Name: Pomiar przewodnictwa i ruchliwości plemników w hermafrodytowym układzie rozrodczym Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Poznaj metodę pomiaru migracji plemników w macicy hermafrodyty C. elegans. Technika wykorzystuje przezroczystość organizmu do wizualizacji ruchu plemników w czasie rzeczywistym i analizy ich dystrybucji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdecznie dziękujemy naszemu zmarłemu mentorowi, dr Michaelowi Millerowi, za jego inspirujący i bezinteresowny mentoring oraz stworzenie tej metody jako narzędzia do lepszego zrozumienia komunikacji plemników i oocytów. Jego nagłe odejście było ogromną stratą dla jego rodziny, laboratorium i społeczności naukowej. Badanie to było wspierane przez NIH (R01GM085105 do MAM i F30HD094446 do MH). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

UWAGA: Wszystkie etapy tego protokołu są wykonywane w temperaturze pokojowej (~20-22 °C) lub w inkubatorach o stałej temperaturze ustawionych na 16 °C lub 20 °C. Samce i hermafrodyty C. elegans są hodowane w standardowych warunkach hodowli z wykorzystaniem E. coli szczepów NA22 lub OP50 jako źródła pożywienia21,22. W poniższej procedurze wykorzystuje się hermafrodyty typu dzikiego N2 oraz samce fog-2(q71).
1. Dzień 1: Wybieranie hermafrodyt w stadium L4 do kopulacji
<ol>
	<li>Aby uzyskać spójne wyniki, wszystkie hermafrodyty powinny zostać zsynchronizowane jako dorośli osobniki w fazie aktywnej reprodukcji. Przenieś 20-30 hermafrodyt w stadium L4 na 6 cm płytkę z podłożem NGM (nematode growth medium). Inkubuj hermafrodyty w temperaturze 20 °C przez 28-30 h. 
	UWAGA: Do kopulacji zostanie wykorzystanych tylko 12-15 hermafrodyt. Pozostałe osobniki stanowią zapas.</li>
</ol>
2. Dzień 1: Barwienie samców fluorescencyjnym barwnikiem mitochondrialnym (Mito-dye)
<ol>
	<li>Przygotuj płytkę do barwienia samców, umieszczając kropkę E. coli (kropkę z pożywką) w centrum nieposianej płytki NGM. Aby przygotować kropkę z pożywką, należy za pomocą końcówki szklanej bagietki zebrać E. coli z trawnika bakteryjnego na posianej płytce i przenieść ją na płytkę nieposianą. Kropka powinna mieć średnicę ok. 5-7 mm.</li>
	<li>Wymieszaj 2 µL 1 mM mito-dye (patrz Tabela materiałów) w DMSO oraz 10 μL buforu M9 (3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O do 1 L. MgSO4 należy dodać po autoklawowaniu). Pipetą nanieś cały roztwór mito-dye na kropkę z pożywką na płytce do barwienia samców. Pozostaw płytkę do wyschnięcia w ciemności (ok. 30 min). 
	UWAGA: Mito-dye jest światłoczuły. Wszystkie roztwory, płytki i nicienie zawierające mito-dye należy chronić przed światłem. Roztwór stokowy 1 mM należy przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przenieś ok. 100 dorosłych samców w wieku 1-3 dni23 na zabarwioną mito-dye kropkę z pożywką na płytce do barwienia samców. Owiń płytkę folią aluminiową i inkubuj przez noc w temperaturze 16 °C. Do kojarzenia użyj ok. 50-60 samców na 12-15 hermafrodytów. Jeśli potrzeba więcej niż ok. 100 samców, przygotuj więcej płytek do barwienia, aby zapobiec nadmiernemu zagęszczeniu samców. 
	UWAGA: Samce można również barwić poprzez inkubację w 10 μM roztworze mito-dye w buforze M9 przez 3 h na szkiełku zegarkowym. Nicienie powinny być przykryte, aby zapobiec odparowaniu i ekspozycji na światło. Po 3 h użyj pipety Pasteura, aby przenieść samce na posianą płytkę NGM o średnicy 10 cm. Przenieś jak najmniejszą ilość roztworu mito-dye. Owiń płytkę folią aluminiową i inkubuj przez noc w temperaturze 16 °C.</li>
</ol>
3. Dzień 2: Kojarzenie
<ol>
	<li>Przenieś zabarwione samce z Dnia 1 na nową, zasiającą płytkę NGM. Przechowuj płytkę w ciemności do momentu kopulacji. Krok ten zapewnia usunięcie nadmiaru bakterii zabarwionych barwnikiem mitochondrialnym znajdujących się wokół samców. Przeniesienie nadmiaru zabarwionych bakterii na płytkę do kopulacji może doprowadzić do zabarwienia tkanek hermafrodyta.</li>
	<li>Przygotuj płytkę do kopulacji, nakładając 2 μL gęstej zawiesiny E. coli na niezasianą płytkę NGM. Pozostaw gęste bakterie do wyschnięcia, aby utworzyć punkt kopulacyjny. Samce i hermafrodyty zostaną przeniesione na ten punkt w celu kopulacji. Aby przygotować gęstą zawiesinę E. coli, odwirować 3 mL hodowli nocnej E. coli i resuspender osad bakteryjny w 1 mL pożywki M9. Zawiesinę tę można przechowywać w temperaturze 4 °C i wykorzystywać ponownie przez maksymalnie 6 miesięcy. 
	UWAGA: Gęstość roztworu E. coli można dostosować. Jeśli roztwór będzie zbyt rzadki, samce mogą odpełznąć od punktu kopulacyjnego zamiast gromadzić się w nim w celu kopulacji. Punkty kopulacyjne wykonane ze zbyt gęstego roztworu E. coli mogą obniżyć efektywność kopulacji.</li>
	<li>Podczas wysychania płytki do kopulacji z kroku 3.2, wymieszaj 300 μL 1% (w/v) trikainy (Tri), 300 μL 0,1% (w/v) tetramizolu (Tet) oraz 900 μL pożywki M9. 
	UWAGA: 1% (w/v) trikainę i 0,1% (w/v) tetramizol należy przechowywać w formie aliquotów w temperaturze -20 °C. Należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.</li>
	<li>Przenieś 600 μL roztworu Tet/Tri na szkiełko zegarkowe.</li>
	<li>Przenieś 12-15 hermafrodytów pobranych w Dniu 1 do roztworu Tet/Tri na szkiełku zegarkowym. Inkubuj przez 30 min, aby unieruchomić hermafrodyty. Przykryj szkiełko zegarkowe, aby zapobiec odparowaniu roztworu Tet/Tri. 
	UWAGA: Ważne jest, aby hermafrodyty były znieczulone przez co najmniej 30 min. Krótszy czas może spowodować ruchy nicieni podczas akwizycji obrazu, co może zakłócać obrazowanie.</li>
	<li>Podczas inkubacji hermafrodytów, przenieś 50-60 zabarwionych samców z kroku 3.1 na punkt kopulacyjny (krok 3.2). Przechowuj płytkę w ciemności aż do kroku 3.8.</li>
	<li>Po 30-minutowej inkubacji w roztworze Tet/Tri, za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś unieruchomione hermafrodyty ze szkiełka zegarkowego na niezasianą płytkę NGM. Usuń jak największą ilość cieczy i poczekaj, aż nadmiar cieczy wyschnie. 
	UWAGA: Nie dopuść do nadmiernego wyschnięcia hermafrodytów. Gdy tylko cała widoczna ciecz odparuje, rozpocznij kolejny krok.</li>
	<li>Przenieś znieczulone hermafrodyty z niezasianej płytki NGM na punkt kopulacyjny z zabarwionymi samcami. Inkubuj w ciemności przez 30 min, aby umożliwić kopulację samców z hermafrodytami.</li>
	<li>Po 30 minutach kopulacji niezwłocznie zamontuj hermafrodyty do obrazowania time-lapse lub przenieś je na nową, zasiającą płytkę NGM, aby odpoczęły przez 1 h przed obrazowaniem. 
	UWAGA: Filmy time-lapse z macicy hermafrodyta służą do ilościowego określenia prędkości plemników i częstotliwości ich cofania się. Statyczne obrazy macicy wykonane 1 h po kopulacji służą do ilościowego określenia rozmieszczenia plemników lub ich prowadzenia (guidance).</li>
</ol>
4. Dzień 2: Montowanie nicieni do wizualizacji
<ol>
	<li>Przygotowanie podkładki montażowej z 2% agarozy w H2O 
	UWAGA: 2% agaroza może być przygotowana w większej ilości, rozdzielona na alikwoty do szklanych probówek i przechowywana w temperaturze 4 °C. W razie potrzeby każdą alikwotę można podgrzać w kuchence mikrofalowej przed użyciem i przechowywać w bloku grzejnym, aby zapobiec jej zestaleniu.
	<ol>
		<li>Aby przygotować podkładkę montażową, ułóż trzy szklane szkiełka przedmiotowe obok siebie tak, aby ich długie krawędzie się stykały. Naklej dwa kawałki taśmy maskującej jeden na drugim na oba zewnętrzne szkiełka. Zewnętrzne szkiełka z taśmą będą pełnić rolę podpór, dzięki czemu grubość powstałej podkładki agarowej będzie odpowiadać grubości „dwóch warstw taśmy”.</li>
		<li>Nanieś ~75 μL roztopionej 2% agarozy na środkowe szkiełko (szkiełko bez taśmy). Natychmiast połóż na agarozie nowe szklane szkiełko przedmiotowe. Górne szkiełko powinno być ustawione prostopadle do pozostałych, a jego końce powinny opierać się na taśmach dwóch szkiełeczek wspierających.</li>
		<li>Pozostaw agarozę do stężenia (~30 s). Ostrożnie usuń górne szkiełko, zsuwając je z podkładki agarowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nanieś 10-15 μL roztworu Tet/Tri na podkładkę z 2% agarozy. Przenieś skojarzone hermafrodyty na podkładkę. Należy zadbać o to, aby przenieść jak najmniej bakterii.</li>
	<li>Przykryj nicienie na podkładce agarowej szkiełkiem nakrywnym.</li>
</ol>
5. Dzień 2: Konfiguracja akwizycji obrazu
UWAGA: Do pozyskiwania obrazów rozkładu plemników można użyć dowolnego mikroskopu biologicznego wyposażonego w epi-fluorescencję, obiektywy 10x i 60x oraz kamerę cyfrową. Do oceny prędkości plemników, prędkości kierunkowej oraz częstotliwości cofania się wymagane jest oprogramowanie umożliwiające akwizycję obrazów w odstępach czasowych (time-lapse).
<ol>
	<li>Pozyskiwanie obrazów 1 h po kopulacji
	<ol>
		<li>Umieść preparat na stoliku mikroskopu. Patrząc przez okulary, wyszukaj nicienie na podkładce agarowej, używając obiektywu 10x z filtrem emisji fluorescencji czerwonej (filtr TRITC). Po znalezieniu nicienia krótko włącz światło fluorescencyjne, aby sprawdzić, czy doszło do kopulacji. Jeśli w macicy widoczny jest plemnik, przełącz na obiektyw 60x. 
		UWAGA: Nacisk wywierany przez obiektyw 60x na szkiełko nakrywowe może uszkodzić niektóre delikatne nicienie, powodując wypadnięcie jelita lub gonady z organizmu. Przesiewanie w celu znalezienia osobników po kopulacji przy użyciu obiektywu 10x może zminimalizować narażenie nicieni na dodatkowy nacisk. Nie wystawiaj kopulujących nicieni na przedłużony czas działania światła fluorescencyjnego.</li>
		<li>Używając mikroskopii kontrastowej DIC (Differential Interference Contrast), ustaw nicienia tak, aby zarówno wulwa, jak i jedna spermateka były w polu widzenia. Ustaw ostrość obrazu, koncentrując się na środku spermateki. Sprawdź ekspozycję dla kanałów DIC i TRITC. W obrazie DIC wewnętrzne struktury nicienia powinny być wyraźnie widoczne. W kanale TRITC poszczególne plemniki powinny być widoczne jako wyraźne punkty. 
		UWAGA: Każdy obraz powinien obejmować macicę od wulwy do jednej ze spermatek. Jeśli macica jest zbyt długa, aby zmieścić się na jednym obrazie, można wykonać dwa osobne zdjęcia. Nie jest konieczne, aby wszystkie obrazy były wykonywane przy tym samym poziomie ekspozycji. Ważne jest jednak, aby poszczególne plemniki można było rozróżnić i policzyć na obrazach fluorescencyjnych.</li>
		<li>Pozyskaj obrazy DIC i fluorescencyjne dla każdej macicy.</li>
		<li>Powtarzaj kroki 5.1.1-5.1.3, aż do wykonania obrazowania wszystkich kopulujących hermafrodytów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nagrywanie filmów time-lapse
	<ol>
		<li>Przeskanuj podkładkę agarową i zlokalizuj hermafrodytów z oznakowanymi plemnikami w macicy, zgodnie z opisem w krokach 5.1.1 i 5.1.2</li>
		<li>Skonfiguruj oprogramowanie do pozyskiwania obrazów time-lapse w kanałach DIC i TRITC. Zazwyczaj obrazy time-lapse wykonuje się w odstępach 15-30 s przez 10-20 min dla każdej macicy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja
<ol>
	<li>Ilościowe określanie rozmieszczenia plemników na obrazach macicy wykonanych 1 h po kopulacji
	<ol>
		<li>Podziel macicę na trzy równe części, przyjmując sromkę jako jeden koniec i spermatekę jako drugi. Będą one reprezentować trzy strefy. Strefa 1 (Z1) zawiera sromkę, a Strefa 3 (Z3) zawiera spermatekę.</li>
