Name: Przygotowanie ciekłych komórek mikrostudzienkowych na bazie grafenu do transmisyjnej mikroskopii elektronowej in situ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj metodę przygotowania ciekłych komórek mikrostudzienkowych na bazie grafenu do transmisyjnej mikroskopii elektronowej in situ. Technika umożliwia obserwację dynamiki wzrostu i trawienia nanokryształów złota w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Tilo Schmutzlerowi za przygotowanie roztworu HAuCl4. Ponadto dziękujemy R. Christianowi Martensowi za korektę. Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe ze strony Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) za pośrednictwem Grupy Badawczo-Szkoleniowej GRK 1896 "Mikroskopia in situ z elektronami, promieniami rentgenowskimi i sondami skanującymi" oraz za pośrednictwem Klastra Doskonałości EXC 315/2 EAM "Inżynieria materiałów zaawansowanych".

1. Wytwarzanie szablonów komórek płynnych na bazie mikrostudzienek
<ol>
	<li>Usuń pozostałości organiczne i natywne warstwy tlenków z monokrystalicznej, domieszkowanej borem (1 – 30) Ωcm (1) – 30) mm płytki krzemowej o grubości 175 μm i średnicy 100 mm (100). Zastosuj etap utleniania zH2O2i TMAH, a następnie zanurz HF w 1-5% roztworze HF.</li>
	<li>Tlenkować termicznie płytkę w atmosferze suchego tlenu w temperaturze 800 °C, aby wytworzyć warstwę tlenku o grubości 11 nm (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2a). 3% Dichloreten (DCE) służy do wiązania zanieczyszczeń metalicznych.</li>
	<li>Osadzać stechiometryczną warstwę Si3N4 za pomocą niskociśnieniowego chemicznego osadzania z fazy gazowej (LPCVD). Grubość warstwy Si3N4 określa głębokość studni. Wybierz wartość odpowiednią dla planowanego eksperymentu (np. 500 nm) (Rysunek 2b).</li>
	<li>Zdefiniuj boczną geometrię studni, strukturyzując przednią stronę za pomocą fotolitografii i reaktywnego trawienia jonowego (RIE) (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2c). Odpowiednimi wymiarami są na przykład okrągłe konstrukcje o promieniu 2,5 μm ułożone w sześciokątne układy. Ostrożnie wybierz odległość studni (na przykład 5 μm), aby uniknąć niestabilności konstrukcji.</li>
	<li>Umieść kolejne 20 nm stechiometrycznego Si3N4 za pomocą LPCVD, który tworzy dolną błonę płynnej komórki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2d). Postępuj zgodnie z procedurą opisaną powyżej (patrz krok 1.3).</li>
	<li>Użyj drugiego kroku fotolitografii/RIE, aby ustrukturyzować tył, który później definiuje wymiary geometryczne ramy LC i jej okien TEM (<silna klasa="xfig">Rysunek 2e) (Średnica ramy: 3 mm).</li>
	<li>Poprzez mikroobróbkę masową w 20% KOH w temperaturze 60 °C, usuń Si w zdefiniowanym obszarze i utwórz wolnostojącą membranę Si3N4 (<klasa mocna = "xfig">Rysunek 2f).</li>
	<li>Usuń resztki jonów metalu w końcowym etapie czyszczenia za pomocą 10% roztworu HCl i wody dejonizowanej (DI).</li>
</ol>
2. Transfer grafenu na siatki TEM
<ol>
	<li>Zwilż tkankę, na której umieszcza się komercyjnie pozyskany kilkuwarstwowy (6 – 8) grafen CVD na PMMA. Zanurz grafen pokryty PMMA na szalce Petriego wypełnionej wodą DI (<silna klasa="xfig">Rysunek 3a). 
	UWAGA: Liczbę warstw grafenu można określić za pomocą możliwych technik32,33.</li>
	<li>Umieść warstwę grafenu na bibule filtracyjnej i pokrój ją na kawałki odpowiednie do pokrycia wszystkich wyprodukowanych studzienek (np. 4 mm²) (<silna klasa="xfig">Rysunek 3b).</li>
	<li>Ponownie zanurz wycięte kawałki na szalce Petriego (<silna klasa="xfig">Rysunek 3c).</li>
	<li>Użyj siatki TEM pokrytej warstwą nośną z dziurawego węgla, aby wyłowić wyprodukowane kawałki z wody DI. Aby to zrobić, ostrożnie zanurz siatkę w wodzie i złap grafen unoszący się na powierzchni. Przytrzymaj siatkę pęsetą antykapilarną (<silna klasa="xfig">Rysunek 3d,e). 
	UWAGA: Zadbaj o to, aby miejsce grafenu stosu grafen-PMMA pozostawało na wierzchu podczas całej procedury. W przeciwnym razie późniejsze usunięcie PMMA spowoduje usunięcie warstwy grafenu.</li>
	<li>Pozostaw prześcieradła do wyschnięcia na kilka godzin.</li>
	<li>Usunąć warstwę ochronną PMMA w kąpieli acetonowej na 30 minut i kolejno dodawać kolejne etapy czyszczenia, zanurzając w etanolu i wodzie demineralizowanej bez suszenia próbki pomiędzy nimi. Użyj płaskiego naczynia (np. szalki Petriego), aby uprościć późniejsze przenoszenie próbki.</li>
	<li>Następnie suszyć próbkę przez 30 minut w warunkach otoczenia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Przygotuj próbkę do włączenia do GSMLC. W tym celu należy przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 1 mM, rozpuszczając 196,915 mg kryształów HAuCl4·3H2O w 0,5 l wody DI.</li>
	<li>Pobrać żądaną ilość próbki z roztworu podstawowego. Tutaj stosuje się 0,5 μl. Można to zrobić za pomocą strzykawki lub pipety Eppendorf.</li>
</ol>
4. Wczytywanie GSMLC
<ol>
	<li>Przepłucz sfabrykowany płynny szablon komórkowy acetonem i etanolem.</li>
	<li>Zastosuj plazmę otoczenia O2/N2 (20%/80%) przez 5 minut, aby zwiększyć zwilżalność membrany.</li>
	<li>Dozować 0,5 μl roztworu próbki na matrycę lub warstwę grafenu. Zapewnij płynną procedurę pracy, aby zminimalizować zmiany stężenia spowodowane parowaniem.</li>
	<li>Umieść siatkę TEM na mikrowzorzystej warstwie Si3N4 tak, aby grafen był skierowany w stronę szablonu. Dociśnij pokrytą grafenem siatkę TEM do szablonu. Uważaj, aby nie zniszczyć dolnej membrany Si3N4.</li>
	<li>Usuń nadmiar roztworu za pomocą chusteczki, aby przyspieszyć wysychanie komórek, a tym samym złagodzić zmiany stężenia (<silna klasa="xfig">Rysunek 4a). Po ok. 2 – 3 minutach oddziaływanie grafen-Si3N4 van-der-Waalsa wystarczająco uszczelnia ogniwo cieczowe (<klasa silna = "xfig">Rysunek 4b). Alternatywnie pozostaw komórkę do całkowitego wyschnięcia bez usuwania nadmiaru roztworu. Ten ostatni oferuje wyższy wskaźnik sukcesu w przetwarzaniu komórek. Oczekuje się jednak, że zmiany stężenia w roztworze próbki wynikające z parowania będą bardziej dotkliwe przy zastosowaniu tego podejścia. 
	UWAGA: Pomyślny proces suszenia można zweryfikować za pomocą zmiany kontrastu na obrzeżach (porównaj <silna klasa="xfig">Rysunek 4a,b).</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij siatkę TEM za pomocą pęsety, wciskając końcówkę pęsety między kratkę a ramkę GSMLC. 
	UWAGA: Wysypkowe ruchy mogą spowodować uszkodzenie leżącej poniżej błony. Aby zmniejszyć uszkodzenia spowodowane siłą tnącą, zacznij od miejsca siatki równolegle do mniejszej krawędzi okna.</li>
	<li>Sprawdź, czy co najmniej jedna membrana GSMLC jest nadal nienaruszona za pomocą mikroskopii optycznej (<silna klasa="xfig">Rysunek 4c). Gdyby wszystkie membrany zostały zerwane, LCTEM byłby niemożliwy</li>.
</ol>
5. Obrazowanie TEM i analiza wideo
<ol>
	<li>Załadować próbkę do (S)TEM bezpośrednio po przygotowaniu za pomocą standardowego uchwytu TEM. 
	UWAGA: Jak podano w przypadku GLCs19, GSMLC mogą z czasem wyschnąć. Dlatego czas między załadowaniem a obrazowaniem powinien być zminimalizowany.</li>
	<li>Zobrazuj próbkę za pomocą odpowiedniej techniki obrazowania, w zależności zarówno od próbki, jak i mikroskopu. W tym przypadku wykorzystywane jest urządzenie (S)TEM pracujące przy napięciu przyspieszenia 300 kV. Użyj niskiej dawki, aby zminimalizować artefakty wywołane wiązką i krótkiego czasu ekspozycji, aby uniknąć rozmycia związanego z ruchem34. W przypadku długotrwałych eksperymentów należy zablokować wiązkę, aby zmniejszyć uszkodzenia spowodowane promieniowaniem. 
	UWAGA: Ze względu na lepszą rozdzielczość czasową, TEM ma być preferowany zamiast STEM w analizach kinetycznych34 i reduced ion reduction35. STEM jest jednak preferowany do badania grubych warstw cieczy i pierwiastków o wysokiej zawartości Z ze względu na wyższą rozdzielczość przestrzenną w grubych próbkach34,35.</li>
	<li>Metoda segmentacji obrazu
	<ol>
		<li>Użyj odpowiedniej platformy przetwarzania obrazu, aby wyodrębnić interesujące Cię funkcje. Do śledzenia i analizy cząstek należy użyć dystrybucji ImageJ o otwartym kodzie źródłowym FIJI36.</li>
		<li>Wykorzystaj funkcję Analizuj cząstki, aby uzyskać precyzyjne informacje (obszar rzutowany, barycentrum) każdej cząstki w każdej klatce. 
		UWAGA: Ta funkcja wymaga obrazów binarnych.</li>
		<li>Połącz cząsteczki między ramkami za pomocą wtyczki TrackMate37. Domyślnie TrackMate szuka jasnych cząstek na ciemnym tle, więc odwróć obrazy (w przypadku BF-TEM) przed uruchomieniem TrackMate.</li>
		<li>Połącz wyniki TrackMate i Analyze Particles za pomocą odpowiedniego skryptu wykorzystującego ekosystem open source oparty na Pythonie SciPy38,39.</li>
		<li>Użyj FIJI, aby wyodrębnić precyzyjne kontury bardziej złożonych struktur, takich jak dendryty. W tym przypadku można również zastosować analizę cząstek (patrz wstawka z Rysunek 6a). 
		UWAGA: Ręczna analiza interesujących nas obiektów może być wykonalna.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

