Name: Test komonetacyjności do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami Vibrio fischeri (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Poznaj metodę testu komonetacyjnego do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami Vibrio fischeri. Protokół wykorzystuje plazmidy z genami oporności na antybiotyki i białkami fluorescencyjnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować recenzentom za ich pomocne opinie. A.N.S. było wspierane przez Fundację Gordona i Betty Moore poprzez Grant GBMF 255.03 dla Fundacji Badań Nauk Przyrodniczych.

<ol><li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+competition%3A+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).</li>
<li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+winnowing%3A+establishing+the+squid-Vibrio+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).</li>
<li>Dörr, N. C. D., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+type+VI+secretion+system+facilitates+niche+domination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).</li>
<li>Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vibrio+cholerae+type+VI+secretion+system+displays+antimicrobial+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).</li>
<li>Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+parahaemolyticus+type+VI+secretion+system+1+is+activated+in+marine+conditions+to+target+bacteria%2C+and+is+differentially+regulated+from+system+2%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2.</a> PloS One. 8 (4), e61086(2013).</li>
<li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+Typhimurium+utilizes+a+T6SS-mediated+antibacterial+weapon+to+establish+in+the+host+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).</li>
<li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068(2010).</li>
<li>Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+independent+pathways+for+self-recognition+in+Proteus+mirabilis+are+linked+by+type+VI-dependent+export%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export.</a> MBio. 4 (4), (2013).</li>
<li>García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-dependent+killing+by+Caulobacter+crescentus+via+cell+surface-associated%2C+glycine+zipper+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins.</a> Elife. 6, 24869(2017).</li>
<li>Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+interfaces+of+bacterial+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Multifaceted interfaces of bacterial competition.</a> Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).</li>
<li>Cornforth, D. M., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics+and+the+art+of+bacterial+war%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Antibiotics and the art of bacterial war.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).</li>
<li>Shank, E. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+microbial+interspecies+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New developments in microbial interspecies signaling.</a> Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).</li>
<li>Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteroidales+secreted+antimicrobial+proteins+target+surface+molecules+necessary+for+gut+colonization+and+mediate+competition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo.</a> MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).</li>
<li>Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sibling+rivalry+in+Myxococcus+xanthus+is+mediated+by+kin+recognition+and+a+polyploid+prophage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage.</a> Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).</li>
<li>Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+CDI+systems+multicolored%2C+facultative%2C+helping+greenbeards%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards?</a> Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).</li>
<li>Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-dependent+growth+inhibition+%28CDI%29+and+CdiB%2FCdiA+two-partner+secretion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins.</a> Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).</li>
<li>Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aim%2C+load%2C+fire%3A+the+type+VI+secretion+system%2C+a+bacterial+nanoweapon%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon.</a> Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).</li>
<li>Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rules+of+engagement%3A+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae.</a> Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).</li>
<li>Speare, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+symbionts+use+a+type+VI+secretion+system+to+eliminate+competitors+in+their+natural+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).</li>
<li>Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+coculture+to+detect+chemically+mediated+interspecies+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li>
<li>Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+interactions+among+marine+bacteria+impede+the+proliferation+of+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).</li>
<li>Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+rfp-and+pES213-derived+tools+for+analyzing+symbiotic+Vibrio+fischeri+reveal+patterns+of+infection+and+lux+expression+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).</li>
<li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+type+VI+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa+strain+PAO1+is+regulated+by+quorum+sensing+and+Fur+and+modulates+internalization+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).</li>
<li>Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+salts+modulate+the+mucin-activated+type+VI+secretion+system+of+pandemic+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS%22%5BJournal%5D)">Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae.</a> PLoS. 9 (8), e0004031(2015).</li>
<li>Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing+regulation+of+the+two+hcp+alleles+in+Vibrio+cholerae+O1+strains%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains.</a> PloS One. 4 (8), e6734(2009).</li>
<li>Ishikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathoadaptive+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae+O1+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains.</a> Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).</li>
<li>Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+Vibrio+fischeri+requires+tfoX+and+tfoY%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY.</a> Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).</li>
<li>Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitin+induces+natural+competence+in+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae.</a> Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).</li>
<li>Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+VI+secretion+system+of+Vibrio+cholerae+fosters+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer.</a> Science. 347 (6217), 63-67 (2015).</li>
<li>Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Vibrio+cholerae+to+low-temperature+shift%3A+CpsV+regulates+type+VI+secretion%2C+biofilm+formation%2C+and+association+with+zooplankton%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+and+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+fluvialis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis.</a> Frontiers in microbiology. 8, 528(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany powyżej test komonetyzacyjnej stanowi potężną metodę wykrywania konkurencji międzybakteryjnej. Podejście to pozwoliło na identyfikację konkurencji wewnątrzgatunkowej wśród izolatów V. fischeri i scharakteryzowanie mechanizmu konkurencji19. Chociaż opisana metoda została zoptymalizowana pod kątem bakterii morskiej V. fischeri, można ją łatwo zmodyfikować, aby uwzględnić inne gatunki bakterii, w tym izolaty kliniczne i środowiskowe. Ważne jest, aby zauważyć, że mechanizmy k...

