Name: Scharakteryzować związane z chorobą mutanty kinaz z rodziny RAF przy użyciu zestawu praktycznych i wykonalnych metod (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Poznaj metody charakteryzacji mutantów kinaz RAF związanych z chorobami, w tym testy kinazowe in vitro i analizę lucyferazy. Techniki te są czułe, powtarzalne i opłacalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Hairy Cell Leukemia Fellowship za wsparcie Yuan Jimin. Prace te były wspierane przez Asia Fund Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge Funding Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF Bridging Grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), grant pilotażowy NCCRF (NCCRF-YR2017-JUL-PG3) oraz SHF Academic Medicine Research Grant (AM/TP011/2018).

1. Test kinazy in vitro do pomiaru aktywności katalitycznej mutantów RAF
<ol>
	<li>Konstruowanie wektorów kodujących mutanty RAF (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A) ze znacznikiem FLAG(DYKDDDDK) na C-końcu przy użyciu montażu Gibsona lub tradycyjnych metod klonowania molekularnego.
	<ol>
		<li>Wprowadź znacznik FLAG i mutacje do sekwencji kodujących RAF za pomocą PCR, a następnie wstaw całe sekwencje do wektora pCDNA3.1 (+) za pomocą montażu Gibsona lub ligacji DNA T4 i postępując zgodnie z protokołami producenta. Dla reakcji PCR należy stosować następujące warunki: (1) 95 °C, 2 min; (2) 95 °C, 30 s; (3) 59 °C, 30 s; (4) 68 °C, 3 min; (5) 20 cykli (od 2 do 4); (6) 4 °C hold. 
		nuta: Startery PCR do klonowania: 5- AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC-3 i 5-CAGCGGGTTTAACGGGCCCTCTA-3.</li>
		<li>Wstaw sekwencję kodowania GST przed sekwencjami kodowania mutantów RAF, aby wygenerować wektory kodujące mutanty RAF z fuzją GST, używając tych samych metod, które opisano w kroku 1.1.1.</li>
		<li>Zweryfikuj wszystkie wektory za pomocą sekwencjonowania DNA przed transfekcją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić komórki 293T w płytkach 6-dołkowych o gęstości 5 x 105 komórek/basenik na jeden dzień przed transfekcją. Gdy gęstość komórek osiągnie 80 ~ 90% konfluencji drugiego dnia, transfekuj wektorami kodującymi kinazy RAF znakowane FLAG lub ich mutanty z kroku 1.1 do komórek, postępując zgodnie z protokołem odczynników do transfekcji producenta (tabela materiałów).</li>
	<li>Wymień pożywkę hodowlaną 24 godziny po transfekcji.</li>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną 48 godzin po transfekcji i dodać 400 μl/studzienkę buforu do lizy (25 mM Tris·HCl, 150 mM NaCl, 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 0,25% NP-40, pH 7,2) uzupełnionego inhibitorami proteazy i fosfatazy w celu lizy komórek na lodzie. 
	nuta: Stężenie NP-40 w buforze do lizy ma kluczowe znaczenie dla wykrywania aktywności katalitycznej mutantów RAF o umiarkowanym powinowactwie/stabilności dimerów in vitro. Wysokie stężenie detergentu lub silnego detergentu w buforze do lizy może rozbić dimery RAF, a tym samym zabić aktywność katalityczną kinaz RAF lub ich mutantów.</li>
	<li>Przenieś lizaty komórek do probówki o pojemności 1,5 ml i wiruj w dół o 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć resztki komórek.</li>
	<li>Przenieść 300 μl na próbkę czystych lizatów całokomórkowych do probówek o pojemności 1,5 ml, dodać 20 μl na próbkę kulek powinowactwa anty-FLAG i obracać w chłodnym pomieszczeniu (4 °C) przez 1 godzinę. Weź również 40 μl na próbkę czystego lizatu całych komórek w celu wykrycia ekspresji i aktywności (fosfo-ERK1 / 2) mutantów RAF przez immunobloloty, jak opisano poniżej.</li>
	<li>Przemyć kulki anty-FLAG raz buforem do lizy, a następnie raz buforem reakcyjnym kinazy (20 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 0,5 mM Na3VO4, 0,5 mM DTT, pH 7,2) i dodać 20 μl mieszaniny reakcyjnej kinazy (2 μg MEK1(K97A) i 100 μM ATP w 20 μL buforu reakcji kinazy) na próbkę. 
	nuta: Mycie kulek powinno być zakończone delikatnie i szybko, pozostały bufor powinien zostać całkowicie odessany przed dodaniem mieszaniny reakcji kinazy, a wszystkie operacje na tym etapie powinny być przeprowadzane w temperaturze 4 °C w chłodni.</li>
