Name: Mapowanie miejsca rozpoczęcia transkrypcji przy użyciu bardzo niskiego wskaźnika wejściowego Carrier-CAGE (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Poznaj metodę SLIC-CAGE do mapowania miejsc rozpoczęcia transkrypcji z użyciem zaledwie 10 nanogramów RNA. Technika ta umożliwia analizę promotorów w delikatnych typach komórek i tkankach embrionalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez grant Wellcome Trust (106954) przyznany B. L. i Medical Research Council (MRC) Core Funding (MC-A652-5QA10). N. C. był wspierany przez EMBO Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 1279-2016); E. P. był wspierany przez Medical Research Council UK; B. L. był wspierany przez Medical Research Council UK (MC UP 1102/1).

<ol><li>Shiraki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap+analysis+gene+expression+for+high-throughput+analysis+of+transcriptional+starting+point+and+identification+of+promoter+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cap analysis gene expression for high-throughput analysis of transcriptional starting point and identification of promoter usage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 15776-15781 (2003).</li>
<li>Haberle, V., Lenhard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+architectures+and+developmental+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Promoter architectures and developmental gene regulation.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 57, 11-23 (2016).</li>
<li>Haberle, V., Stark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+core+promoters+and+the+functional+basis+of+transcription+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic core promoters and the functional basis of transcription initiation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (10), 621-637 (2018).</li>
<li>Andersson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+active+enhancers+across+human+cell+types+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An atlas of active enhancers across human cell types and tissues.</a> Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Celniker, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+secrets+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unlocking the secrets of the genome.</a> Nature. 459 (7249), 927-930 (2009).</li>
<li>Consortium, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+promoter-level+mammalian+expression+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A promoter-level mammalian expression atlas.</a> Nature. 507 (7493), 462-470 (2014).</li>
<li>Boyd, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+enhancer+and+promoter+landscape+of+inflammatory+bowel+disease+from+human+colon+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterization of the enhancer and promoter landscape of inflammatory bowel disease from human colon biopsies.</a> Nature Communications. 9 (1), 1661(2018).</li>
<li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+comparative+analysis+of+5%27-end+RNA-sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Comprehensive comparative analysis of 5'-end RNA-sequencing methods.</a> Nature Methods. , (2018).</li>
<li>Cvetesic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLIC-CAGE%3A+high-resolution+transcription+start+site+mapping+using+nanogram-levels+of+total+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">SLIC-CAGE: high-resolution transcription start site mapping using nanogram-levels of total RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1943-1956 (2018).</li>
<li>Murata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+expressed+genes+using+CAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detecting expressed genes using CAGE.</a> Methods in Molecular Biology. 1164, 67-85 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357(2012).</li>
<li>R Core Team. A language and environment for statistical computing. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.R-project.org/">https://www.R-project.org/</a> (2017).</li>
<li>Haberle, V., Forrest, A. R., Hayashizaki, Y., Carninci, P., Lenhard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAGEr%3A+precise+TSS+data+retrieval+and+high-resolution+promoterome+mining+for+integrative+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CAGEr: precise TSS data retrieval and high-resolution promoterome mining for integrative analyses.</a> Nucleic Acids Research. 43 (8), e51(2015).</li>
<li>Poulain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoCAGE%3A+A+Method+for+the+Analysis+of+Coding+and+Noncoding+5%27-Capped+Transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoCAGE: A Method for the Analysis of Coding and Noncoding 5'-Capped Transcriptomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1543, 57-109 (2017).</li>
<li>Schon, M. A., Kellner, M. J., Plotnikova, A., Hofmann, F., Nodine, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoPARE%3A+parallel+analysis+of+RNA+5%27+ends+from+low-input+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">NanoPARE: parallel analysis of RNA 5' ends from low-input RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1931-1942 (2018).</li>
</ol>

Patent na degradowalny nośnik RNA/DNA został wypełniony.

Aby preparaty z biblioteki SLIC-CAGE były skuteczne, konieczne jest stosowanie końcówek i probówek o niskim stopniu wiązania, aby zapobiec utracie próbki w wyniku adsorpcji próbki. Na wszystkich etapach związanych z pobraniem supernatantu zaleca się odzyskanie całej objętości próbki. Ponieważ protokół składa się z wielu kroków, ciągła utrata próbek doprowadzi do nieudanych bibliotek.
Jeśli CAGE (nAnT-iCAGE) nie był wykonywany rutynowo, najlepiej jest przetestować SLIC-CAGE z różnymi ilościami wejściowymi (10 ng, 20 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng) tej samej całkowitej próbki RNA i porównać z bibliotekami nAnT-iCAGE, które są przygotowywane przy użyciu 5 μg całkowitego RNA. Jeśli biblioteka nAnT-iCAGE nie powiedzie się (mniej niż 0,5-1 ng biblioteki DNA uzyskanej na próbkę), jest mało prawdopodobne, aby SLIC-CAGE zadziałał, a straty próbki należy zminimalizować.