Ten manuskrypt przedstawia metodę opartą na hodowli, która pozwala określić, czy dwa izolaty bakteryjne są zdolne do konkurencyjnych interakcji. Podczas badania populacji mieszanych ważne jest, aby ocenić stopień, w jakim izolaty bakteryjne oddziałują na siebie, w szczególności czy izolaty bezpośrednio konkurują ze sobą poprzez mechanizmy interferencyjne. Konkurencja interferencyjna odnosi się do interakcji, w których jedna populacja bezpośrednio hamuje wzrost lub zabija populację konkurenta1. Identyfikacja tych interakcji jest ważna, ponieważ mogą one mieć głęboki wpływ na strukturę i funkcję społeczności drobnoustrojów2,3.
Mechanizmy konkurencji mikrobiologicznej zostały szeroko odkryte w genomach bakterii z różnych środowisk, w tym zarówno bakterii związanych z gospodarzem, jak i wolno żyjących4,5,6,7,8,9. Opisano różne strategie konkurencji10,11, w tym mechanizmy dyfuzyjne, takie jak bakteriobójcze chemikalia1,12 i wydzielane peptydy przeciwdrobnoustrojowe13, a także mechanizmy zależne od kontaktu, które wymagają kontaktu komórka-komórka, aby przenieść efekt hamujący do komórek docelowych9,14,15,16,17,18.
Chociaż coinkubacje oparte na kulturach są powszechnie używane w mikrobiologii5,8,19, ten manuskrypt opisuje, jak wykorzystać test do scharakteryzowania mechanizmu konkurencji, a także sugestie dotyczące dostosowania protokołu do stosowania z innymi gatunkami bakterii. Ponadto metoda ta opisuje wiele podejść do analizy i prezentacji danych, aby odpowiedzieć na różne pytania dotyczące natury interakcji konkurencyjnych. Chociaż opisane tutaj techniki były wcześniej używane do identyfikacji międzybakteryjnego mechanizmu zabijania leżącego u podstaw wewnątrzgatunkowej konkurencji między symbiotycznymi szczepami koizolowanych bakterii Vibrio fischeri19, są one odpowiednie dla wielu gatunków bakterii, w tym izolatów środowiskowych i ludzkich patogenów, i mogą być wykorzystane do oceny zarówno zależnych od kontaktu, jak i dyfuzyjnych mechanizmów konkurencyjnych. Kroki w protokole mogą wymagać optymalizacji pod kątem innych gatunków bakterii. Biorąc pod uwagę, że coraz więcej systemów modelowych rozszerza swoje badania poza wykorzystanie organizmów izogenicznych, aby objąć różne genotypy10,16,20,21, metoda ta będzie cennym źródłem informacji dla badaczy chcących zrozumieć, w jaki sposób konkurencja wpływa na systemy wieloszczepowe lub wielogatunkowe.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; Pipeta</td><td></td><td></td><td></td>wielokanałowa L</tr><tr><td>100 &mu; Pipeta</td><td></td><td></td><td></td>wielokanałowa L</tr><tr><td>300 &mu; Pipeta</td><td></td><td></td><td></td>wielokanałowa L</tr><tr><td>10 &mu; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td>jednokanałowa</tr><tr><td>20 &mu; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td>jednokanałowa</tr><tr><td>200 &mu; Pipeta</td><td></td><td></td><td></td>jednokanałowa L</tr><tr><td>1 000 &mu; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td>jednokanałowa</tr><tr><td>24-dołkowa płytki</td><td>Fisher</td><td>07-200-84</td><td>sterylna z pokrywką</td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe</td><td>VWR</td><td>10062-900</td><td>sterylne z pokrywką</td></tr><tr><td>Kalkulator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>zapas (20 mg/ml w etanolu); końcowe stężenie w pożywkach (2 &mu; g / mL LBS)</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop preparacyjny z kamerą i oprogramowaniem</td><td></td><td></td><td></td>do obrazowania</tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fisher</td><td>08-880</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan Kanamycyny</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td>zapas (100 mg/ml w wodzie, sterylizacja filtra); końcowe stężenie w pożywkach (1 &mu; g/mL LBS)</td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa (FS MCE, 25MM, NS)</td><td>Fisher</td><td>SA1J788H5</td><td>0,22 &mu; m membrana nitrocelulozowa (PK 100)</td></tr><tr><td>Płytki Petriego</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td>sterylne z pokrywką</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuwety półmikro</td><td>VWR</td><td>97000-586</td><td></td></tr><tr><td>TipOne 0,1-10 &mu; L system startowy</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3500</td><td>10 stojaków</td></tr><tr><td>TipOne 200 &mu; L system startowy</td><td>USA Scientific</td><td>1111-500</td><td>10 stojaków</td></tr><tr><td>TipOne 1000 &mu; L system startowy</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2520</td><td>10 stojaków</td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>LBS media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris Buffer (pH ~7,5)</td><td></td><td></td><td>50 ml 1 M bufor podstawowy (62 ml HCl, 938 ml wody DI, 121 g bazy Trizma)</td></tr><tr><td>Agar Technical</td><td>Fisher</td><td>DF0812-17-9</td><td>15 g (Dodaj tylko do talerzy)</td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td> DI <td>950 ml</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher</td><td>S640-3</td><td>20 g</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Fisher</td><td>BP97265</td><td>10 g</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Fisher</td><td>BP9727-2</td><td>5 g</td></tr></tbody></table>

