Name: Elektrofizjologiczne zapisy prądów jonowych pojedynczych ogniw pod wpływem dobrze zdefiniowanego naprężenia ścinającego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Poznaj elektrofizjologiczną metodę badania mechanosensywnych kanałów jonowych aktywowanych przez naprężenie ścinające w zmodyfikowanej komorze przepływowej. Technika umożliwia analizę w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez National Heart, Lung, and Blood Institute (R01 HL073965, IL) oraz (T32 HL007829-24, ISF). Autorzy pragną również podziękować Naukowemu Warsztatowi Mechanicznemu Uniwersytetu Illinois w Chicago za wygenerowanie naszych najnowszych komór przepływowych MPP.

Wykorzystanie zwierząt w naszych badaniach jest zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Illinois w Chicago (#16-183).
1. Montaż zmodyfikowanej równoległej komory przepływowej
UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą 1 i Rysunek 1 dla identyfikatorów części komory przepływowej MPP. Proszę zapoznać się z Rysunek 1 w celu uzyskania schematu szczegółowo opisującego orientację elementów komory do montażu.
<ol>
	<li>Aby przykleić prostokątną szklankę nakrywkową, kawałek D, do dna elementu C, najpierw przygotuj roztwór elastomeru silikonowego, dokładnie mieszając 500 μl utwardzacza z elastomeru silikonowego z 5 ml bazy z elastomeru silikonowego.</li>
	<li>Nałożyć cienką warstwę roztworu elastomeru silikonowego wokół krawędzi prostokątnej przestrzeni elementu C i delikatnie umieścić prostokątny szklany element nakrywkowy D bezpośrednio na roztworze elastomeru, tak aby kawałek D całkowicie zakrył otwartą prostokątną przestrzeń elementu C. Ostrożnie zetrzyj nadmiar roztworu elastomeru silikonowego.</li>
	<li>Powtórz krok 1.2, aby przykleić prostokątną szklankę nakrywkową, kawałek F, do dna elementu E i pozwól roztworowi elastomeru silikonowego utwardzić się przez noc w temperaturze pokojowej. 
	nuta: Po utwardzeniu prostokątne szkło nakrywkowe pozostanie przyklejone przez okres do sześciu miesięcy, zanim będzie wymagało wymiany.</li>
	<li>Zaczynając od dolnego elementu komory, elementu E, zmontuj komorę przepływową MPP, kolejno umieszczając każdy element na poprzednim w następującej kolejności: kawałek E (na dole), kawałek C, kawałek B, kawałek A (na górze).</li>
	<li>Dopasuj otwory na każdego elementu w rogach i mocno skręć elementy ze sobą, aby zapobiec wyciekom podczas podawania przepływu do komory przepływowej MPP.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek i wysiew do komory przepływowej MPP
UWAGA: Wykonaj kroki 2.1−2.7 dla hodowanych komórek śródbłonka. Postępuj zgodnie z metodą opisaną w krokach 2.8−2.14 w celu wyizolowania komórek śródbłonka z arkady tętniczej krezki myszy i przygotowania świeżo wyizolowanych komórek śródbłonka.
<ol>
	<li>Na płytce 6-dołkowej umieść od czterech do pięciu szklanych kółek / studzienki o średnicy 12 mm i komórek nasiennych między 10% a 30% zbieżności, tak aby można było uzyskać dostęp do pojedynczych komórek w celu zapisów elektrofizjologicznych.</li>
	<li>Inkubować komórki w standardowych warunkach hodowli (5% CO2, 37 °C) przez nie mniej niż 2 godziny, aby umożliwić komórkom przyleganie i nie dłużej niż 24 godziny, ponieważ komórki śródbłonka w doświadczeniu autorów stają się bardzo płaskie i trudne do załatania, gdy są wysiewane w momencie zbiegu przez ponad 24 godziny.</li>
	<li>Wyjąć szklankę nakrywkową zawierającą przylegające komórki z dołka na płytce 6-dołkowej, szybko spłukać w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i przenieść na szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą 2 ml roztworu kąpieli elektrofizjologicznej (tabela 2) przed przeniesieniem do komory przepływowej MPP.</li>
	<li>Przenieść okrąg szkła nakrywkowego na prostokątną szklankę nakrywkową, kawałek D, który przykleja się do części C komory przepływowej MPP, upewniając się, że odpowiedni roztwór pozostaje na szkle nakrywkowym, tak aby komórki nie zostały wystawione na działanie powietrza. Dodaj żądany roztwór do kąpieli (~250 μL) do komórek, tak aby koło szkła nakrywkowego i komórki były całkowicie zanurzone w roztworze.</li>
