Name: Analiza lokalizacji spliceosomalnego snRNA w ludzkich komórkach hela za pomocą mikroiniekcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-06T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj metodę mikroiniekcji fluorescencyjnie znakowanych snRNA do komórek HeLa w celu badania lokalizacji w ciałach Cajala. Technika ta umożliwia identyfikację sekwencji RNA niezbędnych dla prawidłowego transportu jądrowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Czeską Fundację Naukową (18-10035S), Narodowy Program Zrównoważonego Rozwoju I (LO1419), wsparcie instytucjonalne (RVO68378050), Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego (CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) oraz Agencję Grantową Uniwersytetu Karola (GAUK 134516). Wyrażamy również uznanie dla Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, Republika Czeska (wspierane przez granty (Czech-Bioimaging - LM2015062).

1. Przygotowanie snRNA do mikroiniekcji
<ol>
	<li>Przygotuj matrycę DNA zawierającą pełnowymiarową lub skróconą/zmutowaną wersję snRNA metodą PCR, stosując następujące ustawienia PCR: 98 °C przez 60 s, 98 °C przez 15 s, 68 °C przez 30 s, 72 °C przez 1 min, 98 °C przez 15 s przez 35x i 72 °C przez 5 min.</li>
	<li>Starter forward musi zawierać sekwencję promotora do transkrypcji in vitro tuż przed pierwszym transkrybowanym nukleotydem. Amplifikuj sekwencję snRNA U2 za pomocą startera do przodu zawierającego promotor T7 i startera odwrotnego, który kończy się ostatnim transkrybowanym nukleotydem (szczegóły w Tabeli materiałów).</li>
	<li>Zsyntetyzuj snRNA za pomocą zestawu do syntezy krótkiego RNA (szczegółowe informacje znajduje się w tabeli materiałów) zawierającego polimerazę RNA T7. Do mieszaniny reakcyjnej dodać 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0,8 mM UTP, 0,2 mM UTP-Alexa488, 1,8 mM analogu kapu trimetyloguanozyny (m32,2,7G(5')ppp(5')G), 1 μL inhibitora RNA i 500-700 ng matrycy DNA do mieszaniny reakcyjnej i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Dodać 1 μl (2U) DNazy do reakcji i inkubować przez dodatkowe 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wyizolować snRNA przez ekstrakcję kwasowym fenolem/chloroformem. Usuń górną fazę wodną i dodaj 1/10 pierwotnej objętości 3 M octanu sodu (pH = 5,2), 3 μl glikogenu dla lepszej wizualizacji granulek i 2,5 objętości 100% etanolu. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze -80 °C, wirować przez 10 minut przy 14 000 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj granulat 70% etanolem i rozpuść w 12 μl wody wolnej od nukleaz. Typowa wydajność RNA wynosiła około 600 ng/μL. Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Monitorowanie integralności transkrybowanych snRNA in vitro za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.</li>
	<li>Przed mikroiniekcją rozcieńczyć RNA do końcowego stężenia 200 ng/μL w wodzie zawierającej 10 μg/μL dextran-TRITC 70 kDa.</li>
</ol>
2. Komórki
<ol>
	<li>Przed użyciem szkiełka nakrywkowe należy potraktować 1 M HCl przez 1 godzinę, dokładnie umyć w wodzie destylowanej i przechowywać w 100% etanolu. Kwaśne leczenie wspomaga adhezję komórek, aby zapobiec łuszczeniu się komórek podczas lub po wstrzyknięciu. W celu łatwiejszej identyfikacji wstrzykniętych komórek należy użyć szkiełka nakrywkowego z siatką.</li>
	<li>Wysiewaj HeLa lub inne przylegające komórki 1 dzień przed mikroiniekcją na 12 mm szkiełkach nakrywkowych (nr 1 lub nr 1,5), aby osiągnąć 50% zbieżności w momencie mikroiniekcji.</li>
</ol>
3. Wtrysk
