteczki złota sprzężone z ...

Mitochondria i retikulum endoplazmatyczne (ER) są organellami komórkowymi związanymi z błoną. Ich połączenie jest niezbędne do ich funkcjonowania, a białka związane z ich siecią zostały opisane1. Odległość między mitochondriami a ER została opisana jako około 100 nm przy użyciu mikroskopii świetlnej2; jednak ostatnie badania mikroskopii superrozdzielczej3 i mikroskopii elektronowej (EM)4 wykazały, że jest ona znacznie mniejsza, przy około 10-25 nm. Rozdzielczość osiągnięta w mikroskopii superrozdzielczej jest niższa niż w przypadku EM i konieczne jest specyficzne znakowanie. EM jest odpowiednią techniką do uzyskania wystarczająco wysokiego kontrastu w rozdzielczości do badań strukturalnych połączeń między mitochondriami a ER. Wadą jest jednak ograniczona informacja o osi z, ponieważ cienkie sekcje muszą być około 60 nm lub cieńsze w przypadku konwencjonalnej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Aby uzyskać wystarczające obrazowanie w osi Z, można użyć trójwymiarowej mikroskopii elektronowej (3DEM)5. Wiąże się to jednak z przygotowaniem setek cienkich odcinków szeregowych całych ogniw, co jest bardzo trudną pracą, którą opanowało tylko kilku wykwalifikowanych technologów. Te cienkie skrawki są zbierane na kruchych, jednootworowych, pokrytych folią formvar siatkach TEM. Jeśli film pęknie na jednym pasku, obrazowanie seryjne i rekonstrukcja objętości nie są możliwe. Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa z powierzchnią blokową (SBEM) jest popularną techniką dla 3DEM, która wykorzystuje destrukcyjne cięcie en bloc wewnątrz komory próżniowej skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) za pomocą noża diamentowego (Dik-SBEM) lub skupionej wiązki jonów (FIB-SEM)6. Ponieważ jednak techniki te nie są dostępne we wszystkich obiektach, sugerujemy tomografię macierzową7 z wykorzystaniem sekcji szeregowych i SEM. W tomografii matrycowej seryjne odcinki wycięte za pomocą ultramikrotomu są przenoszone na szklane szkiełko nakrywkowe zamiast na siatkę TEM i wizualizowane za pomocą mikroskopii świetlnej i SEM8. Aby wzmocnić sygnał do obrazowania elektronów z rozproszeniem wstecznym (BSE), wykorzystaliśmy protokół barwienia en bloc EM wykorzystujący komórki utrwalone tetratlenkiem osmu (OsO4) z osmiofilowym tiokarbohydrazydem (TCH)9, co umożliwiło nam uzyskanie obrazów bez podwójnego barwienia po osadzeniu.
Dodatkowo, marker mitochondrialny SCO1 (białko 1 zespołu oksydazy cytochromu c) – peroksydaza askorbinianowa 2 (APEX2)10 znacznik molekularny został użyty do wizualizacji mitochondriów na poziomie EM. APEX2 wynosi około 28 kDa i pochodzi z peroksydazy askorbinianu sojowego11. Został on opracowany w celu pokazania szczegółowej lokalizacji określonych białek na poziomie EM w taki sam sposób, w jaki białko znakowane zieloną fluorescencją jest używane w mikroskopii świetlnej. APEX2 przekształca 3,3'-diaminobenzydynę (DAB) w nierozpuszczalny polimer osmiofilowy w miejscu znacznika w obecności kofaktora nadtlenku wodoru (H2O2). APEX2 może być stosowany jako alternatywa dla tradycyjnego znakowania przeciwciał w EM, z lokalizacją białka na całej głębokości komórki. Innymi słowy, białko znakowane APEX2 może być wizualizowane przez specyficzną osmikację11 bez znakowania immunogold i przenikania po ultra-kriosekcji. Peroksydaza chrzanowa (HRP) jest również wrażliwym znacznikiem, który katalizuje zależną odH2O2polimeryzację DAB do zlokalizowanego osadu, zapewniając kontrast EM po leczeniu OsO 4. Sekwencja docelowego peptydu ER HRP-KDEL (lys-asp-glu-leu)12 została zastosowana do wizualizacji ER w całej komórce. Aby ocenić nasz protokół wykorzystania znaczników genetycznych i barwienia en bloc ze zredukowanym osmem i TCH (metoda rOTO), wykorzystując jednocześnie efekt osmikacji, porównaliśmy kontrast błony z użyciem i bez użycia każdego znacznika genetycznego w barwieniu rOTO en bloc. Chociaż 3DEM z tomografią matrycową i barwienie DAB za pomocą APEX i HRP zostały wykorzystane odpowiednio do innych celów, nasz protokół jest wyjątkowy, ponieważ połączyliśmy tomografię matrycową do barwienia 3DEM i DAB do znakowania mitochondriów i ER. W szczególności pokazaliśmy pięć komórek z genami znakowanymi przez APEX i bez nich w tej samej sekcji, co pomogło w zbadaniu wpływu modyfikacji genetycznej na komórki.

