Analiza lokalizacji spliceosomalnego snRNA w ludzkich komórkach hela za pomocą mikroiniekcji
6 sierpnia 2019
Biogeneza spliceosomalnych snRNA to złożony proces obejmujący różne kompartmenty komórkowe. W tym przypadku zastosowaliśmy mikroiniekcję znakowanych fluorescencyjnie snRNA w celu monitorowania ich transportu wewnątrz komórki.
Tutaj zastosowaliśmy mikroiniekcję znakowanych fluorescencyjnie RNA w celu wykrycia sekwencji RNA, które są niezbędne do lokalizacji krótkich jądrowych RNA w strukturach jądrowych zwanych ciałami Cajala. Ta technika ma dwie główne zalety. Po pierwsze, można go zastosować do krótkich RNA, które w przeciwnym razie są trudne do oznakowania i śledzenia.
Po drugie, umożliwia szybkie badania przesiewowe różnych sekwencji i testowanie ich roli w lokalizacji RNA. Na dzień przed mikroiniekcją wysiewaj HeLa lub inne przylegające komórki na 12-milimetrowych szkiełkach nakrywkowych, aby osiągnąć 50% zbiegu w momencie mikroiniekcji. Na początek umieść przygotowane szkiełko nakrywkowe na środku szalki Petriego, dodaj komórki i dwa milimetry pożywki hodowlanej.
Następnego dnia umieść wypełnioną komórkami szalkę Petriego na stoliku mikroskopowym. Za pomocą mikroładowarki załadować trzy mikrolitry mieszaniny snRNA do igły i umieścić igłę w uchwycie mikrowstrzykiwacza pod kątem 45 stopni w stosunku do powierzchni szalki Petriego. Użyj obiektywu długodystansowego 10X, aby znaleźć igłę.
Najpierw ustaw prędkość zgrubną na wtryskiwaczu i opuść igłę, aż dotknie pożywki hodowlanej. Za pomocą lornetki mikroskopowej znajdź jasny punkt, czyli miejsce, w którym igła dotyka pożywki hodowlanej. Zmień prędkość na dokładną i dalej obniżaj igłę, patrząc w mikroskop, aż zostanie zaobserwowana końcówka igły.
Przesuń igłę na środek pola widzenia i przełącz się na obiektyw długodystansowy 40X. Następnie zaznacz komórkę i przesuń igłę nad komórkę. Ustaw ciśnienie i czas kontaktu z celą.
Przesuń igłę w dół do komórki, a następnie ustaw dolną granicę mikromanipulatora. Ustawienie dolnego limitu jest najbardziej krytyczną częścią protokołu. Ponieważ powierzchnia szkiełka nakrywkowego nie jest idealna, a każda komórka jest inna, konieczne będzie kilkakrotne ustawienie dolnej granicy podczas sesji wstrzykiwania.
Następnie przesunąć igłę z powrotem nad komórkę i nacisnąć przycisk wstrzyknięcia na joysticku wstrzykiwacza. Igła przesunie się automatycznie wewnątrz komórki do miejsca, w którym ustawiony jest limit wstrzyknięcia mieszaniny RNA. Aby zakończyć, naciśnij przycisk menu na wtryskiwaczu i wyjmij igłę z uchwytu.
Następnie odłącz rurkę od wtryskiwacza przed wyłączeniem wtryskiwacza i mikromanipulatora. Po mikroiniekcji należy umieścić komórki z powrotem w inkubatorze dwutlenku węgla i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie trzykrotnie przepłucz komórki PBS w temperaturze pokojowej.
Utrwal komórki przez 20 minut za pomocą 4% paraformaldehydu w rurkach 0,1 molowych o pH 6,9. Następnie umyj komórki trzykrotnie PBS o temperaturze pokojowej. Jeśli analizowana jest tylko lokalizacja snRNA, krótko przepłucz komórki w wodzie i zamontuj w pożywce montażowej z DAPI.
W przypadku dodatkowej lokalizacji białka, należy przeniknąć do komórek za pomocą 0,5% Triton X-100 w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać komórki trzykrotnie PBS i wybarwić je odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie spłucz trzy razy PBS i spłucz raz w wodzie.
Następnie zamontuj ogniwa na podłożu montażowym z DAPI. Gdy obraz będzie gotowy, użyj wysokiej klasy mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw immersyjny, aby uzyskać obrazy. Po zidentyfikowaniu mikrowstrzykniętych komórek należy zebrać stos 20 odcinków Z z krokami co 200 nanometrów Z na próbkę i poddać ich matematycznej dekonwolucji.
Aby określić ilościowo sygnał fluorescencyjny, najpierw otwórz obraz mikroskopowy w ImageJ i podziel kanały na okna. Synchronizuj okna za pomocą narzędzia do synchronizacji okna. Następnie narysuj obszar zainteresowania wokół ciała Cajala zidentyfikowanego przez barwienie immunologiczne cewki.