Krytycznym krokiem w celu zapewnienia wysokiej jakości bibliotek pozbawionych nieograniczonego zdegradowanego RNA lub rRNA jest pułapkowanie czapeczki opisane w sekcji 7. Bardzo ważne jest, aby kulki streptawidyny zostały dokładnie zawieszone w płuczących i aby płuczące zostały usunięte przed przejściem do następnego etapu płukania lub elucji cDNA.
Jeśli wyniki qPCR po pierwszej rundzie degradacji nośnika nie wykazują różnicy między użyciem starterów adaptor_f1 i carrier_f1, nadal zaleca się kontynuowanie protokołu. Jeżeli po drugiej rundzie degradacji nośnika różnica w wartościach Ct jest mniejsza niż pięć, zaleca się trzecią rundę degradacji nośnika. Nigdy nie stwierdziliśmy, że konieczna jest trzecia runda degradacji, a jeśli do niej dojdzie, zaleca się wymianę zapasów endonukleazy naprowadzającej.
Do protokołu można dodać dodatkowe rundy amplifikacji PCR, jeśli ostateczna ilość uzyskanej biblioteki nie jest wystarczająca do sekwencjonowania. Amplifikację PCR można następnie ustawić z minimalną liczbą cykli amplifikacji potrzebnych do uzyskania wystarczającej ilości materiału do sekwencjonowania, biorąc pod uwagę utratę próbki, której nie można uniknąć przy doborze wielkości. Oczyszczanie lub wybór wielkości za pomocą kulek magnetycznych SPRI należy następnie przeprowadzać, aż wszystkie małe (<200 pz) fragmenty zostaną usunięte (w razie potrzeby użyj proporcji 0,6:1 kulek do próbki), a bibliotekę należy określić ilościowo za pomocą Picogreen.
Biblioteki mogą być sekwencjonowane w trybie single-end lub paired-end. Za pomocą sekwencjonowania sparowanych końców można uzyskać informacje o izoformach transkryptu. Ponadto, ponieważ odwrotna transkrypcja jest wykonywana przy użyciu losowego startera (TCT-N6, N6 jest losowym heksamerem), informacje z sekwencjonowanego końca 3' mogą być wykorzystane jako unikalne identyfikatory molekularne (UMI) do zwijania duplikatów PCR. Ponieważ stosuje się umiarkowaną liczbę cykli amplifikacji PCR (do 18), stosowanie UMI zostało wcześniej uznane za niepotrzebne.
Ponieważ rdzeń protokołu opiera się na nAnT-iCAGE11, SLIC-CAGE wykorzystuje osiem kodów kreskowych. W związku z tym multipleksowanie więcej niż ośmiu próbek nie jest obecnie obsługiwane. Ponadto zarówno SLIC-CAGE, jak i nAnT-iCAGE nie nadają się do wychwytywania RNA krótszego niż 200 pz, ponieważ protokoły są zaprojektowane tak, aby usuwać łączniki i artefakty PCR poprzez wykluczanie rozmiaru za pomocą kulek AMPure XP.
SLIC-CAGE jest jedyną bezstronną metodą rozdzielczości pojedynczego nukleotydu o niskim nakładzie wejściowym do mapowania miejsc początkowych inicjacji transkrypcji przy użyciu nanogramów całkowitego materiału RNA. Alternatywne metody opierają się na aktywności przełączania matryc odwrotnej transkryptazy na RNA z kodem kreskowym zamiast pułapkowania czapeczki (np. NanoCAGE15 i NanoPARE16). Ze względu na przełączanie szablonów, metody te wykazują specyficzne dla sekwencji odchylenia w wykrywaniu TSS, co prowadzi do zwiększenia liczby fałszywie dodatnich TSS i zmniejszenia liczby prawdziwych TSS 9,10.