<table><tbody><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>EMS</td><td>16200</td><td>Do stosowania tylko w dygestoriach</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>EMS</td><td>19210</td><td>Do stosowania tylko w dygestoriach</td></tr><tr><td>Kakodylan sodu</td><td>EMS</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu 4 % roztwór wodny</td><td>EMS</td><td>16320</td><td>Do stosowania tylko w dygestoriach</td></tr><tr><td>Epon 812</td><td>EMS</td><td>14120</td><td>EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0,8 ml</td></tr><tr><td>Ultra-mikrotom Leica ARTOS 3D</td><td>Leica</td><td>ARTOS 3D</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>EMS</td><td>22400</td><td>Niebezpieczna substancja chemiczna</td></tr><tr><td>Cytrynian ołowiu</td><td>EMS</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>35mm Naczynie nakrywkowe z siatką</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-CGRD</td><td></td></tr><tr><td>Wyładowczy żarówek</td><td>Pelco</td><td>easiGlow</td><td></td></tr><tr><td>Formvar Siatka</td> <td>miedziana powlekana węglemTed Pella</td><td>01805-F</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>SIGMA</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>SIGMA</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime; -diaminobenzamidyna (DAB)</td><td>SIGMA</td><td>D8001</td><td>Niebezpieczna substancja chemiczna</td></tr><tr><td>30% roztwór nadtlenku wodoru</td><td>Merck</td><td>107210</td><td></td></tr><tr><td>Trójwodzian heksacyjanożelazianu(II) potasu</td><td>SIGMA</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>0,22 um filtr strzykawkowy</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>Tiokarbonylodihydrazyd</td><td>SIGMA</td><td>223220</td><td>Stosować tylko w dygestoriach</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Fluka</td><td>10193426</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-asparaginowy</td><td>SIGMA</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjna mikroskopia elektronowa</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe powlekane tlenkiem indu i cyny (ITO)</td><td>SPI</td><td>06489-AB</td><td>szkło kruche</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Nóż diamentowy</td><td>Leica</td><td>AT-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia świetlna</td><td>Nikon</td><td>ECLipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowa mikroskopia elektronowa</td><td>Zeiss</td><td>Auriga</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Organelle komórkowe, takie jak mitochondria i retikulum endoplazmatyczne (ER), tworzą sieć do wykonywania różnych funkcji. Te wysoce zakrzywione struktury są składane w różne kształty, tworząc dynamiczną sieć w zależności od warunków komórkowych. Wizualizację tej sieci między mitochondriami a ER podjęto przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości i mikroskopii świetlnej; jednak ograniczona rozdzielczość jest niewystarczająca do szczegółowej obserwacji błon między mitochondriami a ER. Transmisyjna mikroskopia elektronowa zapewnia dobry kontrast błonowy i rozdzielczość w skali nanometrowej do obserwacji organelli komórkowych; jednak jest to wyjątkowo czasochłonne przy ocenie trójwymiarowej (3D) struktury wysoce zakrzywionych organelli. Dlatego obserwowaliśmy morfologię mitochondriów i ER za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej (CLEM) i technik objętościowej mikroskopii elektronowej przy użyciu wzmocnionej peroksydazy askorbinianowej 2 i barwienia peroksydazą chrzanową. Do obserwacji struktury 3D zastosowano metodę barwienia en bloc, ultracienkie cięcie seryjne (tomografia matrycowa) i objętościową mikroskopię elektronową. W tym protokole sugerujemy połączenie CLEM i mikroskopii elektronowej 3D w celu przeprowadzenia szczegółowych badań strukturalnych mitochondriów i ER.