W przeciwieństwie do dostępnych na rynku ogniw płynnych, wykonane na zamówienie GSMLC mają tę zaletę, że można je zaprojektować tak, aby pasowały do łatwo dostępnych uchwytów TEM i nie wymagają drogiego, dedykowanego uchwytu TEM z płynną komórką.
Zademonstrowana tutaj architektura GSMLC łączy w sobie aspekty SiLC i GLC, które mogą potencjalnie prowadzić do unikalnych korzyści. Z jednej strony SiLC pozwalają na precyzyjne określenie położenia i kształtu komórek, ale wymagają stosunkowo grubych błon Si3N4 w celu zmniejszenia efektu wybrzuszenia, jednocześnie ostatecznie zmniejszając osiągalną rozdzielczość. Z drugiej strony GLC wykazują wyjątkowo cienkie ścianki membrany składające się z grafenu, ale cierpią z powodu losowych rozmiarów i pozycji kieszeni. Łącząc te dwa podejścia membranowe za pomocą GSMLC, można ominąć ograniczenie rozdzielczości spowodowane granicami komórek35. Ponieważ struktura studni jest wytwarzana bezpośrednio w warstwie Si3N4 , rzeczywista membrana Si3N4 może być jeszcze mniejsza niż w SiLC, co upraszcza analizy HRTEM, co zostało już wykazane w GSMLC6. Należy jednak zauważyć, że HRTEM w ogóle jest możliwe również w przypadku SiLC48. Co więcej, duże obszary widzenia mogą być zrealizowane bez poważnych wybrzuszeń okien dzięki małym powierzchniom membrany w poszczególnych komorach na próbki. W ten sposób wzrost grubości związany z wybrzuszeniem35 może być w dużym stopniu wykluczony, jak wykazano w Dukes i wsp.49. Pokazano to na rysunku 7, na którym wyświetlany jest reprezentatywny obraz STEM obciążonego GSMLC pod wysokim kątem pierścieniowym ciemnego pola (HAADF). To zdjęcie zostało uzyskane przy użyciu systemu Dual-beam. Ponieważ jasność obrazu uzyskana w tej konfiguracji jest bezpośrednio związana z grubością próbki, wyraźnie widać, że uszczelnione mikrostudzienki wykazują tylko małe ujemne wybrzuszenia. Kelly i wsp.24 wykazali, że ujemne wybrzuszenie i częściowe wysuszenie studni widoczne na rysunku 7 zależy od średnicy studni. Zmniejszenie średnicy studzienki jest zatem wykonalnym podejściem do dalszej homogenizacji grubości cieczy.
Ze względu na kształt kieszeni równowagowej GLC, grubość cieczy jest również silnie zależna od miejsca35. SiLC są zgodne z konstrukcją dwóch membran pochodzących z różnych płytek Si. Zastąpienie górnej membrany Si3N4 grafenem upraszcza wytwarzanie ogniw cieczowych. Oznacza to, że można uniknąć ewentualnego rozwarstwienia dwóch połączonych płytek krzemowych podczas kolejnych etapów trawienia na mokro i pominąć wyrównanie dwóch kawałków płytki podczas ładowania ogniwa. Płaska powierzchnia po jednej stronie tej architektury ogniwa umożliwia komplementarne metody analizy in situ , takie jak analiza EDXS próbki6, która jest ograniczona w konwencjonalnych architekturach SiLC przez efekty zacienienia na stromych krawędziach Si50.
Uszczelnianie wstępnie wzorzystych mikrostudzienek grafenem zarówno na dole, jak i na górze odwiertu zostało zademonstrowane przed24,25. Zastosowanie dwóch membran grafenowych może zwiększyć osiągalną rozdzielczość. Dwukrotny transfer grafenu jeszcze bardziej skomplikowałby jednak proces przygotowania; Zwłaszcza, że okazało się, że jest to najbardziej wrażliwy etap przygotowań (patrz poniżej). Co więcej, oczekuje się, że omówione powyżej wybrzuszenie membrany będzie jeszcze bardziej krytyczne w przypadku dwóch membran grafenowych, ponieważ grafen jest znacznie bardziej elastyczny niż warstwa Si3N4. W tych architekturach mikrostudzienki zostały skonstruowane przy użyciu sekwencyjnego mielenia skupionej wiązki jonów (FIB). Chociaż okazało się, że takie podejście daje wysokiej jakości wyniki, mielenie FIB jest skomplikowaną i kosztowną techniką produkcji komórek. Wykorzystanie masowo równoległych technik tworzenia wzorów pojedynczych ujęć, które są już standardem w dzisiejszym przemyśle półprzewodnikowym, takich jak nanoimprint lub fotolitografia, ma jednak tę główną zaletę, że jest szybkie, tanie i skalowalne do masowej produkcji.
Należy zauważyć, że przedstawione tutaj podejście nie pozwala na działanie przepływu cieczy, co jest osiągalne przez inne konstrukcje28. Ponieważ obciążenie i objętość cieczy są porównywalne dla GSMLC i GLC, można uniknąć zanieczyszczenia wysokiej próżni spowodowanego pęknięciem membrany19. Eliminuje to konieczność kłopotliwej kontroli uszczelnienia. Chociaż zalety SiLC i GLC zostały połączone, wady obu podejść są nadal obecne w GSMLC. Produkcja ogniw wymaga infrastruktury clean room dla technologii krzemowej, która niekoniecznie jest obecna w laboratoriach TEM. Ponadto ładowanie płynów nie jest trywialne. Wymaga dedykowanego szkolenia, podobnie jak ogniwa grafenowe. Dotyczy to jednak również systemów dostępnych na rynku. W tym przypadku najbardziej wrażliwym etapem przygotowania jest usunięcie siatki TEM po transferze grafenu, ponieważ pochopne ruchy lub drżenie mogą spowodować zerwanie warstwy Si3N4 . Nadmiarowe okna membranowe zwiększają jednak szanse na zachowanie co najmniej jednego obszaru membrany. W konsekwencji wydajność (ilość sprawnych chipów GSMLC) osiągnięta przez wyszkolonego eksperymentatora wynosi 3 na46, a zatem przekracza tę osiągniętą z ogniwami na bazie grafenu (od jednego do dwóch z czterech)19.
Podobnie jak w przypadku GLC, enkapsulacja cieczy w GSMLC opiera się na oddziaływaniach van-der-Waals18. W związku z tym zanieczyszczenie interfejsem może obniżyć wskaźnik powodzenia w przetwarzaniu GSMLC19. Ponadto, w zależności od stałej Hamakera dla fazy ciekłej, która ma być zamknięta w kapsułkach, charakterystyka zwilżania podczas procedury załadunku (a tym samym osiągalna wydajność) może się różnić51, a zatem przygotowanie może być skomplikowane. Z naszego doświadczenia wynika, że dzieje się tak na przykład, gdy obecne są gatunki amfifilne.
Architektura GSMLC umożliwia elastyczną konfigurację głębokości odwiertów, co pozwala na dostosowanie do różnych warunków eksperymentalnych. Ponadto architektura nadaje się do badań tomografii elektronowej w szerokim zakresie kąta nachylenia ±75 °, co pozwoliłoby również na tomografię elektronową in situ 52. W związku z tym za pomocą GSMLC można również przeprowadzić tomografię in situ i pośmiertną próbki w cieczy.