		<li>Ręcznie oblicz liczbę plemników w każdej jednej trzeciej macicy i przedstaw liczbę w każdej strefie jako procent całkowitej liczby plemników w całej macicy. Poniżej przedstawiono przykład. 
		<img alt="Wzór na rozmieszczenie plemników (%Plemników w Z3 = Z3/(Z1+Z2+Z3)). Równanie matematyczne." src="/files/ftp_upload/59783/59783eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie"> 
		UWAGA: Czasami konieczna jest regulacja intensywności sygnału obrazu w kanale TRITC, aby każdy plemnik uchwycony na obrazie był widoczny i mógł zostać zliczony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Śledzenie plemników na obrazach z serii poklatkowej 
	UWAGA: W niniejszej pracy do analizy wykorzystano oprogramowanie NIS-Elements. W poniższych sekcjach podajemy instrukcje dotyczące ręcznego śledzenia plemników przy użyciu tego oprogramowania (krok 6.2.1), jak również otwartoźródłowego oprogramowania ImageJ/Fiji (krok 6.2.2).
	<ol>
		<li>Śledzenie plemników za pomocą NIS-Elements
		<ol>
			<li>Otwórz plik .nd2 z serią poklatkową do śledzenia. Aby rozpocząć śledzenie, otwórz panel Tracking, klikając prawym przyciskiem myszy w oprogramowaniu i wybierając Analysis Controls | Tracking.</li>
			<li>W panelu śledzenia wybierz Define New ROI. Zdefiniuj każdy obszar zainteresowania (ROI), klikając na każdy plemnik, który ma być śledzony. Nad wybranym plemnikiem pojawi się kolorowy znacznik. Kliknij Finish po wybraniu wszystkich ROI.</li>
			<li>Po zidentyfikowaniu ROI przejdź do następnej klatki w serii poklatkowej. Przeciągnij znacznik ROI do nowej pozycji plemnika na obrazie. Powtarzaj tę czynność, dopóki śledzenie plemnika nie stanie się niemożliwe. Pojawią się linie przerywane łączące wszystkie miejsca, w których znacznik ROI został umieszczony we wszystkich klatkach obrazu poklatkowego. 
			UWAGA: Śledzić należy tylko plemniki w Strefie 2, ponieważ plemniki w Strefach 1 i 3 mają tendencję do poruszania się po okręgu, nawet u zwierząt typu dzikiego.</li>
			<li>Wyeksportuj wszystkie mierzalne dane (np. długość ścieżki, czas, pozycję XY itp.) z aktualnie śledzonych plemników do dokumentu Excel, klikając Export w panelu Tracking.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Śledzenie plemników za pomocą Fiji
		<ol>
			<li>Konwertuj obrazy z kanału TRITC w serii poklatkowej na pliki .tif. Zapisz wszystkie pliki z jednej serii w jednym folderze.</li>
			<li>Zaimportuj obrazy do programu Fiji, korzystając z funkcji importu BioFormats. Zaimportuj obrazy z jednej serii poklatkowej jako jeden hyperstack.</li>
			<li>Otwórz TrackMate w programie Fiji24 poprzez Plugins | Tracking | Manual tracking with TrackMate. Otworzy się okno dialogowe.</li>
			<li>Wybierz narzędzie TrackMate na pasku narzędzi Fiji. Dwukrotnie kliknij plemnika, który ma być śledzony. Pojawi się zielone koło z przerywanymi liniami. Koło to można przesunąć, klikając w jego wnętrzu i przeciągając w pożądane miejsce. Rozmiar koła można zmienić, jednocześnie naciskając klawisz ALT i przesuwając kółko myszy.</li>
			<li>Po ustawieniu rozmiaru i pozycji znacznika kliknij ponownie w koło. Przerywane zielone linie zamienią się w ciągłą zieloną linię. Jednocześnie naciśnij klawisze SHIFT i L, aby włączyć tryb śledzenia. Zostanie to zasygnalizowane na pasku narzędzi Fiji.</li>
			<li>Przejdź do następnej klatki w serii poklatkowej. Aby ustawić nową lokalizację śledzonego plemnika w nowej klatce, najedź myszą nad nowy punkt i naciśnij klawisz A. Znacznik pojawi się teraz w nowej lokalizacji, a linie połączą miejsca, w których znacznik został umieszczony w poprzednich klatkach.</li>
			<li>Po zakończeniu wykreślania ścieżek kliknij Analyze w oknie dialogowym TrackMate, aby wygenerować potrzebne dane.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aby obliczyć prędkość, podziel całkowitą długość ścieżki plemnika przez upływ czasu.</li>
		<li>Aby obliczyć prędkość wektorową, narysuj linię przez macicę, zaczynając od sromki i kierując się w stronę spermateki. Zmierz odległość, o jaką plemnik przemieścił się wzdłuż tej linii od początku do końca ścieżki. Podziel tę odległość przez upływ czasu. Wartości ujemne oznaczają, że plemnik przemieścił się w kierunku przeciwnym do spermateki.</li>
		<li>Aby zapisać częstotliwość odwrócenia kierunku, policz liczbę razy, w których ścieżka plemnika utworzyła kąt mniejszy niż 90° w ciągu trzech kolejnych klatek serii poklatkowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Boryshpolets, S., Perez-Cerezales, S., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+mechanism+of+human+sperm+in+thermotaxis%3A+a+role+for+hyperactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Behavioral mechanism of human sperm in thermotaxis: a role for hyperactivation.</a> Human Reproduction. 30 (4), 884-892 (2015).</li>
<li>Edmonds, J. W., McKinney, S. L., Prasain, J. K., Miller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gap+junctional+protein+INX-14+functions+in+oocyte+precursors+to+promote+C.+elegans+sperm+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The gap junctional protein INX-14 functions in oocyte precursors to promote C. elegans sperm guidance.</a> Developmental Biology. 359 (1), 47-58 (2011).</li>
<li>Edmonds, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin%2FFOXO+signaling+regulates+ovarian+prostaglandins+critical+for+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction.</a> Developmental Cell. 19 (6), 858-871 (2010).</li>
<li>Espinal-Enriquez, J., Priego-Espinosa, D. A., Darszon, A., Beltran, C., Martinez-Mekler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+model+predicts+that+CatSper+is+the+main+Ca%282%2B%29+channel+in+the+regulation+of+sea+urchin+sperm+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Network model predicts that CatSper is the main Ca(2+) channel in the regulation of sea urchin sperm motility.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4236(2017).</li>
<li>Hunter, R. H., Nichol, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preovulatory+temperature+gradient+between+the+isthmus+and+ampulla+of+pig+oviducts+during+the+phase+of+sperm+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility%22%5BJournal%5D)">A preovulatory temperature gradient between the isthmus and ampulla of pig oviducts during the phase of sperm storage.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 77 (2), 599-606 (1986).</li>
<li>Hussain, Y. H., Guasto, J. S., Zimmer, R. K., Stocker, R., Riffell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis+promotes+individual+fertilization+success+in+sea+urchins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis promotes individual fertilization success in sea urchins.</a> Journal of Experimental Biology. 219 (Pt 10), 1458-1466 (2016).</li>
<li>Kantsler, V., Dunkel, J., Blayney, M., Goldstein, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheotaxis+facilitates+upstream+navigation+of+mammalian+sperm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Rheotaxis facilitates upstream navigation of mammalian sperm cells.</a> Elife. 3, e02403(2014).</li>
<li>Kubagawa, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+signals+derived+from+polyunsaturated+fatty+acids+control+sperm+recruitment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Oocyte signals derived from polyunsaturated fatty acids control sperm recruitment in vivo.</a> Nature Cell Biology. 8 (10), 1143-1148 (2006).</li>
<li>Miki, K., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheotaxis+guides+mammalian+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Rheotaxis guides mammalian sperm.</a> Current Biology. 23 (6), 443-452 (2013).</li>
<li>Ting, J. J., Tsai, C. N., Schalkowski, R., Cutter, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Contributions+to+Ectopic+Sperm+Cell+Migration+in+Caenorhabditis+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Genetic Contributions to Ectopic Sperm Cell Migration in Caenorhabditis Nematodes.</a> G3. 8 (12), Bethesda. 3891-3902 (2018).</li>
<li>Yanagimachi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physical+guidance+of+fish+spermatozoa+into+the+egg+through+the+micropyledagger%2C+double+dagger%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Chemical and physical guidance of fish spermatozoa into the egg through the micropyledagger, double dagger.</a> Biology of Reproduction. 96 (4), 780-799 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Gradients+on+a+Microfluidic+Device%3A+Toward+a+High-Throughput+Investigation+of+Spermatozoa+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Generation of Gradients on a Microfluidic Device: Toward a High-Throughput Investigation of Spermatozoa Chemotaxis.</a> PloS One. 10 (11), e0142555(2015).</li>
<li>Hoang, H. D., Miller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+and+hyperoxia+circuits+in+C.+elegans+males+influence+sperm+navigational+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemosensory and hyperoxia circuits in C. elegans males influence sperm navigational capacity.</a> PLoS Biology. 15 (6), e2002047(2017).</li>
<li>Hansen, J. M., Chavez, D. R., Stanfield, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COMP-1+promotes+competitive+advantage+of+nematode+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">COMP-1 promotes competitive advantage of nematode sperm.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>L'Hernault, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+Elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-14 (2006).</li>
<li>Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sperm+cytoskeletal+protein+that+signals+oocyte+meiotic+maturation+and+ovulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation.</a> Science. 291 (5511), 2144-2147 (2001).</li>
<li>Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+oocyte+meiotic+maturation+and+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+Elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of oocyte meiotic maturation and fertilization.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-12 (2005).</li>
<li>O'Hagan, R., Wang, J., Barr, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating+behavior%2C+male+sensory+cilia%2C+and+polycystins+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mating behavior, male sensory cilia, and polycystins in Caenorhabditis elegans.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 33, 25-33 (2014).</li>
<li>Hoang, H. D., Prasain, J. K., Dorand, D., Miller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterogeneous+mixture+of+F-series+prostaglandins+promotes+sperm+guidance+in+the+Caenorhabditis+elegans+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A heterogeneous mixture of F-series prostaglandins promotes sperm guidance in the Caenorhabditis elegans reproductive tract.</a> PLoS Genetics. 9 (1), e1003271(2013).</li>
