Wykrywanie pasożytów trypanosoma zewnątrznaczyniowego za pomocą aspiracji cienkoigłowej

Cytologia aspiracyjna cienkoigłowa jest niedrogą, prostą, szybką i małoinwazyjną techniką, której używamy do pobierania trypanosomów z wyczuwalnych palpacyjnie zmian w narządach u żywych myszy. Biorąc pod uwagę, że aspiracja cienkoigłowa jest procedurą nieterminalną, pozwala na wielokrotne pobieranie próbek od tego samego zwierzęcia w czasie. Jeśli te odkrycia można przełożyć na bydło, metoda ta będzie bardzo przydatna dla weterynarzy do diagnozowania trypanosomatozy u bydła w gospodarstwie.

Procedurę barwienia wymazu zademonstruje Ana Margarida Santos, asystentka technologa z mojego laboratorium. Na początek potwierdź znieczulenie metodą szczypania palców u stóp. Gdy odruch wycofania nogi jest nieobecny, ustaw mysz w pozycji leżącej grzbietowej.

Ostrożnie obmacuj jądra, aby określić rozmiar i odległość od leżącej nad nimi skóry, a następnie utrzymaj je między palcem wskazującym i środkowym lub między palcem wskazującym a kciukiem. Aby jeszcze bardziej unieruchomić cel, mocno rozciągnij leżącą na niej skórę i oczyść powierzchnię chusteczkami nasączonymi alkoholem. Następnie włóż końcówkę igły o rozmiarze 23 podłączonej do pięciomililitrowej strzykawki do tarczy, upewniając się, że tłok jest w stanie spoczynku.

Aby zastosować ssanie, cofnąć tłok strzykawki do oznaczenia trzech do czterech milimetrów dwa do trzech razy. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo uzyskania reprezentatywnej próbki i celowania w mniejsze struktury, takie jak najądrza, przekieruj igłę w narządzie w linii prostej lub wzdłuż kilku różnych stycznych. Zwolnić ssanie, a następnie wyjąć igłę.

Igłę można usunąć tylko po zwolnieniu podciśnienia poprzez puszczenie tłoka. W przeciwnym razie aspirat zostanie zassany do strzykawki i jest nieodwracalny. Uciskaj sterylną gąbką z gazy w miejscu nakłucia, aby zatamować krwawienie.

Odłączyć strzykawkę od igły i napełnić ją powietrzem. Ponownie podłączyć igłę, umieścić końcówkę igły bardzo blisko szkiełka lub nawet na nim i delikatnie wysunąć zawartość igły na szkiełko. Aby zapewnić powtórzone pobieranie próbek, należy przeprowadzić co najmniej jedną dodatkową aspirację na narząd i zwierzę.

Po przywróceniu znieczulenia z podskórnym wstrzyknięciem 200 mikrolitrów jednego miligrama na kilogram Atipamezolu w soli fizjologicznej, zwierzęta należy umieścić w klatce domowej w celu wyzdrowienia. Używając ręki niedominującej, podnieś szkiełko, w którym znajduje się kropla zasysacza, ściskając oszroniony koniec między kciukiem a palcem wskazującym. Używając dominującej ręki, podnieś czysty szkiełko rozpierające i umieść go gładką, czystą krawędzią w poprzek drugiego szkiełka tuż na szczycie spadku pod kątem około 30 stopni.

Aby uzyskać cienką warstwę, przesuwaj suwak do przodu jednym lekkim, ciągłym i stałym ruchem. Oprzyj szkiełko i pozwól na całkowite i szybkie wyschnięcie materiału na powietrzu. Oznacz matową krawędź szkiełka ołówkiem.

W przypadku protokołu barwienia Giemsa utrwal wysuszone na powietrzu rozmazy, zanurzając szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 100% metanolu na pięć minut. Następnie przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego 20% roztwór Giemsa i wodę destylowaną na 30 minut. Opłucz szkiełka w wodzie z kranu i przetrzyj bibułą do całkowitego wyschnięcia.