Rysunek 1 przedstawia harmonogram i schemat postępowania dla niniejszego protokołu. Protokół wymaga 7 dni; jednak czas ten może się wydłużyć w zależności od czasu poświęconego na obrazowanie SEM. W przypadku transfekcji komórek należy kontrolować ich konfluencję, aby nie pokryły one dna całej płytki z siatką (Rysunek 1A). Wysoka gęstość komórek mogłaby uniemożliwić identyfikację interesującej komórki podczas obserwacji w mikroskopie świetlnym i EM. Wykorzystaliśmy genetycznie znakowane p...

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Ta technika objętościowej mikroskopii elektronowej służy do wykonywania badań biologicznych, które wymagają obserwacji struktury 3D. Oferuje widok pręta, fieldera i przechowywanie próbek przed ponownym wykonaniem obrazu. Fx2 Asan zaprojektował etapy ścieżki, które katalizują deabilację w celu zwiększenia testu elektronowego struktur docelowych i mogą być wykorzystane do zlokalizowania określonego celu zainteresowania.Cząstki te łączą w sobie wykorzystanie światła korelacyjnego i techniki mikroskopii elektronowej 3D w celu zbadania interakcji między organellami błoniastymi a komórkami gospodarza. 16 do 24 godzin po transfekcji delikatnie umyj kulturę 250 mikrolitrami roztworu utrwalającego o temperaturze od 30 do 37 stopni Celsjusza. Szybko zastąpij pranie 1,5 mililitra świeżego roztworu utrwalającego i umieść kulturę na lodzie na 30 minut.Pod koniec inkubacji przepłukać komórki trzema dziesięciominutowymi płukaniami w jednym mililitrze lodowatego 0,1-molowego buforu kakodylanu sodu na jedno przemycie. Po ostatnim umyciu dodaj jeden mililitr lodowatego roztworu glicyny o temperaturze od 0 do 4 stopni Celsjusza i 20 milimolowych roztworze glicyny do naczynia na dziesięciominutową inkubację na lodzie, a następnie trzy pięciominutowe płukanie jednym mililitrem świeżego, zimnego 0,1-molowego buforu kakodylanu sodu na mycie. Następnie oznacz komórki 500 mikrolitrami świeżo przygotowanego roztworu DAB.I inkubuj komórki na lodzie przez około pięć do czterdziestu pięciu minut. Gdy jasnobrązowa plama jest widoczna pod mikroskopem odwróconego światła, przepłucz komórki trzykrotnie jednym mililitrem świeżego, zimnego 0,1-molowego buforu kakodylanu sodu przez dziesięć minut na pranie. Następnie użyj mikroskopu odwróconego z kontrastem fazowym, aby zobrazować barwienie DAB w powiększeniu 100 razy lub wyższym i zaznacz spód szkła, w którym znajduje się obszar zainteresowania.W celu przygotowania próbki blokowej mikroskopu elektronowego, najpierw utrwal komórki jednym mililitrem 2% zredukowanego tetratlenku osmu przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec utrwalania przepłucz komórki trzema pięciominutowymi płukaniami i jednym mililitrem świeżej wody destylowanej na pranie. Przed potraktowaniem komórek jednym mililitrem przefiltrowanego roztworu TCH przez 20 minut.Pod koniec inkubacji umyj komórki trzykrotnie w wodzie destylowanej, jak właśnie pokazano, i utrwal komórki za pomocą 30-minutowej inkubacji w 2% zredukowanym tetratlenku osmu. Pod koniec drugiego utrwalenia przemyj komórki trzykrotnie wodą destylowaną i przykryj kulturę jednym mililitrem wodnego 1% octanu uranylu przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. Następnego ranka umyj komórki trzy razy wodą destylowaną, a następnie zabarwij jednym mililitrem 60 stopni Celsjusza, podgrzej roztwór asparaginianu ołowiu Waltona przez 30 minut w piekarniku o temperaturze 60 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji umyć komórki trzykrotnie w wodzie destylowanej. I inkubować kulturę w stopniowanej serii 20-minutowych 2-mililitrowych porcji etanolu. Po ostatniej ekspozycji na 100% etanol inkubuj komórki przez 30 minut w jednym mililitrze etanolu trzy do jednego do jednego do podłoża mieszankowego o niskiej lepkości w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji zastąp pożywkę jednym mililitrem etanolu jeden do jednego do pożywki z mieszaniny o niskiej lepkości na kolejne 30 minut inkubacji w temperaturze pokojowej. Następnie zastąp pożywkę jednym mililitrem od jednego do trzech etanolu na pożywkę z mieszaniną