<li>McKnight, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosensory+perception+of+environmental+cues+modulates+sperm+motility+critical+for+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neurosensory perception of environmental cues modulates sperm motility critical for fertilization.</a> Science. 344 (6185), 754-757 (2014).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), (2011).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+Elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Chatterjee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+fertility+decline+in+aging+C.+elegans+males+is+associated+with+mating+execution+deficits+rather+than+diminished+sperm+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Dramatic fertility decline in aging C. elegans males is associated with mating execution deficits rather than diminished sperm quality.</a> Experimental Gerontology. 48 (11), 1156-1166 (2013).</li>
<li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. , 80-90 (2017).</li>
<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+Window+into+Biology%3A+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Sato, M., Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+paternal+mitochondria+by+fertilization-triggered+autophagy+in+C.+elegans+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos.</a> Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+specificity+of+paternal+mitochondrial+elimination+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Kinetics and specificity of paternal mitochondrial elimination in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 7, 12569(2016).</li>
<li>Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-dependent+cytoplasmic+streaming+in+C.+elegans+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis.</a> Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).</li>
<li>Mottram, L. F., Forbes, S., Ackley, B. D., Peterson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+analogues+of+rhodamine+B+and+rhodamine+101%3A+potent+fluorescent+probes+of+mitochondria+in+living+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Beilstein+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic analogues of rhodamine B and rhodamine 101: potent fluorescent probes of mitochondria in living C. elegans.</a> Beilstein Journal of Organic Chemistry. 8, 2156-2165 (2012).</li>
<li>Singson, A., Hill, K. L., L'Hernault, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+competition+in+the+absence+of+fertilization+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sperm competition in the absence of fertilization in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 152 (1), 201-208 (1999).</li>
<li>Wu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+development+and+motility+are+regulated+by+PP1+phosphatases+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sperm development and motility are regulated by PP1 phosphatases in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 190 (1), 143-157 (2012).</li>
<li>Seidel, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+sperm-delivered+toxin+causes+late-stage+embryo+lethality+and+transmission+ratio+distortion+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel sperm-delivered toxin causes late-stage embryo lethality and transmission ratio distortion in C. elegans.</a> PLoS Biology. 9 (7), e1001115(2011).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Zdolność plemników do poruszania się po zawiłych żeńskich drogach rozrodczych i znajdowania oocytów ma kluczowe znaczenie dla rozmnażania płciowego. Ostatnie badania z wykorzystaniem nasienia zwierząt zapładniających wewnętrznie sugerują, że aktywnie reagują one na różne sygnały środowiskowe, w tym sygnały chemiczne, przepływ płynów i gradienty temperatury 1,5,7,9,12. Jednak obserwacje te w dużej mierze wynikają z eksperymentów in vitro i niewiele wiadomo na temat zachowania plemników i komunikacji w drogach rodnych. Jedną z głównych barier w pozyskiwaniu danych in vivo na temat migracji i ruchliwości plemników jest brak widoczności w większości żeńskich dróg rodnych. Opisana przez nas metoda z użyciem C. elegans pokonuje to ograniczenie. Jak pokazują reprezentatywne wyniki, przezroczysty naskórek pozwala na bezpośrednią wizualizację i śledzenie każdego plemnika w rozdzielczości pojedynczej komórki w żywym, nienaruszonym organizmie.
C. elegans ma dwie płcie. Samce, o genotypie XO, produkują tylko plemniki i w tej metodzie są wykorzystywane jako dawcy nasienia. Hermafrodyty o genotypie XX są zmodyfikowanymi samicami. Ich gonady najpierw ulegają spermatogenezie w czwartym stadium larwalnym i przechodzą w oogenezę w wieku dorosłym25. W teście tym wykorzystuje się dorosłe hermafrodyty, których tkanki rozrodcze stanowią model żeńskiego układu rozrodczego. Wykorzystanie obu płci w tym teście pozwala nam zidentyfikować szlaki genetyczne i molekularne zarówno u samców, jak i kobiet, które mogą regulować przewodnictwo i ruchliwość plemników. W połączeniu z całym szeregiem technik genetycznych i molekularnych dostępnych dla C. elegans, metoda ta może prowadzić do nowych informacji na temat migracji i ruchliwości plemników, a także komunikacji plemników i oocytów.
Kilka krytycznych kroków w tym protokole wymaga dalszego rozważenia, oprócz szczegółów podanych w sekcji dotyczącej protokołu.
Robaki 
Zmutowane samce Fog-2(Q71), HIM-5(E1490) lub HIM-8(E1489) mogą być używane zamiast samców N2. Mutacje te zwiększają częstość występowania samców w kulturach, ale nie wpływają na kojarzenie samców ani funkcje plemników13. Samice, takie jak samice mgły-2(q71), mogą być używane zamiast hermafrodytów. Jednak samice muszą być wstępnie kryte z samcami, aby umożliwić prawidłowy rozwój oocytów. Obecność zapłodnionych zarodków z tego okresu przed kryciem zapewnia również, że macica jest wystarczająco długa, aby prawidłowo ocenić dystrybucję plemników. Jeśli oceniane są zmutowane lub eksperymentalne hermafrodyty, należy uwzględnić grupę kontrolną (grupy kontrolne). Na przykład zmutowane hermafrodyty powinny być sparowane z hermafrodytami N2 typu dzikiego jako kontrola dla innych zmiennych w teście. Hermafrodyty, które były karmione bakteriami zawierającymi plazmidy do testów interferencji RNA, powinny być również karmione bakteriami zawierającymi kontrolę pustego wektora. Odległość od sromu, w którym plemniki są zapładniane, do spermateki, miejsca zapłodnienia, może się różnić w zależności od liczby komórek jajowych w macicy (tj. macica rozszerza się wraz ze wzrostem liczby komórek jajowych). Jeśli dokonuje się porównań między genotypami, wybierz hermafrodyty, których macice zawierają podobną liczbę jaj. Nie wybieraj hermafrodytów zawierających wylęgające się zarodki lub poruszające się larwy. Można przeprowadzić kurs w czasie w celu określenia optymalnego wieku, w którym należy badać hermafrodyty.
Zbieranie hermafrodytów i samców Ważne jest, aby hermafrodyty wybrane do tego testu nie pochodziły z przerośniętych lub wygłodzonych płytek. Sygnały dotyczące jedzenia i feromonów modulują ekspresję DAF-7, homologu TGFß. Wykazano, że szlak DAF-7 reguluje syntezę prostaglandyn serii F, które odgrywają ważną rolę w kierowaniu plemników do spermateki20. Wybieranie hermafrodytów z przepełnionych lub wygłodzonych talerzy może skutkować słabym prowadzeniem plemników, niezwiązanym z celem zainteresowania. Wydaje się, że gęstość płytek nie wpływa na męskie plemniki. Jednak samce, które są zbyt młode lub zbyt stare, mogą powodować zmniejszenie wydajności krycia (tj. odsetek hermafrodytów na płytce godowej, które mają wystarczającą ilość plemników w macicy, aby określić ilościowo). 1-3 dniowe dorosłe samce są optymalne do tego testu23.
Znieczulanie hermafrodytów W naszych rękach połączenie tetramizolu i trikainy zapewnia, że robaki są unieruchomione i pozostają przy życiu podczas krycia i pozyskiwania obrazu. Można również stosować inne środki znieczulające, takie jak azydek sodu. Jednak azydek sodu jest wysoce toksyczny i warunki muszą być ustandaryzowane. Techniki immobilizacji z użyciem komór mikrogranulek, agarozy i mikrofluidyki nie są zalecane, ponieważ zakłócają krycie.
Barwienie męskie Barwnik mito-użyty w tym manuskrypcie, MitoTrackerCMXRos, był szeroko stosowany do oznaczania plemników, a także innych mitochondriów u C. elegans. Plemniki znakowane tym barwnikiem mito-barwnikowym są w pełni funkcjonalne, zachowując zdolność do aktywacji, migracji, zapłodnienia oocytów i produkcji zdolnego do życia potomstwa26,27. Inne barwniki mitochondrialne, takie jak rodamina 6G i DiOC6, zostały użyte do barwienia mitochondriów C. elegans 28,29. Jednak warunki dla tych barwników muszą być ustandaryzowane do znakowania plemników w tym teście. Oprócz mechanizmów znakowania mitochronriów, barwienia DNA, takie jak Syto17, mogą być również wykorzystywane do znakowania plemników do testów migracji30. Chociaż te techniki znakowania są stosunkowo łatwe i szybkie do wykonania, strategie transgeniczne mogą być również stosowane do generowania plemników, które wyrażają znaczniki fluorescencyjne pod promotorami specyficznymi dla plemników31,32.
Gody Krzyżujące się kropki, które są zbyt grube, mogą zmniejszyć skuteczność krycia. Należy zachować ostrożność, aby przenieść jak najmniej bakterii podczas przenoszenia samców i znieczulonych hermafrodytów na kropkę godową.
Wykonanie płatków agarozowych i umieszczenie szkiełka nakrywkowego W poduszkach agarozowych mogą powstawać pęcherzyki powietrza. Mogą one załamywać światło podczas akwizycji obrazu lub, gdy są wystarczająco duże, powodować wpadanie robaków, uniemożliwiając uzyskanie obrazu. Podobnie, pęcherzyki powietrza mogą tworzyć się wzdłuż hermafrodytów, gdy szkiełko nakrywkowe zostanie nałożone na nie na podkładkę agarozową. Bąbelki te załamują światło i prowadzą do pogorszenia jakości obrazu. Praktyka pomoże zmniejszyć występowanie pęcherzyków powietrza.
Kwantyfikacji Podczas ilościowego określania dystrybucji plemników, różne płaszczyzny Z przez macicę robaka mogą mieć niewielkie różnice w dystrybucji plemników. Okazuje się, że wykonanie pojedynczego zdjęcia skoncentrowanego na spermatece daje nam powtarzalne wyniki, które są podobne do wyników uzyskanych przez uśrednienie wielu przekrojów Z. Zalecamy ustawienie ostrości obrazu na środku spermateki, ale płaszczyzny ogniskowej można nieznacznie zmienić w zależności od potrzeb eksperymentatora. Bardzo ważne jest jednak, aby wszystkie zdjęcia były wykonywane w ten sam sposób. Ponadto ważne jest, aby liczone były tylko plemniki, które są w centrum uwagi. Jest to decyzja licznika w określaniu kryteriów dla nasienia w ostrości. Niezwykle ważne jest jednak, aby kryteria te były systematycznie stosowane do każdego robaka, który jest określany ilościowo. W przypadku śledzenia nasienia wiele programów oferuje funkcje automatycznego śledzenia. Okazuje się jednak, że ręczne śledzenie przewyższa algorytm automatycznego śledzenia oprogramowania z dwóch głównych powodów: 1) Obfitość jąder o podobnej wielkości w ograniczonej przestrzeni utrudnia oprogramowaniu rozróżnienie poszczególnych plemników i utworzenie zdefiniowanych ROI dla każdego plemnika. 2) Gdy plemniki wchodzą i wystają z ostrości, ich intensywność zmienia się, co utrudnia oprogramowaniu śledzenie plemników przez dłuższy czas.