Analiza ekspresji genów (CAGE) jest metodą używaną do mapowania całego genomu polimerazy II RNA (TSSs)1. Jego ilościowy charakter pozwala również na profilowanie ekspresji 5'-końcowej. Regiony otaczające TSS (około 40 pz w górę i w dół) są głównymi promotorami i reprezentują fizyczną lokalizację, w której wiąże się polimeraza RNA II i ogólne czynniki transkrypcyjne (omówione wcześniej2,3). Informacje o dokładnych lokalizacjach TSS mogą być wykorzystane do wykrywania głównych promotorów i monitorowania dynamiki promotorów. Ponadto, ponieważ aktywne wzmacniacze wykazują sygnatury dwukierunkowej transkrypcji, dane CAGE mogą być również wykorzystywane do wykrywania wzmacniaczy i monitorowania dynamiki wzmacniacza4. Metodologia CAGE zyskała ostatnio na popularności ze względu na jej szerokie zastosowanie i zastosowanie w prestiżowych projektach badawczych, takich jak ENCODE5, modENCODE6, oraz FANTOM projects7. Ponadto informacje TSS okazują się być również ważne dla rozróżnienia tkanek zdrowych i chorych, ponieważ TSS specyficzne dla choroby mogą być używane do celów diagnostycznych8.
Mimo że dostępnych jest kilka metod mapowania TSS (CAGE, RAMPAGE, STRT, nanoCAGE, nanoCAGE-XL, oligo-capping), my i inni ostatnio wykazaliśmy, że CAGE jest najbardziej bezstronną metodą przechwytywania prawdziwych TSS z najmniejszą liczbą fałszywych alarmów9,10. Najnowszy protokół CAGE, nAnT-iCAGE11, jest najbardziej bezstronnym protokołem do profilowania TSS, ponieważ unika cięcia fragmentów na krótkie znaczniki za pomocą enzymów restrykcyjnych i nie wykorzystuje amplifikacji PCR. Ograniczeniem protokołu nAnT-iCAGE jest wymóg dużej ilości materiału wyjściowego (np. 5 μg całkowitego RNA na każdą próbkę). Aby odpowiedzieć na konkretne, biologicznie istotne pytania, często niemożliwe jest uzyskanie tak dużych ilości materiału wyjściowego (np. dla komórek posortowanych metodą FACS lub wczesnych stadiów embrionalnych). Wreszcie, jeśli nAnT-iCAGE zakończy się sukcesem, z każdej próbki dostępne są tylko 1-2 ng materiału z biblioteki DNA, co ogranicza osiągalną głębokość sekwencjonowania.
Aby umożliwić profilowanie TSS przy użyciu tylko nanogramów całkowitego RNA, niedawno opracowaliśmy Super-Low Input Carrier-CAGE10 (SLIC-CAGE, Rysunek 1). SLIC-CAGE wymaga tylko 10 ng całkowitego RNA, aby uzyskać biblioteki o wysokiej złożoności. Nasz protokół opiera się na starannie zaprojektowanym syntetycznym nośniku RNA dodawanym do interesującego nas RNA, aby uzyskać łącznie 5 μg materiału RNA. Syntetyczny nośnik naśladuje docelową bibliotekę DNA w rozkładzie długości, aby uniknąć potencjalnych odchyleń, które mogą być spowodowane nadmiarem jednorodnych cząsteczek. Sekwencja nośnika opiera się na sekwencji genu syntetazy leucylo-tRNA Escherichia coli (Tabela 1) z dwóch powodów. Po pierwsze, wszelkie resztki nośnika w końcowej bibliotece, nawet jeśli zostaną zsekwencjonowane, nie zostaną zmapowane na genom eukariotyczny. Po drugie, ponieważ E. coli jest gatunkiem mezofilnym, jego geny odpowiedzialne za gospodarowanie są zoptymalizowane pod kątem zakresu temperatur odpowiedniego dla SLIC-CAGE. Sekwencja nośnika jest również osadzona w naprowadzających się miejscach rozpoznawania endonukleazy, aby umożliwić specyficzną degradację DNA pochodzącego z cząsteczki nośnika RNA. Docelowa biblioteka pochodząca z próbki pozostaje nienaruszona, ponieważ miejsca rozpoznawania endonukleazy naprowadzającej są długie (I-CeuI = 27 pz; I-SceI = 18 pz) i statystycznie mało prawdopodobne, aby został znaleziony w genomach eukariotycznych. Po określonej degradacji nośnika i usunięciu fragmentów przez wykluczenie rozmiaru, biblioteka docelowa jest amplifikowana metodą PCR i gotowa do sekwencjonowania nowej generacji. W zależności od wyjściowej ilości RNA (1-100 ng) oczekuje się, że wymagane będzie od 13 do 18 cykli amplifikacji PCR. Ostateczna ilość DNA na każdą próbkę waha się między 5-50 ng, co daje wystarczającą ilość materiału do bardzo głębokiego sekwencjonowania. Przy użyciu tylko 1-2 ng całkowitego RNA można wykryć prawdziwe TSS; Oczekuje się jednak, że biblioteki będą miały mniejszą złożoność. Wreszcie, ponieważ SLIC-CAGE jest oparty na protokole nAnT-iCAGE 11, umożliwia multipleksowanie do ośmiu próbek przed sekwencjonowaniem.