o niskiej lepkości na dodatkowe 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zastąp pożywkę jednym mililitrem pożywki do zatapiania o 100% niskiej lepkości przez noc, a następnie zanurz próbkę w mieszaninie do zatapiania o 100% niskiej lepkości na 24 godziny w temperaturze 60 stopni Celsjusza.Do analizy transmisyjnej mikroskopii elektronowej, następnego dnia użyj ultramikrotomu, aby uzyskać skrawki o grubości 90 nanometrów i obserwuj siatkę pod transmisyjną mikroskopią elektronową przy 200 kilowoltach. Przed rozpoczęciem przygotowywania próbki szkiełka nakrywkowe pokryte tlenkiem indu i cyny należy delikatnie mieszać w izopropanolu przez 30 do 60 sekund. Pod koniec mieszania odcedź nadmiar alkoholu i umieść szkiełka nakrywkowe w miejscu wolnym od kurzu.Gdy szkiełka nakrywkowe wyschną, użyj powlekarki plazmowej, aby rozpalić szkiełka nakrywkowe przez jedną minutę. Następnie włóż szkiełka nakrywkowe do uchwytu podłoża i umieść uchwyt podłoża w łódce z nożem. Aby uzyskać próbki do skaningowej mikroskopii elektronowej, należy włożyć osadzony blok próbki do uchwytu próbki ultramikrotomu.I umieść uchwyt w bloku przycinania. Użyj żyletki, aby odciąć nadmiar żywicy wokół pozycji docelowej, tak aby czoło bloku nabrało kształtu trapezu lub prostokąta. Krawędzie natarcia i spływu powinny być ściśle równoległe do siebie.Nie jest łatwo zdobyć dużą liczbę sekcji seryjnych. Krawędzie natarcia i spływu muszą być jednak całkowicie równoległe. Następnie włóż uchwyt na próbkę do ramienia ultramikrotomu.Umieść diamentowy nóż w uchwycie noża i napełnij łódkę noża przefiltrowaną wodą destylowaną. Następnie ostrożnie popchnij uchwyt uchwytu, aby wyregulować pozycję nośnika tak, aby krawędź szkiełek nakrywkowych znajdowała się blisko noża. Po pobraniu próbki przerwij proces cięcia, powoli odkręć mocującą rurkę i opróżnij łódkę z wodą.Po zakończeniu procesu zbierania taśmy usuń podłoże za pomocą uchwytu urządzenia zaciskowego i wysusz taśmę. Zastosowanie genetycznie znakowanych plazmidów wykazujących ekspresję białek będących przedmiotem zainteresowania, pozwala na identyfikację transfekowanych komórek docelowych po barwieniu dla znakowanych białek. Korelacyjna, świetlna mikroskopia elektronowa może być następnie wykorzystana do dalszej wizualizacji znakowanej hodowli komórek.Na przykład ciemne zabarwienie generowane przez SCO1-APEX2 obserwuje się wyłącznie w mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej, a nie w przestrzeni macierzy mitochondriów. Kodowane transfekowane komórki plazmidami zarówno SCO1-APEX2, jak i HRP-KDEL wyrażają bardzo gęsty sygnał elektronowy w mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej i retikulum endoplazmatycznym. Jednak nie obserwuje się barwienia retikulum endoplazmatycznego w komórkach, które są transfekowane tylko SCO1-APEX2.W przypadku obrazowania szeregowego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej za pomocą detektora elektronów rozpraszania wstecznego tworzony jest przegląd całego obrazu matrycy na dużym obszarze. Następnie obszar zainteresowania jest umieszczany w pierwszej sekcji i propagowany do wszystkich pozostałych sekcji. Na koniec obszar zainteresowania zawierający pięć komórek docelowych jest obrazowany za pomocą pikseli obrazowanych w pięciu nanometrach.Powiększenie ujawnia szczegółowe struktury subkomórkowe, takie jak aparat Golgiego, mitochondria i retikulum endpolasmiczne. Obrazowanie seryjne wyraźnie pokazuje, że kontakty retikulum endoplazmatycznego z mitochondriami występują na różnych płaszczyznach z. Powinieneś dobrze rozumieć, jak zlokalizować określoną strukturę docelową za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej w celu zbadania skutków określonej modyfikacji tożsamości.Te techniki barwienia w połączeniu z objętościową mikroskopią elektronową mogą być wykorzystane do badania EM na większą skalę w celu zbadania interakcji komórkowych, szczególnie w eurowirusie. Pamiętaj, że aldehyd glutarowy, również enteterocyd i TCH są bardzo toksyczne, dlatego podczas korzystania z tych materiałów należy nosić odzież ochronną i pracować pod wyciągiem.

