Test komonetacyjności do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami Vibrio fischeri
July 22nd, 2019
Bakterie kodują różne mechanizmy do angażowania się w międzybakteryjną rywalizację. W tym miejscu przedstawiamy oparty na kulturze protokół charakteryzujący konkurencyjne interakcje między izolatami bakteryjnymi i ich wpływ na strukturę przestrzenną populacji mieszanej.
Nasz protokół zapewnia proste, ale solidne podejście do identyfikacji i scharakteryzowania mechanizmów konkurencji między różnymi szczepami bakterii Vibrio fischeri. Metoda ta wykorzystuje stabilne plazmidy, które kodują różne geny oporności na antybiotyki i białka fluorescencyjne, które pozwalają na różnicową selekcję i wizualną dyskryminację każdego szczepu bakteryjnego w mieszanej kulturze. Na początek użyj sterylnej wykałaczki, aby zeskrobać komórki z płytki agarowej wielkości ziarna ryżu.
Ponownie zawieś komórki w 1,5 mililitrowej probówce mikrowirówkowej zawierającej jeden mililitr bulionu LBS. Aby rozbić grudki komórek, wciśnij je w bok probówki, a następnie energicznie pipetuj w górę iw dół. Zamknij probówkę i wiruj przez jedną do dwóch sekund i powtórz, jeśli grudki komórek są nadal widoczne, aż próbka będzie wizualnie jednolita.
Powtórz te etapy przygotowania, od skrobania komórek do wirowania dla wszystkich próbek. Zmierz i zapisz gęstość optyczną przy 600 nanometrach dla wszystkich próbek. Aby uzyskać dokładny pomiar średnicy zewnętrznej, rozcieńczyć próbki do 10 razy za pomocą bulionu LBS.
Następnie znormalizuj każdą próbkę do żądanego OD 600. Aby wymieszać szczep referencyjny i szczep konkurencji w stosunku jeden do jednego, dodaj 100 mikrolitrów każdego szczepu znormalizowanego do OD 1,0 do oznakowanej 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej i wiruj przez jedną do dwóch sekund. Jako kontrolę, wymieszaj szczep referencyjny z różnie oznaczoną wersją samego siebie, a także wirem.
Bardzo ważne jest, aby osiągnąć prawidłowy współczynnik początkowy, ponieważ może to znacznie zmienić wynik eksperymentu. Aby zapewnić sukces, ten krok może wymagać optymalizacji dla danego gatunku bakterii. Po powtórzeniu tego kroku dla każdej kontrpróby biologicznej powinny istnieć cztery kontrpróby biologiczne ze szczepami referencyjnymi znakowanymi różnicowo jako kontrolami oraz cztery kontrpróby biologiczne ze szczepami referencyjnymi i konkurencyjnymi znakowanymi różnicowo.
Aby uzyskać plamki hodowlane, które zostaną użyte do mikroskopii fluorescencyjnej po inkubacji, dodaj 10 mikrolitrów każdej mieszaniny kontrolnej i doświadczalnej na płytkę Petriego zawierającą agar LBS. Po całkowitym wyschnięciu plam na ławce inkubuj płytki w temperaturze 24 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Aby uzyskać miejsca hodowlane, które zostaną wykorzystane do ilościowego określenia jednostek tworzących kolonie dla każdego szczepu pod koniec eksperymentu, dodaj 10 mikrolitrów każdej mieszaniny kontrolnej i eksperymentalnej do 24 dołków zawierających jeden mililitr agaru LBS na studzienkę.
Po całkowitym wyschnięciu plam inkubuj płytki w temperaturze 24 stopni Celsjusza przez pięć godzin. Aby przeprowadzić seryjne rozcieńczanie początkowych mieszanin do coinkubacji, należy obrócić 96-dołkową płytkę o 90 stopni, tak aby było osiem kolumn i 12 rzędów. Oznacz każdy wiersz identyfikatorem szczepu, numerem repliki i czasem rozpoczynającym się od t zero.
Oznacz płytki agarowe LBS uzupełnione odpowiednim antybiotykiem, na którym można zauważyć serię rozcieńczeń, upewniając się, że zidentyfikowałeś, dla którego szczepu wybierana jest każda płytka z antybiotykiem. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 180 mikrolitrów bulionu LBS do każdej studzienki, pozostawiając pierwszą kolumnę pustą dla nierozcieńczonej mieszaniny do monetkubacji. Za pomocą pipety jednokanałowej o pojemności 200 mikrolitrów przenieś 100 mikrolitrów mieszaniny monetkubacji z probówki do pierwszego dołka pierwszej kolumny, a następnie wyrzuć końcówkę i powtórz dla wszystkich mieszanin do monetkubacji.
Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 20 mikrolitrów z kolumny pierwszej do kolumny drugiej, a następnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Odrzucić końcówki i powtórzyć czynności dla każdej kolumny, zachowując spójność z liczbą pipetowania w górę i w dół dla każdego rozcieńczenia. Pod koniec każdy rząd będzie zawierał 10-krotne seryjne rozcieńczenie początkowej mieszaniny.
Za pomocą pipety wielokanałowej wyposażonej w osiem końcówek odessać pięć mikrolitrów z każdej studzienki w serii rozcieńczeń i umieścić na płytce agarowej LBS uzupełnionej kanamycyną, która wybiera szczep referencyjny. Powtórz ten krok, aby wybrać dla konkurencyjnego szczepu plamienie na płytce z dodatkiem chloramfenikolu. Po całkowitym wyschnięciu plam umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 24 stopni Celsjusza.
Po inkubacji miejsc coincubation i 24-dołkowych płytkach inkubowanych przez pięć godzin w temperaturze 24 stopni Celsjusza, dodaj jeden mililitr bulionu LBS do każdej studzienki. Zawiesić przez pipetowanie w górę i w dół, aż wszystkie komórki zostaną ponownie zawieszone, zgodnie z energią, z jaką komórki są ponownie zawieszane we wszystkich kontrpróbach. Po ponownym zawieszeniu każdego miejsca inkubacji należy przygotować 96-dołkową płytkę do seryjnego rozcieńczania oraz płytki agarowe LBS z odpowiednimi antybiotykami, na których należy wykryć rozcieńczenie w taki sam sposób, jak poprzednio.
Aby zakończyć seryjne rozcieńczanie dla końcowych pomiarów na płytkach 24-dołkowych, należy wykonać kroki stosowane do seryjnego rozcieńczania inokulum wyjściowego i umieścić każde rozcieńczenie na płytkach agarowych LBS, tak jak to miało miejsce wcześniej. Kontynuuj obrazowanie punktów monetkubacji na płytkach Petriego i analizę danych zgodnie z opisem w manuskrypcie. W badaniu eksperymentalnym szczep referencyjny i szczep konkurencyjny jeden są obecne w proporcji 0,5 na początku i na końcu eksperymentu, zgodnie z badaniem kontrolnym.
Wartości logarytmu RCI nie różniły się statystycznie od zera dla badania kontrolnego lub gdy szczep referencyjny był inkubowany z konkurencyjnym szczepem pierwszym. Dane te sugerują, że nie było konkurencji między szczepem referencyjnym a szczepem konkurencyjnym. W przeciwieństwie do tego, gdy szczep referencyjny był inkubowany z drugim szczepem konkurencyjnym, szczep referencyjny zmniejszył się z proporcji 0,5 na początku do proporcji mniejszej niż 0,01 na końcu eksperymentu.
Co więcej, wartości logarytmu RCI były znacznie większe od zera, gdy szczep referencyjny był inkubowany z konkurencyjnym szczepem drugim. Łącznie dane te wskazują, że proporcja szczepu referencyjnego zmniejszyła się w obecności konkurencyjnego szczepu drugiego, co sugeruje konkurencję między szczepami. Gdy szczep referencyjny był inkubowany z konkurencyjnym szczepem pierwszym, CFU obu szczepów wzrosły w ciągu pięciu godzin i nie różniły się znacząco, co sugeruje, że nie wystąpiła żadna konkurencja.
Zaobserwowano również około 3200% odzysku, co nie różniło się statystycznie od grupy kontrolnej. Jednakże, gdy szczep referencyjny był inkubowany z konkurencyjnym szczepem drugim, CFU szczepu referencyjnego były znacznie niższe niż CFU szczepu drugiego w kontroli po pięciu godzinach. Zaobserwowano również około 4% odzysku znacznie mniej niż w grupie kontrolnej.
Ogólnie rzecz biorąc, dane te wskazują, że szczep drugi rywalizował ze szczepem referencyjnym, zabijając jego komórki. Najważniejszym krokiem w tej procedurze jest osiągnięcie prawidłowego przełożenia początkowego, ponieważ może to znacząco wpłynąć na wyniki.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół oparty na kulturze do charakteryzacji interakcji konkurencyjnych między izolatami bakteryjnymi, w szczególności Vibrio fischeri. Metoda ta pozwala badaczom na zbadanie, jak te interakcje wpływają na strukturę przestrzenną mieszanych populacji bakteryjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Konkurencja międzybakteryjna
- Techniki hodowania komórek
Tło
- Bakterie wykorzystują różne mechanizmy do konkurencji.