<table><tbody><tr><td>2-propanol, Bioultra, do biologii molekularnej, &ge; 99,5%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>59304-100ML-F</td><td>Stosowany w oczyszczaniu RNAclean XP.</td></tr><tr><td>Sekwencje łączników</td><td></td><td></td> 3' <td>są opisane w Murata et al. 2014 i w tabeli uzupełniającej 1 niniejszego manuskryptu. Wyżarzanie pasm w celu wytworzenia łączników 3' opisano w uzupełnieniu do niniejszego protokołu.</td></tr><tr><td>Sekwencje łączników</td><td></td><td></td> 5' <td>są opisane w Murata et al. 2014 i w tabeli uzupełniającej 1 tego manuskryptu. Wyżarzanie pasm w celu wytworzenia łączników 5' jest opisane w uzupełnieniu do niniejszego protokołu.</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP, 60 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Oczyszczanie DNA</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>Oczyszczanie RNA i hybryd RNA:cDNA w krokach CAGE.</td></tr><tr><td>Axygen 0,2 ml polipropylenowe paski probówek do PCR i wypukłe paski z nakrętką</td><td>Axygen (dostępne przez Corning)</td> <td>PCR-0208-CP-C</td><td>Lub dowolne 8-rurkowe paski do PCR (używane tylko do wody i mieszanek).</td></tr><tr><td>Axygen 1 x 8 pasków wypukłe nasadki do PCR</td><td>Axygen (dostępne przez Corning)</td> <td>PCR-02CP-C</td><td>Kapsułki do płytek PCR.</td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek Axygen 1,5 ml Maxymum Recovery Snaplock</td><td>Axygen (dostępna przez Corning)</td> <td>MCT-150-L-C</td><td>Probówki 1,5 ml o niskim poziomie wiązania, używane do mieszanin enzymów lub zatężania próbek.</td></tr><tr><td>Axygen 96 well no no skirt PCR mikroplate</td><td>Axygen (dostępny przez Corning)</td><td>PCR-96-C</td><td>Płytki PCR o niskim poziomie wiązania - muszą być używane na wszystkich etapach protokołu. Należy pamiętać, że płytki powinny być przycięte tak, aby zawierały 2 x 8 dołków dla lepszej widoczności próbek</td></tr><tr><td>Bioanalizator (lub Tapestation): Zestawy DNA RNA nano i HS</td><td>Agilent</td><td></td><td>Aby określić jakość RNA, efektywny dobór rozmiaru i końcową jakość biblioteki (można również użyć Tapestation)</td></tr><tr><td>Biotyna (długie ramię) Hydrazyd</td><td>Vector laboratoria</td><td>SP-1100</td><td>Biotynylacja/znakowanie</td></tr><tr><td>Bufor</td><td>Cutsmart NEB</td><td></td><td>Bufor enzymu restrykcyjnego</td></tr><tr><td>Deep Vent (egzo-) Polimeraza DNA</td><td>NEB</td><td>M0259S</td> Zestaw do ligacji DNA <td>do syntezy drugiej nici</td></tr><tr><td>, Mighty Mix</td><td>Takara</td><td>6023</td><td>Używany do ligacji 5' i 3'-linker</td></tr> mieszanka <tr><td>dNTP (10 mM każdy)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427013</td><td>mieszanka dNTP do produkcji matryc nośnikowych (lub dowolnych dNTP odpowiednich do PCR)</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 Streptawidyna</td><td>Invitrogen</td><td>65305</td><td>Zatrzask czapki. Nie używaj innych kulek, ponieważ są one zoptymalizowane pod kątem zastosowanych.</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Podstawka magnetyczna do probówek 1,5 ml - służy do przygotowania kulek Streptawidyny.</td></tr><tr><td>DynaMag-96 Magnes z listwą boczną</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12027</td><td>Stojak magnetyczny na płytki PCR (płytki 96-dołkowe) - używany z płytkami ciętymi do przechowywania 2 x 8 dołków.</td></tr><tr><td>Etanol, BioUltra, do biologii molekularnej, &ge; 99,8%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>51976-500ML-F</td><td>Stosowany w pralniach AMPure. Można użyć dowolnego etanolu odpowiedniego do biologii molekularnej.</td></tr><tr><td>Egzonukleaza I (E. coli)</td><td>NEB</td><td>M0293S Degradacja</td><td>resztek podkładu</td></tr><tr><td>Barwnik ładujący żel, fioletowy (6x), bez SDS</td><td>NEB</td><td>B7025S</td><td>barwnik ładujący żel agarozowy</td></tr><tr><td>HiScribe T7 Zestaw do syntezy RNA o wysokiej wydajności</td> New <td>England Biolabs</td><td>E2040S</td><td>Zestaw do transkrypcji in vitro</td></tr><tr><td>Aparatura</td><td></td><td></td> <td>do elektroforezy poziomejoczyszczanie matryc DNA nośników z żeli agarozowych</td></tr><tr><td>I-Ceu</td><td>NEB</td><td>R0699S</td><td>Endonukleaza samonaprowadzająca stosowana do degradacji nośnika.