Mechanizmy molekularne, dzięki którym plemniki (określane jako plemniki) przemieszczają się przez żeński układ rozrodczy w kierunku oocytu, nie są dobrze poznane, ale są fundamentalne dla rozmnażania płciowego. Ruchliwość plemników jest bardzo dynamiczna i zależy od silnych sygnałów komunikacyjnych, które zmieniają prędkość plemników i ruchliwość kierunkową1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. C. elegans stał się potężnym modelem do badania ruchu plemników in vivo, ponieważ przezroczysty naskórek hermafrodyty pozwala na śledzenie żywych plemników w rozdzielczości pojedynczej komórki2,3,8,10. Celem pracy jest przedstawienie metod oceny ruchu plemników w obrębie hermafrodytycznej macicy C. elegans.
U gatunków zwierząt, gdzie plemnik i oocyt spotykają się w środowisku zewnętrznym (tj. w środowisku wodnym), plemniki reagują na sygnały chemotaktyczne wydzielane przez oocyty. Sygnały te kierują kierunkiem ruchu plemników, zbliżając je do źródła sygnału4,6,11. Jednak znacznie mniej wiadomo o ruchu plemników u gatunków, które zapładniają się wewnętrznie. Dużym wyzwaniem jest architektura żeńskiego układu rozrodczego, która u większości gatunków jest niedostępna do mikroskopii. Na przykład badania in vitro na ludziach, myszach i świniach dostarczają dowodów na to, że subpopulacje plemników mogą reagować na chemoatraktanty, przepływ płynów i gradienty termiczne1,5,7,9,12. W przypadku tych systemów niemożność wizualizacji i śledzenia ruchu plemników in vivo nakłada poważne ograniczenia na strategie odkrywania kluczowych mechanizmów regulujących te funkcje.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy metody wykorzystujące nicienie C. elegans do bezpośredniej wizualizacji plemników po inseminacji, do pomiaru indywidualnych parametrów migracji plemników in vivo oraz do pomiaru zdolności populacji plemników do celowania w miejsce zapłodnienia. Metody te, wraz z molekularnym i genetycznym zestawem narzędzi C. elegans, ułatwiają odkrywanie chemicznych cząsteczek sygnałowych i maszynerii molekularnej, które regulują zachowania ruchliwości plemników. Na przykład, genetyczne badania przesiewowe mogą być przeprowadzane u hermafrodytów lub samców w celu zidentyfikowania genów, które są niezbędne do efektywnego ruchu plemników in vivo13. Cząsteczki można wstrzykiwać do gonady hermafrodyty w celu przetestowania wpływu na aktywację plemników, prędkość migracji i ruchliwość kierunkową3. Dodatkowo, opisane metody mogą być wykorzystane do monitorowania migracji plemników do ektopowych lokalizacji ciała oraz do oceny konkurencji plemników10,14.
C. elegans występują w naturze jako hermafrodyty i samce (patrz Rysunek 1). Gonada hermafrodytowa ma dwa ramiona w kształcie litery U, które są swoimi lustrzanymi odbiciami. W stadium larwalnym L4 spermatogenezie ulega najbardziej proksymalne komórki rozrodcze (tj. komórki w pobliżu spermateki). Każdy pierwotny spermatocyt wchodzi w mejozę i wytwarza cztery haploidalne spermatydy. Plemniki te są wpychane do spermateki wraz z pierwszym dojrzałym oocytem i ulegają spermiogenezie15. Dorosłe hermafrodyty przechodzą ze spermatogenezy na oogenezę. Oocyty dojrzewają na linii montażowej wzdłuż gonady, przy czym najbardziej dojrzały oocyt znajduje się na bliższym końcu gonady, obok spermateki. Sygnały MSP z plemnika są potrzebne do wywołania dojrzewania mejotycznego i owulacji16,17. Z drugiej strony samce C. elegans mają gonadę w kształcie litery J, która wytwarza tylko plemniki. Spermatydy są przechowywane w pęcherzyku nasiennym. Po kryciu z hermafrodytą lub samicą samiec wkłada kolce w pobliżu ogona do sromu. Plemniki są aktywowane podczas wytrysku, gdy wchodzą w kontakt z płynem nasiennym18. Plemniki C. elegans nie pływają, ponieważ nie są wiciowe. Zamiast tego czołgają się przez układ rozrodczy, używając pseudopoda do poruszania się. Powszechnie wiadomo, że męskie plemniki, które są większe, mają przewagę konkurencyjną nad hermafrodytami spermą14.
W tej metodzie, samce C. elegans pełnią rolę dawcy nasienia i są kojarzone z dorosłymi hermafrodytami. Dorosłe samce są barwione fluorescencyjnym barwnikiem mitochondrialnym w celu wytworzenia znakowanych plemników. Po zdeponowaniu przez srom hermafrodyty plemniki muszą pełzać wokół zarodków w macicy w kierunku spermateki, czyli miejsca zapłodnienia. Przezroczysty naskórek modelu C. elegans pozwala na bezpośrednią wizualizację każdego pojedynczego plemnika podczas jego poruszania się po żeńskim układzie rozrodczym. W ostatnich latach nasze laboratorium z powodzeniem wykorzystało tę metodę, aby zademonstrować znaczenie klasy prostaglandyn serii F w prowadzeniu plemników z sromu do spermateki19,20. Mechanizmy molekularne rządzące jego syntezą przez hermafrodytę i reakcją plemnika są nadal badane. Jednak ta metoda oceny ruchliwości i migracji plemników znacznie ułatwia identyfikację kluczowych graczy, którzy kontrolują komunikację plemników i oocytów u zwierząt zapładniających wewnętrznie. Poniższy protokół opisuje krok po kroku, jak wykonać ten test.