test komonetacyjności do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami vibrio fischeri

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Ten manuskrypt opisuje oparty na kulturze, komonetyczny test do wykrywania i charakteryzowania konkurencyjnych interakcji między dwiema populacjami bakterii. Metoda ta wykorzystuje stabilne plazmidy, które pozwalają na zróżnicowane znakowanie każdej populacji z odrębnymi zdolnościami w zakresie oporności na antybiotyki i białkami fluorescencyjnymi do selekcji i wizualnej dyskryminacji każdej populacji. W tym miejscu opisujemy przygotowanie i komonetację konkurencyjnych szczepów Vibrio fischeri, obrazowanie mikroskopią fluorescencyjną oraz analizę danych ilościowych. Podejście to jest proste, daje szybkie wyniki i może być wykorzystane do określenia, czy jedna populacja zabija lub hamuje wzrost innej populacji oraz czy konkurencja odbywa się za pośrednictwem dyfuzyjnej cząsteczki, czy też wymaga bezpośredniego kontaktu komórka-komórka. Ponieważ każda populacja bakterii wyraża inne białko fluorescencyjne, test pozwala na przestrzenną dyskryminację konkurujących populacji w obrębie mieszanej kolonii. Chociaż opisane metody są wykonywane na symbiotycznej bakterii V. fischeri w warunkach zoptymalizowanych dla tego gatunku, protokół można dostosować do większości kulturowych izolatów bakteryjnych.

W celu oceny oddziaływań konkurencyjnych między populacjami bakterii opracowano i zoptymalizowano protokół testu współinkubacji dla V. fischeri. Metoda ta wykorzystuje stabilne plazmidy kodujące geny oporności na antybiotyki oraz białka fluorescencyjne, co pozwala na różnicową selekcję i wizualne rozróżnienie poszczególnych szczepów. Analiza danych zebranych w teście współinkubacji umożliwia określenie wyniku konkurencyjnego oddziaływania oraz mechanizmu tego procesu. Przykładowo...

Bakterie kodują różne mechanizmy do angażowania się w międzybakteryjną rywalizację. W tym miejscu przedstawiamy oparty na kulturze protokół charakteryzujący konkurencyjne interakcje między izolatami bakteryjnymi i ich wpływ na strukturę przestrzenną populacji mieszanej.