	<li>Inkubować reakcje kinazy w temperaturze pokojowej (25 °C) przez 10 minut, a podczas inkubacji obracać palcami probówki zawierające reakcje kinazy</li>.
	<li>Dodać 5 μl 5x buforu próbki SDS (375 mM Tris·HCl, 9% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 50% glicerolu, 0,03% błękitu bromofenolowego) na próbkę, aby zatrzymać reakcje kinazy, a następnie podgrzewać próbki w temperaturze 90 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Uruchom próbki w 9 ~ 12% elektroforezie w żelu poliakryloamidowym (PAGE) z 0,1% SDS, przenieś białka do membrany nitrocelulozowej i wykryj poziomy mutantów fosfo-MEK i RAF w próbkach za pomocą immunoblots. 
	nuta: Fosfo-MEK można również określić ilościowo, stosując γ inkorporację32P-ATP. Krótko mówiąc, 10 μM γ32P-ATP dodaje się do buforu reakcji kinazy, a następnie określa się ilościowo ilość fosforylowanego MEK po separacji PAGE przy użyciu standardowych technik autoradiografii, fosforyzacji lub zliczania scyntylacji cieczy, w zależności od potrzeb.</li>
</ol>
2. Test koaktywacji RAF do oceny aktywności allosterycznej mutantów RAF z martwą kinazą
<ol>
	<li>Skonstruuj wektory kodujące odbiornik RAF (domena kinazy CRAF z niefosforylowanym motywem NtA, AAFF) lub aktywatory RAF martwej kinazy (domena kinazy RAF z motywem NtA naśladowanym przez fosforylację, SSDD, DDEE lub DGEE) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A) zgodnie z opisem w kroku 1.1.</li>
	<li>Transfekcja komórek 293T z dwoma wektorami kodującymi zarówno odbiornik RAF, jak i aktywator RAF martwy w wyniku kinazy lub pojedynczym wektorem kodującym jedno z białek, jak opisano w krokach 1.2 i 1.3.</li>
	<li>Wymienić pożywkę hodowlaną po 24 godzinach od transfekcji i zebrać transfektanty 293T po 48 godzinach, aby przygotować lizaty całych komórek, jak opisano w krokach 1.4 i 1.5.</li>
	<li>Czysty lizat całokomórkowy szybko wymieszać z 5-krotnym buforem próbki SDS w temperaturze pokojowej (25 °C), a następnie gotować w temperaturze 90 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Uruchom próbki ugotowanego lizatu całych komórek w 9 ~ 12% PAGE z 0,1% SDS, przenieś białka do błony nitrocelulozowej i wykryj poziomy fosfo-ERK1 / 2 i kontroluj białka za pomocą immunoblotów.</li>
</ol>
3. Komplementarny test lucyferazy do pomiaru względnego powinowactwa/stabilności do dimerów mutantów RAF
<ol>
	<li>Skonstruuj wektory kodujące mutanty RAF oznaczone znacznikiem FLAG połączone z N-końcem Nluc (N-końcem lucyferazy świetlika, aa2-416) lub C-końcem Cluc (C-końcem lucyferazy świetlika, aa398-550), jak opisano w kroku 1.1.</li>
	<li>Transfekcyjne komórki 293T z parą wektorów kodujących różne mutanty Nluc-RAF i mutanty Cluc-RAF, jak opisano w kroku 1.2.</li>
	<li>Po 24 godzinach od transfekcji ponownie poszczepić transfektanty komórkowe 293T na krystalicznie czarne płytki obrazowe o gęstości komórek 2x105 na studzienkę z pożywką bezbarwną (tj. DMEM bez czerwieni fenolowej).</li>
	<li>24 godziny później dodaj D-lucyferynę (0,2 mg / ml) do transfektantów komórek 293T, inkubuj przez 30 minut i zmierz sygnały lucyferazy za pomocą systemu wielokrotnej detekcji (tabela materiałów).</li>
	<li>Po zmierzeniu sygnałów lucyferazy odessać pożywkę i lizować transfektanty 293T buforem do lizy, aby przygotować lizaty całych komórek, jak opisano w krokach 1.4 i 1.5.</li>
	<li>Uruchom próbki lizatu całych komórek w 9 ~ 12% PAGE z 0,1% SDS i wykryj poziomy ekspresji mutantów Nluc-RAF i mutantów Cluc-RAF za pomocą immunoblot anty-FLAG, jak opisano w kroku 2.5. Względne poziomy ekspresji zarówno mutanta Nluc-RAF, jak i mutanta Cluc-RAF w transfektantach 293T określa się ilościowo za pomocą obrazu J z ich immunoblotów.</li>
	<li>Normalizuj sygnały lucyferazy transfektantów komórek 293T zgodnie z poziomami ekspresji mutantów Nluc-RAF i mutantów Cluc-RAF. Krótko mówiąc, osiąga się to poprzez podzielenie surowego sygnału lucyferazy przez względne poziomy ekspresji mutantów Nluc-RAF i mutantów Cluc-RAF z kroku 3.6.</li>
</ol>

