Test komonetacyjności do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami Vibrio fischeri

Nasz protokół zapewnia proste, ale solidne podejście do identyfikacji i scharakteryzowania mechanizmów konkurencji między różnymi szczepami bakterii Vibrio fischeri. Metoda ta wykorzystuje stabilne plazmidy, które kodują różne geny oporności na antybiotyki i białka fluorescencyjne, które pozwalają na różnicową selekcję i wizualną dyskryminację każdego szczepu bakteryjnego w mieszanej kulturze. Na początek użyj sterylnej wykałaczki, aby zeskrobać komórki z płytki agarowej wielkości ziarna ryżu.

Ponownie zawieś komórki w 1,5 mililitrowej probówce mikrowirówkowej zawierającej jeden mililitr bulionu LBS. Aby rozbić grudki komórek, wciśnij je w bok probówki, a następnie energicznie pipetuj w górę iw dół. Zamknij probówkę i wiruj przez jedną do dwóch sekund i powtórz, jeśli grudki komórek są nadal widoczne, aż próbka będzie wizualnie jednolita.

Powtórz te etapy przygotowania, od skrobania komórek do wirowania dla wszystkich próbek. Zmierz i zapisz gęstość optyczną przy 600 nanometrach dla wszystkich próbek. Aby uzyskać dokładny pomiar średnicy zewnętrznej, rozcieńczyć próbki do 10 razy za pomocą bulionu LBS.

Następnie znormalizuj każdą próbkę do żądanego OD 600. Aby wymieszać szczep referencyjny i szczep konkurencji w stosunku jeden do jednego, dodaj 100 mikrolitrów każdego szczepu znormalizowanego do OD 1,0 do oznakowanej 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej i wiruj przez jedną do dwóch sekund. Jako kontrolę, wymieszaj szczep referencyjny z różnie oznaczoną wersją samego siebie, a także wirem.

Bardzo ważne jest, aby osiągnąć prawidłowy współczynnik początkowy, ponieważ może to znacznie zmienić wynik eksperymentu. Aby zapewnić sukces, ten krok może wymagać optymalizacji dla danego gatunku bakterii. Po powtórzeniu tego kroku dla każdej kontrpróby biologicznej powinny istnieć cztery kontrpróby biologiczne ze szczepami referencyjnymi znakowanymi różnicowo jako kontrolami oraz cztery kontrpróby biologiczne ze szczepami referencyjnymi i konkurencyjnymi znakowanymi różnicowo.

Aby uzyskać plamki hodowlane, które zostaną użyte do mikroskopii fluorescencyjnej po inkubacji, dodaj 10 mikrolitrów każdej mieszaniny kontrolnej i doświadczalnej na płytkę Petriego zawierającą agar LBS. Po całkowitym wyschnięciu plam na ławce inkubuj płytki w temperaturze 24 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Aby uzyskać miejsca hodowlane, które zostaną wykorzystane do ilościowego określenia jednostek tworzących kolonie dla każdego szczepu pod koniec eksperymentu, dodaj 10 mikrolitrów każdej mieszaniny kontrolnej i eksperymentalnej do 24 dołków zawierających jeden mililitr agaru LBS na studzienkę.

Po całkowitym wyschnięciu plam inkubuj płytki w temperaturze 24 stopni Celsjusza przez pięć godzin. Aby przeprowadzić seryjne rozcieńczanie początkowych mieszanin do coinkubacji, należy obrócić 96-dołkową płytkę o 90 stopni, tak aby było osiem kolumn i 12 rzędów. Oznacz każdy wiersz identyfikatorem szczepu, numerem repliki i czasem rozpoczynającym się od t zero.

Oznacz płytki agarowe LBS uzupełnione odpowiednim antybiotykiem, na którym można zauważyć serię rozcieńczeń, upewniając się, że zidentyfikowałeś, dla którego szczepu wybierana jest każda płytka z antybiotykiem. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 180 mikrolitrów bulionu LBS do każdej studzienki, pozostawiając pierwszą kolumnę pustą dla nierozcieńczonej mieszaniny do monetkubacji. Za pomocą pipety jednokanałowej o pojemności 200 mikrolitrów przenieś 100 mikrolitrów mieszaniny monetkubacji z probówki do pierwszego dołka pierwszej kolumny, a następnie wyrzuć końcówkę i powtórz dla wszystkich mieszanin do monetkubacji.

Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 20 mikrolitrów z kolumny pierwszej do kolumny drugiej, a następnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Odrzucić końcówki i powtórzyć czynności dla każdej kolumny, zachowując spójność z liczbą pipetowania w górę i w dół dla każdego rozcieńczenia. Pod koniec każdy rząd będzie zawierał 10-krotne seryjne rozcieńczenie początkowej mieszaniny.

Za pomocą pipety wielokanałowej wyposażonej w osiem końcówek odessać pięć mikrolitrów z każdej studzienki w serii rozcieńczeń i umieścić na płytce agarowej LBS uzupełnionej kanamycyną, która wybiera szczep referencyjny. Powtórz ten krok, aby wybrać dla konkurencyjnego szczepu plamienie na płytce z dodatkiem chloramfenikolu. Po całkowitym wyschnięciu plam umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 24 stopni Celsjusza.

Po inkubacji miejsc coincubation i 24-dołkowych płytkach inkubowanych przez pięć godzin w temperaturze 24 stopni Celsjusza, dodaj jeden mililitr bulionu LBS do każdej studzienki. Zawiesić przez pipetowanie w górę i w dół, aż wszystkie komórki zostaną ponownie zawieszone, zgodnie z energią, z jaką komórki są ponownie zawieszane we wszystkich kontrpróbach. Po ponownym zawieszeniu każdego miejsca inkubacji należy przygotować 96-dołkową płytkę do seryjnego rozcieńczania oraz płytki agarowe LBS z odpowiednimi antybiotykami, na których należy wykryć rozcieńczenie w taki sam sposób, jak poprzednio.

Aby zakończyć seryjne rozcieńczanie dla końcowych pomiarów na płytkach 24-dołkowych, należy wykonać kroki stosowane do seryjnego rozcieńczania inokulum wyjściowego i umieścić każde rozcieńczenie na płytkach agarowych LBS, tak jak to miało miejsce wcześniej. Kontynuuj obrazowanie punktów monetkubacji na płytkach Petriego i analizę danych zgodnie z opisem w manuskrypcie. W badaniu eksperymentalnym szczep referencyjny i szczep konkurencyjny jeden są obecne w proporcji 0,5 na początku i na końcu eksperymentu, zgodnie z badaniem kontrolnym.

Wartości logarytmu RCI nie różniły się statystycznie od zera dla badania kontrolnego lub gdy szczep referencyjny był inkubowany z konkurencyjnym szczepem pierwszym. Dane te sugerują, że nie było konkurencji między szczepem referencyjnym a szczepem konkurencyjnym. W przeciwieństwie do tego, gdy szczep referencyjny był inkubowany z drugim szczepem konkurencyjnym, szczep referencyjny zmniejszył się z proporcji 0,5 na początku do proporcji mniejszej niż 0,01 na końcu eksperymentu.

Co więcej, wartości logarytmu RCI były znacznie większe od zera, gdy szczep referencyjny był inkubowany z konkurencyjnym szczepem drugim. Łącznie dane te wskazują, że proporcja szczepu referencyjnego zmniejszyła się w obecności konkurencyjnego szczepu drugiego, co sugeruje konkurencję między szczepami. Gdy szczep referencyjny był inkubowany z konkurencyjnym szczepem pierwszym, CFU obu szczepów wzrosły w ciągu pięciu godzin i nie różniły się znacząco, co sugeruje, że nie wystąpiła żadna konkurencja.

Zaobserwowano również około 3200% odzysku, co nie różniło się statystycznie od grupy kontrolnej. Jednakże, gdy szczep referencyjny był inkubowany z konkurencyjnym szczepem drugim, CFU szczepu referencyjnego były znacznie niższe niż CFU szczepu drugiego w kontroli po pięciu godzinach. Zaobserwowano również około 4% odzysku znacznie mniej niż w grupie kontrolnej.

Ogólnie rzecz biorąc, dane te wskazują, że szczep drugi rywalizował ze szczepem referencyjnym, zabijając jego komórki. Najważniejszym krokiem w tej procedurze jest osiągnięcie prawidłowego przełożenia początkowego, ponieważ może to znacząco wpłynąć na wyniki.