UWAGA: Komórki HeLa zostały mikrowstrzyknięte do zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium firmy Dulbecco (D-MEM, 4,5 g/L D-glukozy zawierającej czerwień fenolową i antybiotyki). Iniekcję wykonywano za pomocą iniektora i mikromanipulatora wyposażonego w sterylną igłę (szczegóły w Tabeli Materiałów). Cały system mikroskopowy/mikromanipulacyjny był wstępnie podgrzewany do temperatury 37 °C przez co najmniej 4 godziny, aby zapobiec wahaniom poszczególnych części mikroskopu i mikrowtryskiwacza.
<ol>
	<li>Umieścić szalkę Petriego (30 mm) zawierającą 2 ml pożywki hodowlanej ze szkiełkiem nakrywkowym pośrodku do uchwytu mikroskopu. Załaduj 3 μl mieszaniny snRNA do igły za pomocą mikroładowarki. Umieścić igłę w uchwycie mikrowstrzykiwacza pod kątem 45° w stosunku do powierzchni szalki Petriego.</li>
	<li>Aby znaleźć igłę, użyj obiektywu długodystansowego 10x. Najpierw ustaw prędkość COARSE na wtryskiwaczu i opuść igłę, aż dotknie pożywki hodowlanej. Za pomocą lornetki mikroskopowej znajdź jasny punkt, czyli miejsce, w którym igła dotyka pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Zmień prędkość na FINE i dalej obniżaj igłę, patrząc w mikroskop, aż zaobserwujesz końcówkę igły. Przesuń igłę na środek pola widzenia i przełącz się na obiektyw dalekiego zasięgu 40x.</li>
	<li>Po zmianie celu zaznacz komórkę i przesuń igłę nad tę komórkę. Ustaw ciśnienie i czas kontaktu komórkowego (patrz Wskazówki i rozwiązywanie problemów w dyskusji).</li>
	<li>Przesuń igłę w dół do komórki, a następnie ustaw dolną granicę na mikromanipulatorze. Należy uważać, aby nie przesunąć igły poniżej ogniwa.</li>
	<li>Po ustawieniu dolnego limitu należy przesunąć igłę z powrotem nad kuwetę i nacisnąć przycisk wstrzykiwania na joysticku wtryskiwacza. Igła automatycznie przesuwa się wewnątrz komórki do miejsca, w którym ustalany jest limit i wstrzykuje mieszaninę RNA.</li>
	<li>Aby zakończyć, naciśnij przycisk MENU na wtryskiwaczu i wyjmij igłę z uchwytu. Następnie odłącz rurkę od wtryskiwacza przed wyłączeniem wtryskiwacza i mikromanipulatora.</li>
</ol>
4. Utrwalanie i barwienie komórek
<ol>
	<li>Po mikroiniekcji należy umieścić komórki z powrotem w inkubatorze z użyciem CO2 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Po inkubacji przepłukać komórki trzykrotnie buforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS) w temperaturze pokojowej, utrwalić na 20 minut 4% paraformaldehydem w 0,1 M RURACH o pH 6,9 i przemyć trzykrotnie PBS o temperaturze pokojowej. Jeśli analizowana jest tylko lokalizacja snRNA, krótko przepłucz komórki w wodzie i zamontuj w pożywce montażowej z DAPI.</li>
	<li>W przypadku dodatkowej lokalizacji białka należy przepuszczać komórki za pomocą 0,5% Triton-X100 w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po trzech płukaniach PBS inkubować komórki z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi, a po końcowym płukaniu w PBS i krótkim płukaniu w wodzie, zamontować w pożywce montażowej z DAPI.</li>
</ol>
5. Mikroskopia
<ol>
	<li>Jeśli nie zostaną zobrazowane natychmiast po zamontowaniu, przechowuj szkiełka w temperaturze 4 °C do czasu obrazowania.</li>
	<li>Uzyskuj obrazy za pomocą wysokiej klasy mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw immersyjny (60X lub 100x/1,4NA).</li>
	<li>Po zidentyfikowaniu mikrowstrzykniętych komórek należy zebrać stos 20 przekrojów z odstępami co 200 nm na próbkę i poddać go matematycznej dekonwolucji. Następnie zaprezentowano maksymalne rzuty lub poszczególne stosy z.</li>
	<li>Aby określić ilościowo sygnał fluorescencyjny, narysuj obszar zainteresowania (ROI) wokół ciała Cajala zidentyfikowanego przez barwienie immunologiczne cewki. Zmierz intensywność sygnału snRNA w ROI zdefiniowanym przez cewkę. Następnie określ intensywność fluorescencji snRNA w ROI losowo umieszczonym w nukleoplazmie i oblicz stosunek sygnału RNA w ciele Cajala i nukleoplazmie.</li>
</ol>