<ol><li>Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+regulating+the+Raf+kinase+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of regulating the Raf kinase family.</a> Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).</li>
<li>Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAF+proteins+take+center+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The RAF proteins take center stage.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).</li>
<li>Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+nature%3A+biological+functions+of+the+Raf-1+%22kinase%22%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letter%22%5BJournal%5D)">Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase".</a> FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).</li>
<li>Lavioe, H., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+RAF+protein+kinases+in+ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).</li>
<li>Schreck, R., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raf+kinases%3A+oncogenesis+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Raf kinases: oncogenesis and drug discovery.</a> International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).</li>
<li>Roberts, P. J., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Raf-MEK-ERK+mitogen-activated+protein+kinase+cascade+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer.</a> Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).</li>
<li>McCubrey, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+Raf%2FMEK%2FERK+pathway+in+cell+growth%2C+malignant+transformation+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Biophysics+Acta%22%5BJournal%5D)">Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance.</a> Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).</li>
<li>Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+Ras+in+developmental+disorders+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).</li>
<li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).</li>
<li>Garnett, M. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guilty+as+charged%3A+B-RAF+is+a+human+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene.</a> Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).</li>
<li>Pandit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-of-function+RAF1+mutations+cause+Noonan+and+LEOPARD+syndromes+with+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).</li>
<li>Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+and+tyrosine+phosphorylations+cooperate+in+Raf-1%2C+but+not+B-Raf+activation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation.</a> EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+activation+of+functionally+asymmetric+RAF+kinase+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers.</a> Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).</li>
<li>Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alike+but+different%3A+RAF+paralogs+and+their+signaling+outputs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs.</a> Cell. 161 (5), 967-970 (2015).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dimer-dependent+catalytic+activity+of+RAF+family+kinases+is+revealed+through+characterizing+their+oncogenic+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants.</a> Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).</li>
<li>Wan, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+activation+of+the+RAF-ERK+signaling+pathway+by+oncogenic+mutations+of+B-RAF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF.</a> Cell. 116 (6), 855-867 (2004).</li>
<li>Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinases+and+pseudokinases%3A+lessons+from+RAF%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinases and pseudokinases: lessons from RAF.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).</li>
<li>Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudokinases+from+a+structural+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Pseudokinases from a structural perspective.</a> Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).</li>
<li>Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefrançois, M., Sicheri, F., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dimerization-dependent+mechanism+drives+RAF+catalytic+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation.</a> Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).</li>
<li>Heidorn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase-dead+BRAF+and+oncogenic+RAS+cooperate+to+drive+tumor+progression+through+CRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF.</a> Cell. 140 (2), 209-221 (2010).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+mutations+in+MEK1+enhance+homodimerization+and+promote+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis.</a> Science Signaling. 11 (554), 6795(2018).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AMPK+inhibitor+overcomes+the+paradoxical+effect+of+RAF+inhibitors+through+blocking+phospho-Ser-621+in+the+C+terminus+of+CRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase+regulation+by+hydrophobic+spine+assembly+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).</li>
<li>Poulikakos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitor+resistance+is+mediated+by+dimerization+of+aberrantly+spliced+BRAF%28V600E%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E).</a> Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+that+blocks+ATP+binding+creates+a+pseudokinase+stabilizing+the+scaffolding+function+of+kinase+suppressor+of+Ras%2C+CRAF+and+BRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).</li>
<li>Taylor, S. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinases%3A+evolution+of+dynamic+regulatory+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochemistry+Sciences%22%5BJournal%5D)">Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins.</a> Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).</li>
<li>Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li>
<li>Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+activates+c-Raf-1+through+a+Ras-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism.</a> Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).</li>
<li>Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+Ras+induces+heterodimerization+of+cRaf+and+BRaf%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf.</a> Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).</li>
<li>Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+and+mutant+B-RAF+activate+C-RAF+through+distinct+mechanisms+involving+heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization.</a> Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).</li>
<li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li>
<li>Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitors+transactivate+RAF+dimers+and+ERK+signalling+in+cells+with+wild-type+BRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF.</a> Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).</li>
<li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meaningful+relationships%3A+the+regulation+of+the+Ras%2FRAF%2FMEK%2FERK+pathway+by+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Journal%22%5BJournal%5D)">Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions.</a> Biochemistry Journal. 351, Pt 2 289-305 (2000).</li>
<li>Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22RAF%22+neighborhood%3A+protein-protein+interaction+in+the+Raf%2FMek%2FErk+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">"RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).</li>
<li>García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Protein+Interactions%3A+Emerging+Oncotargets+in+the+RAS-ERK+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cancer%22%5BJournal%5D)">Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway.</a> Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).</li>
<li>Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+regulated+protein%E2%80%93protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li>
<li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+BRAF+deletions+that+function+as+homodimers+and+are+sensitive+to+inhibition+by+RAF+dimer+inhibitor+LY3009120%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120.</a> Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).</li>
<li>Foster, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+mechanism+of+oncogenic+deletion+mutations+in+BRAF%2C+EGFR%2C+and+HER2%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2.</a> Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym artykule przedstawiliśmy trzy metody charakteryzowania mutantów RAF związanych z chorobą, które obejmują test kinazy in vitro, test koaktywacji RAF i bezpłatny test lucyferazy rozszczepionej. Ponieważ kinazy RAF mają zarówno aktywność katalityczną, jak i allosteryczną, różne mutanty RAF mogą aktywować sygnalizację za pomocą dwóch odrębnych mechanizmów 13,14,16,17,18.<sup class=...