	<li>Ustawić okrąg szkła nakrywkowego w taki sposób, aby spoczywał w połowie najbliżej strony zbiornika próżniowego, tak aby komórki znajdowały się w jednej linii z otworami szczelinowymi elementu B. Upewnij się, że koło szklanej pokrywy przylega do kawałka D poprzez przyleganie roztworu do szkła, tak aby przepływ do komory nie zakłócał położenia koła szkła nakrywkowego.</li>
	<li>Zmontuj komorę przepływową MPP, skręcając elementy razem w odpowiedniej kolejności, jak opisano w krokach 1.4 i 1.5 oraz jak pokazano na Rysunek 1. Przenieść komorę do stolika mikroskopu i natychmiast przetoczyć perfuzję komory roztworem kąpieli tak, aby roztwór dotarł do zbiornika próżniowego w celu aspiracji (~10 ml).</li>
	<li>Zidentyfikuj zdrową komórkę do eksperymentu, identyfikując komórkę z ciemną obwódką i oczywistym jądrem. Unikaj komórek, które wydają się pęcherzykować lub komórek, które mają kontakt z innymi komórkami. 
	nuta: W laboratorium autorów wykorzystuje się ludzkie komórki śródbłonka aorty oraz pierwotne komórki śródbłonka krezki myszy w hodowli. Jednak każdy inny typ komórki adherentnej, który jest interesujący dla określonych potrzeb badawczych, może być używany w ten sam sposób.</li>
	<li>Przemyć izolowany arkada tętnicy w roztworze dysocjacyjnym (Tabela 2). Przenieść arkadkę do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 2 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) roztworu dysocjacyjnego (przepis na roztwór dysocjacyjny pokazano w Tabeli 2) zawierającej obojętną proteazę (0,5 mg/ml) i elastazę (0,5 mg/ml). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając co 10 minut.</li>
	<li>Usunąć 1 ml obojętnego roztworu dysocjacyjnego proteazy/elastazy i dodać 1 mg/ml kolagenazy typu 1. Z powrotem roztwór kolagenazy należy umieścić z powrotem w roztworze zawierającym tętnice, aby uzyskać końcowe stężenie kolagenazy typu 1 wynoszące 0,5 mg/ml. Inkubować przez 2-3 minuty w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Używając kleszczyków o 5 stopniach, szybko przenieś arkadę na szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą 750 μl kropli świeżego, schłodzonego roztworu dysocjacyjnego. Dalej dysocjuj tkankę za pomocą dwóch igieł strzykawkowych 20 G, aby mechanicznie uwolnić komórki śródbłonka z trawionych enzymatycznie tętnic.</li>
	<li>Używając 9-calowej jednorazowej szklanej pipety Pasteura, rozetrzyj roztwór komórek 10 razy przed przeniesieniem komórek do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą szklanej pipety.</li>
	<li>Przemyć szalkę Petriego kolejnymi 750 μl roztworu dysocjacyjnego i przenieść do tej samej probówki. Za pomocą szklanej pipety należy następnie mechanicznie rozproszyć komórki, pipetując co najmniej 10 razy, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków, które mogą uszkodzić integralność komórek śródbłonka.</li>
	<li>Dodaj 750 μl zawiesiny komórek śródbłonka (~500−1,000 komórek) bezpośrednio do kawałka D komory przepływowej MPP w połowie najbliższej stronie próżni zbiornika. Pozwól komórkom śródbłonka przylegać od 45 minut do 1 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zmontuj komorę przepływową MPP, skręcając elementy razem w odpowiedniej kolejności, jak opisano w krokach 1.4 i 1.5 oraz jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 1. Przenieść komorę do stolika mikroskopu i natychmiast przeprowadzić perfuzję komory roztworem kąpieli tak, aby roztwór osiągnął aspirację próżniową (~10 ml). Identyfikuj dostępne komórki śródbłonka na podstawie ich szorstkiego i okrągłego fenotypu19,20. 
	nuta: Do izolowania komórek śródbłonka z różnych łożysk tętniczych stosowano różne metody trawienia i koktajle enzymatyczne. Patrz Tabela 3, aby uzyskać szczegółowe opisy protokołów, które były używane przez różnych badaczy do izolowania komórek śródbłonka do elektrofizjologii mechanowrażliwych kanałów jonowych. Metody te są prawdopodobnie odpowiednie do stosowania w połączeniu z komorą przepływową MPP.</li>
</ol>
3. Kontrolowanie naprężeń ścinających w komorze przepływowej MPP dla elektrofizjologicznych zapisów mechanowrażliwych kanałów jonowych aktywowanych ścinaniem