<table><tbody><tr><td>Odczynniki i materiał</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm szalka Petriego</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Fisher</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Rosół LB, Miller</td><td>Fisher</td><td>1426-2</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli szczep NA22</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>NA22</td><td>Albo to, albo OP50 E. coli mogą być używane do C. elegans konserwacji i testowaniu. Oba można kupić w CGC</td></tr><tr><td>N2</td><td>CGC</td><td>N2</td><td></td></tr><tr><td>fog-2(q71)</td><td>CGC</td><td>CB4108</td><td></td></tr><tr><td>Drut platynowy o średnicy 0,25 mm</td><td>Alfa Aesar</td><td>10288</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4" Jednorazowa pipeta Pasteura</td><td>Fisher</td><td>13-678-20A Szkiełko</td><td></td></tr><tr><td>zegarkowe</td><td>Fisher</td><td>02-612A</td><td></td></tr><tr><td>o średnicy 5 mm Pręt</td> <td>szklanyFisher</td><td>50-121-5269</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker CMXRos (Mito-dye)</td><td>Fisher</td><td>M7512</td><td>Tarcza przed światłem, przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Fosforan monopostasowy</td><td>Fisher</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan disodowy</td><td>Fisher</td><td>S374-1</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan dimetylu</td><td>Fisher</td><td>BP231-1</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Fisher</td><td>01-213-102</td><td></td></tr><tr><td>3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian</td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td>Tricaine to nazwa zwyczajowa. Przechowywać w porcjach w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Chlorowodorek tetramizolu</td><td>Sigma</td><td>L9756-5G</td><td>Przechowywać w porcjkwotach w temperaturze -20 °; C</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Fisher</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher</td><td>12-548-A</td><td>18 x 18-1</td></tr><tr><td>Matowe szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</strong</td><td>>Komentarze</td></tr><tr><td>Ekwipunek</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 &deg; C oraz 20 &deg; Inkubatory C</td><td>Fisher</td><td>97-990E</td><td>Ten sam model, ustawiony na różne temperatury.</td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy z oświetlaczem epi-fluorescencyjnym, kamerą oraz obiektywami 10x i 60x</td><td>Oprogramowanie firmy Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>z możliwością akwizycji i śledzenia obrazu</td><td>Nikon</td><td>NIS-elements AR</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>Z tym protokołem można używać dowolnego mikroskopu stereoskopowego, który może być używany do wizualizacji C. elegans</td></tr></tbody></table>