<ol><li>Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+truncated+forms+of+U1+snRNA+reveals+a+novel+RNA+degradation+pathway+during+snRNP+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).</li>
<li>Stanek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal+bodies+and+snRNPs+-+friends+with+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.</a> RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).</li>
<li>Stanek, D., Fox, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+bodies%3A+news+insights+into+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curentr+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear bodies: news insights into structure and function.</a> Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).</li>
<li>Novotny, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SART3-Dependent+Accumulation+of+Incomplete+Spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies.</a> Cell Reports. 10, 429-440 (2015).</li>
<li>Roithova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sm-core+mediates+the+retention+of+partially-assembled+spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+bodies+until+their+full+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).</li>
<li>Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleo-cytoplasmic+transport+of+U+snRNPs%3A+definition+of+a+nuclear+location+signal+in+the+Sm+core+domain+that+binds+a+transport+receptor+independently+of+the+m3G+cap%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap.</a> EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).</li>
<li>Shukla, S., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+of+assembly-defective+U1+snRNAs+by+decapping+and+5%27-to-3%27+exonucleolytic+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion.</a> Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+message+clear%3A+visualizing+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).</li>
<li>Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+U4%2FU6+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+association+in+Cajal+bodies+predicted+by+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).</li>
<li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zastosowaliśmy mikroiniekcję znakowanych fluorescencyjnie snRNA w celu określenia sekwencji ważnych dla lokalizacji snRNA w jądrowych ciałach Cajala. Ze względu na szybkie i dość proste przygotowanie znakowanych RNA (przygotowanie matrycy DNA metodą PCR, a następnie transkrypcja in vitro), metoda ta oferuje skuteczną analizę tego, w jaki sposób różne sekwencje przyczyniają się do lokalizacji RNA. W stosunkowo krótkim czasie byliśmy w stanie przeanalizować dziesięć różnych delecji lub podstawień snRNA U2 (odniesienie<sup ...