Zmierz intensywność sygnału snRNA w ROI zdefiniowanym przez cewkę. Określ intensywność fluorescencji snRNA w ROI losowo umieszczonym w nukleoplazmie. Zapisz zmierzone wartości i oblicz stosunek sygnału RNA w ciele Cajala i nukleoplazmie.
W tym badaniu znakowane fluorescencyjnie snRNA są mikrowstrzykiwane w celu monitorowania ich transportu wewnątrz komórki. Aby sprawdzić, czy miejsce SM jest ważne dla akumulacji ciał Cajala, snRNA pozbawione miejsca SM jest mikrowstrzykiwane bezpośrednio do jądra. Wstrzyknięcie do cytoplazmy służy jako kontrola, podczas gdy snRNA na całej długości jest mikrowstrzykiwane, aby służyć jako kontrola pozytywna.
Po inkubacji mikrowstrzyknięte komórki są utrwalane, a cewka markera ciała Cajala jest wizualizowana za pomocą immunofluorescencji pośredniej. Pełnej długości snRNA nagromadziło się w ciałach Cajala zarówno po wstrzyknięciach jądrowych, jak i cytoplazmatycznych. Natomiast snRNA pozbawione miejsca SM pozostało w cytoplazmie po mikrowstrzyknięciu do tego przedziału, podczas gdy mikroiniekcja jądrowa snRNA bez miejsca SM ujawnia, że sekwencja wiążąca SM jest ważna dla lokalizacji ciała Cajala, ponieważ to snRNA pozostaje w jądrze, ale nie kumuluje się w ciałach Cajala.
Czasami mikroiniekcja tylko do jednego przedziału komórkowego nie udaje się i oszukany Dekstran 70 kilodaltonów można znaleźć zarówno w jądrze, jak i cytoplazmie. Komórki te są odrzucane z dalszej analizy. Pomimo tego, że znakowane fluorescencyjnie snRNA są przechowywane w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza przed wstrzyknięciem, może dojść do degradacji RNA.
Zdegradowane snRNA wstrzyknięte do cytoplazmy nie jest transportowane do jądra i pozostaje zlokalizowane w cytoplazmie. Takie snRNA należy odrzucić, a nowe snRNA powinno zostać zsyntetyzowane. Ważne jest, aby prawidłowo dostosować ciśnienie iniekcji i kompensacji do typu ogniwa.
Jak wspomniano wcześniej, ustawienie prawidłowego dolnego limitu wstrzyknięcia komórek jest niezbędne dla dobrego mikrozastrzyku. Należy pamiętać, że chloroform fenolowy używany podczas izolacji RNA jest niebezpieczny, a igła do mikroiniekcji jest ostrym przedmiotem. Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z tymi materiałami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje biogenezę spliceosomalnych snRNA oraz ich transport wewnątrzkomórkowy z wykorzystaniem mikroiniekcji snRNA znakowanych fluorescencyjnie. Głównym pytaniem biologicznym jest lokalizacja tych snRNA w strukturach jądrowych znanych jako ciałka Cajala, co pozwala na poznanie sekwencji niezbędnych do ich prawidłowej lokalizacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Biologia molekularna
- Lokalizacja RNA
Wprowadzenie
- snRNA odgrywają kluczową rolę w splicingu i przetwarzaniu RNA.
- Zrozumienie ich lokalizacji może wyjaśnić mechanizmy komórkowe zaangażowane w funkcjonalność RNA.
- Ciałka Cajala są strukturami podjądrowymi związanymi z przetwarzaniem snRNA.
- Mikroiniekcja umożliwia bezpośrednią manipulację i obserwację cząsteczek RNA w żywych komórkach.
Cel badania
- Zbadanie mechanizmów transportu i lokalizacji snRNA spliceosomalnych.
- Ocena znaczenia specyficznych sekwencji RNA w określaniu lokalizacji snRNA.
- Opracowanie wiarygodnej metody śledzenia cząsteczek snRNA wewnątrz komórek.
Zastosowane metody
- Zastosowano technikę mikrowstrzykiwania z użyciem znakowanych fluorescencyjnie snRNA.
- Komórki HeLa posłużyły jako model biologiczny do badania lokalizacji snRNA.
- W celu zapewnienia dokładności i wiarygodności procesu wstrzykiwania zastosowano różnorodne kontrole i korekty.
- Komórki utrwalono i poddano immunofluorescencji w celu wizualizacji markerów ciałek Cajala.
- Ilościowego pomiaru sygnałów fluorescencyjnych dokonano przy użyciu programu ImageJ w celu przeprowadzenia szczegółowej analizy.
Główne wyniki
- Pełnowymiarowe snRNA zlokalizowały się pomyślnie w ciałkach Cajala, potwierdzając konieczność obecności sekwencji SM dla prawidłowej akumulacji.
- snRNA pozbawione sekwencji SM wykazały deficyt lokalizacji w ciałkach Cajala, pozostając w cytoplazmie.
- Iniekcje kontrolne wykazały oczekiwane wzorce transportu, co pomogło w walidacji wyników.
- Inkubacja oraz staranne dostrojenie metody mikroiniekcji były kluczowe dla uzyskania pomyślnych rezultatów.