Nowoczesne materiałoznawstwo, chemia i biologia komórki wymagają głębokiego zrozumienia leżących u podstaw dynamicznych procesów i efektów w skali submikronowej. Pomimo potęgi zaawansowanych technik mikroskopii optycznej, takich jak mikroskopia fluorescencyjna z wymuszoną emisją i zubożeniem1, techniki bezpośredniego obrazowania w celu uzyskania dostępu do szczegółowych morfologii wymagają mikroskopii elektronowej. W szczególności wykazano, że transmisyjna mikroskopia elektronowa (S)TEM in situ (skaningowa) dostarcza cennych informacji na temat dynamiki procesu poprzez hermetyzację cieczy w dedykowanych, szczelnych próżniowo komórkach2. Różne eksperymenty, takie jak ilościowe badania kinetyki powstawania nanostruktur i termodynamiki3,4,5,6, obrazowanie próbek biologicznych7,8,9,10 oraz badania mechanizmów związanych z magazynowaniem energii11,12 wraz z kompleksowymi badaniami dynamiki procesu korozji13 lub fizyka nanopęcherzyków14,15,16 odkryły wiele zjawisk za pomocą (S)TEM, które nie były dostępne przy użyciu standardowych technik mikroskopowych.
W ciągu ostatniej dekady ustanowiono dwa główne podejścia do realizacji in situ płynnych komórek TEM (LCTEM). W pierwszym podejściu ciecz jest zamknięta we wnęce między dwiema membranami Si3N4 wytwarzanymi w technologii procesu Si17, podczas gdy w drugim małe kieszenie cieczy są tworzone między dwoma arkuszami grafenu lub tlenku grafenu10,18. Zademonstrowano obsługę zarówno ogniw płynnych na bazie krzemu (SiLC), jak i ogniw płynnych na bazie grafenu (GLC)19,20,21. Chociaż oba podejścia uległy znaczącym ulepszeniom22,23,24,25, nadal brakuje im kombinacji odpowiednich zalet. Ogólnie rzecz biorąc, istnieje kompromis między hermetyzacją próbki w często niezdefiniowanych kieszeniach grafenowych o małej objętości cieczy, która umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości18, a dobrze zdefiniowanymi objętościami komórek, co skutkuje grubszymi membranami i warstwami cieczy, które zapewniają środowisko bliższe naturalnej sytuacji w bulk liquid26 kosztem resolution2. Co więcej, niektóre eksperymenty opierają się na przepływie cieczy26,27, który został zrealizowany tylko w architekturach SiLC i wymaga dedykowanego uchwytu TEM28.
Tutaj prezentujemy produkcję i obsługę podejścia opartego na płynnych ogniwach do wysokowydajnego LCTEM in situ za pomocą statycznych mikrodowiertowych komórek płynnych (GSMLC) z grafenem do analiz TEM. Szkic GSMLC znajduje się w Rysunek 1. Udowodniono, że GSMLC są w stanie umożliwić uzyskanie wyników transmisyjnej mikroskopii elektronowej in situ o wysokiej rozdzielczości (HRTEM) 6 i są również wykonalne dla skaningowej mikroskopii elektronowej in situ29. Ich rama oparta na technologii krzemu pozwala na masową produkcję komórek o powtarzalnym kształcie z dostosowaną grubością cieczy i wyjątkowo cienkimi membranami z jednej płytki. Membrana grafenowa pokrywająca te komórki łagodzi również zakłócenia wywołane wiązką elektronów8,30,31, ponieważ wiązka elektronów przechodzi najpierw przez górną membranę grafenową. Płaska topografia komórek pozwala na stosowanie uzupełniających się metod analizy, takich jak spektroskopia rentgenowska z dyspersją energii (EDXS)6 bez żadnych efektów zacienienia wynikających z samej komórki cieczowej, umożliwiając różnorodne eksperymenty mikroskopii elektronowej in situ z wykorzystaniem płynnych komórek.