<ol>
	<li>Skonfiguruj system perfuzji grawitacyjnej, podłączając cylinder strzykawkowy z podziałką o pojemności 30 ml do 3-kierunkowego zamka luer wyposażonego w rurkę z mikrootworem (średnica wewnętrzna: 0.05 cala, średnica zewnętrzna: 0.09 cala) przystosowaną do włożenia do otworu wlotowego o średnicy 3 mm elementu A komory MPP.</li>
	<li>Przymocuj cylinder z podziałką do zewnętrznej powierzchni klatki Faradaya otaczającej stanowisko do elektrofizjologii (<silna klasa="xfig">Rysunek 2) za pomocą taśmy dwustronnej. Przed włożeniem rurki do komory MPP należy wstępnie napełnić strzykawkę i rurkę roztworem do kąpieli (patrz Tabela 2 dla roztworu do kąpieli używanego do badania wewnętrznych kanałów prostowniczych K+ w komórkach śródbłonka). Włóż rurkę do otworu wlotowego komory przepływowej MPP elementu A.</li>
	<li>Wstępnie napełnić komorę przepływową MPP roztworem w taki sposób, aby roztwór był usuwany ze zbiornika próżniowego. Zatrzymaj przepływ do komory i napełnij cylinder z podziałką do górnego znaku. Obliczaj natężenia przepływu ręcznie, pozwalając roztworowi przepływać przez komorę i używając stopera do obliczania ml / s przy danej wysokości cylindra strzykawki.</li>
	<li>Podnieś lub opuść strzykawkę, aby zmienić przepływ, a tym samym ścinać w komorze, i kontynuuj ten proces, aż zostanie znaleziony pożądany poziom naprężenia ścinającego.</li>
	<li>Oblicz naprężenie ścinające w komorze równoległej, korzystając z następującego równania21: 
	τ = 6μQ/h2w 
	gdzie μ = lepkość płynu (g/cm·s), Q = natężenie przepływu (ml/s) i szerokość komory równoległej płyty (w = 2,2 cm) i wysokość (h = 0,1 cm). 
	nuta: W obecnym systemie perfuzji grawitacyjnej, przy wysokości cylindra strzykawki (mierzonej od górnej części cylindra) wynoszącej 57 cm nad stolikiem mikroskopu, natężenie przepływu wynosi 0,3 ml/s. Ścinanie obliczone w komorze przy tej wysokości cylindra strzykawki i natężeniu przepływu wynosi 0,7 dyn/cm2. Należy również zauważyć, że inne systemy perfuzyjne, takie jak pompa perystaltyczna, mogą być używane do kontrolowania przepływu do komory przepływowej MPP. Urządzenia te mogą jednak powodować niepożądane turbulencje i wpływać na stabilność pomiarów elektrofizjologicznych pod przepływem, dlatego zaleca się stosowanie opisanego tutaj systemu perfuzji grawitacyjnej.</li>
	<li>Przenieść zmontowaną komorę zawierającą przylegające komórki do stopnia mikroskopu urządzenia do elektrofizjologii i włożyć rurkę wstępnie napełnioną roztworem do kąpieli do otworu elementu A. Jednocześnie napełnić komorę i umyć komórki 10 ml roztworu do kąpieli, obracając 3-kierunkową blokadę luer tak, aby roztwór spływał do komory.</li>
	<li>Po pomyślnym uzyskaniu żądanej konfiguracji łat pozwól, aby prądy kanału ustabilizowały się w kąpieli statycznej w temperaturze pokojowej. Gdy prądy się ustabilizują, należy je stosować stopniowo, umożliwiając ustabilizowanie wzrostu prądu przed następnym krokiem wzrostu naprężenia ścinającego. 
	nuta: Autorzy odnoszą największe sukcesy w konfiguracji perforowanych plastrów podczas badania mechanoaktywowanych kanałów jonowych w komórkach śródbłonka. Aby wykonać perforowane konfiguracje łatek całokomórkowych, dodaj 5 μl podstawowej amfoterycyny B o stężeniu 60 mg/ml w dimetylosulfotlenku (DMSO) do 1 ml sterylnego roztworu pipet z filtrem o stężeniu 0,2 μm. Po wygenerowaniu giga-omowej uszczelki w konfiguracji dołączonej do ogniwa, w ciągu 2-5 minut tworzą się perforowane łaty całych komórek.</li>
	<li>Usunąć narażenie komórek na ścinanie, zatrzymując przepływ do komory, umożliwiając mechanowrażliwym prądom kanałowym powrót do prądów podstawowych obserwowanych w kąpieli statycznej.</li>
	<li>Odizoluj mechanowrażliwe prądy kanałów jonowych będących przedmiotem zainteresowania, zmieniając wartościowość roztworu (np. 60 mM K+ w roztworze kąpielowym z 0 Ca2+ w roztworze pipety, aby zbadać wewnętrzne korygowanie kanałów K+. Tabela 2 przedstawia przykładowe receptury roztworów) i/lub farmakologiczne hamowanie potencjalnie zanieczyszczających źródeł prądu.</li>
</ol>