Splicing RNA jest jednym z kluczowych etapów ekspresji genów, który jest katalizowany przez duży kompleks rybonukleoproteinowy zwany spliceosomem. W sumie ponad 150 białek i 5 małych jądrowych RNA (snRNA) jest zintegrowanych ze spliceosomem na różnych etapach szlaku splicingu. SnRNA U1, U2, U4, U5 i U6 uczestniczą w splicingu głównych intronów GU-AG. Te snRNA dołączają do spliceosomu jako wstępnie uformowane małe jądrowe cząstki rybonukleoproteiny (snRNP), które zawierają snRNA, siedem białek Sm związanych z snRNA (lub białka Like-Sm, które łączą się z snRNA U6) i 1-12 białek specyficznych dla każdego snRNP.
Składanie snRNP obejmuje etapy cytoplazmatyczne i jądrowe. Nowo transkrybowane snRNA jest eksportowane do cytoplazmy, gdzie uzyskuje pierścień złożony z siedmiu białek Sm. Pierścień Sm służy następnie jako sygnał do ponownego importu snRNA z powrotem do jądra. Wadliwe snRNA, które nie łączą się z białkami Sm, są zatrzymywane w cytoplasm1. Nowo importowane snRNP pojawiają się najpierw w ciele Cajala, gdzie spotykają się z białkami specyficznymi dla snRNP i kończą dojrzewanie (przegląd w referencji2,3). Niedawno wykazaliśmy, że hamowanie końcowych etapów dojrzewania powoduje sekwestrację niedojrzałych snRNP w ciałach Cajala4,5. Zaproponowaliśmy model, w którym końcowe dojrzewanie snRNP odbywa się pod kontrolą jakości, która monitoruje dodawanie białek specyficznych dla snRNP i tworzenie aktywnych snRNP. Jednak molekularne szczegóły dotyczące tego, w jaki sposób komórki rozróżniają prawidłowo złożone dojrzałe i nieprawidłowe niedojrzałe cząstki, pozostają nieuchwytne.
Aby określić sekwencje snRNA, które są niezbędne do celowania i akumulacji snRNA w jądrowych ciałach Cajala, zdecydowaliśmy się zastosować mikroiniekcję fluorescencyjnie znakowanych snRNA. Mikroiniekcja była metodą z wyboru, ponieważ: 1) nie wymaga dodatkowego znacznika sekwencji, aby odróżnić syntetyczne snRNA od ich endogennych odpowiedników, co jest szczególnie ważne w przypadku krótkich RNA z niewielką przestrzenią na wprowadzenie dodatkowej sekwencji znacznika; 2) umożliwia analizę sekwencji, które są ważne dla biogenezy. Na przykład sekwencja Sm jest niezbędna do złożenia pierścienia Sm i ponownego importu do klasy nucleus<sup="xref">6. Kiedy snRNA ulegają ekspresji w komórce, snRNA pozbawione sekwencji Sm są degradowane w cytoplazmie i nie docierają do jądra i ciał Cajala7. Jednak snRNA bez sekwencji Sm mogą być bezpośrednio mikrowstrzykiwane do jądra, a tym samym badana jest potencjalna rola sekwencji Sm w lokalizacji ciała Cajala.
Tutaj szczegółowo opisujemy metodę mikroiniekcji, którą zastosowaliśmy do określenia sekwencji snRNA niezbędnych do skierowania snRNA do ciała Cajala5. Wykazaliśmy, że miejsca wiązania Sm i SMN są razem niezbędne i wystarczające do lokalizacji nie tylko snRNA, ale różnych krótkich niekodujących RNA w ciele Cajala. Opierając się na mikroiniekcji, a także innych dowodach, zaproponowaliśmy, że pierścień Sm zamontowany w miejscu wiązania Sm jest sygnałem lokalizacji ciała Cajala.