<table><tbody><tr><td>Aceton</td><td>VWR Chemicals</td><td>50488858</td><td>VLSI</td></tr><tr>Woda <td></td><td></td><td>dejonizowana</td><td>własnej produkcji</td></tr><tr><td>Pęseta antykapilarna Dumont</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>LH72.1</td><td>0203-N5AC-PO Etanol ze stopu dumoxel</td></tr><tr><td></td><td>VWR Chemicals</td><td>85651.360</td><td>VLSI</td></tr><tr><td>FIJI to tylko ImageJ</td><td>FIJI.sc</td><td>wersji 1.51</td><td></td></tr><tr><td>Gold Quantifoil, Amorficzny węgiel Siatki TEM</td><td>Plano GmbH</td><td>S173-8</td><td>R 2/2 Au 300 mesh</td></tr><tr><td>HAuCl4 &middot; 3 kryształ H2O</td><td>Alfa Aesar</td><td>36400.06</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Jupyter Notebook</td><td>Project Jupyter</td><td>Version 5.7.2</td><td></td></tr><tr><td>Matplotlib-Package</td><td>John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom i zespół programistów Matplotlib</td><td>Wersja 3.0.2</td><td></td></tr><tr><td>NumPy-Package</td><td>Programiści NumPy</td><td>Wersja 1.15.4</td><td></td></tr><tr><td>Pandas-Package</td><td>AQR Capital Management, LLC, Lambda Foundry, Inc. i PyData Development Team</td><td>Wersja 0.23.4</td><td></td></tr><tr><td>Python</td><td>Python Software Foundation</td><td>Wersja 3.7</td><td></td></tr><tr><td>Scipy-Package</td><td>Deweloperzy SciPy</td><td>Wersja 1.1.0</td><td></td></tr><tr><td>Seaborn-Package</td><td>Michael Waskom</td><td>Wersja 0.9.0</td><td></td></tr><tr><td>Si wafel</td><td>Siegert Wafer GmbH</td><td></td><td>Cienki krzem (100) wafel 175 +/-5 i mikro; m, 4", typ P, domieszkowany borem (1-30 Ohm cm), dwustronnie polerowany</td></tr><tr><td>uchwyt TEM z pojedynczym przechyłem</td><td>Philips</td><td></td><td>Upewnij się, że ogniwo pasuje</td></tr><tr><td>do transmisyjnego mikroskopu elektronowego</td><td>Philips</td><td>CM 30 (S)TEM</td><td>300 kV</td></tr><tr><td>Triwialny grafen transferowy</td><td>ACS Materiał</td><td>TTG60011</td><td>pokryty PMMA, 6 -- 8 ML</td></tr></tbody></table>

przygotowanie ciekłych komórek mikrostudzienkowych na bazie grafenu do transmisyjnej mikroskopii elektronowej in situ

Preparation of Graphene-Supported Microwell Liquid Cells for In Situ Transmission Electron Microscopy

Wytwarzanie i przygotowanie mikrodowinowych komórek płynnych (GSMLC) z grafenem do mikroskopii elektronowej in situ jest przedstawione w protokole krokowym. Wszechstronność GSMLC została zademonstrowana w kontekście badań nad wytrawianiem i dynamiką wzrostu nanostruktur złota z roztworu prekursora HAuCl4. GSMLC łączą w sobie zalety konwencjonalnych ogniw płynnych na bazie krzemu i grafenu, oferując powtarzalne głębokości odwiertów wraz z łatwą produkcją ogniw i obsługą badanej próbki. GSMLC są wytwarzane na pojedynczym podłożu krzemowym, co drastycznie zmniejsza złożoność procesu produkcyjnego w porównaniu z konstrukcjami płynnych ogniw opartych na dwóch płytkach. W tym przypadku nie są wymagane żadne etapy procesu klejenia ani wyrównywania. Co więcej, zamkniętą objętość cieczy można dostosować do odpowiednich wymagań eksperymentalnych, po prostu dostosowując grubość warstwy azotku krzemu. Umożliwia to znaczne zmniejszenie wybrzuszeń okien w próżni mikroskopu elektronowego. Na koniec przedstawiono najnowszą ocenę ilościową śledzenia pojedynczych cząstek i tworzenia dendrytów w eksperymentach z komórkami płynnymi przy użyciu wyłącznie oprogramowania open source.