Trzymając szkiełko poziomo, nałóż kilka kropli niewodnego medium mocującego na rozmaz. Umieść krawędź szkła nakrywkowego na szkiełku, opuść je i delikatnie dociśnij, aby usunąć pęcherzyki powietrza. W przypadku immunocytochemii utrwal wysuszone na powietrzu rozmazy w 100% metanolu w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Myj szkiełko przez pięć minut w słoiku Coplin z 1X PBS, powtarzając ten krok trzy razy, używając za każdym razem świeżego 1X PBS. Po wyjęciu szkiełek ze słoika Coplin należy wytrzeć nadmiar buforu bez dotykania rozmazu i narysować linię wokół rozmazu za pomocą wodoodpornego pisaka. Trzymając szkiełko poziomo, nanieść 150 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na każdy rozmaz i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji myj szkiełka przez pięć minut w słoiku Coplin z 1X PBS, powtarzając ten krok trzy razy, używając za każdym razem świeżego 1X PBS. Trzymając szkiełko poziomo, nałóż 150 mikrolitrów dostępnego w handlu systemu wizualizacji DAB peroksydazy chrzanowej na każdy rozmaz, a następnie inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka ponownie trzy razy przez pięć minut w PBS.

Następnie przeciwdziałaj barwieniu, zanurzając szkiełka w słoiku Coplin zawierającym hematoksylinę Harrisa na 10 sekund. Spłucz w wodzie z kranu i przetrzyj papierem do całkowitego wyschnięcia. Trzymając szkiełko poziomo, nałóż kilka kropli niewodnego medium mocującego na rozmaz.

Umieść krawędź szkła nakrywkowego na szkiełku, opuść je i delikatnie dociśnij, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Dobrej jakości rozmaz charakteryzował się jednowarstwą komórek o dobrej gęstości i zachowanych cechach morfologicznych pozwalających na identyfikację ich tkanki pochodzenia i względnych proporcji między sobą. Co więcej, pasożyty były skutecznie wybarwione immunologicznie, identyfikowalne i policzalne.

Słabe lub ujemne wyniki aspiracji cienkoigłowej mogą być spowodowane zbyt małą ilością materiału, a tym samym niedostateczną reprezentatywnością masy lub narządu. Może to być również spowodowane zbyt dużą ilością materiału na jednym szkiełku, powodującym zbyt grube rozmazy i upośledzającym ocenę cytologiczną. Tak zwany zmiażdżony artefakt dzieje się z powodu zbyt dużej siły przyłożonej podczas wykonywania rozmazu, pozostawiając go do uszkodzonych komórek, co skutkuje dużą ilością nagich jąder i smug DNA.

Gdy podczas przygotowywania rozmazu nie zostanie przyłożona wystarczająca siła, komórki nie ulegają dezagregacji, co powoduje powstanie warstwowej warstwy, która utrudnia ocenę cech morfologicznych komórek. Porównanie cytopatologii aspiracyjnej cienkoigłowej z histopatologią, cytopatologia miała tę zaletę, że lepiej zachowała morfologia komórkowa oraz lepsza ocena względnych proporcji i zliczania komórek. Immunocytochemia jest prostsza, szybsza i łatwiejsza do optymalizacji niż immunohistochemia.

W przypadku aspiracji cienkoigłowej należy zawsze upewnić się, że zwierzę jest dobrze unieruchomione, ustabilizowało narządy lub masę, która ma być odessana, oraz skoordynowaną aplikację i uwalnianie próżniowe. Następnie, aby uzyskać wysokiej jakości rozmazy, natychmiast rozprowadź go po umieszczeniu materiału na szkle i delikatnie stosuj siłę zastosowaną do rozmazu, aby uniknąć artefaktów zmiażdżonych komórek. Oprócz rutynowej mikroskopii i immunocytochemii, materiał ten może być również stosowany do mikroskopii elektronowej, analizy biochemicznej, cytometrii przepływowej, biologii molekularnej, a nawet do testów in vitro.

Technika ta pozwoliła nam wykazać, że aspiracja cienkoigłowa może być stosowana do diagnozowania i badania chorób u zwierząt doświadczalnych. Udało nam się zdiagnozować tropizm pasożytów Trypanosoma w stosunku do zewnętrznych męskich narządów rozrodczych, a także scharakteryzować tę chorobę w trakcie infekcji.