<ol><li>Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Adaptation+to+Exercise+in+Humans%3A+Role+of+Hemodynamic+Stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli.</a> Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).</li>
<li>Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction%2C+hemodynamic+forces%2C+and+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 902, discussion 239-240 230-239 (2000).</li>
<li>Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemodynamic+shear+stress+activates+a+K%2B+current+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells.</a> Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).</li>
<li>Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secrets+of+the+code%3A+do+vascular+endothelial+cells+use+ion+channels+to+decipher+complex+flow+signals%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals?</a> Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).</li>
<li>Beech, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Piezo1+channels+as+sensors+of+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise.</a> Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).</li>
<li>Ahn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inwardly+rectifying+K%28%2B%29+channels+are+major+contributors+to+flow-induced+vasodilatation+in+resistance+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries.</a> Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).</li>
<li>Fancher, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia-Induced+Loss+of+Flow-Induced+Vasodilation+and+Lesion+Formation+in+Apolipoprotein+E-Deficient+Mice+Critically+Depend+on+Inwardly+Rectifying+K%28%2B%29+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).</li>
<li>Rode, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+channels+sense+whole+body+physical+activity+to+reset+cardiovascular+homeostasis+and+enhance+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance.</a> Nature Communications. 8 (1), 350(2017).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezo1+integration+of+vascular+architecture+with+physiological+force%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force.</a> Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).</li>
<li>Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chamber+to+permit+invasive+manipulation+of+adherent+cells+in+laminar+flow+with+minimal+disturbance+of+the+flow+field%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomed+Engineering%22%5BJournal%5D)">A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field.</a> Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia+suppresses+inwardly+rectifying+K%2B+channels+in+aortic+endothelium+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo.</a> Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).</li>
<li>Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+adhesion+assay+to+study+leucocyte+recruitment+to+human+hepatic+sinusoidal+endothelium+under+conditions+of+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51330(2014).</li>
<li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+Analysis+of+Endothelial+Cells+Exposed+to+Shear+Stress+Using+Multiple+Parallel-plate+Flow+Chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58478(2018).</li>
<li>White, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Assembly+and+Application+of+%27Shear+Rings%27%3A+A+Novel+Endothelial+Model+for+Orbital%2C+Unidirectional+and+Periodic+Fluid+Flow+and+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54632(2016).</li>
<li>Franzoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+cone-and-plate+device+for+controlled+realistic+shear+stress+stimulation+on+endothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers.</a> Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).</li>
<li>Dewey, C. F. Jr, Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A. Jr, Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+response+of+vascular+endothelial+cells+to+fluid+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).</li>
<li>Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+regulates+the+endothelial+Kir2.1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).</li>
<li>Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-activated+Na%28%2B%29and+K%28%2B%29Current+in+cardiac+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).</li>
<li>Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+differential+cellular+distribution+of+inward+rectifier+K+channels+in+the+rat+isolated+mesenteric+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery.</a> Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).</li>
<li>Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+SK%28Ca%29+and+IK%28Ca%29+channels+regulate+brain+parenchymal+arteriolar+diameter+and+cortical+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cereberal+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow.</a> Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).</li>
<li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3349(2012).</li>
<li>Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+membrane+potential+and+ion+current+responses+to+different+types+of+shear+stress+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).</li>
<li>Le Master, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proatherogenic+Flow+Increases+Endothelial+Stiffness+via+Enhanced+CD36-Mediated+Uptake+of+Oxidized+Low-Density+Lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).</li>
<li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Ion+Concentration+in+the+Unstirred+Boundary+Layer+with+Open+Patch-Clamp+Pipette%3A+Implications+in+Control+of+Ion+Channels+by+Fluid+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58228(2019).</li>
<li>Kim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow+facilitates+inward+rectifier+K%28%2B%29+current+by+convectively+restoring+%5BK%28%2B%29%5D+at+the+cell+membrane+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface.</a> Scientific Reports. 6, 39585(2016).</li>
<li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li>
<li>Jacobs, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+activated+channels+in+cell-attached+patches+of+cultured+bovine+aortic+endothelial+cells.+Pflugers+Archiv%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).</li>
<li>Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow-activated+chloride-selective+membrane+current+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells.</a> Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).</li>
<li>Fitzgerald, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+shear+stress+stimulates+vascular+smooth+muscle+cell+apoptosis+via+the+Akt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway.</a> Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).</li>
<li>Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+as+an+inhibitor+of+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation.+Role+of+transforming+growth+factor-beta+1+and+tissue-type+plasminogen+activator%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Układ naczyniowy jest stale narażony na działanie aktywnych sił hemodynamicznych, które aktywują mechanowrażliwe kanały jonowe 3,22, ale fizjologiczne role tych kanałów w mechanotransdukcji wywołanej naprężeniem ścinającym dopiero zaczynają się wyłaniać 4,6,8. Mechanizmy odpowiedzialne za mechanowrażliwość kanałów aktywowanych naprężeniami ścinającymi pozostają nieznane....