Po załadowaniu komórki pomyślny transfer grafenu objawia się innym odcieniem wgłębień obserwowanych pod mikroskopem optycznym. Jest to widoczne na przykład na prawej membranie na Rysunku 3c. Jak wspomniano, kluczowe jest ostrożne usunięcie siatki TEM, aby nie przerwać cienkiej warstwy Si3N4. W przypadku przerwania membrany w mikroskopie optycznym wyraźnie widoczne są prześwitujące i zakrzywione pozostałości, co pokazano na dwóch lewych membranach na Rysunku 3c. Dzięki wielu obszarom obserwacyjnym w zastosowanej konstrukcji GSMLC, z komórki można korzystać tak długo, jak przynajmniej jedna membrana pozostaje nienaruszona. Przerwane membrany mogą służyć do ustawiania TEM bez narażania próbki na działanie wiązki elektronów.
Prawidłową enkapsulację roztworu próbki można zweryfikować podczas mikroskopii elektronowej. Rycina 5 przedstawia poszczególne mikrografie z Filmu uzupełniającego 1, w których statystycznie oceniono rozpuszczanie zbioru nanocząstek i wzrost struktury dendrytycznej w GSMLC. Poza ruchem obrazu wywołanym dryftem widoczne są niewielkie, indywidualne ortogonalne ruchy cząstek, co wskazuje na obecność cząstek w roztworze. Co więcej, powszechność rozpuszczania cząstek dowodzi zachodzenia mokrej reakcji chemicznej, która nie byłaby możliwa bez skutecznego zamknięcia cieczy. Innymi typowymi oznakami zamkniętych cieczy są tworzenie się pęcherzyków wywołane wiązką elektronów19 lub ruch cząstek. Sama obecność cząstek Au w komórkach z grafenu nie wskazuje jednoznacznie na środowisko ciekłe, ponieważ cząstki te mogłyby również pochodzić z redukcji HAuCl4 indukowanej przez grafen40. W celu weryfikacji środowiska ciekłego można również przeprowadzić kwantyfikację pików tlenu zamkniętej cieczy za pomocą spektroskopii strat energii elektronów (EELS)41.
Aby uzyskać wgląd w kinetykę wzrostu i rozpuszczania cząstek, ważne jest badanie każdej cząstki indywidualnie, zamiast analizować rozwój parametrów średnich42. Kluczowe jest również wykluczenie cząstek znajdujących się na krawędziach klatek, które są rejestrowane przez kamerę tylko częściowo, ponieważ zmiany pozycji takich cząstek związane z efektem dryfu mogłyby zostać błędnie zinterpretowane jako procesy wzrostu lub rozpuszczania. Przypuszcza się, że trawienie jest powodowane przez gatunki utleniające generowane w wyniku radiolizy indukowanej wiązką elektronów43. W celu uzyskania wystarczających statystyk wymagane jest komputerowe śledzenie pojedynczych cząstek. Poprzez oszacowanie wykładnika wzrostu α zmienności promienia równoważnego poszczególnych cząstek w czasie, można uzyskać informacje o podstawowej kinetyce reakcji. W tym celu możliwe jest wprowadzenie promienia równoważnego opartego na rzutowanej powierzchni cząstki, nawet jeśli nie wszystkie cząstki są całkowicie sferyczne6,44. Rysunek 5b przedstawia śledzenie promieni równoważnych w czasie dla sześciu reprezentatywnych cząstek wyróżnionych na Rysunku 5a. Rysunek 5c pokazuje rozkład α na podstawie 73 rozpuszczających się cząstek z niniejszego badania. Uwzględniono jedynie cząstki, w których model allometryczny wyjaśnia spadek promienia w co najmniej 50% (skorygowany współczynnik determinacji).
Ponadto, po około 42 s w tej samej studni przedstawionej na Rysunku 6a szybko wyłania się struktura dendrytyczna. Tworzenie dendrytów jest innym typowym, dobrze udokumentowanym procesem w komórkach ciekłych45,46. Aby ilościowo określić wzrost dendrytów, analizowane są zarysy strukturalne (patrz wstawka na Rysunku 6a). Ewolucja promienia wierzchołka i prędkości w czasie (patrz Rysunek 6b,c) ujawnia oczekiwaną zależność hiperboliczną47 (Rysunek 6d). Wzrost dendrytów jest spowodowany lokalnym przesyconoem jonami Au w wyniku wspomnianego trawienia cząstek. Na Rysunku 5a wyraźnie widać, że cząstki wciąż się rozpuszczają, podczas gdy przesycony układ przechodzi w wzrost dendrytów. Może to być spowodowane lokalnymi wahaniami stężenia zarówno jonów Au, jak i gatunków utleniających w wyniku wysokiej lepkości cieczy w GSMLC, co obserwowano już wcześniej6. Szczegółowa dyskusja nad tym zjawiskiem wykracza jednak poza zakres niniejszej pracy.
<img alt="Schemat mikroszybka z membraną Si₃N₄ i grafenem; przekrój poprzeczny dla analizy cieczy z próbką." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat GSMLC: Schemat struktury mikrodołowej komórki cieczowej z podłożem grafenowym. Przedrukowano z https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.nanolett.8b03388 6. Dalsze zapytania o zgodę należy kierować do American Chemical Society (ACS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig1large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat procesu nanofabrykacji krzemu; etapy a-f pokazujące wzorowanie warstw dwutlenku/azotku krzemu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Fabrykacja ramek GSMLC. Schematyczny rysunek procesu fabrykacji ramek GSMLC. (a) Utlenianie wafla Si po czyszczeniu. (b) LPCVD Si3N4. (c) Wzorowanie Si3N4 na stronie przedniej za pomocą fotolitografii i RIE w celu zdefiniowania objętości komórki. (d) Osadzanie Si3N4 w celu utworzenia dolnego okna komórki. (e) Litografia i RIE na stronie