Generowanie neurosfer z mieszanych pierwotnych neuronów hipokampa i kory mózgowej wyizolowanych z zarodka szczura E14-E16 Sprague Dawley

Prezentowany tutaj jest protokół spontanicznego generowania neurosfer wzbogaconych w neurony progenitorowe neuronów o dużej gęstości. Podczas tego samego eksperymentu, gdy neurony są powlekane o mniejszej gęstości, protokół powoduje również przedłużone hodowle pierwotnych neuronów szczurów.

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie rozwoju neurosfer z mieszanych pierwotnych neuronów hipokampa i kory mózgowej wyizolowanych z zarodka szczura E14-E16 Sprague Dawley, w celu zaoferowania solidnej i taniej platformy do badania wpływu różnych przewodów neuroterapeutycznych. Jak wiesz, mózg jest złożoną siecią neuronów związanych z dużą liczbą komórek podporowych. Aby zrozumieć funkcjonowanie mózgu, często większość badań jest ponownie inicjowana na podstawie eksperymentów in vitro, które obejmują dostępne na rynku linie komórkowe pochodzące z linii neuronalnych.

Jednak te linie komórkowe są przekształconymi liniami komórkowymi, które cierpią na zmiany genotypowe i fenotypowe. Aby rozwiązać ten problem, odpowiednim podejściem jest pierwotna hodowla neuronów. W tym miejscu zilustrowaliśmy prosty i opłacalny protokół hodowli neuronów pierwotnych i zbudowaliśmy solidną platformę przesiewową dla różnych terapii neuronalnych.

Główną zaletą tego protokołu jest to, że po prostu modulując gęstość posiewu komórek, możemy zaprezentować dwie kontrastujące ze sobą platformy hodowli neuronów, gdzie niska gęstość prowadzi do przedłużonej pierwotnej hodowli neuronów, a wysoka gęstość generuje spontaniczne neurosfery. Weź dwie płytki 24-dołkowe. Jeden do powlekania o dużej gęstości, a drugi do powlekania o niskiej gęstości.

Przenieść 12 mm sterylnych szklanych szkiełek nakrywkowych do płytek 24-dołkowych. Wlać 300 mikrolitrów roztworu PDL do każdej ze studzienek w taki sposób, aby całkowicie pokrył powierzchnię całego szkiełka nakrywkowego. Przygotować roztwór PDL o stężeniu 0,1 mg/ml w wodzie dejonizowanej.

Owiń płytki folią aluminiową, aby zapobiec wysuszeniu, i trzymaj je na noc w inkubatorze CO2. Następnego dnia, przed posiewem, odessać roztwór PDL. Umyj dokładnie sterylną wodą dwa do trzech razy.

Następnie dodaj pożywkę galwaniczną i włóż płytki z powrotem do inkubatora do momentu posiewu. Poświęć ciężarną szczura Sprague-Dawley E14-E16, wykonaj cięcie w kształcie litery V w okolicy brzucha za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek o końcach. Usuń wszystkie płody i ostrożnie umieść je na szalce Petriego z zimnym roztworem HBSS.

Wyjmij zarodki z woreczków embrionalnych i umyj je ostrożnie na osobnej szalce Petriego w świeżym, zimnym HBSS. Odetnij głowę za pomocą sterylnych nożyczek. Przenieść głowice na sterylnych płytkach Petriego o średnicy 90 mm za pomocą zimnego HBSS.

Pod mikroskopem stereoskopowym przytrzymaj głowę od okolicy pyska sterylnymi ząbkowanymi kleszczami i wyjmij mózg, rozcinając skórę i czaszkę. Usuń wszystkie opony mózgowe z półkul i śródmózgowia, trzymając pień mózgu. Ostrożnie usuń nienaruszone półkule, przypominające kapelusze grzybów, które zawierają hipokamp i korę.

Zbierz półkule zawierające korę i nienaruszony hipokamp w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml pożywki dysocjacyjnej. Pozwól zebranym tkankom osiąść i odessać pożywkę dysocjacyjną, pozostawiając w niej od pięciu do dziesięciu procent pożywki. Ponownie dodaj do niego 10 ml świeżej pożywki dysocjacyjnej i powtórz ten krok dwukrotnie.

Dodać 4,5 ml pożywki dysocjacyjnej i 0,5 ml roztworu trypsyny-EDTA. Trzymaj go w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby trawienie mogło postępować. Odessać pożywkę i przemyć kolejno 10 ml pożywki dysocjacyjnej i pożywki galwanicznej.

Ponownie zawiesić je w 2,5 ml podłoża galwanicznego. Trzymaj sterylne naczynie o średnicy 90 mm na odwróconej pokrywie naczynia i wlej je na dno sterylnego naczynia o średnicy 90 mm. Miareczkować strawione tkanki w rogu podstawy naczynia, używając końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, tak aby zajmowały jak najmniej objętości.

Otrzymaną zawiesinę komórek przepuścić przez sitko o średnicy 70 mikrometrów, z wyłączeniem wszelkich kawałków tkanki. Określ gęstość żywotnych komórek za pomocą wykluczenia niebieskiego barwnika trypanowego i policz liczbę komórek w automatycznym liczniku komórek. Rozcieńczyć liczbę otrzymanych komórek w taki sposób, aby pokryć je 1,5 na 10 do mocy 5 komórek na ml w przypadku posiewu o dużej gęstości i 20 000 komórek na ml w przypadku posiewu o małej gęstości w dwóch oddzielnych probówkach zawierających 30 ml podłoża galwanowego.