Siły hemodynamiczne generowane przez przepływ krwi są dobrze znane z tego, że odgrywają główną rolę w funkcjonowaniu śródbłonka i naczyń krwionośnych1,2. Wiadomo również, że kilka typów kanałów jonowych ostro reaguje na zmiany naprężeń ścinających3,4,5, co prowadzi do hipotezy, że kanały jonowe mogą być głównymi czujnikami naprężeń ścinających. Niedawno wraz z innymi wykazaliśmy, że mechanowrażliwe kanały jonowe odgrywają kluczową rolę w kilku funkcjach naczyniowych wrażliwych na naprężenia ścinające, w tym w wazoaktywnej odpowiedzi na naprężenie ścinające6,7,8 oraz angiogenezie rozwojowej9. Mechanizmy wrażliwości kanałów jonowych na naprężenia ścinające są jednak prawie całkowicie nieznane. Ta luka w wiedzy prawdopodobnie wynika z trudności technicznych związanych z wykonywaniem zapisów elektrofizjologicznych przy dobrze zdefiniowanym naprężeniu ścinającym. Dlatego w tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół krok po kroku, rutynowo wykonywany w naszym laboratorium, aby osiągnąć ten cel6,7,10,11.
Ogólnym celem tej metody jest umożliwienie badania w czasie rzeczywistym mechanoaktywacji kanałów jonowych pod dobrze zdefiniowanym naprężeniem ścinającym w zakresie fizjologicznym. Osiąga się to poprzez modyfikację standardowej równoległej komory przepływu płytek, aby umożliwić opuszczenie pipety elektrofizjologicznej do komory i dostęp do komórek rosnących na dolnej płytce podczas ekspozycji na przepływ w czasie rzeczywistym, zapewniając unikalne podejście do osiągnięcia tego celu6,7,11. W przeciwieństwie do tego, standardowe równoległe komory przepływowe z płytkami, opisane we wcześniejszych publikacjach, mogą być używane do analizy obrazowej w czasie rzeczywistym komórek narażonych na działanie sił ścinających12 lub inne nieinwazyjne podejścia13,14, ale nie do elektrofizjologii. Podobnie, aparat stożkowy i płytkowy, inne potężne podejście do wystawiania komórek na naprężenia ścinające15,16 również nie nadaje się do zapisów elektrofizjologicznych. W związku z tym te urządzenia przepływowe nie pozwalają na badanie wrażliwości kanałów jonowych na naprężenia ścinające. Trudność w wykonywaniu zapisów elektrofizjologicznych pod przepływem jest główną przyczyną niedostatku informacji o mechanizmach odpowiedzialnych za te kluczowe efekty.
Jeśli chodzi o alternatywne podejścia do osiągnięcia tego samego celu, nie ma żadnego, które byłoby tak dokładne i kontrolowane. Niektóre wcześniejsze badania próbowały rejestrować aktywność kanału jonowego pod przepływem poprzez wystawienie komórek na działanie strumienia cieczy pochodzącego z innej pipety przyniesionej w pobliże komórki z góry17,18. Jest to wysoce niefizjologiczne, ponieważ siły mechaniczne powstające w tych warunkach mają niewiele wspólnego z fizjologicznymi profilami naprężeń ścinających w naczyniach krwionośnych. Podobne obawy dotyczą prób symulacji fizjologicznego naprężenia ścinającego poprzez perfuzję otwartych komór. Jak szczegółowo omówiono w naszym wcześniejszym badaniu10, otwarty interfejs ciecz-powietrze powoduje wiele zakłóceń i recyrkulacji, które są niefizjologiczne. Aby rozwiązać wszystkie te problemy, zaprojektowaliśmy zmodyfikowaną komorę przepływową z płytą równoległą (MPP), określaną również jako "minimalnie inwazyjne urządzenie przepływowe" w naszych wcześniejszych badaniach6,7,10,11, wykonana z akrylu i szeroko stosowana w naszym laboratorium. Jednak pomimo faktu, że oryginalny opis konstrukcji został opublikowany prawie 20 lat temu i jest to jedyne urządzenie przepływowe, które pozwala na wykonywanie zapisów elektrofizjologicznych pod dobrze zdefiniowanym naprężeniem ścinającym, metodologia ta nie została przyjęta przez inne laboratoria i istnieje bardzo niewiele badań, które próbują rejestrować prądy pod przepływem. Uważamy zatem, że szczegółowy opis korzystania z komory przepływowej MPP będzie bardzo pomocny dla badaczy zainteresowanych mechanowrażliwymi kanałami jonowymi i biologią naczyniową.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mikro; m sterylne filtry strzykawkowe</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>Służy do filtrowania roztworu do pipet elektrofizjologicznych</td></tr><tr><td>5 stopni</td><td>kleszczy Fine Scientific Tools</td><td>1252-30</td><td>Służy do przenoszenia strawionych tętnic do świeżego roztworu</td></tr><tr><td>9" Pasteur Pipet</td><td>Fisher Scientifc</td><td>13-678-20D</td><td>Służy do mechanicznego rozbijania strawionych tętnic i przenoszenia świeżo wyizolowanych komórek endohtelialnych&nbsp;</td></tr><tr><td>Średnica 12 mm Szklane kółka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientifc</td><td>12-545-80</td><td>Do stosowania w badaniach z udziałem hodowanych komórek i wielokrotnych zabiegach. Komórki przylegające do szkła nakrywkowego są używane do analiz zacisków krosowych</td></tr><tr><td>24 mm x 40 mm Prostokątne Szkło nakrywkowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS2975224</td><td>Szkło nakrywkowe, które należy dodać do części komory przepływowej MPP C (rysunek 1)</td></tr> <tr><td>24 mm x 50 mm Prostokątne szkło nakrywkowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS2975245</td><td>Szkło nakrywkowe, które należy dodać do komory przepływowej MPP E (rysunek 1)</td></tr> <tr><td>Igły strzykawkowe 20 G</td><td>Becton Dickinson and Co</td><td>305175</td><td>Do stosowania w mechanicznym rozbijaniu trawionych tętnic krezkowych</td></tr><tr><td>35 mm szalka Petriego</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td>Do stosowania w mechanicznym rozbijaniu trawionych tętnic krezkowych</td></tr><tr><td>Amfoterycyna B rozpuszczona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9528-50MG</td><td>Służy do generowania perforowanej konfiguracji łaty całokomórkowej</td></tr>.<tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>100 mg - LS004194</td><td>Enzym stosowany w naszym laboratorium jako krótkie trawienie po początkowym koktajlu neutralnej proteazy i elastazy</td></tr><tr><td>Dimetylosulftlenek (DMSO)</td><td>Fisher Scientifc</td><td>67-68-5</td><td>Rozpuszczalnik do amfoterycyny B stosowany w perforowanym zacisku łatowym dla całych komórek</td></tr><tr><td>Elastaza, liofilizowana</td><td>Worthington Biochemical</td><td>25 mg - LS002290&nbsp;</td><td>Enzym stosowany w naszym laboratorium w koktajlu z neutralną proteazą/dypazą w celu rozpoczęcia trawienia tętnic w celu izolacji komórek śródbłonka.</td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkankowej Falcon, 6-dołkowa, z płaskim dnem i pokrywką o niskiej parowaniu&nbsp;</td><td>Corning</td><td>353046</td><td>Do stosowania w badaniach z udziałem hodowanych komórek i wielu zabiegach</td></tr><tr><td>Neutralna proteaza/dypaza</td><td>Worthington Biochemical</td><td>10 mg- LS02100 50 mg - LS02104</td><td>Enzym stosowany w naszym laboratorium w koktajlu z elastazą do rozpoczęcia trawienia tętnic w celu izolacji komórek śródbłonka</td></tr><tr><td>SylGard&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Elastomer silikonowy do przyklejania prostokątnego szkiełka nakrywkowego do elementów C i E komory przepływowej MPP (ilustracja 1)</td></tr><tr><td>Rurki Tygon ND 10-80</td><td>Rurki z mikrootworami</td><td>AAQ04133</td><td>ID: 0,05 cala, OD: 0,09 cala, rurka perfuzyjna wlotowa do administrowania przepływem do komory</td></tr></tbody></table>