tylnej. (f) Mikrobobróbka objętościowa za pomocą KOH w celu utworzenia wolnostojącej membrany z Si3N4 zawierającej mikroszczeliny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces transferu grafenu; z użyciem papieru filtrującego, grafenu/PMMA, siatki TEM oraz pęsety antykapilarnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Transfer kilkuwarstwowego grafenu CVD z warstwą ochronną PMMA na siatkę TEM. Przedstawiono transfer kilkuwarstwowego grafenu CVD na PMMA na wierzch siatki TEM powlekanej dziurkowanym węglem. (a) Zanurzenie kilkuwarstwowego grafenu CVD na PMMA w czarce Petri wypełnionej wodą DI. (b) Przeniesiony stos grafen/PMMA na papierze filtrującym zostaje pocięty na fragmenty odpowiednie do pokrycia ramek GSMLC. (c) Ponowne zanurzenie pociętego fragmentu grafenu/PMMA. (d) Transfer warstwy grafen/PMMA na siatkę TEM powlekaną dziurkowanym węglem (e) Stos grafen/PMMA po pomyślnym transferze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza trwałości membrany grafenowej poprzez obrazowanie mikroskopowe; porównanie próbki szczelnej i uszkodzonej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Usunięcie górnej siatki TEM. Proces suszenia obciążonego GSMLC został udokumentowany za pomocą mikroskopu optycznego. (a) Siatka TEM powlekana grafenem została umieszczona na wierzchu GSMLC bezpośrednio po ładowaniu. Warstwa grafenowa jest widoczna jako turkusowy prostokąt pokrywający wszystkie trzy obszary obserwacji. Jej kontury zostały orientacyjnie zaznaczone czarnym prostokątem. (b) Prawie całkowicie przylegająca membrana jest widoczna dzięki zmianie kontrastu między obszarem mokrym (ciemnym, por. (a)) a obszarem przylegającym (turkusowym) po około dwóch minutach. (c) Przedstawiono GSMLC po odjęciu siatki TEM, co ujawnia dwie uszkodzone membrany (lewa i środkowa) oraz jedną membranę z pomyślnie załadowanymi i uszczelnionymi mikroskrutkami (prawa). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wzrost nanocząstek, obrazy z mikroskopii szeregów czasowych z wykresem rozkładu wielkości, analiza statystyczna wykresów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Reprezentatywny rozwój promieni nanocząstek. Śledzono rozwój promienia 183 poszczególnych cząstek. (a) Sekwencja obrazów pochodząca z Krótkiego filmu uzupełniającego 1. Wyróżniono sześć reprezentatywnych cząstek. Kolorowe okręgi odpowiadają uzyskanemu promieniowi równoważnemu. (b) Wykres logarytmiczny promieni cząstek. (c) Histogram 73 cząstek, dla których wyznaczono ujemny wykładnik allometryczny α przy użyciu zautomatyzowanej procedury. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig5v2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia time-lapse nanostruktur wraz z wykresami przedstawiającymi analizę danych średniego promienia wierzchołka i prędkości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Dynamika dendrytów: Przeanalizowano promień wierzchołka pięciu gałęzi dendrytów. Słupki błędów odpowiadają odpowiednim odchyleniom standardowym. (a) Sekwencja obrazów pochodząca z Supplementary Video 1 przedstawiająca powstający dendryt, który staje się widoczny po około 42 s. Wstawka na prawym obrazie pokazuje ewoluujące kontury dendrytu. Tutaj różowe obrysy odpowiadają czasowi 42,09 s, czerwone 42,7 s, a fioletowe 43,3 s. (b) Zmiana (uśrednionego) promienia wierzchołka w czasie. (c) Średnia prędkość wierzchołka przedstawiona w funkcji czasu. (d) Uśredniony promień wierzchołka naniesiony logarytmicznie względem uśrednionej prędkości wierzchołka, co ujawnia zależność hiperboliczną (pomarańczowa krzywa). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy porowatej nanostruktury do analizy materiałowej; pasek skali 3 µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig7.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Obraz SEM załadowanego GSMLC: Przedstawiono reprezentatywny obraz SEM uzyskany w trybie HAADF STEM w SEM załadowanego GSMLC przy niskim napięciu przyspieszającym (29 kV).Oprócz wyraźnych mikrootworów o szerokości 5 µm, widoczne są dwie częściowo nakładające się okrągłe perforowane siatki węglowe (średnica 2 µm) wynikające z opisanego powyżej transferu grafenu. Pierwsza siatka węglowa jest efektem nieudanego transferu grafenu. Wyraźnie widać, że cieniowanie membrany pozostaje w większości stałe nad obszarem otworu, ale lekko ciemnieje w kierunku jego centrum. Świadczy to o słabym, ujemnym wybrzuszeniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wideo uzupełniające 1: In situ wideo przedstawiające reprezentatywne wyniki badania TEM w jasnym polu w komórce z cieczą, obrazujące trawienie nanocząsteczek Au i późniejszy wzrost struktury dendrytycznej spowodowany przesyceniem otaczającego roztworu próbki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/Supplementary_Video_1.avi">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Przedstawiono protokół przygotowania mikrodobitkowych komórek płynnych z grafenem do mikroskopii elektronowej in situ nanokryształów złota z roztworu prekursorowego HAuCl4. Ponadto przedstawiono procedurę analizy w celu ilościowego określenia obserwowanego trawienia i dynamiki wzrostu.