Kinazy rodziny RAF są kluczowym składnikiem kaskady sygnalizacyjnej RAS/RAF/MEK/ERK, która przesyła sygnał z RAS do aktywacji kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MEK)1,2,3,4. Ta rodzina kinaz odgrywa kluczową rolę we wzroście, przetrwaniu i różnicowaniu komórek, a ich zmiany wywołują wiele chorób, w szczególności raka5,6,7,8. Ostatnio sekwencjonowanie genomu zidentyfikowało wiele mutantów RAF związanych z chorobą, które wykazują różne właściwości w transmisji sygnału kaskady RAS/RAF/MEK/ERK9,10,11. Dokładna charakterystyka mutantów RAF pomoże nam zrozumieć mechanizmy molekularne, w jaki sposób mutanty RAF zmieniają sygnał wyjściowy kaskady RAS/RAF/MEK/ERK, ostatecznie wybrać odpowiednie podejścia do leczenia różnych chorób wywołanych przez mutacje RAF.
Kinazy rodziny RAF obejmują trzy członkinie, CRAF, BRAF i ARAF, które mają podobne struktury molekularne, ale różne zdolności do aktywacji sygnalizacji w dół strumienia1,2,3,4. Spośród tych paralogów, BRAF ma najwyższą aktywność ze względu na konstytutywnie fosforylowany motyw NtA (N-t erminal acidic) motif12,13,14, podczas gdy ARAF ma najniższą aktywność wynikającą z jego niekanonicznego motywu APE15. Może to wyjaśniać różną częstość mutacji paralogów RAF w chorobach: BRAF>CRAF>ARAF. Co więcej, w obrębie tego samego paralogu RAF mutacje w różnych miejscach mogą wyzwalać sygnalizację w dół w różny sposób, co dodaje kolejną warstwę złożoności do regulacji kinaz z rodziny RAF. Ostatnie badania wykazały, że wszystkie kinazy RAF mają zarówno aktywność katalityczną, jak i allosteryczną13,14,16,17,18. Konstytutywnie aktywne mutanty RAF włączają sygnalizację bezpośrednią poprzez fosforylację MEK, podczas gdy mutanty RAF martwe w kinazie mogą transaktywować swoje odpowiedniki typu dzikiego poprzez dimeryzację z boku na bok i aktywować sygnalizację MEK-ERK16,19,20. Powinowactwo/stabilność dimerów jest kluczowym parametrem, który nie tylko określa aktywność allosteryczną mutantów RAF martwych w kinazie, ale także wpływa na aktywność katalityczną konstytutywnie aktywnych mutantów RAF15,21,22. Martwe w kinazie mutanty RAF o wysokim powinowactwie/stabilności dimerów mogą bezpośrednio transaktywować endogenne RAF typu dzikiego15, podczas gdy te z pośrednim powinowactwem/stabilnością dimerów wymagają koordynacji aktywnego Ras lub podwyższonego poziomu cząsteczek RAF typu dzikiego do działania13,15,20,21,23. Podobnie, konstytutywnie aktywne mutanty RAF fosforylują MEK w sposób zależny od dimerów, a te o niskim powinowactwie/stabilności dimerów tracą swoją aktywność katalityczną in vitro po immunoprecypitacji, która rozbija słabe dimery RAF15,21,22. Powinowactwo/stabilność dimerów określa również wrażliwość mutantów RAF na ich inhibitory i dodatnio koreluje z opornością inhibitorów RAF24. Dlatego, aby scharakteryzować mutanty RAF związane z chorobą, konieczne jest zmierzenie ich aktywności katalitycznej i allosterycznej oraz powinowactwa/stabilności dimerów.
W ostatnich latach nasze laboratorium i inne opracowały różne metody charakteryzowania kinaz rodziny RAF i ich mutantów. Zgodnie z naszym laboratorium i doświadczeniem innych osób uważamy, że następujące trzy testy mają zalety w definiowaniu mutantów RAF związanych z chorobą: (1) test kinazy in vitro, który można łatwo przeprowadzić w celu wykrycia aktywności katalitycznej konstytutywnie aktywnych mutantów RAF15; (2) test koaktywacji RAF, który jest wiarygodną i wygodną metodą pomiaru aktywności allosterycznej mutantów RAF martwych w wyniku kinazy13,15,21,22,23,25; (3) komplementarny test lucyferazy rozszczepionej, który ma znacznie wyższą czułość w pomiarze względnego powinowactwa/stabilności dimerów mutantów RAF w przeciwieństwie do tradycyjnego testu koimmunoprecypitacji i jest w stanie przeprowadzić bez zaawansowanego sprzętu w przeciwieństwie do ilościowych metod analitycznych, takich jak analiza rezonansu SPR (Surface Plasmon Resonance15,22. Łącząc te trzy testy, możemy łatwo zrozumieć, w jaki sposób mutant RAF związany z chorobą zmienia dalszą sygnalizację, a tym samym wykorzystać odpowiednią strategię terapeutyczną do leczenia choroby spowodowanej tą mutacją RAF.