Wnioski
- Niniejsze badanie dostarcza szczegółowego protokołu do badania transportu i lokalizacji snRNA w żywych komórkach.
- Zrozumienie mechanizmów lokalizacji RNA pomaga w ujawnieniu potencjalnych szlaków regulacyjnych związanych z aktywnością RNA.
- Wnioski z tych badań mogą przyczynić się do szerszych studiów z zakresu biologii molekularnej dotyczących funkcji RNA i organizacji komórkowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Zrozumienie lokalizacji snRNA spliceosomalnych w ciałkach Cajala dostarcza wglądu w mechanizmy szlaków przetwarzania RNA, które są istotne dla walidacji celów w terapeutykach kwasów nukleinowych. Test lokalizacji oparty na mikrowstrzykiwaniu umożliwia szybką analizę determinant sekwencyjnych sterujących transportem wewnątrzkomórkowym, co wspiera wczesne etapy ograniczania ryzyka w przypadku modalności celowanych w RNA. Podejście to przyczynia się do zwiększenia pewności prognostycznej w identyfikacji funkcjonalnych elementów RNA, które są krytyczne dla skuteczności terapeutycznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na analizę elementów sekwencji RNA warunkujących lokalizację wewnątrzkomórkową, co umożliwia testowanie hipotez dotyczących domen funkcjonalnych w snRNA.
- Wartość operacyjna: Ułatwia szybkie przesiewanie konstruktów zmutowanych w celu zidentyfikowania sekwencji niezbędnych do akumulacji w ciałkach jądrowych.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność wyboru celu poprzez powiązanie specyficznych motywów RNA z potwierdzonymi wzorcami lokalizacji wewnątrzkomórkowej.
Przesiew i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia ilościową ocenę transportu RNA za pomocą stosunków intensywności fluorescencji w określonych przedziałach podkomórkowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia możliwość wielokrotnego wykorzystania platformy do testowania wariantów RNA ze zstandardyzowanymi odczytami wydajności lokalizacji.
- Gotowość do analizy: Generuje ilościowe wyniki oparte na obrazowaniu, odpowiednie do potwierdzania trafień w kampaniach przesiewowych skoncentrowanych na RNA.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ustanawia kompatybilność systemu istotną dla przebiegu choroby, wykorzystując ludzkie komórki HeLa do modelowania mechanizmów lokalizacji snRNA.
- Wartość operacyjna: Wspiera dostosowanie biomarkerów translacyjnych poprzez zdefiniowanie zależności między sekwencją a funkcją w transporcie jądrowym RNA.
- Redukcja ryzyka prognostycznego: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w projektowaniu terapii RNA poprzez walidację funkcjonalności zależnej od lokalizacji.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, umożliwiając analizę zależności sekwencja-funkcja przed etapami identyfikacji związku wiodącego oraz walidacji przedklinicznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących determinantów sekwencji RNA w lokalizacji subkomórkowej i wyjaśnianie szlaków sygnałowych.
- Screening: Zapewnia gotowość do przeprowadzania testów dzięki ilościowym odczytom fluorescencji i powtarzalnym metrykom lokalizacji.
- Analityka: Umożliwia ilościowe pomiary zmiennych zależnych (stosunki fluorescencji ciał Cajala do nukleoplazmy), co pozwala na analizę porównawczą warunków.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez zastosowanie ludzkich modeli komórkowych i zdefiniowanych punktów końcowych lokalizacji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy standaryzowaną możliwość testowania lokalizacji RNA, którą można zastosować w ramach wielu programów celowanych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Mechaniczne ograniczanie ryzyka w przypadku terapii opartych na RNA poprzez walidację lokalizacji specyficznej dla sekwencji w funkcjonalnych przedziałach jądrowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki kontrolowanym procedurom mikroiniekcji, fiksacji i ilościowego obrazowania.
- Wartość strategiczna: Wsparcie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) poprzez powiązanie cech sekwencji RNA z walidowanym transportem wewnątrzkomórkowym, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwienie priorytetyzacji celów RNA z uwzględnieniem ryzyka na podstawie wykazanej zdolności do lokalizacji.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w zakresie mikroiniekcji, mikroskopii fluorescencyjnej oraz kwantyfikacji z wykorzystaniem oprogramowania ImageJ.
- Metoda jest zależna od systemów mikrofluidycznych do iniekcji, mikroskopów fluorescencyjnych z możliwością sekcjonowania w osi Z oraz oprogramowania do dekonwolucji.
- Konieczna jest standaryzacja ciśnienia iniekcji, czasu inkubacji oraz protokołów fiksacji dla różnych użytkowników i linii komórkowych.
- Wymagane jest rozważenie adaptacji metody przy rozszerzeniu jej na modele komórek pierwotnych lub nieadherentnych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują ryzyko degradacji RNA oraz zmienną skuteczność iniekcji, co nakłada konieczność stosowania kontroli jakości w celu weryfikacji integralności znakowanego RNA.
