Pomiar przewodnictwa i ruchliwości plemników w hermafrodytowym układzie rozrodczym Caenorhabditis elegans

Metoda ta stanowi narzędzie dla naukowców do badania środowiskowych czynników genetycznych, które wpływają na migrację plemników i zachowanie w ich naturalnym środowisku w żeńskim układzie rozrodczym. Główną zaletą tej techniki jest przezroczysty naskórek C.elegans, który pozwala eksperymentatorom łatwo wizualizować i rejestrować ruch plemników u żywych zwierząt. Na początek użyj kilofa ślimakowego wykonanego z pipety Pasteura i platynowego drutu spłaszczonego na jednym końcu, aby wybrać od 20 do 30 hermafrodytów etapu L4 i delikatnie umieść je na sześciocentymetrowej płytce NGM z nasionami.

Inkubuj hermafrodyty w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 28 do 30 godzin. Następnie wykonaj męską płytkę do barwienia. Użyj końca szklanego pręta do mieszania, aby zeskrobać E. coli z bakteryjnego trawnika na talerzu z nasionami i umieść go na środku nieobsianej płytki NGM, tworząc kropkę żywności o średnicy od pięciu do siedmiu milimetrów.

Wymieszaj ze sobą dwa mikrolitry jednomilimolowego barwnika mito-barwnika w DMSO i 10 mikrolitrów buforu M9 w probówce do mikrowirówki. Odpipetuj cały roztwór mito-dye na kropkę żywności na męskiej płytce barwiącej. Umieść talerz w ciemności do wyschnięcia na 30 minut.

Pod mikroskopem, na płytce zawierającej dorosłe osobniki C.elegans w wieku od jednego do trzech dni, zidentyfikuj samce po ich ogonie w kształcie wachlarza. Wybierz około 100 samców do plamki żywności poplamionej barwnikiem mito na męskiej płytce barwiącej. Zawiń płytkę w folię aluminiową i inkubuj przez noc w temperaturze 16 stopni Celsjusza.

Drugiego dnia przenieś wybarwione samce na nową płytkę NGM z nasionami, aby usunąć nadmiar bakterii barwionych mitobarwnikiem. Trzymaj talerz w ciemności do momentu krycia. Aby zrobić płytkę łączącą, na nieobsianej płytce NGM wlej dwa mikrolitry gęstej mieszanki E. coli.

Odczekaj około 10 do 15 minut, aż grube bakterie wyschną, tworząc kropkę godową. Czekając, aż płytka współpracująca wyschnie, wymieszaj ze sobą 300 mikrolitrów trikainy o zawartości 1% objętości, 300 mikrolitrów tetramizolu o zawartości 0,1% objętości i 900 mikrolitrów M9. Przenieść 600 mikrolitrów roztworu tetramizolu/trikainy do szkiełka zegarkowego. Przenieś od 12 do 15 hermafrodytów zebranych pierwszego dnia do roztworu tetramizolu/trikainy na szkiełku zegarka.

Umieść dolną połowę szalki Petriego na szkiełku zegarka, aby nie uległa parowaniu, i inkubuj przez 30 minut, aby unieruchomić hermafrodyty. Następnie odzyskaj z ciemności płytkę z nasionami NGM, która zawiera poplamione samce, i wybierz od 50 do 60 poplamionych samców na wysuszoną kropkę godową na płytce godowej. Przechowuj płytkę w ciemności.

Po unieruchomieniu hermafrodytów użyj szklanej pipety Pasteura, aby zebrać unieruchomione hermafrodyty ze szkła zegarka. Unikaj zasysania hermafrodytów poza wąską część pipety. Przenieś hermafrodyty na nieobsianą płytkę NGM.

Usuń jak najwięcej płynu i pozostaw nadmiar płynu do wyschnięcia. Jak tylko cała widoczna ciecz wyparuje, przenieś znieczulone hermafrodyty na kropkę godową z barwionymi samcami. Wysiaduj w ciemności przez 30 minut, aby umożliwić krycie.

Jeśli pożądana jest ocena dystrybucji plemników, przenieś sparowane hermafrodyty na wysiewaną płytkę NGM i pozwól im odpocząć przez godzinę przed zamontowaniem w celu wizualizacji. Aby zamontować robaki do wizualizacji, najpierw wlej od 10 do 15 mikrolitrów roztworu tetramizolu/trikainy na przygotowaną 2% podkładkę agarozową i przenieś połączone hermafrodyty do roztworu na podkładce. Umieść szkiełko nakrywkowe na robakach.

Zamontuj szkiełko na pionowym mikroskopie wyposażonym w epifluorescencję i ustaw robaka tak, aby zarówno srom, jak i jedna spermateka były w zasięgu wzroku. Ustaw ostrość obrazu, skupiając się na środku spermateki. Sprawdź ekspozycję zarówno dla kanałów DIC, jak i TRITC.

W DIC wyraźnie widoczne są wewnętrzne struktury robaków. W TRITC poszczególne plemniki są widoczne jako odrębne punkty. Uzyskaj obrazy DIC i fluorescencji dla każdej macicy.

Aby nagrać filmy poklatkowe, najpierw zlokalizuj hermafrodyty, które zawierają oznaczone plemniki w macicy. Na panelu Akwizycja dostosuj interwały uzyskiwania obrazu do 15 do 30 sekund, a czas trwania do 10 do 20 minut na macicę. Następnie kliknij przycisk Uruchom, aby uzyskać obrazy poklatkowe w kanałach DIC i TRITC.