<table><tbody><tr><td>anty-fosfoERK1/2</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>4370</td><td></td></tr><tr><td>anty-fosfoMEK1/2</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>9154</td><td></td></tr><tr><td>anty-ERK1/2</td><td>AB klonalny</td><td>A0229</td><td></td></tr><tr><td>anty-MEK1/2</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>9124</td><td></td></tr><tr><td>anty-FLAG(mysz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>anty-HA</td><td>Novus Biologicals</td><td>MAB6875</td><td></td></tr><tr><td>anty-FLAG(Królik)</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>14793</td><td></td></tr><tr><td>anty-&beta;-aktyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2228</td><td></td></tr><tr><td>koraliki anty-FLAG (M2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4596</td><td></td></tr><tr><td>IgG przeciw myszy sprzężone z HRP</td><td>Jackson Laboratories</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Sprzężone z HRP anty-królicze IgG</td><td>Jackson Laboratories</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1(+)</td><td>In vitrogen</td><td>V79020</td><td></td></tr><tr><td>Klonowanie montażu Gibsona&nbsp; Zestaw</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Roche</td><td>11 814 443 001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM bez czerwieni fenolowej</td><td>Invitrogen</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>D-lucyferyna&nbsp;</td><td>GoldBio</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>6xhis-tagged MEK1 (K97A)</td><td>&nbsp; przygotowane w naszych poprzednich badaniach</td><td>N.A.</td><td>Numer referencyjny 15.</td></tr><tr><td>System detekcji GloMax-Multi.</td><td>Przekaźnik Promega</td><td>E7041</td><td></td></tr></tbody></table>

scharakteryzować związane z chorobą mutanty kinaz z rodziny raf przy użyciu zestawu praktycznych i wykonalnych metod

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Kinazy z rodziny szybko przyspieszonego włókniakomięsaka (RAF) odgrywają kluczową rolę w biologii komórki, a ich dysfunkcja prowadzi do nowotworów i zaburzeń rozwojowych. Charakterystyka mutantów RAF związanych z chorobą pomoże nam dobrać odpowiednie strategie terapeutyczne w leczeniu tych chorób. Ostatnie badania wykazały, że kinazy z rodziny RAF mają zarówno aktywność katalityczną, jak i allosteryczną, która jest ściśle regulowana przez dimeryzację. Tutaj skonstruowaliśmy zestaw praktycznych i wykonalnych metod do określenia aktywności katalitycznej i allosterycznej oraz względnego powinowactwa/stabilności dimerów kinaz z rodziny RAF i ich mutantów. Po pierwsze, zmieniliśmy klasyczny test kinazy in vitro, zmniejszając stężenie detergentu w, wykorzystując delikatną procedurę szybkiego mycia i stosując fuzję S-transferazy glutationowej (GST), aby zapobiec dysocjacji dimerów RAF podczas oczyszczania. Dzięki temu możemy odpowiednio zmierzyć aktywność katalityczną konstytutywnie aktywnych mutantów RAF. Po drugie, opracowaliśmy nowatorski test koaktywacji RAF w celu oceny aktywności allosterycznej mutantów RAF martwych w wyniku kinazy przy użyciu N-końcowych skróconych białek RAF, eliminując wymóg aktywnego Ras w obecnych protokołach, a tym samym osiągając wyższą czułość. Na koniec wygenerowaliśmy unikalny komplementarny test lucyferazy rozszczepionej, aby ilościowo zmierzyć względne powinowactwo/stabilność dimerów różnych mutantów RAF, który jest bardziej wiarygodny i czuły w porównaniu z tradycyjnym testem koimmunoprecypitacji. Podsumowując, metody te mają następujące zalety: (1) są przyjazne dla użytkownika; (2) zdolne do skutecznego działania bez zaawansowanego sprzętu; (3) opłacalne; (4) Wysoka czułość i powtarzalność.