<table><tbody><tr><td>ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP</td><td>ThermoFisher</td><td>C11403</td><td>Stężenie zapasów 1 mM</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium - wysoka glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>Zawiera 4,5 g&frasl; L D-glukoza, czerwień fenolowa i antybiotyki</td></tr><tr><td>FemtoJet express Injector</td><td>Eppendorf</td><td>5247000013</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips II</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td>Igła do mikroiniekcji 0,5 i mikro; m wewnętrznym i 0,7 &mikro; m średnica zewnętrzna</td></tr><tr><td>Fluoromont G z DAPI</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9510</td><td>Stężenie zapasowe 5 mg/ml</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe w kratkę</td><td>Ibidi</td><td>10817</td><td>Szkiełka nakrywkowe z siatką, brak bezpośredniego doświadczenia z nimi</td></tr><tr><td>Mikromanipulator InjectMan NI 2</td><td>Eppendorf</td><td>5181000017</td><td></td></tr><tr><td>m3-2,2,7G(5')ppp(5')G analog czapki trimetylowej</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-853-1</td><td>Stężenie zapasów 40 mM</td></tr><tr><td>Zestaw do transkrypcji MEGAshortscript T7</td><td>Okulary</td> nakrywkowe do mikroskopu ThermoFisher <td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>12 mm, nr 1</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>111520</td><td>Do rutynowych prac</td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe do mikroskopu 12 mm, nr 1.5</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>117520</td><td>Do wysokich rozdzielczość obrazów</td></tr><tr><td>Mikroskop DeltaVision</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Do akwizycji obrazu</td></tr><tr><td>Mikroskop DMI6000</td><td>Leica</td><td></td><td>Do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 32% roztwór EM klasy EMS</td><td></td><td>15714</td><td>Rozpuszczony w RURACH do końcowego stężenia 4%</td></tr> <tr><td>Fenol:Chloroform 5:1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Startery do wzmocnienia U2: Do przodu: 5'-TAATACGACT CACTATAGGGATCGCTTCT CGGCCTTTTGG, Wsteczny: 5&acute; TGGTG CACCGTTCCTGGAGGT</td> Sekwencja promotora <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>T7 kursywą</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Phusion High Fidelity</td><td>BioLab</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>Stężenie magazynowe 40 mM</td></tr><tr><td>Izotiocyjanian tetrametylodaminy Dekstran 65-85 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1162</td><td>Rozpuszczony w wodzie, stężenie podstawowe 1 mg / ml</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Serva</td><td>37240</td><td>Rozpuszczony w wodzie, stężenie wyjściowe 10%</td></tr></tbody></table>

analiza lokalizacji spliceosomalnego snrna w ludzkich komórkach hela za pomocą mikroiniekcji

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

Biogeneza spliceosomalnych snRNA to złożony proces obejmujący zarówno fazę jądrową, jak i cytoplazmatyczną, a ostatni etap zachodzi w przedziale jądrowym zwanym ciałem Cajala. Jednak sekwencje, które kierują lokalizację snRNA w tej subjądrowej strukturze, nie były znane do niedawna. Aby określić sekwencje ważne dla akumulacji snRNA w ciałach Cajal, zastosowaliśmy mikroiniekcję znakowanych fluorescencyjnie snRNA, a następnie ich lokalizację wewnątrz komórek. Najpierw przygotowaliśmy mutanty delecji snRNA, zsyntetyzowaliśmy matryce DNA do transkrypcji in vitro i dokonaliśmy transkrypcji snRNA w obecności UTP sprzężonego z Alexa488. Znakowane snRNA zmieszano z 70 kDa-dekstranem sprzężonym z TRITC i mikrowstrzyknięto do jądra lub cytoplazmy ludzkich komórek HeLa. Komórki inkubowano przez 1 godzinę i utrwalano, a cewkę markera ciała Cajala uwidoczniono za pomocą immunofluorescencji pośredniej, podczas gdy snRNA i dekstran, który służy jako marker wstrzyknięcia jądrowego lub cytoplazmatycznego, obserwowano bezpośrednio za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Metoda ta pozwala na skuteczne i szybkie testowanie, w jaki sposób różne sekwencje wpływają na lokalizację RNA wewnątrz komórek. Tutaj pokazujemy znaczenie sekwencji wiążącej Sm dla efektywnej lokalizacji snRNA w ciele Cajala.

Aby monitorować lokalizację snRNA oraz rolę miejsca wiązania Sm w kierowaniu do ciałek Cajala, przygotowano matrycę DNA zawierającą promotor T7 oraz pełnowartościowe U2 snRNA lub U2 snRNA pozbawione siedmiu nukleotydów (AUUUUUG) tworzących miejsce wiązania Sm. cząsteczki snRNA poddano transkrypcji in vitro, wyizolowano i zmieszano z dekstranem-70kDa sprzężonym z TRITC. Mieszaninę zawierającą transkrybowane in vitro snRNA mikroinjektowano do jądra lub cytoplazmy komórek HeLa.
Wcześniej wykazano...

Biogeneza spliceosomalnych snRNA to złożony proces obejmujący różne kompartmenty komórkowe. W tym przypadku zastosowaliśmy mikroiniekcję znakowanych fluorescencyjnie snRNA w celu monitorowania ich transportu wewnątrz komórki.