Test komonetacyjności do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami Vibrio fischeri

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

Nasz protokół zapewnia proste, ale solidne podejście do identyfikacji i scharakteryzowania mechanizmów konkurencji między różnymi szczepami bakterii Vibrio fischeri. Metoda ta wykorzystuje stabilne plazmidy, które kodują różne geny oporności na antybiotyki i białka fluorescencyjne, które pozwalają na różnicową selekcję i wizualną dyskryminację każdego szczepu bakteryjnego w mieszanej kulturze. Na początek użyj sterylnej wykałaczki, aby zeskrobać komórki z płytki agarowej wielkości ziarna ryżu.Ponownie zawieś komórki w 1,5 mililitrowej probówce mikrowirówkowej zawierającej jeden mililitr bulionu LBS. Aby rozbić grudki komórek, wciśnij je w bok probówki, a następnie energicznie pipetuj w górę iw dół. Zamknij probówkę i wiruj przez jedną do dwóch sekund i powtórz, jeśli grudki komórek są nadal widoczne, aż próbka będzie wizualnie jednolita.Powtórz te etapy przygotowania, od skrobania komórek do wirowania dla wszystkich próbek. Zmierz i zapisz gęstość optyczną przy 600 nanometrach dla wszystkich próbek. Aby uzyskać dokładny pomiar średnicy zewnętrznej, rozcieńczyć próbki do 10 razy za pomocą bulionu LBS.Następnie znormalizuj każdą próbkę do żądanego OD 600. Aby wymieszać szczep referencyjny i szczep konkurencji w stosunku jeden do jednego, dodaj 100 mikrolitrów każdego szczepu znormalizowanego do OD 1,0 do oznakowanej 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej i wiruj przez jedną do dwóch sekund. Jako kontrolę, wymieszaj szczep referencyjny z różnie oznaczoną wersją samego siebie, a także wirem.Bardzo ważne jest, aby osiągnąć prawidłowy współczynnik początkowy, ponieważ może to znacznie zmienić wynik eksperymentu. Aby zapewnić sukces, ten krok może wymagać optymalizacji dla danego gatunku bakterii. Po powtórzeniu tego kroku dla każdej kontrpróby biologicznej powinny istnieć cztery kontrpróby biologiczne ze szczepami referencyjnymi znakowanymi różnicowo jako kontrolami oraz cztery kontrpróby biologiczne ze szczepami referencyjnymi i konkurencyjnymi znakowanymi różnicowo.Aby uzyskać plamki hodowlane, które zostaną użyte do mikroskopii fluorescencyjnej po inkubacji, dodaj 10 mikrolitrów każdej mieszaniny kontrolnej i doświadczalnej na płytkę Petriego zawierającą agar LBS. Po całkowitym wyschnięciu plam na ławce inkubuj płytki w temperaturze 24 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Aby uzyskać miejsca hodowlane, które zostaną wykorzystane do ilościowego określenia jednostek tworzących kolonie dla każdego szczepu pod koniec eksperymentu, dodaj 10 mikrolitrów każdej mieszaniny kontrolnej i eksperymentalnej do 24 dołków zawierających jeden mililitr agaru LBS na studzienkę.Po całkowitym wyschnięciu plam inkubuj płytki w temperaturze 24 stopni Celsjusza przez pięć godzin. Aby przeprowadzić seryjne rozcieńczanie początkowych mieszanin do coinkubacji, należy obrócić 96-dołkową płytkę o 90 stopni, tak aby było osiem kolumn i 12 rzędów. Oznacz każdy wiersz identyfikatorem szczepu, numerem repliki i czasem rozpoczynającym się od t zero.Oznacz płytki agarowe LBS uzupełnione odpowiednim antybiotykiem, na którym można zauważyć serię rozcieńczeń, upewniając się, że zidentyfikowałeś, dla którego szczepu wybierana jest każda płytka z antybiotykiem. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 180 mikrolitrów bulionu LBS do każdej studzienki, pozostawiając pierwszą kolumnę pustą dla nierozcieńczonej mieszaniny do monetkubacji. Za pomocą pipety jednokanałowej o pojemności 200 mikrolitrów przenieś 100 mikrolitrów mieszaniny monetkubacji z probówki do pierwszego dołka pierwszej kolumny, a następnie wyrzuć końcówkę i powtórz dla wszystkich mieszanin do monetkubacji.Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 20 mikrolitrów z kolumny pierwszej do kolumny drugiej, a następnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Odrzucić końcówki i powtórzyć czynności dla każdej kolumny, zachowując spójność z liczbą pipetowania w górę i w dół dla każdego rozcieńczenia. Pod koniec każdy rząd będzie zawierał 10-krotne seryjne rozcieńczenie początkowej mieszaniny.Za pomocą pipety wielokanałowej wyposażonej w osiem końcówek odessać pięć mikrolitrów z każdej studzienki w serii rozcieńczeń i umieścić na płytce agarowej LBS uzupełnionej kanamycyną, która wybiera szczep referencyjny. Powtórz ten krok, aby wybrać dla konkurencyjnego szczepu plamienie na płytce z dodatkiem chloramfenikolu. Po całkowitym wyschnięciu plam umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 24 stopni Celsjusza.Po inkubacji miejsc coincubation i 24-dołkowych płytkach inkubowanych przez pięć godzin w temperaturze 24 stopni Celsjusza, dodaj jeden mililitr bulionu LBS do każdej studzienki. Zawiesić przez pipetowanie w górę i w dół, aż wszystkie komórki zostaną ponownie zawieszone, zgodnie z energią, z jaką komórki są ponownie zawieszane we wszystkich kontrpróbach. Po ponownym zawieszeniu każdego miejsca inkubacji należy przygotować 96-dołkową płytkę do seryjnego rozcieńczania oraz płytki agarowe LBS z odpowiednimi antybiotykami, na których należy wykryć rozcieńczenie w taki sam sposób, jak poprzednio.Aby zakończyć seryjne rozcieńczanie dla końcowych pomiarów na płytkach 24-dołkowych, należy wykonać kroki stosowane do seryjnego rozcieńczania inokulum wyjściowego i umieścić każde rozcieńczenie na płytkach agarowych LBS, tak jak to miało miejsce wcześniej. Kontynuuj obrazowanie punktów monetkubacji na płytkach Petriego i analizę danych zgodnie z opisem w manuskrypcie. W badaniu eksperymentalnym szczep referencyjny i szczep konkurencyjny jeden są obecne w proporcji 0,5 na początku i na końcu eksperymentu, zgodnie z badaniem kontrolnym.Wartości logarytmu RCI nie różniły się statystycznie od zera dla badania kontrolnego lub gdy szczep referencyjny był inkubowany z konkurencyjnym szczepem pierwszym. Dane te sugerują, że nie było konkurencji między szczepem referencyjnym a szczepem konkurencyjnym. W przeciwieństwie do tego, gdy szczep referencyjny był inkubowany z drugim szczepem konkurencyjnym, szczep referencyjny zmniejszył się z proporcji 0,5 na początku do proporcji mniejszej niż 0,01 na końcu eksperymentu.Co więcej, wartości logarytmu RCI były znacznie większe od zera, gdy szczep referencyjny był inkubowany z konkurencyjnym szczepem drugim. Łącznie dane te wskazują, że proporcja szczepu referencyjnego zmniejszyła się w obecności konkurencyjnego szczepu drugiego, co sugeruje konkurencję między szczepami. Gdy szczep referencyjny był inkubowany z konkurencyjnym szczepem pierwszym, CFU obu szczepów wzrosły w ciągu pięciu godzin i nie różniły się znacząco, co sugeruje, że nie wystąpiła żadna konkurencja.Zaobserwowano również około 3200% odzysku, co nie różniło się statystycznie od grupy kontrolnej. Jednakże, gdy szczep referencyjny był inkubowany z konkurencyjnym szczepem drugim, CFU szczepu referencyjnego były znacznie niższe niż CFU szczepu drugiego w kontroli po pięciu godzinach. Zaobserwowano również około 4% odzysku znacznie mniej niż w grupie kontrolnej.Ogólnie rzecz biorąc, dane te wskazują, że szczep drugi rywalizował ze szczepem referencyjnym, zabijając jego komórki. Najważniejszym krokiem w tej procedurze jest osiągnięcie prawidłowego przełożenia początkowego, ponieważ może to znacząco wpłynąć na wyniki.