mitochondria-endoplasmic-reticulum-imaging-correlative-light-volume

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Technikę CLEM dostosowano do analizy morfologii ultrastrukturalnej błon, organelli i struktur wewnątrzkomórkowych pod wpływem cząsteczek wstrzykniętych metodą mikroiniekcji. Metoda ta łączy zaawansowane techniki mikromanipulacji/mikroiniekcji, konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej oraz mikroskopii elektronowej, co pozwala na uzyskanie rozdzielczości od milimetrów do wielu nanometrów. Technika ta znajduje zastosowanie w szerokim spektrum badań.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM) jako narzędzie do wizualizacji cząsteczek wprowadzonych metodą mikroiniekcji oraz ich eukariotycznych celów wewnątrzkomórkowych

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Opisano metodę, dzięki której nanocząstki kropek kwantowych (QD) mogą być używane do korelacyjnych badań immunocytochemicznych osadzonych w żywicy epoksydowej ludzkiej tkance patologicznej. Stosujemy komercyjne QD sprzężone z fragmentami przeciwciał, które są wizualizowane za pomocą szerokokątnej fluorescencyjnej mikroskopii świetlnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa z wykorzystaniem nanocząstek kropek kwantowych

Tutaj opisujemy procedurę wizualizacji i ilościowego określania z dużą czułością endogennych interakcji między retikulum endoplazmatycznym a mitochondriami w komórkach stałych. Protokół zawiera zoptymalizowany test ligacji zbliżeniowej in situ ukierunkowany na receptor 1,4,5-trifosforanu inozytolu / białko regulowane glukozą 75 / zależny od napięcia kanał anionowy / kompleks cyklofiliny D na granicy faz błony związanej z mitochondriami.

Badanie interakcji retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ w komórkach utrwalonych

Prosty i wszechstronny protokół do pozyskiwania trójwymiarowych szczegółów miejsc kontaktu błony między organellami w hepatocytach z wątroby lub komórek w innych tkankach.

Trójwymiarowa charakterystyka miejsc kontaktu między organellami w hepatocytach przy użyciu mikroskopii elektronowej o przekroju szeregowym

Tutaj prezentujemy protokół do zoptymalizowanej korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej opartej na endogennym, fluorescencyjnym znakowaniu jako narzędzie do badania lokalizacji rzadkich białek w odniesieniu do ultrastruktury komórkowej. O sile tego podejścia świadczy ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 w wygłodzonych komórkach bez leczenia bafilomycyną.

Ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej na przekroju

Ten protokół opisuje, jak zrekonstruować grzebienie mitochondrialne, aby uzyskać obrazowanie 3D z wysoką dokładnością, wysoką rozdzielczością i wysoką przepustowością.

Trójwymiarowa technika wizualizacji ultrastrukturalnych zmian mitochondrialnych w komórkach raka trzustki

Przedstawiamy szczegółowy protokół dla korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej Epon po osadzeniu przy użyciu białka fluorescencyjnego o nazwie mScarlet. Ta metoda może jednocześnie utrzymać fluorescencję i ultrastrukturę. Ta technika jest podatna na szeroką gamę zastosowań biologicznych.

Epon Post Osadzanie korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej

Ten protokół opisuje szczegółowe kroki przygotowania próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej, skupiając się na cechach strukturalnych końcówek fotoreceptorów siatkówki.

Przygotowanie próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje mechanizm użycia światła korelacyjnego i mikroskopii elektronowej do wizualizacji interakcji mitochondriów i lizosomów znakowanych odpowiednio mEosEM i APEX2.

Dwukolorowa korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do wizualizacji interakcji między mitochondriami a lizosomami

Poznaj metodę korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej do badania przestrzennego rozmieszczenia mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w komórkach po modyfikacjach genetycznych.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Przeglądaj więcej filmów