Kinazy z rodziny RAF wykazują zarówno aktywność katalityczną, jak i allosteryczną, co pozwala ich mutantom związanym z chorobami na uruchamianie sygnalizacji w dół kaskady poprzez różne mechanizmy13,14,16,17,18. Konstytutywnie aktywne mutanty RAF bezpośrednio fosforylują swoje substraty, podczas gdy mutanty RAF pozbawione aktywności kinazy (kinase-dead) realiz...

W tym artykule przedstawiliśmy zestaw praktycznych i wykonalnych metod charakteryzowania mutantów kinaz rodziny RAF związanych z chorobą, które obejmują test kinazy in vitro, test koaktywacji RAF i komplementarny test rozszczepionej lucyferazy.

Scharakteryzować związane z chorobą mutanty kinaz z rodziny RAF przy użyciu zestawu praktycznych i wykonalnych metod

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Metoda ta ułatwia skuteczną charakterystykę metod kinazy RAF związanych z chorobą. Technika ta jest bardzo czuła i powtarzalna, opłacalna, przyjazna dla użytkownika i nie wymaga żadnego zaawansowanego sprzętu. Aby zmierzyć aktywność katalityczną mutantów RAF, należy wprowadzić mutacje technologii flagowej do sekwencji kodującej RAF za pomocą PCR, przed wstawieniem całych sekwencji do odpowiedniego wektora zgodnie ze standardowymi protokołami.Wstawić glutation jako sekwencję kodującą transferazę przed sekwencjami kodującymi zmutowane RAF, aby w ten sam sposób wygenerować wektory kodujące glutation jako mutanty RAF połączone z transferazą. Transwekcja 80% do 90% konfluentnych kultur komórkowych 293T z wektorami kodującymi oznaczone flagą kinazy RAF lub ich mutanty, zgodnie z protokołami standardów. Po 24 godzinach hodowli wymień pożywkę w każdej kulturze.Po 48 godzinach hodowli dodaj 400 mikrolitrów buforu do lizy uzupełnionego inhibitorami proteazy i fosfatazy do każdego dołka na lodzie. Po pięciu do 10 minutach przenieś lizaty komórkowe do 1,5 mililitrowej probówki w celu odwirowania w celu osadzenia resztek komórek. Przenieś 300 mikrolitrów każdej próbki do pojedynczych mikroprobówek wirówkowych o pojemności 1,5 mililitra.Odłóż 40 mikrolitrów na próbkę do dalszej hurtowej analizy kinazy jedno- i dwuskładnikowej regulowanej ekspresją i aktywnością kinazy o niższym i średnim syle. Dodaj 20 mikrolitrów kulek powinowactwa anty-FLAG do każdej probówki, na godzinną inkubację z rotacją w chłodni o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji szybko i delikatnie umyć kulki antyflagowe raz buforem do lizy w chłodni i raz buforem reakcyjnym kinazy przed dodaniem 20 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej kinazy.Wykres Mutanty o niskim powinowactwie do Dima mogą utracić swoją aktywność katalityczną in vitro z powodu dysocjacji Dima. Dlatego tak ważne jest szybkie i delikatne pranie. Po 10 minutach w temperaturze pokojowej z przewracaniem co drugą minutę, zatrzymaj reakcje kinazy za pomocą pięciu mikrolitrów pięciu do próbek XSDS na próbkę i gotuj próbki w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez pięć minut.Pod koniec inkubacji należy umieścić próbki na 9 do 12% żelu do elektroforezy poliakrylamidowej z 0,1% SDS, a następnie przenieść białka do membrany nitrocelulozowej, aby umożliwić wykrycie poziomów kinazy białkowej aktywowanej mitogenem fosfo i mutantów RAF w każdej próbce za pomocą immunoblottingu. Aby ocenić aktywność allosteryczną mutantów RAF martwych w kinazie, skonstruuj wektory kodujące odbiornik RAF lub aktywatory RAF martwej kinazy. Transwekcja 293 limfocytów T z dwoma wektorami kodującymi zarówno odbiornik RAF, jak i aktywator martwej kinazy RAF lub pojedynczym wektorem kodującym jedno z białek, jak pokazano.Zbierz lizaty całych komórek po 48 godzinach hodowli, jak pokazano, i szybko wymieszaj czysty lizat całych komórek z pięcioma próbek XSDS w temperaturze pokojowej, przed gotowaniem lizatów przez pięć