coincubation-assay-for-quantifying-competitive-interactions-between

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Speare, L., et al. Test komonetacyjności do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami Vibrio fischeri.  J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia test współinkubacji używany do badania, w jaki sposób szczepy bakteryjne konkurują ze sobą we wspólnym środowisku. Jest szeroko stosowany w mikrobiologii do identyfikacji mechanizmów, takich jak zabijanie zależne od kontaktu lub niezależne od kontaktu, które napędzają te interakcje.

Test Coincubation do badania konkurencyjnych interakcji między szczepami bakterii

Źródło: Brumfield, K. D. i in. Techniki laboratoryjne stosowane do utrzymania i rozróżniania biotypów Vibrio cholerae Izolat kliniczne i środowiskowe. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje miękki test agarowy z użyciem chlorku triphenyltetrazolu do oceny i porównania ruchliwości szczepów Vibrio cholerae poprzez wizualizację aktywności metabolycznej poprzez formowanie się strefy czerwonej wokół aktywnie migrujących komórek.

Test ruchliwości do porównywania szczepów Vibrio cholerae z użyciem chlorku trifenyltetrazolu

Źródło: Brumfield, K. D. i in., Techniki laboratoryjne stosowane do utrzymania i różnicowania biotypów Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates. J. Vis. Exp. (2017).Ten film demonstruje test Voges-Proskauer (VP) mający na celu rozróżnienie trzech biotypów Vibrio cholerae: klasycznego, dzikiego typu El Tor oraz wariantu El Tor. Każda hodowla jest zaszczepiana w podłożu zawierającym glukozę, inkubowana i traktowana α-naftolem i wodorotlenkiem potasu, aby wykryć obecność acetonu.

Badanie Voges-Proskauer do rozróżniania biotypów Vibrio cholerae

Źródło: Nag, D. i inni. Ilościowe określenie kolonizacji i biegunki Vibrio cholerae w modelu dorosłych danio dano. J. Vis. Exp. (2018)Ten film prezentuje protokół mającycy mierzenie obciążenia bakteryjnego jelitowego u dorosłych danio zakażonych antybiotykoopornym szczepem Vibrio cholerae. Po eutanazji i sekcji przewód jelitowy jest izolowany, ujednolicany szklanymi kulkami i przetwarzany w celu uwolnienia bakterii. Powstały homogenat jest nakładany na selektywne ośrodko, a niebieskobiałe...

Ilościowa analiza obciążenia bakteryjnego jelitowego u danio pręgowanego Vibrio cholerae

Ten film demonstruje metodę opartą na mikroskopii fluorescencyjnej do badania konkurencji bakterii na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta dostarcza informacji na temat struktury i funkcji społeczności bakteryjnych.

Test koinkubacji bakterii: technika oparta na mikroskopii fluorescencyjnej do wizualizacji wewnątrzgatunkowej konkurencji bakteryjnej na poziomie pojedynczej komórki

Opisujemy jakościowy test do monitorowania konkurencji bakteryjnej, w której pośredniczy system sekrecji Pseudomonas aeruginosa typu VI (T6SS). Test opiera się na przeżyciu/zabiciu komórek docelowych Escherichia coli zawierających lacZ-reporter. Technika ta jest regulowana w celu oceny aktywności bakteriobójczej/bakteriostazy mikroorganizmów biegłych w T6SS.

Test wizualny do monitorowania konkurencji bakteryjnej za pośrednictwem T6SS

Przyczepienie się bakterii do komórek gospodarza jest kluczowym krokiem podczas kolonizacji i infekcji gospodarza. Protokół ten opisuje wytwarzanie rekombinowanych adhezyn sprzężonych z polimerami jako materiałów biomimetycznych, które umożliwiają analizę udziału poszczególnych adhezyn w tych procesach, niezależnie od innych czynników bakteryjnych.

Materiały biomimetyczne do charakteryzowania interakcji bakteria-gospodarz

Wykrywanie i izolacja klinicznie istotnych gatunków Vibrio wymaga selektywnych i zróżnicowanych pożywek hodowlanych. W badaniu tym oceniono zdolność nowej pożywki chromogennej do wykrywania i identyfikacji V. parahaemolyticus i innych pokrewnych gatunków. Okazało się, że nowe podłoże ma lepszą czułość i swoistość niż konwencjonalne podłoże.

Opracowanie bardziej czułego i specyficznego chromogennego podłoża agarowego do wykrywania Vibrio parahaemolyticus i innych gatunków Vibrio

Ten manuskrypt opisuje prawidłowe techniki utrzymania Vibrio cholerae wraz z serią testów biochemicznych, wspólnie wykorzystywanych do szybkiego i niezawodnego rozróżniania klinicznego i środowiskowego V.  biotypy w warunkach laboratoryjnych.

Techniki laboratoryjne stosowane do utrzymania i różnicowania biotypów izolatów klinicznych i środowiskowych Vibrio cholerae

Ten manuskrypt opisuje metodę wykorzystania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej komórki do wizualizacji i ilościowego określenia konkurencji bakterii w kokulturze.

Kwantyfikacja konkurencji międzybakteryjnej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego pojedynczych komórek

Poznaj metodę testu komonetacyjnego do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami Vibrio fischeri. Protokół wykorzystuje plazmidy z genami oporności na antybiotyki i białkami fluorescencyjnymi.

Test komonetacyjności do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami Vibrio fischeri

Przeglądaj więcej filmów