elektrofizjologiczne zapisy prądów jonowych pojedynczych ogniw pod wpływem dobrze zdefiniowanego naprężenia ścinającego

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Naprężenie ścinające płynów jest dobrze znane z tego, że odgrywa główną rolę w funkcjonowaniu śródbłonka. W większości łożysk naczyniowych podwyższone naprężenie ścinające spowodowane ostrym wzrostem przepływu krwi wyzwala kaskadę sygnalizacyjną powodującą rozszerzenie naczyń krwionośnych, łagodząc w ten sposób obciążenie mechaniczne ściany naczynia. Wzór naprężeń ścinających jest również dobrze znany jako krytyczny czynnik w rozwoju miażdżycy, przy czym laminarne naprężenie ścinające jest miażdżycowe, a zaburzone naprężenie ścinające jest promiażdżycowe. Chociaż mamy szczegółową wiedzę na temat różnych pośrednich szlaków sygnalizacji komórkowej, receptory, które jako pierwsze przekształcają bodziec mechaniczny w mediatory chemiczne, nie są w pełni poznane. Mechanowrażliwe kanały jonowe mają kluczowe znaczenie dla odpowiedzi na ścinanie i regulują sygnalizację komórkową wywołaną ścinaniem, kontrolując w ten sposób produkcję mediatorów wazoaktywnych. Kanały te są jednymi z najwcześniej aktywowanych składników sygnalizacyjnych do ścinania i zostały powiązane z rozszerzeniem naczyń krwionośnych wywołanym ścinaniem poprzez promowanie produkcji tlenku azotu (np. Kanały korygujące wewnętrznie K+ [Kir] i przejściowy potencjał receptora [TRP]) i czynnik hiperpolaryzacyjny śródbłonka (np. Kir i K + aktywowane wapniem [KCa]) i zwężenie naczyń krwionośnych wywołane ścinaniem poprzez nieokreślony mechanizm, który obejmuje kanały piezoelektryczne. Zrozumienie biofizycznego mechanizmu, za pomocą którego kanały te są aktywowane przez siły ścinające (tj. bezpośrednio lub przez główny mechanoreceptor), może dostarczyć potencjalnych nowych celów do rozwiązania patofizjologii związanej z dysfunkcją śródbłonka i miażdżycą. Nadal dużym wyzwaniem jest rejestrowanie aktywacji kanałów jonowych wywołanej przepływem w czasie rzeczywistym za pomocą elektrofizjologii. Standardowe metody wystawiania komórek na dobrze zdefiniowane naprężenia ścinające, takie jak reometr stożkowy i płytkowy oraz zamknięta równoległa komora przepływowa z płytką, nie pozwalają na badanie aktywacji kanałów jonowych w czasie rzeczywistym. Celem tego protokołu jest opisanie zmodyfikowanej równoległej komory przepływowej, która umożliwia elektrofizjologiczne rejestrowanie w czasie rzeczywistym mechanowrażliwych kanałów jonowych pod dobrze zdefiniowanym naprężeniem ścinającym.

Na Rysunku 1 przedstawiono kilka fotografii ukazujących różne widoki komory przepływowej MPP na stole mikroskopu (panel górny) oraz schematyczny rysunek komory przepływowej MPP (panel dolny). Schemat szczegółowo przedstawia wymiary całego urządzenia oraz komory przepływowej. Rysunek 2 przedstawia fotografię systemu perfuzji grawitacyjnej do komory przepływowej MPP w naszym laboratorium (panel górny). Przedstawiono również schemat...

Celem tego protokołu jest opisanie zmodyfikowanej równoległej komory przepływowej do wykorzystania w badaniu w czasie rzeczywistym aktywacji mechanowrażliwych kanałów jonowych przez naprężenie ścinające.

Elektrofizjologiczne zapisy prądów jonowych pojedynczych ogniw pod wpływem dobrze zdefiniowanego naprężenia ścinającego

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...