pomiar przewodnictwa i ruchliwości plemników w hermafrodytowym układzie rozrodczym caenorhabditis elegans

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Udane zapłodnienie jest podstawą rozmnażania płciowego, jednak niewiele wiadomo o mechanizmach, które kierują plemniki do oocytów w żeńskim układzie rozrodczym. Podczas gdy badania in vitro sugerują, że plemniki zwierząt zapładniających wewnętrznie mogą reagować na różne sygnały z otoczenia, niemożność wizualizacji ich zachowania w żeńskim układzie rozrodczym stwarza wyzwanie dla zrozumienia migracji i ruchliwości plemników w ich naturalnym środowisku. W tym miejscu opisujemy metodę z użyciem C. elegans, która pokonuje to ograniczenie i wykorzystuje ich przezroczysty naskórek. Samce C. elegans barwione barwnikiem mitochondrialnym są kojarzone z dorosłymi hermafrodytami, które działają jak zmodyfikowane samice i deponują fluorescencyjnie znakowane plemniki w macicy hermafrodytów. Migrację i ruchliwość znakowanych plemników można następnie bezpośrednio śledzić za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego w żywym hermafrodycie. U zwierząt typu dzikiego około 90% oznakowanych plemników pełza przez macicę i dociera do miejsca zapłodnienia, czyli spermateki. Zdjęcia macicy można wykonać 1 godzinę po kryciu, aby ocenić rozmieszczenie plemników w macicy i procent plemników, które dotarły do spermateki. Alternatywnie, zdjęcia poklatkowe mogą być wykonywane natychmiast po kryciu, aby ocenić prędkość plemników, prędkość kierunkową i częstotliwość odwrócenia. Metodę tę można połączyć z innymi narzędziami genetycznymi i molekularnymi dostępnymi dla C. elegans w celu zidentyfikowania nowych mechanizmów genetycznych i molekularnych, które są ważne w regulacji przewodnictwa i ruchliwości plemników w żeńskim układzie rozrodczym.

Aby uzyskać wyniki przedstawione w niniejszej pracy, samce fog-2(q71) zabarwiono barwnikiem mitochondrialnym i skrzyżowano z hermafrodytami typu dzikiego, N2. Rysunek 2 przedstawia ogólny schemat metody, obejmujący przygotowanie nicieni, kojarzenie oraz analizę. Jak pokazano w Filmie 1, trakt rozrodczy dorosłego hermafrodyty składa się z dwóch ramion będących swoimi lustrzanymi odbiciami. Po kopulacji znakowane plemniki są deponowane w macicy hermafrodyty poprzez wulwę. Plemniki przemieszczają się wokół rozwijających się embrionów w macicy w kierunku spermateki, gdzie są przechowywane do momentu zapłodnienia. W miarę jak komórki zarodkowe u dorosłego hermafrodyty rozwijają się w oocyty, proksymalny, najbardziej dojrzały oocyt jest przesuwany do spermateki poprzez skurcze komórek osłonowych. Zapłodnienie następuje, gdy oocyt znajduje się w spermatece.
Aby określić ilość i rozkład plemników oraz ich migrację przez żeński układ rozrodczy, macicę hermafrodyty dzieli się na trzy strefy (Movie 1, Figure 3A). Strefa 1 obejmuje pierwszą trzecią część macicy, zaczynając od vulvy. Strefa 2 obejmuje środkową trzecią część macicy, a Strefa 3 obejmuje ostatnią trzecią część macicy i zawiera spermatekę. Prawidłowe prowadzenie plemników u hermafrodyt typu dzikiego N2 i samców fog-2(q71) powinno skutkować dotarciem około 90% znakowanych plemników do spermateki, czyli do Strefy 3 (Figure 3B). Nie należy uwzględniać kopulacji, w których w macicy znajduje się zbyt mało (Figure 3C, mniej niż 10-15 plemników) lub zbyt wiele (Figure 3D, macica wypełniona plemnikami) plemników. W przypadku kopulacji skutkujących obecnością mniej niż 10-15 plemników, 3-4 błąkające się plemniki mogą znacząco zaburzyć dane. Podobnie, gdy macica jest całkowicie wypełniona plemnikami, nie mogą one migrować w odpowiedni sposób. U niektórych mutantów wykazujących fenotyp zaburzonego prowadzenia plemników może wydawać się, że plemniki są rozproszone w całej macicy. Jednak w takim przypadku plemniki nie powinny wypełniać każdej szczeliny macicy, jak pokazano na Figure 3D. Ilościowe określenie zawartości każdego ramienia gonady jest uznawane za jedną próbkę, czyli jedno n.
Obrazy z serii czasowej (time-lapse) są rejestrowane w celu ilościowego określenia prędkości plemników oraz częstotliwości ich zawracania. Śledzić należy tylko plemniki znajdujące się w Strefie 2 (Rysunek 4A), ponieważ plemniki w Strefach 1 i 3 (Film 1) mają tendencję do poruszania się po okręgu, nawet u zwierząt typu dzikiego. Do śledzenia plemników zazwyczaj wykorzystuje się obrazy time-lapse wykonane w odstępach 15-30 s. Ilościowo analizuje się tylko te plemniki, których ruch można śledzić w kolejnych klatkach przez ponad 2,5-3 min. Na Rysunku 4B-M plemniki oznaczone czerwonymi i niebieskimi kropkami spełniają to kryterium, natomiast plemnik oznaczony zieloną kropką go nie spełnia. W związku z tym wartości zdefiniowane na Rysunku 4N zostały wyznaczone dla plemników oznaczonych czerwonymi i niebieskimi kropkami (Rysunek 4O), natomiast dla plemnika oznaczonego zieloną kropką nie dokonano pomiarów.
<img alt="Schemat anatomii hermafrodyty i samca; oznaczone linia zarodkowa, oocyt, wulwa, spermateka, pęcherzyk nasienny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59783/59783fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat dorosłego hermafrodyty i samca C. elegans. Na rysunku oznaczono główne struktury rozrodcze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59783/59783fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat protokołu barwienia mitochondriów; kopulacja nicieni i analiza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59783/59783fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat przygotowania próbek i pozyskiwania danych. Samce zabarwione barwnikiem mitochondrialnym są kopulowane z zsynchronizowanymi dorosłymi hermafrodytami. Obrazy time-lapse skopulowanych hermafrodyt są rejestrowane bezpośrednio po kopulacji w celu zebrania danych dotyczących prędkości plemników i częstotliwości ich cofania się. Obrazy statyczne skopulowanych hermafrodyt są rejestrowane 1 h po kopulacji w celu oceny rozmieszczenia plemników w macicy. Więcej szczegółów znajduje się w tekście. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59783/59783fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat równowagi statycznej; analiza rozmieszczenia plemników za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej; kwantyfikacja stref." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59783/59783fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Kwantyfikacja rozmieszczenia plemników w macicy hermafrodyta. (A). Schemat macicy hermafrodyta C. elegans. V = vulva, E = embrion, S = spermateka, O = oocyt, Z1-Z3 = Strefy 1-3 wykorzystywane do pomiaru rozmieszczenia plemników. (B-D). Zdjęcia z nałożeniem DIC+TRITC (panele lewe) oraz same obrazy TRITC (panele prawe) macic hermafrodytów typu dzikiego 1 h po kopulacji z samcami fog-2(q71) barwionych barwnikiem mitochondrialnym. Plemniki widoczne są na czerwono. Żółte obrysowania wskazują lokalizację spermateki. Pasek skali: 20 μm. Kwantyfikacja Z1, Z2, Z3 w B przedstawia procent plemników w każdej strefie ± odchylenie standardowe. Zdjęcia w C i D przedstawiają kopulacje, które doprowadziły do obecności zbyt niewielkiej (C) lub zbyt dużej (D) liczby plemników do przeprowadzenia kwantyfikacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59783/59783fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza ruchliwości plemników, schemat mikroskopii fluorescencyjnej, obliczenia prędkości i częstotliwości zawrotów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59783/59783fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Ilościowe określanie prędkości plemników i częstotliwości zawrotów podczas migracji przez macicę. (A). Połączony obraz DIC+TRITC macicy hermafrodyty zawierającej fluorescencyjne plemniki (czerwone). V = vulva, żółty = spermatheca, Z1-Z3 = trzy strefy macicy, czarna ramka: strefa 2. (B-M). Obrazy z kanału TRITC w trybie time-lapse, powiększenie strefy 2 (czarna ramka w A). Obrazy były pozyskiwane w odstępach 20 s. Na każdym obrazie śledzono 3 poszczególne plemniki (kropki czerwone, zielone i niebieskie). Kolorowe kropki w panelu M reprezentują tor ruchu każdego plemnika z paneli B-L. Pasek skali = 20μm. (N). Równania i definicje prędkości plemników, prędkości wektorowej i częstotliwości zawrotów. (O). Prędkość, prędkość wektorowa i częstotliwość zawrotów plemników śledzonych w panelach B-L za pomocą czerwonych i niebieskich kropek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59783/59783fig4v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Skurcze pochewki i proces owulacji, schemat biologiczny, badanie anatomii nicieni, mikroskopia." src="/files/ftp_upload/59783/59783movie1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Film 1"> 
Film 1: Film przedstawiający ruch i migrację plemników. Hermafrodyta typu dzikiego została skrzyżowana z samcami fog-2(q71) zabarwionymi barwnikiem mitochondrialnym. Film stanowi kompozycję obrazów z serii time-lapse, wykonanych w różnych odstępach czasu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59783/Movie_1_final.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)</a>