</td></tr><tr><td>Endonukleaza samonaprowadzająca</td> <td>SceI</td><td>NEB</td><td>R0694S</td> stosowana do degradacji nośnika.</tr><tr><td>KAPA HiFi HS ReadyMix (2x)</td><td>Kapa Biosystems (Dostarczane przez Roche)</td><td>KK2601</td><td>Mieszanka PCR do amplifikacji biblioteki docelowej</td></tr><tr><td>Zestaw KAPA SYBR FAST qPCR (uniwersalny) 2x</td><td>Kapa Biosystems (dostarczony przez Roche)</td><td>Mieszanka qPCR KK4600</td><td>do oceny wydajności degradacji i wymaganej liczby cykli amplifikacji PCR</td></tr><tr><td>Mikropipety i mikropipety wielokanałowe (0,1-10 i mikro; L, 1-20 i mikro; L, 20-200 i mikro; L)</td> <td>Zaleca</td><td></td><td>się stosowanie Gilsona z nisko wiążącymi końcówkami Sorenson. Inne mikropipety mogą nie być kompatybilne. Końcówki o niskim wiązaniu różnych marek mogą nie być jednakowej jakości i mogą zwiększać utratę próbki.</td></tr><tr>Czytnik <td></td><td></td><td>mikropłytek</td><td>Do pomiaru stężenia Picogreen w bibliotece końcowej. Mikropłytki są stosowane w celu umożliwienia pomiaru małej objętości i zmniejszenia ilości odpadów próbki.</td></tr><tr><td>woda wolna od nukleaz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9937</td><td>Lub dowolna woda wolna od nukleaz (DNazy i RNazy)</td></tr><tr>Etapy inkubacji<td>termocyklera</td><td></td><td></td> PCR <td>i amplficykacja PCR</td></tr><tr><td>Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wierności Polimeraza</td> DNA <td>ThermoFisher Scientific</td><td>F530S</td><td>do amplifikacji matryc nośnikowych (lub dowolnej polimerazy o wysokiej wierności)</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick (50)</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Oczyszczanie matryc nośnika PCR z żeli agarozowych.</td></tr><tr>Maszyna <td></td><td></td><td>qPCR</td><td>określająca liczbę cykli amplifikacji PCR i stopień degradacji nośnika</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Odczynnik</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P11495</td><td>Służy do pomiaru końcowego stężenia biblioteki - zalecane, ponieważ w naszych rękach jest dokładniejsze i bardziej powtarzalne niż Qubit.</td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 100 bp Drabinka DNA</td><td>NEB</td><td>N0551S</td><td>Drabinka DNA</td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 1 kb Plus Drabinka DNA</td><td>NEB</td><td>N0550S</td><td>Drabinka DNA</td></tr><tr><td>Rybonukleaza H</td><td>Takara</td><td>2150A</td><td>Trawienie RNA po uwięzieniu czapeczki.</td></tr><tr><td>RNase ONE Rybonukleaza</td><td>Promega</td><td>M4261</td><td>Degradacja jednoniciowego RNA niechronionego przez cDNA.</td></tr><tr><td>Zestaw DNazy bez RNaz</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>Usuwanie matryc DNA nośnika po transkrypcji in vitro.</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Do oczyszczania nośnego RNA z transkrypcji lub cappingu in vitro</td></tr><tr><td>Octan sodu, 1 M, roztwór wody, pH 4,5 Roztwór wolny od RNAzy</td><td>VWR</td><td>AAJ63669-AK</td><td>lub dowolny roztwór wolny od nukleaz (DNaz i RNazy)</td></tr><tr><td>Octan sodu, 1 M, roztwór woda, pH 6,0 Bez RNAZ</td><td></td><td></td><td>Lub dowolny roztwór wolny od nukleaz (DNazy i RNazy)</td></tr><tr><td>Periodynian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311448-100G</td><td>Utlenianie dioli vicinal</td></tr><tr><td>Końcówki barierowe aerozolowe o niskim poziomie wiązania Sorenson, MicroReach Guard, zakres objętości 10 &mu; L, Stopniowany</td><td>Sorenson (dostępny przez SIGMA-ALDRICH)</td><td>Z719390-960EA</td><td>Końcówki o niskim wiązaniu - zalecane stosowanie w całym protokole w celu zminimalizowania utraty próbki.</td></tr><tr><td>Końcówki barierowe aerozolowe o niskim poziomie wiązania Sorenson, MultiGuard, zakres objętości 1 000 &mu; L, Stopniowany</td><td>Sorenson (dostępny przez SIGMA-ALDRICH)</td><td>Z719463-1000EA</td><td>Końcówki o niskim poziomie wiązania - zalecane stosowanie w całym protokole w celu zminimalizowania utraty próbki.</td></tr><tr><td>Końcówki barierowe Sorenson o niskim poziomie wiązania, MultiGuard, zakres objętości 20 &mu; L, Stopniowany</td><td>Sorenson (dostępny przez SIGMA-ALDRICH)</td><td>Z719412-960EA</td><td>Końcówki o niskim wiązaniu - zalecane stosowanie w całym protokole w celu zminimalizowania utraty próbki.</td></tr><tr><td>Końcówki barierowe aerozolowe o niskim poziomie wiązania Sorenson, MultiGuard, zakres objętości 200 &mu; L, Stopniowany</td><td>Sorenson (dostępny przez SIGMA-ALDRICH)</td><td>Z719447-960EA</td><td>Końcówki o niskim poziomie wiązania - zalecane stosowanie w całym protokole w celu zminimalizowania utraty próbki.</td></tr><tr>Koncentrator <td></td><td></td><td>próżniowy SpeedVac</td><td>zagęszczający próbki w różnych krokach w celu zmniejszenia objętości</td></tr><tr><td>SuperScript III Odwrotna transkryptaza</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080044</td><td>Używany do odwrotnej transkrypcji (1. krok CAGE)</td></tr> <tr>Przygotowanie <td>roztworu</td><td></td><td></td> trehalozy/sorbitolu <td>opisano w Murata i wsp. 2014.</td></tr><tr><td>Tris-HCl, 1 M roztwór aq.soln, pH 8,5</td><td></td><td></td><td>1 M roztwór, roztwór tRNA wolny od DNaz i RNaz</td></tr><tr><td>(20 mg / ml)</td><td></td><td></td><td>tRNA. Przygotowanie opisano w Murata et al. 2014.</td></tr><tr><td>UltraPure Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16520050</td><td>Lub dowolna odpowiednia czysta agaroza o niskiej temperaturze topnienia.</td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna z krewetkami USB (SAP)</td><td>Applied Biosystems (dostarczone przez ThermoFisher Scientific)</td><td>78390500UN</td><td></td></tr><tr><td>USER Enzym</td><td>NEB</td><td>M5505S</td><td>Degradacja górnej nici łącznika 3', odczynnik do wycinania specyficznego uracylu/enzym</td></tr><tr><td>System zamykania krowianki</td><td>NEB</td><td>M2080S</td><td>Zestaw enzymatyczny do zamykania in vitro cząsteczek nośnikowych</td></tr><tr><td>Bufor do płukania A</td><td></td><td></td><td>Mycie zatrzaskowe nasadek. Przygotowanie opisano w Murata et al. 2014.</td></tr><tr><td>Bufor myjący B</td><td></td><td></td><td>Mycie pułapki płuczącej płuczki. Przygotowanie opisano w Murata et al. 2014.</td></tr><tr><td>Bufor myjący C</td><td></td><td></td><td>Mycie pułapki wychwytującej. Przygotowanie opisano w Murata et al. 2014.</td></tr></tbody></table>

mapowanie miejsca rozpoczęcia transkrypcji przy użyciu bardzo niskiego wskaźnika wejściowego carrier-cage

Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE

Analiza ekspresji genów metodą (CAGE) jest metodą używaną do wykrywania miejsc rozpoczęcia transkrypcji polimerazy II RNA (TSS) w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu. Dokładne wykrywanie TSS usprawnia identyfikację i odkrywanie głównych promotorów. Ponadto aktywne wzmacniacze można wykryć za pomocą sygnatur dwukierunkowej inicjacji transkrypcji. Opisany tutaj jest protokół do wykonywania KLATKI NOŚNEJ O BARDZO NISKIM NAKŁADZIE WEJŚCIOWYM (SLIC-CAGE). Ta adaptacja protokołu CAGE do SLIC minimalizuje straty RNA poprzez sztuczne zwiększanie ilości RNA poprzez zastosowanie mieszanki nośników RNA transkrybowanych in vitro, które są dodawane do próbki będącej przedmiotem zainteresowania, umożliwiając w ten sposób przygotowanie biblioteki z nanogramowych ilości całkowitego RNA (tj. tysięcy komórek). Nośnik naśladuje oczekiwany rozkład długości fragmentów biblioteki DNA, eliminując w ten sposób odchylenia, które mogą być spowodowane obfitością jednorodnego nośnika. W ostatnich etapach protokołu nośnik jest usuwany w wyniku degradacji za pomocą endonukleaz naprowadzających, a biblioteka docelowa jest amplifikowana. Docelowa biblioteka próbek jest chroniona przed degradacją, ponieważ miejsca rozpoznawania endonukleazy naprowadzającej są długie (od 18 do 27 pz), co sprawia, że prawdopodobieństwo ich istnienia w genomach eukariotycznych jest bardzo niskie. Efektem końcowym jest biblioteka DNA gotowa do sekwencjonowania nowej generacji. Wszystkie kroki w protokole, aż do sekwencjonowania, można wykonać w ciągu 6 dni. Przygotowanie przewoźnika wymaga pełnego dnia pracy; Można go jednak przygotowywać w dużych ilościach i przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -80 °C. Po zsekwencjonowaniu odczyty mogą być przetwarzane w celu uzyskania TSS o rozdzielczości pojedynczego nukleotydu w całym genomie. TSS mogą być wykorzystywane do odkrywania głównych promotorów lub wzmacniaczy, zapewniając wgląd w regulację genów. Po zagregowaniu do promotorów dane można również wykorzystać do profilowania ekspresji 5'centrycznej.