Analiza lokalizacji spliceosomalnego snRNA w ludzkich komórkach hela za pomocą mikroiniekcji

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

Tutaj zastosowaliśmy mikroiniekcję znakowanych fluorescencyjnie RNA w celu wykrycia sekwencji RNA, które są niezbędne do lokalizacji krótkich jądrowych RNA w strukturach jądrowych zwanych ciałami Cajala. Ta technika ma dwie główne zalety. Po pierwsze, można go zastosować do krótkich RNA, które w przeciwnym razie są trudne do oznakowania i śledzenia.Po drugie, umożliwia szybkie badania przesiewowe różnych sekwencji i testowanie ich roli w lokalizacji RNA. Na dzień przed mikroiniekcją wysiewaj HeLa lub inne przylegające komórki na 12-milimetrowych szkiełkach nakrywkowych, aby osiągnąć 50% zbiegu w momencie mikroiniekcji. Na początek umieść przygotowane szkiełko nakrywkowe na środku szalki Petriego, dodaj komórki i dwa milimetry pożywki hodowlanej.Następnego dnia umieść wypełnioną komórkami szalkę Petriego na stoliku mikroskopowym. Za pomocą mikroładowarki załadować trzy mikrolitry mieszaniny snRNA do igły i umieścić igłę w uchwycie mikrowstrzykiwacza pod kątem 45 stopni w stosunku do powierzchni szalki Petriego. Użyj obiektywu długodystansowego 10X, aby znaleźć igłę.Najpierw ustaw prędkość zgrubną na wtryskiwaczu i opuść igłę, aż dotknie pożywki hodowlanej. Za pomocą lornetki mikroskopowej znajdź jasny punkt, czyli miejsce, w którym igła dotyka pożywki hodowlanej. Zmień prędkość na dokładną i dalej obniżaj igłę, patrząc w mikroskop, aż zostanie zaobserwowana końcówka igły.Przesuń igłę na środek pola widzenia i przełącz się na obiektyw długodystansowy 40X. Następnie zaznacz komórkę i przesuń igłę nad komórkę. Ustaw ciśnienie i czas kontaktu z celą.Przesuń igłę w dół do komórki, a następnie ustaw dolną granicę mikromanipulatora. Ustawienie dolnego limitu jest najbardziej krytyczną częścią protokołu. Ponieważ powierzchnia szkiełka nakrywkowego nie jest idealna, a każda komórka jest inna, konieczne będzie kilkakrotne ustawienie dolnej granicy podczas sesji wstrzykiwania.Następnie przesunąć igłę z powrotem nad komórkę i nacisnąć przycisk wstrzyknięcia na joysticku wstrzykiwacza. Igła przesunie się automatycznie wewnątrz komórki do miejsca, w którym ustawiony jest limit wstrzyknięcia mieszaniny RNA. Aby zakończyć, naciśnij przycisk menu na wtryskiwaczu i wyjmij igłę z uchwytu.Następnie odłącz rurkę od wtryskiwacza przed wyłączeniem wtryskiwacza i mikromanipulatora. Po mikroiniekcji należy umieścić komórki z powrotem w inkubatorze dwutlenku węgla i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie trzykrotnie przepłucz komórki PBS w temperaturze pokojowej.Utrwal komórki przez 20 minut za pomocą 4% paraformaldehydu w rurkach 0,1 molowych o pH 6,9. Następnie umyj komórki trzykrotnie PBS o temperaturze pokojowej. Jeśli analizowana jest tylko lokalizacja snRNA, krótko przepłucz komórki w wodzie i zamontuj w pożywce montażowej z DAPI.W przypadku dodatkowej lokalizacji białka, należy przeniknąć do komórek za pomocą 0,5% Triton X-100 