Elektrofizjologiczne zapisy prądów jonowych pojedynczych ogniw pod wpływem dobrze zdefiniowanego naprężenia ścinającego

Celem tego protokołu jest opisanie zmodyfikowanej równoległej komory przepływowej do wykorzystania w badaniu w czasie rzeczywistym aktywacji mechanowrażliwych kanałów jonowych przez naprężenie ścinające.

Zastosowanie zmodyfikowanej komory przepływu z równoległą płytą może pomóc naukowcom odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące funkcjonalnej odpowiedzi mechanowrażliwych kanałów jonowych na naprężenia ścinające. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona badanie w czasie rzeczywistym w celu przepływu aktywowanych kanałów jonowych w łatwej do zmontowania, równoległej komorze przepływowej wielokrotnego użytku. Aby rozpocząć procedurę, nałóż cienką warstwę roztworu elastomeru silikonowego wokół krawędzi prostokątnej przestrzeni elementu C i delikatnie umieść prostokątne szkło nakrywkowe, kawałek D, bezpośrednio na roztworze elastomeru, aby całkowicie pokryć otwartą prostokątną przestrzeń elementu C. Ostrożnie zetrzyj nadmiar roztworu elastomeru silikonowego.

Następnie powtórz procedurę przyklejania prostokątnego szkła nakrywkowego, kawałka F, do dna kawałka E i pozwól roztworowi elastomeru silikonowego utwardzić się przez noc w temperaturze pokojowej. Teraz zmontuj komorę przepływową MPP, kolejno umieszczając każdy element na górze poprzedniej, zaczynając od dolnej komory, kawałka E, następnie kawałka C, kawałka B, a następnie kawałka A na górze. Następnie wyrównaj otwory na każdego elementu w rogach i mocno skręć elementy ze sobą, aby zapobiec występowaniu wycieków podczas podawania przepływu do komory przepływowej MPP.

Na sześciodołkowej płytce umieść od czterech do pięciu 12-milimetrowych szklanych kółek w każdym dołku. Zapisz komórki w zakresie od 10% do 30% zbieżności, tak aby można było uzyskać dostęp do pojedynczych komórek w celu uzyskania zapisów elektrofizjologicznych. Następnie inkubuj komórki w standardowych warunkach hodowli przez nie mniej niż dwie godziny, aby umożliwić komórkom przyleganie, i nie dłużej niż 24 godziny, ponieważ komórki śródbłonka staną się płaskie i trudne do załatania, gdy zostaną wysiane w momencie zbiegu przez ponad 24 godziny.

Następnie wyjmij szklankę nakrywkową zawierającą przylegające komórki z dołka płytki sześciodołkowej i szybko spłucz w PBS. Następnie przenieś szkło nakrywkowe z komórkami na 35-milimetrową szalkę Petriego zawierającą dwa mililitry elektrofizjologicznego roztworu BAF. Natychmiast przenieść szkło nakrywkowe z komórkami do komory przepływowej MPP.

Przenieś okrąg szkła nakrywkowego na prostokątną szklaną szklaną pokrywę, kawałek D, który jest przyklejony do elementu C komory przepływowej MPP. Dodaj roztwór BAF, aby całkowicie zanurzyć okrąg szkła nakrywkowego i komórki. Następnie umieść okrąg szkła nakrywkowego na elemencie D tak, aby komórki znajdowały się w jednej linii z otworami szczelinowymi elementu B. Upewnij się, że koło szkła nakrywkowego przylega do kawałka D poprzez przyleganie szkła do roztworu, aby uniknąć zakłócenia pozycji koła szkła nakrywkowego przez aplikację przepływową.

Następnie zmontuj komorę przepływową MPP, skręcając ze sobą elementy w odpowiedniej kolejności. Przenieść komorę do stolika mikroskopu i natychmiast przetworzyć komorę roztworem BAF. Następnie zidentyfikuj zdrową komórkę z ciemną obwódką i oczywistym jądrem do eksperymentu.

Unikaj komórek, które wydają się błyszczeć lub komórek, które stykają się z innymi komórkami. Aby kontrolować naprężenia ścinające, skonfiguruj system perfuzji grawitacyjnej, podłączając 30-mililitrową cylindryczną strzykawkę z podziałką do trójdrożnego zamka Luer wyposażonego w rurkę z mikrootworem. Następnie przymocuj cylinder z podziałką do klatki Faradaya otaczającej stanowisko do elektrofizjologii za pomocą taśmy dwustronnej.

Przed włożeniem rurki do komory MPP należy wstępnie napełnić strzykawkę i rurkę roztworem BAF. Następnie włóż rurkę do otworu wlotowego komory przepływowej MPP elementu A. Wstępnie napełnij komorę przepływu MPP roztworem, tak aby była usuwana ze zbiornika próżniowego. Zatrzymaj przepływ do komory i napełnij cylinder z podziałką do górnego znaku.

Oblicz natężenie przepływu ręcznie za pomocą stopera, pozwalając roztworowi przepływać przez komorę na danej wysokości cylindra strzykawki. Podnieś lub opuść strzykawkę, aby zmienić przepływ i oblicz naprężenie ścinające w równoległej komorze za pomocą tego równania. Powtarzaj ten proces, aż zostanie znaleziony żądany poziom naprężenia ścinającego.

Następnie przenieś zmontowaną komorę zawierającą przylegające komórki do stopnia mikroskopowego stanowiska do elektrofizjologii. I włóż rurkę, wstępnie napełnioną roztworem BAF, do otworu elementu A. Następnie napełnij komorę i jednocześnie umyj komórki 10 mililitrami roztworu BAF. Po pomyślnym uzyskaniu żądanej konfiguracji łat pozwól, aby prądy kanału ustabilizowały się w kąpieli statycznej w temperaturze pokojowej.

Gdy tylko prądy się ustabilizują, należy stosować ścinanie w sposób krokowy, pozwalając zwiększonemu prądowi ustabilizować się przed kolejnym krokiem wzrostu naprężeń ścinających. Usuń narażenie komórek na ścinanie, zatrzymując przepływ do komory, umożliwiając mechanowrażliwym prądom kanałowym powrót do prądów podstawowych obserwowanych w kąpieli statycznej. Pokazano tutaj reprezentatywny surowy zapis prądu Kir z pierwotnej komórki śródbłonka krezki myszy z zauważalnym liniowym prądem wycieku na zewnątrz.

Rampa od minus 140 do dodatnich 40 miliwoltów została zastosowana do łaty w ciągu 400 milisekund. Prąd upływowy uniemożliwia analizę rzeczywistej aktywności kanału Kir. Aby odjąć prąd upływu, najpierw oblicz przewodność nachylenia liniowego prądu upływu.

Wielokrotne nachylenie G przez odpowiednie napięcia całej nieprzetworzonej ścieżki w celu wykreślenia prądu upływu na surowych danych. Linia powinna dokładnie nakładać się na zewnętrzny przeciek liniowy. Następnie odejmij wykreślony prąd upływowy od całej ścieżki, tak aby liniowy prąd wychodzący wynosił około zero pikoamperów na pikofarad, a rzeczywisty prąd Kir można przeanalizować.

Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas wykonywania tej procedury, jest prawidłowe ustawienie szkła nakrywkowego w komorze, tak aby komórki były dostępne do eksperymentów. Ponadto należy upewnić się, że szkiełko nakrywkowe jest odpowiednio przylegające do elementu D, tak aby przepływ płynu nie zakłócił ogniw szkła nakrywkowego.