Zassać wcześniej dodane podłoże galwaniczne i rozmieścić na płytce 500 mikrolitrów komórek rozproszonych w pożywce galwanicznej w każdym dołku. Następnie włóż płytki z powrotem do inkubatora na cztery godziny. Cztery godziny po posiewie zbadaj komórki pod kątem przylegania pod mikroskopem.

Po czterech godzinach posiewu, zarówno na płytkach o wysokiej, jak i niskiej gęstości, neurony wykazują dobre przyleganie do płytek. Zastąp pożywkę w każdej studzience 500 mikrolitrami świeżej pożywki do konserwacji i inkubuj ją w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Musimy wyhodować te neurony posiane w wysokiej i niskiej gęstości.

Podczas gdy neurony o niskiej gęstości mogą być używane do przedłużonych hodowli, do 30 dni, poprzez zmianę pożywki podtrzymującej dwa razy w tygodniu, neurony o dużej gęstości zaczynają spontanicznie generować neurosfery, co nastąpiło dzień po tym, jak utrzymywaliśmy w bardzo niskiej płytce przyczepującej. Po 24 godzinach posiewu obserwuje się, że zarówno neurony o wysokiej, jak i niskiej gęstości wykazują zdrową morfologię. Pokazany jest tutaj obraz kontrastu fazowego neuronów o niskiej gęstości, hodowanych przez około siedem dni.

Neurony wykazują zdrową morfologię i mogą być utrzymywane do 30 dni z bardziej energicznym routingiem i połączeniami. Diagram słupkowy pokazuje około 90 procent żywotności platerowanych neuronów o niskiej gęstości nawet po 30 dniach hodowli, jak określono za pomocą testu MTT. Pierwotne neurony w tym miejscu zostały scharakteryzowane przez barwienie immunologiczne za pomocą Tuj 1, markera zróżnicowanych neuronów, i tau, markera aksonów neuronalnych.

Czystość neuronów potwierdza brak barwienia w markerach nieneuronalnych GFAP dla astrocytów i O4 dla oligodendrocytów. We wszystkich badaniach charakteryzacyjnych jądra zostały wybarwione Hoechst 33258. W tym przypadku komórki zasiewne o niskiej gęstości zostały wybarwione markerem astrocytarnym GFAP i markerem neuronalnym Tuj 1 w celu sprawdzenia czystości kultury do siedmiu dni.

Zaobserwowano, że protokół ten wspiera preferencyjny wzrost neuronów w stosunku do astrocytów, jak wskazano w analizie ilościowej. Jądra zostały wybarwione za pomocą Hoechst 33258. Podobnie, w komórkach o dużej gęstości nasion, astrocyty zostały wybarwione GFAP, a neurony przez Tuj 1.

Tutaj, w analizie ilościowej, obserwuje się około 17 procent astrocytów w porównaniu do 83 procent neuronów. Jądra zostały wybarwione za pomocą Hoechst 33258. Po siedmiu dniach obserwuje się spontanicznie uformowane liczne neurosfery w neuronach o dużej gęstości.

Około ósmego do dziesiątego dnia hodowli, w neuronach pokrytych płytkami o dużej gęstości, neurosfery zaczynają tworzyć duże projekcje i mostki składające się z promienistych rozszerzeń przypominających glej. Czarne strzałki wskazują most między dwiema nowo powstałymi neurosferami. Testy żywych i martwych komórek przeprowadzano na neurosferach przez 15 dni.

W gęstym barwieniu Calcein AM, bez absolutnie żadnego barwienia jodkiem propidyny, wskazuje na prawie 100-procentową żywotność neurosfer w hodowli. Wykres liniowy wskazuje na rozszerzanie się wielkości neurosfer wraz z upływem liczby dni. Ten nadmiernie zabarwiony obraz neurosfery wskazuje na bogatą populację neuronalnych komórek progenitorowych poprzez zwiększoną ekspresję markerów NPC Nestin i Tuj 1.

Tutejsze neurosfery wykazują dużą ilość astrocytów charakteryzujących się silną ekspresją GFAP, której towarzyszy jeszcze wyższa ekspresja markera neuronalnego Tuj 1. Jądra zostały wybarwione za pomocą Hoechst 33258. Myślę więc, że nasz protokół jest dość ekscytujący i interesujący, biorąc pod uwagę fakt, że z jednej strategii jesteśmy w stanie uzyskać dwie platformy: jedną 2-D i jedną 3-D.

Będzie to świetna platforma do badań przesiewowych różnych ścieżek neuroterapeutycznych. Myślę więc, że jest to naprawdę bardzo przydatne dla wszystkich neurobiologów. Kolejnym ważnym aspektem jest to, że neurosfery, na które się decydujemy, są niezwykle bogate w neuronalne komórki progenitorowe, NPC.

Można je wykorzystać do różnicowania ich w neurony i linie nieneuronalne. Tak więc, czuję, że jeśli ludzie naprawdę mogą opanować tę technikę, korzystając z pomocy tego filmu, będzie to naprawdę bardzo przydatne dla wszystkich. Dziękuję.