Niniejszy raport opisuje pełny protokół SLIC-CAGE służący do otrzymywania bibliotek gotowych do sekwencjonowania z nanogramowych ilości wyjściowego całkowitego RNA (Rysunek 1). Aby uzyskać mieszaninę syntetycznego nośnika RNA, najpierw należy przygotować matryce nośnika PCR i oczyścić je za pomocą elektroforezy żelowej w celu usunięcia produktów ubocznych PCR (Rysunek 2A). Każda matryca do PCR (łącznie dziesięć) jest otrzymywana przy użyciu wspólnego prawego, lecz różnych lewych starterów (Tabela 2), co prowadzi do uzyskania matryc PCR o różnych długościach, aby umożliwić zróżnicowanie rozmiaru syntetycznych nośników RNA. Po oczyszczeniu matryce PCR są wykorzystywane do transkrypcji in vitro cząsteczek nośnika. Oczekiwanym rezultatem jest pojedynczy produkt nośnika RNA, jeżeli matryce zostały oczyszczone za pomocą elektroforezy żelowej (patrz reprezentacyjna analiza żelowa w Rycina 2B). Przygotowanie nośnika można przeskalować w zależności od potrzeb, a po przygotowaniu wymieszać i zamrozić w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.
Stosując zalecaną minimalną ilość całkowitego RNA z próbki (10 ng) w połączeniu z 16-18 cyklami amplifikacji PCR, można uzyskać biblioteki SLIC-CAGE o wysokiej złożoności. Liczba cykli PCR wymaganych do amplifikacji końcowej biblioteki w dużym stopniu zależy od ilości użytego całkowitego RNA wejściowego (oczekiwana liczba cykli jest przedstawiona w Tabeli 4).
Po pierwszej rundzie degradacji, w wynikach qPCR (krok 17), oczekiwana różnica między wartościami Ct uzyskanymi przy użyciu startera adaptor_f1 a carrier_f1 wynosi 1-2, przy czym wartości Ct uzyskane dla adaptor_f1 są niższe niż dla carrier_f1.
Rozkład długości fragmentów w końcowej bibliotece wynosi od 200 do 2 000 bp, przy średniej wielkości fragmentu od 700 do 900 bp (na podstawie analizy regionów przy użyciu oprogramowania Bioanalyzer, Rysunek 4B,D). Krótsze fragmenty, przedstawione na Rysunku 4A,C, muszą zostać usunięte poprzez dodatkowe cykle wykluczania wielkością (kroki 20-21). Krótkie fragmenty te są artefaktami amplifikacji PCR, a nie docelową biblioteką. Należy pamiętać, że krótsze fragmenty lepiej skupiają się na przepływowych komórkach sekwencjonujących i mogą powodować problemy z sekwencjonowaniem.
Oczekiwana ilość materiału biblioteki uzyskanego z jednej próbki wynosi od 5-50 ng. Znacznie niższe ilości wskazują na stratę próbki podczas protokołu. Jeśli uzyskana niska ilość jest wystarczająca do sekwencjonowania (wymagane jest 2-3 ng połączonych bibliotek), biblioteki mogą charakteryzować się mniejszą złożonością (patrz poniżej).
W zależności od sekwenatora konieczna może być optymalizacja ilości biblioteki załadowanej na ogniwo przepływowe. W przypadku zastosowania systemu Illumina HiSeq 2500, załadowanie bibliotek SLIC-CAGE o stężeniu 8-12 pM pozwala uzyskać średnio 150-200 milionów odczytów, z czego &gt;80% odczytów spełnia próg jakości Q30.