w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać komórki trzykrotnie PBS i wybarwić je odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie spłucz trzy razy PBS i spłucz raz w wodzie.Następnie zamontuj ogniwa na podłożu montażowym z DAPI. Gdy obraz będzie gotowy, użyj wysokiej klasy mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw immersyjny, aby uzyskać obrazy. Po zidentyfikowaniu mikrowstrzykniętych komórek należy zebrać stos 20 odcinków Z z krokami co 200 nanometrów Z na próbkę i poddać ich matematycznej dekonwolucji.Aby określić ilościowo sygnał fluorescencyjny, najpierw otwórz obraz mikroskopowy w ImageJ i podziel kanały na okna. Synchronizuj okna za pomocą narzędzia do synchronizacji okna. Następnie narysuj obszar zainteresowania wokół ciała Cajala zidentyfikowanego przez barwienie immunologiczne cewki.Zmierz intensywność sygnału snRNA w ROI zdefiniowanym przez cewkę. Określ intensywność fluorescencji snRNA w ROI losowo umieszczonym w nukleoplazmie. Zapisz zmierzone wartości i oblicz stosunek sygnału RNA w ciele Cajala i nukleoplazmie.W tym badaniu znakowane fluorescencyjnie snRNA są mikrowstrzykiwane w celu monitorowania ich transportu wewnątrz komórki. Aby sprawdzić, czy miejsce SM jest ważne dla akumulacji ciał Cajala, snRNA pozbawione miejsca SM jest mikrowstrzykiwane bezpośrednio do jądra. Wstrzyknięcie do cytoplazmy służy jako kontrola, podczas gdy snRNA na całej długości jest mikrowstrzykiwane, aby służyć jako kontrola pozytywna.Po inkubacji mikrowstrzyknięte komórki są utrwalane, a cewka markera ciała Cajala jest wizualizowana za pomocą immunofluorescencji pośredniej. Pełnej długości snRNA nagromadziło się w ciałach Cajala zarówno po wstrzyknięciach jądrowych, jak i cytoplazmatycznych. Natomiast snRNA pozbawione miejsca SM pozostało w cytoplazmie po mikrowstrzyknięciu do tego przedziału, podczas gdy mikroiniekcja jądrowa snRNA bez miejsca SM ujawnia, że sekwencja wiążąca SM jest ważna dla lokalizacji ciała Cajala, ponieważ to snRNA pozostaje w jądrze, ale nie kumuluje się w ciałach Cajala.Czasami mikroiniekcja tylko do jednego przedziału komórkowego nie udaje się i oszukany Dekstran 70 kilodaltonów można znaleźć zarówno w jądrze, jak i cytoplazmie. Komórki te są odrzucane z dalszej analizy. Pomimo tego, że znakowane fluorescencyjnie snRNA są przechowywane w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza przed wstrzyknięciem, może dojść do degradacji RNA.Zdegradowane snRNA wstrzyknięte do cytoplazmy nie jest transportowane do jądra i pozostaje zlokalizowane w cytoplazmie. Takie snRNA należy odrzucić, a nowe snRNA powinno zostać zsyntetyzowane. Ważne jest, aby prawidłowo dostosować ciśnienie iniekcji i kompensacji do typu ogniwa.Jak wspomniano wcześniej, ustawienie prawidłowego dolnego limitu wstrzyknięcia komórek jest niezbędne dla dobrego mikrozastrzyku. Należy pamiętać, że chloroform fenolowy używany podczas izolacji RNA jest niebezpieczny, a igła do mikroiniekcji jest ostrym przedmiotem. Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z tymi materiałami.

