Podwójnie humanizowany model myszy BLT ze stabilnym mikrobiomem jelitowym podobnym do ludzkiego i ludzkim układem odpornościowym

Nasz protokół jest znaczący, ponieważ można go wykorzystać do powtarzalnego tworzenia myszy zarówno z ludzkim mikrobiomem jelitowym, jak i ludzkim układem odpornościowym. Nazywamy te myszy podwójnie humanizowanymi myszami. Podwójnie humanizowany model myszy może być wykorzystywany zarówno do podstawowych, jak i translacyjnych badań biomedycznych, w tym do badania relacji in vivo między ludzkim mikrobiomem jelitowym a ludzkim układem odpornościowym.

Procedurę zademonstrują Jianshui Zhang, doktorant podoktorski i Yilun Chang, doktorant z naszego laboratorium. Aby wszczepić tkanki wątroby i grasicy do lewej torebki nerkowej, najpierw umieść mysz w kapturze. W dniu operacji należy potraktować myszy subletalnym napromienianiem całego ciała w dawce 12 centygrai na gram masy ciała.

Ogol każdą mysz wokół lewej bocznej i przyśrodkowej strony po potwierdzeniu odpowiedniego poziomu sedacji. Nałóż maść okulistyczną na oczy zwierzęcia i w razie potrzeby załóż kolczyk do ucha. Zdezynfekuj skórę trzema sekwencyjnymi peelingami jodowymi i 70% izopropanolem.

Po przygotowaniu skóry użyj kleszczy, aby załadować od jednego do sześciu milimetrów sześciennych ludzkiego fragmentu tkanki wątroby płodu do trokaru, a następnie jeden do 1,6 milimetra sześciennego fragmentu ludzkiej tkanki grasicy płodowej. Użyj kleszczy, aby podnieść skórę i użyj skalpela, aby wykonać małe podłużne nacięcie w skórze. Przedłuż cięcie do 1,5 do dwóch centymetrów po lewej stronie myszy.

I użyj kleszczy, aby podnieść warstwę mięśni. Za pomocą nożyczek otwórz warstwę mięśniową wzdłużnie, przedłużając nacięcie w razie potrzeby, aby odsłonić nerkę i delikatnie chwyć tkankę tłuszczową otaczającą nerkę. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie o długości od jednego do dwóch milimetrów na tylnym końcu torebki nerkowej i powoli włóż wstępnie załadowany trokar do nacięcia równoległego do długiej osi nerki.

Uwolnij tkanki między torebką nerkową a nerką i przywróć nerkę i jelita do ich normalnych pozycji. Następnie użyj szwów, aby zamknąć warstwę mięśniową i zszywek chirurgicznych, aby zamknąć skórę. Umieść mysz w autoklawowanej klatce mikroizolatora z monitorowaniem aż do pełnego spożycia.

Sześć godzin po zabiegu umieść myszy pod lampą grzewczą i zdezynfekuj ogony 70% izopropanolem. Wstrzyknąć od 1,5 do pięciu razy 10 do pięciu CD34-dodatnich ludzkich płodowych komórek macierzystych w 200 mikrolitrach PBS do jednej rozszerzonej żyły ogonowej na zwierzę. Następnie zatamuj krwawienie delikatnym naciskiem i wróć do domowej klatki.

Dziewięć do 12 tygodni po operacji użyj odpowiedniej wielkości plastikowego krępującego grzebienia, aby odizolować jedną nogę jednej humanizowanej myszy i spryskaj przyśrodkową stronę izolowanej nogi 70% izopropanolem. Rozprowadź antybiotyk i maść przeciwbólową na miejscu pobrania. Za pomocą igły o rozmiarze 25 trzymanej pod kątem 90 stopni nakłuj żyłę odpiszczelową, aby zebrać od 50 do 100 mikrolitrów krwi do probówki do pobrania krwi pokrytej EDTA.

Po uzyskaniu odpowiedniej objętości krwi należy przyłożyć do tego miejsca sterylny kawałek gazy, aby zatrzymać krwawienie przed powrotem myszy do klatki. Następnie użyj pobranej próbki krwi obwodowej do oceny poziomu rekonstytucji ludzkich komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu przeciwciał przeciwko ludzkim CD45, CD3, CD4, CD8, CD19 i mysim CD45. Aby pobrać świeżą próbkę kału, umieść pojedyncze autoklawowane papierowe worki w dygestoriach i umieść jedną mysz w każdym worku, aż każde zwierzę się wypróżni.

Następnie wróć myszy do klatki i użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść każdą próbkę kału do jednej 1,5-mililitrowej probówki na mysz do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Pod koniec 14-dniowej kuracji antybiotykowej zmień wodę pitną na sterylizowaną w autoklawie i przenieś myszy do nowej autoklawowanej klatki. 24 i 48 godzin po zaprzestaniu antybiotyków należy rozmrozić odpowiednio przygotowane źródła materiału do przeszczepu mikrobioty kałowej i podwielokrotnić próbki w komorze beztlenowej w warunkach beztlenowych.

Aby przeprowadzić przeszczep kału, należy dostarczyć 200 mikrolitrów materiału do przeszczepu mikrobioty kałowej przez zgłębnik doustny każdemu zwierzęciu doświadczalnemu i rozprowadzić pozostały rozmrożony materiał na futrze humanizowanych myszy lub na ściółkę klatki. Tutaj pokazano przykład analizy cytometrii przepływowej krwi obwodowej od humanizowanej myszy BLT 10 tygodni po operacji. Można zidentyfikować zarówno populacje limfocytów T, jak i B, a także podzbiory limfocytów T CD4 i CD8-dodatnich.

Na tym wykresie można zaobserwować względną obfitość próbek ludzkiego dawcy kału używanych do przenoszenia mikrobiomu jelitowego w celu stworzenia podwójnie humanizowanych myszy. Zmiany fenotypowe śledziony i jelita ślepego wywołane antybiotykopatią są podobne do obserwowanych u zwierząt wolnych od zarazków. Ten wykres analizy głównych składowych reprezentatywnych danych sekwencjonowania rybosomalnego RNA 16S ujawnia, że podwójnie humanizowane myszy mają podobne do ludzkich mikrobiomy jelitowe, które są unikalne dla ludzkiej próbki dawcy.

Najważniejszym aspektem tego protokołu jest ograniczenie wprowadzania niepożądanych bakterii, aby zapewnić, że myszy pozostaną zdrowe i utrzymają ludzki mikrobiom jelitowy. Model ten ma potencjał, aby rozwinąć medycynę spersonalizowaną i pozwolić nam przyjrzeć się, w jaki sposób choroba ludzka wpływa na mikrobiom jelitowy, jednocześnie kontrolując inne czynniki łagodzące.