minut w temperaturze 90 stopni Celsjusza. Następnie uruchom ugotowane próbki lizatu całych komórek na 9 do 12% żelu do elektroforezy poliakrylamidowej o zawartości 0,1% SDS i przenieś białka do membrany nitrocelulozowej w celu wykrycia poziomów kinazy fosfo regulowanej sygnałem pozakomórkowym jeden i dwa oraz białek kontrolnych przez blotting immunologiczny, jak pokazano. Aby zmierzyć względne powinowactwo dimerów i/lub stabilność mutantów RAF, skonstruuj wektory kodujące flagę tech draft mutanty połączone z końcem lucyferazy Firefly lub C, końcem C, lucyferazą świetlika.Transvect 293 limfocyty T z parą wektorów kodujących różne i Koniec mutantów RAF lucyferazy świetlika i C Koniec mutanty RAF lucyferazy świetlika, jak pokazano. 24 godziny po transwekcji przeplataj dwa razy po 10 do piątej transakcji 293 limfocytów T na studzienkę na krystalicznie czarne płytki obrazowe w podłożu bezbarwnym. 48 godzin po transwestycji dodaj lucyferynę do transwektentów komórek T 293 i inkubuj przez 30 minut.Przed pomiarem sygnałów lucyferazy w systemie wielokrotnej detekcji. Pod koniec pomiaru odessać supernatity i zagłuszyć 293 limfocyty T z buforem lizy, jak pokazano. Uruchom próbki lizatu całego ogniwa na 9 do 12% żelu do elektroforezy poliakryloamidowej z 0,1% SDS.Wykryj poziomy ekspresji końca końcowego mutantów RAF lucyferazy świetlika lub końca C mutantów lucyferazy Firefly RAF za pomocą przeciw fladze aminowej blot, jak pokazano. Następnie znormalizuj sygnały lucyferazy transwektantów 293 limfocytów T zgodnie z poziomami ekspresji końca lucyferazy świetlika i końca C mutantów RAF lucyferazy świetlików. Kinaza asa in vitro może być stosowana do skutecznego badania aktywności katalitycznej niektórych konstytutywnie aktywnych mutantów R-kręgosłupa, ale nie martwych mutantów kinazy ze zrośniętym grzbietem C.Aktywność katalityczna konstytutywnie aktywnych mutantów RAF o słabym powinowactwie do dimerów lub stabilności może jednak nie być badana przy użyciu tego ASA, ponieważ ich dimery są łamane podczas procesu oczyszczania. Aby uniknąć utraty aktywności katalitycznej mutantów RAF o słabym powinowactwie do dimerów lub stabilności, mutanty te można połączyć z transferazą glutationu, aby uratować aktywność katalityczną mutantów. Współaktywacja RAF ASA może być wykorzystana do oceny aktywności allosterycznej mutantów RAF martwych kinazy.Jak pokazano, martwe mutanty kinazy z kwaśnym motywem końcowym i fuzją grzbietu C działają jako aktywatory allosteryczne, wyzwalając aktywność katalityczną mutantów z niepowiązanym z luminoforem motywem kwaśnego końca końcowego, gdy co ulega ekspresji w komórkach 293T. Co więcej, komplementarna rozszczepiona lucyferazy SA może być użyta do pomiaru względnego powinowactwa lub stabilności dimerów kinaz rodziny RAF i ich mutantów. Stosowanie buforu lizasowego o niskim stężeniu detergentu i szybka procedura delikatnego mycia podczas oczyszczania próbki jest niezbędne do udanego badania kinazy in vitro SA. Technika ta pomoże naukowcom precyzyjnie określić, w jaki sposób mutacje RAF przenoszą chorobę, aktywują dalszy szlak, ułatwiając wybór odpowiednich strategii terapeutycznych do leczenia choroby.

characterize-disease-related-mutants-raf-family-kinases-using-set

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Kinaza 2 z powtórzeniami bogatymi w leucynę (LRRK2) jest dużą, wielodomenową kinazą, której mutacje stanowią najczęstszą genetyczną przyczynę choroby Parkinsona. Analiza aktywności kinazowej tego białka okazała się kluczowym narzędziem w zrozumieniu biologii i dysfunkcji tego białka. W niniejszej pracy opisano badanie aktywności kinazowej LRRK2 oraz wybranych jej mutantów in vitro, zapewniając system eksperymentalny do badania fosforylacji domniemanych substratów oraz potencjalnej dysfunkcji...