Plemnik musi pomyślnie przejść przez jajowód, aby zapłodnić oocyt. W tym miejscu opisujemy test do pomiaru migracji plemników w obrębie macicy hermafrodyty C. elegans. Test ten może dostarczyć danych ilościowych na temat rozmieszczenia plemników w macicy po kryciu, a także na temat prędkości, prędkości kierunkowej i częstotliwości odwrócenia.

Pomiar przewodnictwa i ruchliwości plemników w hermafrodytowym układzie rozrodczym Caenorhabditis elegans

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Metoda ta stanowi narzędzie dla naukowców do badania środowiskowych czynników genetycznych, które wpływają na migrację plemników i zachowanie w ich naturalnym środowisku w żeńskim układzie rozrodczym. Główną zaletą tej techniki jest przezroczysty naskórek C.elegans, który pozwala eksperymentatorom łatwo wizualizować i rejestrować ruch plemników u żywych zwierząt. Na początek użyj kilofa ślimakowego wykonanego z pipety Pasteura i platynowego drutu spłaszczonego na jednym końcu, aby wybrać od 20 do 30 hermafrodytów etapu L4 i delikatnie umieść je na sześciocentymetrowej płytce NGM z nasionami.Inkubuj hermafrodyty w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 28 do 30 godzin. Następnie wykonaj męską płytkę do barwienia. Użyj końca szklanego pręta do mieszania, aby zeskrobać E. coli z bakteryjnego trawnika na talerzu z nasionami i umieść go na środku nieobsianej płytki NGM, tworząc kropkę żywności o średnicy od pięciu do siedmiu milimetrów.Wymieszaj ze sobą dwa mikrolitry jednomilimolowego barwnika mito-barwnika w DMSO i 10 mikrolitrów buforu M9 w probówce do mikrowirówki. Odpipetuj cały roztwór mito-dye na kropkę żywności na męskiej płytce barwiącej. Umieść talerz w ciemności do wyschnięcia na 30 minut.Pod mikroskopem, na płytce zawierającej dorosłe osobniki C.elegans w wieku od jednego do trzech dni, zidentyfikuj samce po ich ogonie w kształcie wachlarza. Wybierz około 100 samców do plamki żywności poplamionej barwnikiem mito na męskiej płytce barwiącej. Zawiń płytkę w folię aluminiową i inkubuj przez noc w temperaturze 16 stopni Celsjusza.Drugiego dnia przenieś wybarwione samce na nową płytkę NGM z nasionami, aby usunąć nadmiar bakterii barwionych mitobarwnikiem. Trzymaj talerz w ciemności do momentu krycia. Aby zrobić płytkę łączącą, na nieobsianej płytce NGM wlej dwa mikrolitry gęstej mieszanki E. coli.Odczekaj około 10 do 15 minut, aż grube bakterie wyschną, tworząc kropkę godową. Czekając, aż płytka współpracująca wyschnie, wymieszaj ze sobą 300 mikrolitrów trikainy o zawartości 1% objętości, 300 mikrolitrów tetramizolu o zawartości 0,1% objętości i 900 mikrolitrów M9. Przenieść 600 mikrolitrów roztworu tetramizolu/trikainy do szkiełka zegarkowego. Przenieś od 12 do 15 hermafrodytów zebranych pierwszego dnia do roztworu tetramizolu/trikainy na szkiełku zegarka.Umieść dolną połowę szalki Petriego na szkiełku zegarka, aby nie uległa parowaniu, i inkubuj przez 30 minut, aby unieruchomić hermafrodyty. Następnie odzyskaj z ciemności płytkę z nasionami NGM, która zawiera poplamione samce, i wybierz od 50 do 60 poplamionych samców na wysuszoną kropkę godową na płytce godowej. Przechowuj płytkę w ciemności.Po unieruchomieniu hermafrodytów użyj szklanej pipety Pasteura, aby zebrać unieruchomione hermafrodyty ze szkła zegarka. Unikaj zasysania hermafrodytów poza wąską część pipety. Przenieś hermafrodyty na nieobsianą płytkę NGM.Usuń jak najwięcej płynu i pozostaw nadmiar płynu do wyschnięcia. Jak tylko cała widoczna ciecz wyparuje, przenieś znieczulone hermafrodyty na kropkę godową z barwionymi samcami. Wysiaduj w ciemności przez 30 minut, aby umożliwić krycie.Jeśli pożądana jest ocena dystrybucji plemników, przenieś sparowane hermafrodyty na wysiewaną płytkę NGM i pozwól im odpocząć przez godzinę przed zamontowaniem w celu wizualizacji. Aby zamontować robaki do wizualizacji, najpierw wlej od 10 do 15 mikrolitrów roztworu tetramizolu/trikainy na przygotowaną 2% podkładkę agarozową i przenieś połączone hermafrodyty do roztworu na podkładce. Umieść szkiełko nakrywkowe na robakach.Zamontuj szkiełko na pionowym mikroskopie wyposażonym w epifluorescencję i ustaw robaka tak, aby zarówno srom, jak i jedna spermateka były w zasięgu wzroku. Ustaw ostrość obrazu, skupiając się na środku spermateki. Sprawdź ekspozycję zarówno dla kanałów DIC, jak i TRITC.W DIC wyraźnie widoczne są wewnętrzne struktury robaków. W TRITC poszczególne plemniki są widoczne jako odrębne punkty. Uzyskaj obrazy DIC i fluorescencji dla każdej macicy.Aby nagrać filmy poklatkowe, najpierw zlokalizuj hermafrodyty, które zawierają oznaczone plemniki w macicy. Na panelu Akwizycja dostosuj interwały uzyskiwania obrazu do 15 do 30 sekund, a czas trwania do 10 do 20 minut na macicę. Następnie kliknij przycisk Uruchom, aby uzyskać obrazy poklatkowe w kanałach DIC i TRITC.Zaczynając od sromu na jednym końcu i spermateki na drugim, podziel macicę na trzy strefy, ze strefą zawierającą srom i strefą trzecią zawierającą spermatekę. Ręcznie policz liczbę plemników w każdej trzeciej macicy i podaj liczbę w każdej strefie jako procent całkowitej liczby plemników w całej macicy. W razie potrzeby skorzystaj z tabeli przeglądowej, aby dostosować intensywność sygnału obrazów kanału TRITC, tak aby każdy plemnik mógł być widoczny i określony ilościowo.Aby śledzić plemniki na zdjęciach poklatkowych, użyj oprogramowania Fiji do analizy. Użyj funkcji Import Bio-Formats, aby zaimportować obrazy z jednej serii poklatkowej jako jeden hyperstack. Następnie kliknij Wtyczki, Śledzenie, a następnie Śledzenie ręczne.W otwartym oknie dialogowym wybierz narzędzie TrackMate na pasku narzędzi Fidżi. Kliknij dwukrotnie plemniki, które będą śledzone. Kliknij wewnątrz wyświetlonego zielonego okręgu z przerywanymi liniami i przeciągnij do żądanej pozycji.Kliknij ponownie kółko. Przerywana zielona linia zamienia się w ciągłą zieloną linię. Jednocześnie naciśnij Shift i L, aby włączyć tryb śledzenia.Przejdź do następnej klatki z serii poklatkowej. Aby ustawić nową lokalizację śledzonego plemnika w nowej ramce, najedź myszką na nowy punkt i naciśnij A. Podręczny element śledzący pojawi się w nowym miejscu i pojawi się linia łącząca lokalizację, w której podręczny element śledzący został umieszczony w poprzedniej klatce.Powtórz tę samą procedurę dla pozostałych klatek. Po zakończeniu śledzenia kliknij przycisk Analizuj w oknie dialogowym TrackMate, aby wygenerować potrzebne dane. Aby obliczyć prędkość, podziel całkowitą długość drogi plemników przez czas, który upłynął.Aby obliczyć prędkość wektorową, narysuj linię biegnącą przez macicę, zaczynając od sromu, kierując się w stronę spermateki. Użyj narzędzia Linia, aby zmierzyć odległość, jaką plemniki przebyły wzdłuż tej linii od początku do końca śladu. Podziel tę odległość przez czas, który upłynął.Wartości ujemne wskazują, że plemniki odeszły od spermateki. Aby zarejestrować częstotliwość odwrócenia, policz, ile razy ślad plemnika wygenerował kąt mniejszy niż 90 stopni podczas trzech kolejnych klatek poklatkowych. W tym protokole samce robaków fog-2 q71 zostały zabarwione barwnikiem mito-i połączone z hermafrodytami N2 typu dzikiego.Dorosły hermafrodytyczny układ rozrodczy ma dwa ramiona, które są swoimi lustrzanymi odbiciami. Po kryciu znakowane plemniki są deponowane w macicy hermafrodyty przez srom. Plemniki przemieszczają się wokół rozwijających się zarodków w macicy, w kierunku spermateki, gdzie są przechowywane do momentu zapłodnienia.Macica hermafrodytowa została podzielona na trzy strefy w celu ilościowego określenia rozmieszczenia i migracji plemników. Aby ocenić prędkość plemników i częstotliwość odwrócenia, tylko plemniki w strefie drugiej były śledzone za pomocą obrazów poklatkowych. Plemniki w strefie pierwszej, zaczynając od sromu, i w strefie trzeciej, w tym spermateka, mają tendencję do poruszania się w okrągłym wzorze.Plemniki oznaczone czerwonymi i niebieskimi kropkami miały określoną ilościowo prędkość plemników i częstotliwość odwrócenia. Podczas ilościowego określania rozmieszczenia plemników w macicy, właściwe prowadzenie nasienia przy użyciu hermafrodytów N2 typu dzikiego i samców mgły-2 q71 spowodowało, że około 90% znakowanych plemników dotarło do spermateki. Dane nie powinny być liczone, jeśli krycie skutkuje zbyt małą ilością plemników w macicy lub zbyt dużą liczbą plemników w macicy, wypełniających każdą szczelinę.Ważne jest, aby zwierzęta były traktowane delikatnie podczas każdego etapu przenoszenia, aby hermafrodyty były całkowicie unieruchomione, a płytki i robaki zawierające barwnik mio-barwnik były osłonięte przed światłem. Metoda ta może być połączona z eksperymentami z knockdownem lub knockoutem genów, eksperymentami środowiskowymi lub chemicznymi lub innymi manipulacjami w celu zidentyfikowania czynników, które mogą regulować migrację plemników. Ta technika pozwoliła nam zidentyfikować specyficzne prostaglandyny, które są ważne dla prowadzenia plemników do oocytu.Te prostaglandyny są syntetyzowane za pomocą niekonwencjonalnego mechanizmu, który może być zachowany u wyższych ssaków. Tetraizol, trikaina, DMSO działają drażniąco na skórę i oczy i mogą mieć działanie toksyczne w dużych dawkach. Ważne jest, aby nosić odpowiedni sprzęt ochronny podczas obchodzenia się z jakimikolwiek chemikaliami.