analysis-spliceosomal-snrna-localization-human-hela-cells-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

W niniejszej pracy opisujemy test wykorzystujący mikroiniekcję w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ w celu dokładnego pomiaru kinetyki eksportu mRNA z jądra w somatycznych komórkach ssaków.

Analiza kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków za pomocą mikroiniekcji

Hybrydyzacja in situ (ISH) RNA umożliwia wizualizację RNA w komórkach i tkankach. Tutaj pokazujemy, jak połączenie RNAscope ISH z immunohistochemią lub barwnikami histologicznymi może być z powodzeniem wykorzystane do wykrywania mRNA zlokalizowanych na aksonach w odcinkach mózgu myszy i człowieka.

Wykrywanie aksonalnie zlokalizowanych mRNA w skrawkach mózgu za pomocą hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości

Opisano protokół hybrydyzacji in situ (ISH), który wykorzystuje krótkie oligonukleotydy antysensowne do wykrywania alternatywnych wzorców splicingu pre-mRNA w sekcjach mózgu myszy.

Analiza ilościowa alternatywnego splicingu pre-mRNA w skrawkach mózgu myszy przy użyciu testu hybrydyzacji RNA in situ

Tutaj opisujemy test hybrydyzacji in situ, który umożliwia czułe i specyficzne wykrywanie sekwencji tak krótkich jak 50 nukleotydów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu na poziomie pojedynczej komórki. Test, który może być wykonywany ręcznie lub automatycznie, może umożliwić wizualizację wariantów splicingu, krótkich sekwencji i mutacji w kontekście tkanki.

Wizualizacja wariantów genetycznych, krótkich celów i mutacji punktowych w kontekście morfologicznym tkanki za pomocą testu hybrydyzacji RNA in situ

Ten protokół przedstawia kroki potrzebne do wygenerowania modelowego systemu, w którym transkrypcja interesującego nas endogennego genu może być warunkowo kontrolowana u żywych zwierząt lub komórek za pomocą ulepszonych systemów represora lac i/lub aktywatora tet.

Zastosowanie in vivo systemu REMOTE-control do manipulacji endogenną ekspresją genów

Aby w sposób powtarzalny zliczyć liczbę mRNA w poszczególnych oocytach, zoptymalizowano jednocząsteczkową fluorescencję RNA in situ (RNA-FISH) dla komórek nieprzylegających. Oocyty zebrano, zhybrydyzowano z sondami specyficznymi dla transkryptu i oznaczono ilościowo za pomocą oprogramowania do kwantyfikacji obrazu.

Zastosowanie jednocząsteczkowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (SM-FISH) do ilościowego oznaczania i lokalizacji mRNA w mysich oocytach

Ten protokół przedstawia szybkie i użyteczne narzędzie do oceny roli białka o niescharakteryzowanej funkcji w alternatywnej regulacji splicingu po leczeniu chemioterapeutycznym.

Wykorzystanie narzędzia E1A Minigene do badania zmian splicingu mRNA

Ten protokół opisuje test reporterowy minigenu do monitorowania wpływu mutacji miejsca 5'-splicingu na splicing i rozwija supresorowe U1 snRNA w celu ratowania indukowanego mutacjami hamowania splicingu. Konstrukty reporterowe i supresorowe U1 snRNA ulegają ekspresji w komórkach HeLa, a splicing jest analizowany przez wydłużenie startera lub RT-PCR.

Test komórkowy oparty na reporterze do monitorowania wydajności splicingu

Ten protokół opisuje szczegółowe, niskonakładowe przygotowanie próbki do sekwencjonowania pojedynczego jądra, w tym sekcję górnych zwojów szyjnych i gwiaździstych myszy, dysocjację komórek, krioprezerwację, izolację jądra i kodowanie kreskowe hashtagów.

Izolacja i multipleksowanie jądra o niskim poziomie wejściowym z przeciwciałami kodowymi zwojów współczulnych myszy do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Poznaj metodę mikroiniekcji fluorescencyjnie znakowanych snRNA do komórek HeLa w celu badania lokalizacji w ciałach Cajala. Technika ta umożliwia identyfikację sekwencji RNA niezbędnych dla prawidłowego transportu jądrowego.

Analiza lokalizacji spliceosomalnego snRNA w ludzkich komórkach hela za pomocą mikroiniekcji

Przeglądaj więcej filmów