Przygotowanie ciekłych komórek mikrostudzienkowych na bazie grafenu do transmisyjnej mikroskopii elektronowej in situ

The fabrication and preparation of graphene-supported microwell liquid cells (GSMLCs) for in situ electron microscopy is presented in a stepwise protocol. ...

Mikroskopia elektronowa z ciekłymi komórkami jest potężną techniką badania cech nano w C2 w ciekłych ośrodkach w wysokiej rozdzielczości i zapewnia unikalny wgląd w czasie rzeczywistym w dynamiczne procesy w skali nano. Ciekła komórka mikrodołkowa na bazie grafenu łączy w sobie zalety architektur ogniw opartych na technologii grafenu i krzemu. Pozwala to na korelację z metodami analitycznymi, takimi jak spektroskopia EDX, na widoku.Technika ta pozwala nam bezpośrednio śledzić procesy zachodzące w materiale w cieczach podczas ich zachodzenia. Ta obserwacja in situ jest podstawą naszej grupy badawczej. Mikroskopia in situ z elektronami, promieniami rentgenowskimi i sondami skanującymi finansowana przez Niemiecką Fundację Badawczą.Procedurę zademonstruje dr hab. inż. Robert Branscheid, pracownik mojego laboratorium. Aby rozpocząć, przenieś grafen na siatki TEM, najpierw zwilżając tkankę podtrzymującą sześć do ośmiu warstw grafenu CVD na PMMA. Uważaj, aby woda nie była bezpośrednio aplikowana na membranę PMMA.Całkowicie zanurz grafen pokryty PMMA na szalce Petriego wypełnionej wodą DI, a następnie użyj bibuły filtracyjnej, aby zebrać warstwę grafenu. Zadbaj o to, aby grafenowa strona stosu grafenu PMMA pozostawała na wierzchu podczas całej procedury. Pokrój warstwę grafenu na kawałki, które są wystarczająco duże, aby pokryć wszystkie wykonane studzienki.Następnie ponownie zanurz pokrojone kawałki w szalce Petriego. Następnie, za pomocą pęsety antykapilarnej, podnieś siatkę TEM pokrytą warstwą nośną z dziurawego węgla. Ostrożnie zanurz siatkę w wodzie i złap grafen unoszący się na powierzchni.Pozostaw prześcieradła do wyschnięcia na kilka godzin. Następnie usuń warstwę ochronną PMMA, przenosząc ją do kąpieli acetonowej na 30 minut. Po kąpieli acetonowej natychmiast zanurzyć próbkę w etanolu i wodzie demineralizowanej, nie susząc próbki między roztworami.Użyj płaskiego naczynia, aby łatwo usunąć próbkę. Po zakończeniu wyjmij próbkę z wody demineralizowanej, a następnie susz ją przez 30 minut w warunkach otoczenia. Utwórz szablon płynnej komórki z mikrowzorami mikrostudzienek, postępując zgodnie z protokołem tekstowym.Przepłucz wytworzony płynny szablon komórkowy acetonem, a następnie etanolem. Następnie nałóż otaczającą plazmę o zawartości 20% tlenu i 80% azotu na pięć minut, aby zwiększyć zwilżalność membrany. Dozować 0,5 mikrolitra roztworu próbki na matrycę lub warstwę grafenu.Zapewnij płynną procedurę pracy, aby zminimalizować zmiany stężenia spowodowane parowaniem. Następnie umieść siatkę TEM na warstwie azotku krzemu z mikrowzorem, tak aby grafen był skierowany w stronę szablonu. Ostrożnie dociśnij pokrytą grafenem siatkę TEM do szablonu, uważając, aby nie zniszczyć dolnej membrany z azotku krzemu.Usuń nadmiar roztworu za pomocą chusteczki, aby przyspieszyć wysychanie komórek i złagodzić zmiany stężenia. Po około dwóch do trzech minutach obserwuj zmianę kontrastu, gdy oddziaływania azotku grafenu i krzemu Van der Waalsa uszczelniają płynną komórkę. Następnie umieść próbkę pod mikroskopem optycznym.Użyj pęsety, aby ostrożnie usunąć siatkę TEM, wciskając końcówkę między siatkę a ramę ciekłej komórki mikrodołka podpartej grafenem. Aby zmniejszyć uszkodzenia spowodowane samą siłą, zacznij od miejsca siatki równolegle do mniejszej krawędzi okna. Upewnij się, że co najmniej jedna membrana ciekłych komórek mikrostudzienki na nośniku grafenu jest nadal nienaruszona.Za pomocą standardowego uchwytu TEM załaduj próbkę do uchwytu. Bezpośrednio po jego przygotowaniu załadować uchwyt i próbkę do skaningowego transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Zobrazuj próbkę odpowiednio z uwzględnieniem charakterystyki próbki i mikroskopu.Użyj niskiej dawki, aby zminimalizować wstępnie wywołany artefakt, i krótkiego czasu ekspozycji, aby uniknąć rozmycia związanego z ruchem. W przypadku długotrwałych eksperymentów zablokuj wiązkę, aby zmniejszyć uszkodzenia spowodowane promieniowaniem. Po uzyskaniu obrazów użyj odpowiedniej platformy przetwarzania obrazu, aby wyodrębnić interesujące Cię cechy.Do śledzenia i analizy cząstek użyj dystrybucji ImageJ o otwartym kodzie źródłowym, Fidżi. Po załadowaniu obrazu i przekonwertowaniu go na obraz binarny, wykorzystaj funkcję analizy cząstek, aby uzyskać precyzyjne informacje dotyczące rzutowanego obszaru i barycentrum cząstki dla każdej cząstki w każdej klatce. Odwróć oryginalny obraz, aby cząstki wyglądały jak jasne punkty.Następnie połącz cząsteczki między ramkami za pomocą wtyczki TrackMate. Domyślnie TrackMate wyszukuje jasne cząstki na ciemnym tle. Na koniec połącz wyniki TrackMate i przeanalizuj cząstki za pomocą odpowiedniego skryptu, wykorzystując ekosystem open source oparty na Pythonie, SciPy.Pomyślna enkapsulacja roztworu próbki może być zweryfikowana podczas mikroskopii elektronowej. Ten film pokazuje rozpuszczanie zespołu nanocząstek i wzrost struktury dendrytycznej. Aby uzyskać wgląd w kinetykę wzrostu i rozpuszczania cząstek, ważne jest, aby badać każdą cząstkę z osobna, a nie analizować rozwój średnich parametrów.Szacując wykładnik wzrostu, alfa, równoważnej zmienności promienia poszczególnych cząstek w czasie, można uzyskać informacje o kinetyce leżącej u podstaw reakcji. W tym miejscu wyświetlany jest rozkład alfa oparty na 73 rozpuszczających się cząstkach. Pod uwagę brane są tylko cząstki, w przypadku których model allometryczny wyjaśnia spadek promienia do co najmniej 50%.Pod koniec filmu wyłania się struktura dendrytowa. Tworzenie się dendrytów to kolejny typowy, dobrze udokumentowany proces w komórkach płynnych. Aby określić ilościowo wzrost dendrytów, analizowane są zarysy strukturalne.Ewolucja promienia końcówki i prędkości w czasie ujawnia oczekiwaną zależność hiperboliczną. Wzrost dendrytów jest spowodowany miejscowym przesyceniem jonów złota w wyniku wspomnianego wcześniej trawienia cząstek. W tej części filmu wyraźnie widać, że cząsteczki nadal się rozpuszczają, podczas gdy przesycony system rozluźnia się do wzrostu dendrytów.Może to być spowodowane lokalnymi zmianami stężeń zarówno jonów złota, jak i form utleniających. Obciążenie cieczą i suhrf jest w dużym stopniu zależne od próbki będącej przedmiotem zainteresowania, ponieważ przyczepność grafenu i wymagane czasy schnięcia mogą się różnić, jeśli stosowane są różne roztwory próbek. Architektura ciekłych komórek mikrodołka na bazie grafenu pozwala również na stosowanie uzupełniających metod in situ, takich jak uzysk w EDSX.Ponadto z powodzeniem przeprowadzono eksperymenty SEM w trybie transmisyjnym i tomografii. Po opracowaniu tej techniki możliwe stało się rozwikłanie mechanizmu wzrostu złota, srebra, kawsh-en i innych cząstek aż do rozdzielczości atomowej. Wyniki są doskonale zgodne z pomiarami rezonansu plazmy uzyskanymi przez naszych kolegów z wydziału fizyki, którzy również uczestniczą w badawczej grupie szkoleniowej.Chociaż nie pokazano tutaj, produkcja ram nośnych wykorzystuje substancje i toksyczne. Zachowaj ostrożność podczas pracy i podejmij wymagane środki ostrożności.

preparation-graphene-supported-microwell-liquid-cells-for-situ

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Mikroskopia elektronowa z ciekłych komórek grafenowych może być używana do obserwacji dynamiki nanokryształów w środowisku ciekłym z większą rozdzielczością przestrzenną niż inne techniki mikroskopii elektronowej w ciekłych komórkach. Wytrawianie gotowych nanokryształów i śledzenie ich kształtu za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej z ciekłymi ogniwami grafenowymi może dostarczyć ważnych informacji mechanistycznych na temat przemian nanocząstek.

Wykorzystanie mikroskopii elektronowej transmisji ciekłych komórek grafenowych do badania trawienia nanokryształów in situ

Tutaj prezentujemy protokół produkcji i przygotowania płynnego ogniwa grafenowego do obserwacji w mikroskopii elektronowej in situ, wraz z syntezą materiałów elektrodowych i testami elektrochemicznych ogniw akumulatorowych.

Przygotowanie ogniw ciekłych grafenu do obserwacji materiału baterii litowo-jonowych

Prezentowany jest tutaj protokół oznaczania białek błonowych w komórkach ssaków i pokrywania próbki grafenem do skanowania w fazie ciekłej transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Za pomocą tego protokołu można również badać stabilność próbek w stosunku do uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem.

Grafenowa obudowa chemicznie utrwalonych komórek ssaków do mikroskopii elektronowej w fazie ciekłej

Tutaj prezentujemy protokół przeprowadzania eksperymentów z reakcjami na gaz zamkniętymi in situ TEM, jednocześnie szczegółowo opisując kilka powszechnie stosowanych metod przygotowania próbek.

Przeprowadzanie reakcji gazowych in situ w komórkach zamkniętych w transmisyjnym mikroskopie elektronowym

Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) jest znaczącym wąskim gardłem w procesie określania struktury tej metody. W tym miejscu podajemy szczegółowe metody wykorzystania łatwego w użyciu, drukowanego trójwymiarowo bloku do przygotowania folii nośnych do stabilizacji próbek do transmisyjnych badań EM.

Przygotowanie warstw nośnych próbek w transmisyjnej mikroskopii elektronowej przy użyciu bloku flotacyjnego

Celem tego protokołu jest skierowanie adhezji i wzrostu komórek do docelowych obszarów siatek do mikroskopii krioelektronowej. Osiąga się to poprzez nałożenie warstwy przeciwporostowej, która jest ablowana w określonych przez użytkownika wzorach, a następnie osadzanie się białek macierzy zewnątrzkomórkowej w obszarach wzorzystych przed wysiewem komórek.

Mikrowzorce Transmisyjne siatki mikroskopii elektronowej do bezpośredniego pozycjonowania komórek w przepływach pracy kriotomografii elektronowej całej komórki

Obecny protokół opisuje modyfikacje transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) z systemem oświetlenia świetlnego, wytwarzanie komórek płynnych oraz obserwacje in situ TEM indukowanych światłem interakcji między komórkami bakteryjnymi a fotosensybilizatorem. Omówiono również metody przygotowania próbek, uszkodzenia wiązki elektronów i obrazowanie.

Indukowana światłem transmisyjna mikroskopia elektronowa in situ do obserwacji oddziaływania ciecz-miękka materia

Tutaj opisujemy protokół stosowania pojedynczej monowarstwy grafenu na siatkach mikroskopii elektronowej i jak przygotować je do użycia w określaniu struktury krioEM.

Wytwarzanie jednowarstwowych siatek pokrytych grafenem do mikroskopii krioelektronowej

Zastosowanie warstw nośnych do siatek kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryoEM) może zwiększyć gęstość cząstek, ograniczyć interakcje z interfejsem powietrze-woda, zredukować ruch wywołany wiązką i poprawić rozkład orientacji cząstek. W artykule opisano solidny protokół powlekania siatek krioEM monowarstwą grafenu w celu lepszego przygotowania próbek kriogenicznych.

Zastosowanie jednowarstwowego grafenu w siatkach mikroskopii krioelektronowej do określania struktury w wysokiej rozdzielczości

Ten protokół wideo ilustruje, jak wykonać skaningową tomografię elektronową mikroskopii transmisyjnej na próbkach wirusologicznych. Dla optymalnych rezultatów próbki przygotowuje się przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i późniejszą podstawienie zamrożenia.

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Poznaj metodę przygotowania ciekłych komórek mikrostudzienkowych na bazie grafenu do transmisyjnej mikroskopii elektronowej in situ. Technika umożliwia obserwację dynamiki wzrostu i trawienia nanokryształów złota w czasie rzeczywistym.

Przygotowanie ciekłych komórek mikrostudzienkowych na bazie grafenu do transmisyjnej mikroskopii elektronowej in situ

Przeglądaj więcej filmów