measuring-sperm-guidance-motility-within-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym protokole opisano metodę izolacji i aktywacji spermatyd z samców C. elegans. Odcięcie tylnego końca samca powoduje uwolnienie spermatyd. Spermatydy można aktywować poprzez dodanie proteazy.

Izolacja i aktywacja in vitro plemników Caenorhabditis elegans

Łatwość utrzymania i propagacji nicieni C. elegans sprawia, że są one doskonałym organizmem modelowym. Możliwość synchronizacji nicieni pozwala na pracę ze znaczną liczbą osobników w tym samym stadium rozwojowym, co ułatwia badanie konkretnego procesu u wielu zwierząt.

Podstawowe metody pracy z Caenorhabditis elegans: Synchronizacja i obserwacja

Ten film opisuje metodę preparowania gonad od dorosłych hermafrodytów C. elegans, w wyniku czego powstają tkanki odpowiednie do barwienia immunologicznego i obrazowania fluorescencyjnego.

C. elegans (C. elegans) Wytłaczanie gonad: technika szybkiej sekcji

C. elegans podczas składania jaj może dostarczyć ważnych informacji w badaniach rozwojowych, reprodukcyjnych i anatomicznych. Ten film przedstawia ważne etapy testu składania jaj i pokazuje próbkę eksperymentu, w którym lek jest testowany pod kątem toksyczności reprodukcyjnej.

Test składania jaj: metoda ilościowego określania zachowania C. elegans podczas składania jaj

Ten film opisuje użycie oprogramowania do nagrywania ruchu robaków na arenie. Przykładowy protokół mierzy wpływ ekspozycji na etanol na poruszanie się robaków.

C. elegans (C. elegans) Śledzenie ruchu: metoda oceny lokomocji u robaków

Ten film demonstruje zastosowanie testu lokomocji promieniowej do oceny dysfunkcji motorycznej u C. elegans wykazujących ekspresję ludzkiego białka TDP-43 typu dzikiego lub z mutacją ALS. Robaki o różnym poziomie ekspresji TDP-43 typu dzikiego lub zmutowanego mogą pełzać, a ich ruch jest mierzony odległością promieniową przebytą od centralnego punktu na płytce testowej. Test rozróżnia łagodne, umiarkowane i ciężkie upośledzenie motoryczne na podstawie odległości przebytej przez różne szczepy C.

Ocena upośledzenia motorycznego w modelach C. elegans za pomocą testu lokomocji radialnej

Tutaj szczegółowo opisujemy protokoły specjalnie zaprojektowane do monitorowania wad morfogenicznych, które występują podczas wczesnych i późnych faz wydłużania się embrionalnego nicienia Caenorhabditis elegans. Ostatecznie protokoły te mają na celu identyfikację genów, które regulują te fazy i scharakteryzowanie ich zróżnicowanych wymagań wzdłuż przednio-tylnej osi zarodka.

Nowe wskaźniki charakteryzujące wydłużenie embrionalne nicieni Caenorhabditis elegans

Prezentujemy zautomatyzowaną metodę trójwymiarowej rekonstrukcji linii zarodkowej Caenorhabditis elegans. Nasza metoda określa liczbę i położenie każdego jądra w linii zarodkowej oraz analizuje rozmieszczenie białek linii zarodkowej i strukturę cytoszkieletu.

Analiza obliczeniowa linii zarodkowej Caenorhabditis elegans w celu zbadania rozmieszczenia jąder, białek i cytoszkieletu

To jest powszechnie stosowana metoda do sekcji gonad C. elegans, po której następuje pęknięcie zamrażające, która wytwarza próbki linii zarodkowej do immunofluorescencji poprzez barwienie przeciwciał, lub do prostego barwienia DAPI w celu wizualizacji DNA. Protokół ten okazał się skuteczny w przypadku studentów studiów licencjackich w laboratorium badawczym i w ramach badań licencjackich opartych na kursach.

C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie gonad i pęknięcie zamrażające do barwienia immunofluorescencyjnego i DAPI

Tutaj prezentujemy ogólną metodę określania żywotności embrionalnej i całkowitej liczby wyprodukowanych zarodków (czerwiu) za pomocą organizmu modelowego C. elegans.

Pomiar żywotności zarodka i wielkości lęgu u Caenorhabditis elegans

Ten protokół ustanawia metody ekstrakcji i ilościowego określania reakcji na lotny feromon płciowy w C. elegans, zapewniając narzędzia do badania komunikacji chemicznej i trajektorii nawigacji.

Lotna ekstrakcja feromonów płciowych i test chemoatrakcji w Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę pomiaru migracji plemników w macicy hermafrodyty C. elegans. Technika wykorzystuje przezroczystość organizmu do wizualizacji ruchu plemników w czasie rzeczywistym i analizy ich dystrybucji.

Pomiar przewodnictwa i ruchliwości plemników w hermafrodytowym układzie rozrodczym Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów