Analiza lokalizacji spliceosomalnego snRNA w ludzkich komórkach hela za pomocą mikroiniekcji

Tutaj zastosowaliśmy mikroiniekcję znakowanych fluorescencyjnie RNA w celu wykrycia sekwencji RNA, które są niezbędne do lokalizacji krótkich jądrowych RNA w strukturach jądrowych zwanych ciałami Cajala. Ta technika ma dwie główne zalety. Po pierwsze, można go zastosować do krótkich RNA, które w przeciwnym razie są trudne do oznakowania i śledzenia.

Po drugie, umożliwia szybkie badania przesiewowe różnych sekwencji i testowanie ich roli w lokalizacji RNA. Na dzień przed mikroiniekcją wysiewaj HeLa lub inne przylegające komórki na 12-milimetrowych szkiełkach nakrywkowych, aby osiągnąć 50% zbiegu w momencie mikroiniekcji. Na początek umieść przygotowane szkiełko nakrywkowe na środku szalki Petriego, dodaj komórki i dwa milimetry pożywki hodowlanej.

Następnego dnia umieść wypełnioną komórkami szalkę Petriego na stoliku mikroskopowym. Za pomocą mikroładowarki załadować trzy mikrolitry mieszaniny snRNA do igły i umieścić igłę w uchwycie mikrowstrzykiwacza pod kątem 45 stopni w stosunku do powierzchni szalki Petriego. Użyj obiektywu długodystansowego 10X, aby znaleźć igłę.

Najpierw ustaw prędkość zgrubną na wtryskiwaczu i opuść igłę, aż dotknie pożywki hodowlanej. Za pomocą lornetki mikroskopowej znajdź jasny punkt, czyli miejsce, w którym igła dotyka pożywki hodowlanej. Zmień prędkość na dokładną i dalej obniżaj igłę, patrząc w mikroskop, aż zostanie zaobserwowana końcówka igły.

Przesuń igłę na środek pola widzenia i przełącz się na obiektyw długodystansowy 40X. Następnie zaznacz komórkę i przesuń igłę nad komórkę. Ustaw ciśnienie i czas kontaktu z celą.

Przesuń igłę w dół do komórki, a następnie ustaw dolną granicę mikromanipulatora. Ustawienie dolnego limitu jest najbardziej krytyczną częścią protokołu. Ponieważ powierzchnia szkiełka nakrywkowego nie jest idealna, a każda komórka jest inna, konieczne będzie kilkakrotne ustawienie dolnej granicy podczas sesji wstrzykiwania.

Następnie przesunąć igłę z powrotem nad komórkę i nacisnąć przycisk wstrzyknięcia na joysticku wstrzykiwacza. Igła przesunie się automatycznie wewnątrz komórki do miejsca, w którym ustawiony jest limit wstrzyknięcia mieszaniny RNA. Aby zakończyć, naciśnij przycisk menu na wtryskiwaczu i wyjmij igłę z uchwytu.

Następnie odłącz rurkę od wtryskiwacza przed wyłączeniem wtryskiwacza i mikromanipulatora. Po mikroiniekcji należy umieścić komórki z powrotem w inkubatorze dwutlenku węgla i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie trzykrotnie przepłucz komórki PBS w temperaturze pokojowej.

Utrwal komórki przez 20 minut za pomocą 4% paraformaldehydu w rurkach 0,1 molowych o pH 6,9. Następnie umyj komórki trzykrotnie PBS o temperaturze pokojowej. Jeśli analizowana jest tylko lokalizacja snRNA, krótko przepłucz komórki w wodzie i zamontuj w pożywce montażowej z DAPI.

W przypadku dodatkowej lokalizacji białka, należy przeniknąć do komórek za pomocą 0,5% Triton X-100 w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać komórki trzykrotnie PBS i wybarwić je odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie spłucz trzy razy PBS i spłucz raz w wodzie.

Następnie zamontuj ogniwa na podłożu montażowym z DAPI. Gdy obraz będzie gotowy, użyj wysokiej klasy mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw immersyjny, aby uzyskać obrazy. Po zidentyfikowaniu mikrowstrzykniętych komórek należy zebrać stos 20 odcinków Z z krokami co 200 nanometrów Z na próbkę i poddać ich matematycznej dekonwolucji.

Aby określić ilościowo sygnał fluorescencyjny, najpierw otwórz obraz mikroskopowy w ImageJ i podziel kanały na okna. Synchronizuj okna za pomocą narzędzia do synchronizacji okna. Następnie narysuj obszar zainteresowania wokół ciała Cajala zidentyfikowanego przez barwienie immunologiczne cewki.

Zmierz intensywność sygnału snRNA w ROI zdefiniowanym przez cewkę. Określ intensywność fluorescencji snRNA w ROI losowo umieszczonym w nukleoplazmie. Zapisz zmierzone wartości i oblicz stosunek sygnału RNA w ciele Cajala i nukleoplazmie.

W tym badaniu znakowane fluorescencyjnie snRNA są mikrowstrzykiwane w celu monitorowania ich transportu wewnątrz komórki. Aby sprawdzić, czy miejsce SM jest ważne dla akumulacji ciał Cajala, snRNA pozbawione miejsca SM jest mikrowstrzykiwane bezpośrednio do jądra. Wstrzyknięcie do cytoplazmy służy jako kontrola, podczas gdy snRNA na całej długości jest mikrowstrzykiwane, aby służyć jako kontrola pozytywna.

Po inkubacji mikrowstrzyknięte komórki są utrwalane, a cewka markera ciała Cajala jest wizualizowana za pomocą immunofluorescencji pośredniej. Pełnej długości snRNA nagromadziło się w ciałach Cajala zarówno po wstrzyknięciach jądrowych, jak i cytoplazmatycznych. Natomiast snRNA pozbawione miejsca SM pozostało w cytoplazmie po mikrowstrzyknięciu do tego przedziału, podczas gdy mikroiniekcja jądrowa snRNA bez miejsca SM ujawnia, że sekwencja wiążąca SM jest ważna dla lokalizacji ciała Cajala, ponieważ to snRNA pozostaje w jądrze, ale nie kumuluje się w ciałach Cajala.

Czasami mikroiniekcja tylko do jednego przedziału komórkowego nie udaje się i oszukany Dekstran 70 kilodaltonów można znaleźć zarówno w jądrze, jak i cytoplazmie. Komórki te są odrzucane z dalszej analizy. Pomimo tego, że znakowane fluorescencyjnie snRNA są przechowywane w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza przed wstrzyknięciem, może dojść do degradacji RNA.

Zdegradowane snRNA wstrzyknięte do cytoplazmy nie jest transportowane do jądra i pozostaje zlokalizowane w cytoplazmie. Takie snRNA należy odrzucić, a nowe snRNA powinno zostać zsyntetyzowane. Ważne jest, aby prawidłowo dostosować ciśnienie iniekcji i kompensacji do typu ogniwa.

Jak wspomniano wcześniej, ustawienie prawidłowego dolnego limitu wstrzyknięcia komórek jest niezbędne dla dobrego mikrozastrzyku. Należy pamiętać, że chloroform fenolowy używany podczas izolacji RNA jest niebezpieczny, a igła do mikroiniekcji jest ostrym przedmiotem. Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z tymi materiałami.