Zastosowanie zmodyfikowanej komory przepływu z równoległą płytą może pomóc naukowcom odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące funkcjonalnej odpowiedzi mechanowrażliwych kanałów jonowych na naprężenia ścinające. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona badanie w czasie rzeczywistym w celu przepływu aktywowanych kanałów jonowych w łatwej do zmontowania, równoległej komorze przepływowej wielokrotnego użytku. Aby rozpocząć procedurę, nałóż cienką warstwę roztworu elastomeru silikonowego wokół krawędzi prostokątnej przestrzeni elementu C i delikatnie umieść prostokątne szkło nakrywkowe, kawałek D, bezpośrednio na roztworze elastomeru, aby całkowicie pokryć otwartą prostokątną przestrzeń elementu C. Ostrożnie zetrzyj nadmiar roztworu elastomeru silikonowego.Następnie powtórz procedurę przyklejania prostokątnego szkła nakrywkowego, kawałka F, do dna kawałka E i pozwól roztworowi elastomeru silikonowego utwardzić się przez noc w temperaturze pokojowej. Teraz zmontuj komorę przepływową MPP, kolejno umieszczając każdy element na górze poprzedniej, zaczynając od dolnej komory, kawałka E, następnie kawałka C, kawałka B, a następnie kawałka A na górze. Następnie wyrównaj otwory na każdego elementu w rogach i mocno skręć elementy ze sobą, aby zapobiec występowaniu wycieków podczas podawania przepływu do komory przepływowej MPP.Na sześciodołkowej płytce umieść od czterech do pięciu 12-milimetrowych szklanych kółek w każdym dołku. Zapisz komórki w zakresie od 10% do 30% zbieżności, tak aby można było uzyskać dostęp do pojedynczych komórek w celu uzyskania zapisów elektrofizjologicznych. Następnie inkubuj komórki w standardowych warunkach hodowli przez nie mniej niż dwie godziny, aby umożliwić komórkom przyleganie, i nie dłużej niż 24 godziny, ponieważ komórki śródbłonka staną się płaskie i trudne do załatania, gdy zostaną wysiane w momencie zbiegu przez ponad 24 godziny.Następnie wyjmij szklankę nakrywkową zawierającą przylegające komórki z dołka płytki sześciodołkowej i szybko spłucz w PBS. Następnie przenieś szkło nakrywkowe z komórkami na 35-milimetrową szalkę Petriego zawierającą dwa mililitry elektrofizjologicznego roztworu BAF. Natychmiast przenieść szkło nakrywkowe z komórkami do komory przepływowej MPP.Przenieś okrąg szkła nakrywkowego na prostokątną szklaną szklaną pokrywę, kawałek D, który jest przyklejony do elementu C komory przepływowej MPP. Dodaj roztwór BAF, aby całkowicie zanurzyć okrąg szkła nakrywkowego i komórki. Następnie umieść okrąg szkła nakrywkowego na elemencie D tak, aby komórki znajdowały się w jednej linii z otworami szczelinowymi elementu B. Upewnij się, że koło szkła nakrywkowego przylega do kawałka D poprzez przyleganie szkła do roztworu, aby uniknąć zakłócenia pozycji koła szkła nakrywkowego przez aplikację przepływową.Następnie zmontuj komorę przepływową MPP, skręcając ze sobą elementy w odpowiedniej kolejności. Przenieść komorę do stolika mikroskopu i natychmiast przetworzyć komorę roztworem BAF. Następnie zidentyfikuj zdrową komórkę z ciemną obwódką i oczywistym jądrem do eksperymentu.Unikaj komórek, które wydają się błyszczeć lub komórek, które stykają się z innymi komórkami. Aby kontrolować naprężenia ścinające, skonfiguruj system perfuzji grawitacyjnej, podłączając 30-mililitrową cylindryczną strzykawkę z podziałką do trójdrożnego zamka Luer wyposażonego w rurkę z mikrootworem. Następnie przymocuj cylinder z podziałką do klatki Faradaya otaczającej stanowisko do elektrofizjologii za pomocą taśmy dwustronnej.Przed włożeniem rurki do komory MPP należy wstępnie napełnić strzykawkę i rurkę roztworem BAF. Następnie włóż rurkę do otworu wlotowego komory przepływowej MPP elementu A. Wstępnie napełnij komorę przepływu MPP roztworem, tak aby była usuwana ze zbiornika próżniowego. Zatrzymaj przepływ do komory i napełnij cylinder z podziałką do górnego znaku.Oblicz natężenie przepływu ręcznie za pomocą stopera, pozwalając roztworowi przepływać przez komorę na danej wysokości cylindra strzykawki. Podnieś lub opuść strzykawkę, aby zmienić przepływ i oblicz naprężenie ścinające w równoległej komorze za pomocą tego równania. Powtarzaj ten proces, aż zostanie znaleziony żądany poziom naprężenia ścinającego.Następnie przenieś zmontowaną komorę zawierającą przylegające komórki do stopnia mikroskopowego stanowiska do elektrofizjologii. I włóż rurkę, wstępnie napełnioną roztworem BAF, do otworu elementu A. Następnie napełnij komorę i jednocześnie umyj komórki 10 mililitrami roztworu BAF. Po pomyślnym uzyskaniu żądanej konfiguracji łat pozwól, aby prądy kanału ustabilizowały się w kąpieli statycznej w temperaturze pokojowej.Gdy tylko prądy się ustabilizują, należy stosować ścinanie w sposób krokowy, pozwalając zwiększonemu prądowi ustabilizować się przed kolejnym krokiem wzrostu naprężeń ścinających. Usuń narażenie komórek na ścinanie, zatrzymując przepływ do komory, umożliwiając mechanowrażliwym prądom kanałowym powrót do prądów podstawowych obserwowanych w kąpieli statycznej. Pokazano tutaj reprezentatywny surowy zapis prądu Kir z pierwotnej komórki śródbłonka krezki myszy z zauważalnym liniowym prądem wycieku na zewnątrz.Rampa od minus 140 do dodatnich 40 miliwoltów została zastosowana do łaty w ciągu 400 milisekund. Prąd upływowy uniemożliwia analizę rzeczywistej aktywności kanału Kir. Aby odjąć prąd upływu, najpierw oblicz przewodność nachylenia liniowego prądu upływu.Wielokrotne nachylenie G przez odpowiednie napięcia całej nieprzetworzonej ścieżki w celu wykreślenia prądu upływu na surowych danych. Linia powinna dokładnie nakładać się na zewnętrzny przeciek liniowy. Następnie odejmij wykreślony prąd upływowy od całej ścieżki, tak aby liniowy prąd wychodzący wynosił około zero pikoamperów na pikofarad, a rzeczywisty prąd Kir można przeanalizować.Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas wykonywania tej procedury, jest prawidłowe ustawienie szkła nakrywkowego w komorze, tak aby komórki były dostępne do eksperymentów. Ponadto należy upewnić się, że szkiełko nakrywkowe jest odpowiednio przylegające do elementu D, tak aby przepływ płynu nie zakłócił ogniw szkła nakrywkowego.

electrophysiological-recordings-single-cell-ion-currents-under-well

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym filmie przedstawiono proces rejestracji metodą voltage clamp w całej komórce (whole-cell) w skrawku siatkówki wodnego salamandry tygrysiej. Demonstrujemy przygotowanie skrawka oraz sposób przeprowadzania rejestracji metodą patch clamp podczas stymulacji wizualnej siatkówki.

Rejestracja w konfiguracji whole-cell pobudzeniowych prądów synaptycznych wywołanych światłem w skrawku siatkówki

W tym filmie, embrionalne hodowle komórek nerkowych wyrażające zależne od światła białka kanału jonowego połączone fluorescencyjnym reporterem demonstrują wpływ światła na ruch jonów. Zacisk krosowy na całe komórki służy do monitorowania ruchu jonów.

Zapis elektrofizjologii optogenetycznej komórek z kanałami jonowymi zależnymi od światła

Opisujemy przygotowanie cienkich wycinków siatkówki z wodnych salamander tygrysich (Ambystoma tigrinum) i wyjaśniamy, jak używamy tych wycinków do badania przetwarzania synaptycznego w siatkówce, uzyskując podwójne zapisy napięcia całego ogniwa z fotoreceptorów oraz komórek poziomych i dwubiegunowych drugiego rzędu.

Jednoczesne zapisy całych komórek z fotoreceptorów i neuronów drugiego rzędu w preparacie plastra siatkówki

Opisujemy izolację ludzkich miocytów przedsionkowych, które mogą być używane do wewnątrzkomórkowych pomiarów Ca2+ w połączeniu z elektrofizjologicznymi badaniami patch-clamp.

Izolacja ludzkich miocytów przedsionkowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądów błonowych

Ten protokół opisuje podstawowe kroki proceduralne do wykonywania nagrań z użyciem krosówek dla całej komórki. Technika ta pozwala na badanie zachowania elektrycznego neuronów, a gdy jest wykonywana w wycinkach mózgu, pozwala na ocenę różnych funkcji neuronalnych z neuronów, które są nadal zintegrowane w stosunkowo dobrze zachowanych obwodach mózgowych.

Nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu

Ten manuskrypt zawiera protokoły, które wykorzystują elektroporację in utero (IUE) do opisania strukturalnej łączności neuronów na poziomie pojedynczej komórki i pobudliwości neuronów znakowanych fluorescencyjnie. Histologia służy do charakteryzowania projekcji dendrytycznych i aksonalnych. Zapis całych komórek w ostrych wycinkach służy do badania pobudliwości.

In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek

Tutaj opisujemy podstawowe kroki dla zapisów całokomórkowych krosówek z neuronów istoty żelowej (SG) w przekroju rdzenia kręgowego in vitro. Metoda ta pozwala na badanie wewnętrznych właściwości błony, przekaźnictwa synaptycznego i charakterystyki morfologicznej neuronów SG.

Przygotowanie wycinków ostrego rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach istoty żelatynowej

Przedstawiona tutaj jest metoda mechanicznego fenotypowania pojedynczych komórek za pomocą opartej na elektronice platformy mikroprzepływowej zwanej mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). Platforma ta utrzymuje umiarkowaną przepustowość 1-10 komórek/s, mierząc zarówno elastyczne, jak i lepkie właściwości biofizyczne komórek.

Mechano-Node-Pore Sensing: szybka, niewymagająca oznaczeń platforma do wieloparametrowych pomiarów lepkosprężystych pojedynczych komórek

Ten protokół przedstawia ilościowe określanie właściwości mechanicznych nowotworowych i nienowotworowych linii komórkowych in vitro. Konserwatywne różnice w mechanice komórek nowotworowych i prawidłowych mogą działać jako biomarker, który może mieć wpływ na rokowanie i diagnozę.

Protokół testu ścinania w celu określenia właściwości materiału jednokomórkowego

Ten protokół opisuje szybką i skuteczną metodę izolowania komórek mięśni gładkich od tętnicy podstawnej szczura i rejestrowania do wewnątrz korygujących prądów kanału potasowego w tych komórkach za pomocą techniki zacisku krosowego dla całych komórek. Stanowi on nowatorskie podejście dla naukowców badających tętnicę podstawną i kanały jonowe.

Rejestracja wewnętrznych prądów prostowniczych K+ w świeżo wyizolowanych komórkach mięśni gładkich tętnicy podstawnej techniką patch clamp

W tym miejscu przedstawiamy protokół wytwarzania unikalnego dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego do badania elektromechanicznej regulacji homeostazy tkanek nabłonkowych. Urządzenie aplikuje statyczne fizjologiczne prądy elektryczne prostopadłe do płaszczyzny tkanki, wpływając na adhezję, proliferację i wytłaczanie komórki. Obrazowanie żywych komórek i pomiary naprężeń mechanicznych ujawniają mechanizmy tych procesów.

Ujawnienie elektromechanicznej kontroli homeostazy tkanek za pomocą dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego

Poznaj elektrofizjologiczną metodę badania mechanosensywnych kanałów jonowych aktywowanych przez naprężenie ścinające w zmodyfikowanej komorze przepływowej. Technika umożliwia analizę w czasie rzeczywistym.

Elektrofizjologiczne zapisy prądów jonowych pojedynczych ogniw pod wpływem dobrze zdefiniowanego naprężenia ścinającego

Przeglądaj więcej filmów