Oznaczanie aktywności kinazy LRRK2 in vitro

Pojawienie się genetycznej oporności na terapię inhibitorami kinaz stanowi poważne wyzwanie dla skutecznej terapii przeciwnowotworowej. Identyfikacja i charakterystyka mutacji opornych na nowo opracowany lek pomaga w lepszym zarządzaniu klinicznym i projektowaniu leków nowej generacji. W tym miejscu opisujemy nasz protokół badań przesiewowych in vitro i walidacji opornych mutacji.

Metoda badań przesiewowych i walidacji opornych mutacji przeciwko inhibitorom kinaz

Kinazy białkowe to wysoce rozwinięte enzymy sygnalizacyjne i rusztowania, które są kluczowe dla między- i wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału. Przedstawiamy protokół pomiaru aktywności kinazy za pomocą znakowanego radioaktywnie trifosforanu adenozyny ([γ-32P] ATP), niezawodnej metody pomagającej w wyjaśnieniu regulacji sygnalizacji komórkowej.

Oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP

Niniejsze badanie opisuje prostą metodę wykrywania endogennych poziomów fosforylacji Rab10 przez bogatą w leucynę kinazę powtórzeniową 2.

Wykrywanie fosforylacji Rab10 przez aktywność LRRK2 przy użyciu SDS-PAGE ze znacznikiem wiążącym fosforany

Tutaj prezentujemy protokół dla macierzy przeciwciał do identyfikacji zmian w szlakach sygnałowych w różnych modelach komórkowych. Zmiany te, spowodowane przez leki/niedotlenienie/światło ultrafioletowe/promieniowanie lub przez nadekspresję/regulację w dół/nokauty, są ważne dla różnych modeli choroby i mogą wskazywać, czy terapia będzie skuteczna lub czy mogą zidentyfikować mechanizmy oporności na leki.

Ocena oporności na inhibitory kinazy tyrozynowej poprzez badanie szlaków transdukcji sygnału przez macierze przeciwciał

Scharakteryzowaliśmy nowe białko kinazy za pomocą solidnych podejść biochemicznych: analiza Western Blot z dedykowanym specyficznym przeciwciałem na różnych liniach komórkowych i tkankach, interakcje za pomocą eksperymentów z koimmunoprecypitacją, aktywność kinazy wykryta przez Western Blot przy użyciu przeciwciała specyficznego dla fosfy oraz znakowanie γ[32P] ATP.

Charakterystyka na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych nowego białka kinazy

Przedstawiono szczegółowy protokół generowania samodzielnie składających się mikromacierzy białek ludzkich do badań przesiewowych inhibitorów kinaz.

Badania przesiewowe inhibitorów kinaz w samoorganizujących się mikromacierzach białek ludzkich

Ten protokół opisuje test oparty na bret do pomiaru interakcji kinazy CRAF z białkami 14-3-3 w żywych komórkach. Protokół określa etapy przygotowania ogniw, odczytu emisji BRET i analizy danych. Przedstawiono również przykładowy wynik wraz z identyfikacją odpowiednich elementów sterujących i rozwiązywaniem problemów w celu optymalizacji testu.

Test oparty na rezonansie bioluminescencyjnym (BRET) do pomiaru oddziaływań CRAF z białkami 14-3-3 w żywych komórkach

Genetyka chemiczna polega na zastąpieniu reszty strażnika aminokwasem zawierającym inny łańcuch boczny w docelowym locus. W tym przypadku wygenerowaliśmy zmutowanego pasożyta zawierającego hipomorficzny allel cdpk1 i zidentyfikowaliśmy szlaki kompensacyjne przyjęte przez pasożyta na tle mutacji.

Zrozumienie rozwoju szlaków kompensacyjnych u zmutowanego pasożyta malarii zawierającego hipomorficzny allel kinaz roślinopodobnych

Ten protokół opisuje projektowanie, tworzenie i stosowanie fosfataz regulowanych rapamycyną. Metoda ta zapewnia wysoką swoistość i ścisłą kontrolę czasową aktywacji fosfatazy w żywych komórkach.

Rozwój i zastosowanie fosfataz tyrozynowych regulowanych rapamycyną

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

Poznaj metody charakteryzacji mutantów kinaz RAF związanych z chorobami, w tym testy kinazowe in vitro i analizę lucyferazy. Techniki te są czułe, powtarzalne i opłacalne.

Scharakteryzować związane z chorobą mutanty kinaz z rodziny RAF przy użyciu zestawu praktycznych i wykonalnych metod

Przeglądaj więcej filmów