Zaczynając od sromu na jednym końcu i spermateki na drugim, podziel macicę na trzy strefy, ze strefą zawierającą srom i strefą trzecią zawierającą spermatekę. Ręcznie policz liczbę plemników w każdej trzeciej macicy i podaj liczbę w każdej strefie jako procent całkowitej liczby plemników w całej macicy. W razie potrzeby skorzystaj z tabeli przeglądowej, aby dostosować intensywność sygnału obrazów kanału TRITC, tak aby każdy plemnik mógł być widoczny i określony ilościowo.

Aby śledzić plemniki na zdjęciach poklatkowych, użyj oprogramowania Fiji do analizy. Użyj funkcji Import Bio-Formats, aby zaimportować obrazy z jednej serii poklatkowej jako jeden hyperstack. Następnie kliknij Wtyczki, Śledzenie, a następnie Śledzenie ręczne.

W otwartym oknie dialogowym wybierz narzędzie TrackMate na pasku narzędzi Fidżi. Kliknij dwukrotnie plemniki, które będą śledzone. Kliknij wewnątrz wyświetlonego zielonego okręgu z przerywanymi liniami i przeciągnij do żądanej pozycji.

Kliknij ponownie kółko. Przerywana zielona linia zamienia się w ciągłą zieloną linię. Jednocześnie naciśnij Shift i L, aby włączyć tryb śledzenia.

Przejdź do następnej klatki z serii poklatkowej. Aby ustawić nową lokalizację śledzonego plemnika w nowej ramce, najedź myszką na nowy punkt i naciśnij A. Podręczny element śledzący pojawi się w nowym miejscu i pojawi się linia łącząca lokalizację, w której podręczny element śledzący został umieszczony w poprzedniej klatce.

Powtórz tę samą procedurę dla pozostałych klatek. Po zakończeniu śledzenia kliknij przycisk Analizuj w oknie dialogowym TrackMate, aby wygenerować potrzebne dane. Aby obliczyć prędkość, podziel całkowitą długość drogi plemników przez czas, który upłynął.

Aby obliczyć prędkość wektorową, narysuj linię biegnącą przez macicę, zaczynając od sromu, kierując się w stronę spermateki. Użyj narzędzia Linia, aby zmierzyć odległość, jaką plemniki przebyły wzdłuż tej linii od początku do końca śladu. Podziel tę odległość przez czas, który upłynął.

Wartości ujemne wskazują, że plemniki odeszły od spermateki. Aby zarejestrować częstotliwość odwrócenia, policz, ile razy ślad plemnika wygenerował kąt mniejszy niż 90 stopni podczas trzech kolejnych klatek poklatkowych. W tym protokole samce robaków fog-2 q71 zostały zabarwione barwnikiem mito-i połączone z hermafrodytami N2 typu dzikiego.

Dorosły hermafrodytyczny układ rozrodczy ma dwa ramiona, które są swoimi lustrzanymi odbiciami. Po kryciu znakowane plemniki są deponowane w macicy hermafrodyty przez srom. Plemniki przemieszczają się wokół rozwijających się zarodków w macicy, w kierunku spermateki, gdzie są przechowywane do momentu zapłodnienia.

Macica hermafrodytowa została podzielona na trzy strefy w celu ilościowego określenia rozmieszczenia i migracji plemników. Aby ocenić prędkość plemników i częstotliwość odwrócenia, tylko plemniki w strefie drugiej były śledzone za pomocą obrazów poklatkowych. Plemniki w strefie pierwszej, zaczynając od sromu, i w strefie trzeciej, w tym spermateka, mają tendencję do poruszania się w okrągłym wzorze.

Plemniki oznaczone czerwonymi i niebieskimi kropkami miały określoną ilościowo prędkość plemników i częstotliwość odwrócenia. Podczas ilościowego określania rozmieszczenia plemników w macicy, właściwe prowadzenie nasienia przy użyciu hermafrodytów N2 typu dzikiego i samców mgły-2 q71 spowodowało, że około 90% znakowanych plemników dotarło do spermateki. Dane nie powinny być liczone, jeśli krycie skutkuje zbyt małą ilością plemników w macicy lub zbyt dużą liczbą plemników w macicy, wypełniających każdą szczelinę.

Ważne jest, aby zwierzęta były traktowane delikatnie podczas każdego etapu przenoszenia, aby hermafrodyty były całkowicie unieruchomione, a płytki i robaki zawierające barwnik mio-barwnik były osłonięte przed światłem. Metoda ta może być połączona z eksperymentami z knockdownem lub knockoutem genów, eksperymentami środowiskowymi lub chemicznymi lub innymi manipulacjami w celu zidentyfikowania czynników, które mogą regulować migrację plemników. Ta technika pozwoliła nam zidentyfikować specyficzne prostaglandyny, które są ważne dla prowadzenia plemników do oocytu.

Te prostaglandyny są syntetyzowane za pomocą niekonwencjonalnego mechanizmu, który może być zachowany u wyższych ssaków. Tetraizol, trikaina, DMSO działają drażniąco na skórę i oczy i mogą mieć działanie toksyczne w dużych dawkach. Ważne jest, aby nosić odpowiedni sprzęt ochronny podczas obchodzenia się z jakimikolwiek chemikaliami.