- Zrozumienie tych mechanizmów może dać wgląd w ekologię mikrobową.
- Charakteryzowanie interakcji może pomóc w badaniu dynamiki populacji.
- Fluoryzujące białka i geny odporności na antybiotyki są używane do różnicowania.
Cel badania
- Aby zidentyfikować mechanizmy konkurencji między szczepami bakteryjnymi.
- Aby ocenić wpływ tych interakcji na strukturę populacji.
- Aby zapewnić niezawodny protokół dla badaczy w dziedzinie mikrobiologii.
Stosowane metody
- Użycie stabilnych plazmidów kodujących odporność na antybiotyki i białka fluoryzujące.
- Zdrapki komórek z płytek agarowych i resuspendowanie w bulionie.
- Mieszanie w wiryżercie i pipetowanie w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny komórek.
- Wizyjne rozróżnianie szczepów w mieszanych kulturach.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie różnicuje między szczepami bakteryjnymi.
- Interakcje konkurencyjne mogą być charakteryzowane w ustawieniach mieszanej kultury.
- Struktura przestrzenna populacji jest wpłynięta przez te interakcje.
- Wyniki mogą informować dalsze badania nad ekologią bakteryjną.
Wnioski
- Przedstawiona metoda jest prosta i niezawodna do badania konkurencji bakteryjnej.
- Zwiększa zrozumienie dynamiki międzybakteryjnej.
- Przyszłe badania mogą budować na tych odkryciach, aby zbadać ekologiczne implikacje.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This coincubation assay enables biopharma R&D teams to quantitatively assess competitive interactions between bacterial strains, supporting target validation in antimicrobial discovery. By distinguishing bactericidal versus bacteriostatic outcomes and contact-dependent versus diffusible mechanisms, the method provides mechanistic de-risking early in lead identification. The assay’s compatibility with fluorescent tagging and antibiotic selection allows integration into high-throughput screening workflows for prioritizing compounds that modulate interbacterial competition.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying strain-specific competitive outcomes in co-culture.
- Operational Value: Uses dual fluorescent and antibiotic markers for unambiguous discrimination of competing populations without genetic manipulation of native traits.
- Predictive Value: Distinguishes killing from growth inhibition, informing mechanism-of-action classification for antimicrobial candidates.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative CFU recovery and spatial imaging data suitable for automation in multi-well formats.
- Reproducibility: Standardized starting ratios and serial dilution protocols ensure consistent quantification across biological replicates.
- Scalability: Compatible with 24-well and 96-well plate formats for dose-response or strain-panel screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports evaluation of antimicrobial candidates in pathogen-competitor co-culture models that mimic niche environments.
- Translational Continuity: Links in vitro competition outcomes to predictive confidence in in vivo efficacy by identifying strains with competitive dominance.
- Risk Mitigation: Identifies false positives where apparent activity stems from competitive exclusion rather than direct antimicrobial action.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, informing lead identification by validating whether observed antimicrobial effects result from direct compound action or altered competitive fitness.
- Discovery Biology: Tests target engagement by measuring shifts in strain proportions under competitive pressure, de-risking mechanism-based hypotheses.
- Screening: Outputs CFU counts and fluorescence ratios as quantitative endpoints for hit confirmation and structure-activity relationship studies.
- Analytics: Log RCI calculations provide normalized, statistically comparable metrics for cross-condition benchmarking.
- Translational Research: Enables assessment of whether lead compounds shift competitive balance in favor of desired microbiota, supporting microbiome-modulating therapeutic strategies.
- Enterprise Reuse: Plasmid-based tagging system allows reuse across multiple bacterial species with minimal reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in antimicrobial screening by distinguishing direct inhibition from competitive exclusion.
- Operational Value: Employs widely accessible tools (fluorescence microscopy, plate readers, standard antibiotics) minimizing specialized equipment needs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by validating target-mediated effects in ecologically relevant contexts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of leads that demonstrate specific competitive modulation over broad cytotoxicity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial culture, fluorescence microscopy, and CFU quantification techniques.
- Dependent on availability of fluorescent protein and antibiotic resistance plasmids compatible with target strains.
- Necessitates optimization of starting OD ratios for each strain pair to ensure accurate competitive fitness measurements.
- Adaptation to new species may require validation of plasmid stability and antibiotic selection efficacy.
- Practical limitation: Assay duration (5–24 hours) may not capture slow-acting or biofilm-mediated competitive mechanisms.