Uzyskane odczyty są następnie mapowane do genomu referencyjnego [dla odczytów 50 bp można zastosować program Bowtie212 z parametrami domyślnymi, które dopuszczają zero niedopasowań na sekwencję ziarna (22 bp)]. Oczekiwana wydajność mapowania zależy od całkowitej ilości wprowadzonego RNA i jest przedstawiona w Tabeli 5. Unikalnie zmapowane odczyty można następnie załadować do środowiska obliczeń graficznych i statystycznych R13 i przetworzyć przy użyciu pakietu CAGEr (pakiet Bioconductor14). Winieta pakietu jest łatwa do śledzenia i szczegółowo wyjaśnia przebieg prac oraz przetwarzanie zmapowanych danych. Prostym sposobem wizualnej kontroli złożoności biblioteki jest rozkład szerokości promotora, ponieważ biblioteki o niskiej złożoności będą miały sztucznie zwężone promotory (Rysunek 5A, biblioteka SLIC-CAGE pochodząca z 1 ng całkowitego RNA, szczegóły w poprzedniej publikacji10). Jednak nawet biblioteki SLIC-CAGE o niskiej złożoności pozwalają na identyfikację rzeczywistych CTSS z większą precyzją niż alternatywne metody mapowania TSS przy niskiej/średniej ilości materiału wejściowego (Rysunek 5B,C).
<img alt="Schemat przetwarzania i analizy RNA obejmujący syntezę cDNA, biotynilację oraz amplifikację PCR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Etapy protokołu SLIC-CAGE. RNA z próbki miesza się z mieszaniną nośnika RNA, aby uzyskać 5 µg całkowitego materiału RNA. cDNA jest syntetyzowane poprzez transkrypcję odwrotną, a czapeczka zostaje utleniona przy użyciu nadjodynianu sodu. Utlenianie umożliwia przyłączenie biotyny do czapeczki za pomocą hydrazydy biotyny. Biotyna przyłącza się również do końca 3′ mRNA, ponieważ ten również jest utleniany nadjodynianem sodu. Aby usunąć biotynę z hybryd mRNA:cDNA z niepełnie zsyntetyzowanym cDNA oraz z końców 3′ mRNA, próbki traktuje się RNazą I. cDNA, które dotarło do końca 5′ mRNA, jest następnie wyodrębniane poprzez oczyszczanie powinowactwa na magnetycznych koralikach z streptawidyną (wychwytywanie czapeczki). Po uwolnieniu cDNA liguje się linkery 5′ oraz 3′. Cząsteczki biblioteki pochodzące z nośnika są degradowane za pomocą endonukleaz homingowych I-SceI i I-CeuI, a fragmenty są usuwane przy użyciu magnetycznych koralików SPRI. Następnie biblioteka jest amplifikowana metodą PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Żel do elektroforezy PCR wykazujący matryce nośnikowe i transkrypty in vitro do analizy DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywna analiza żelowa matryc PCR nośnikowych i transkryptów nośnikowych in vitro. (A) Matryce PCR nośnikowe przed oczyszczaniem żelowym: pierwsza studnia zawiera marker 1 kbp, a następnie matryce PCR nośnikowe 1, 1-10. (B) Transkrypty nośnikowe in vitro: pierwsza studnia zawiera marker 1 kbp, a następnie transkrypty nośnikowe 1-10. Transkrypty nośnikowe zostały zdenaturowane przez ogrzewanie przez 5 min w 95 °C przed nałożeniem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza fragmentów DNA, elektroferogram; długość fragmentu a intensywność fluorescencji; sekwencjonowanie genów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywny zapis jakości DNA (chip DNA o wysokiej czułości) SLIC-CAGE przed pierwszą rundą degradacji nośnika. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig3large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykresy analizy fragmentów DNA; elektroforeza; długość fragmentu a fluorescencja; wyniki eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Reprezentatywne profile jakości DNA (chip DNA o wysokiej czułości) bibliotek SLIC-CAGE po amplifikacji PCR. (A) Biblioteka SLIC-CAGE wymagająca dodatkowej selekcji wielkości w celu usunięcia krótkich fragmentów. (B) Biblioteka SLIC-CAGE po selekcji wielkości z zastosowaniem kulek SPRI w stosunku 0,6x do próbki. (C) Biblioteka SLIC-CAGE o niższej wydajności, wymagająca selekcji wielkości w celu usunięcia krótkich fragmentów. (D) Biblioteka SLIC-CAGE o niższej wydajności po selekcji wielkości z zastosowaniem kulek SPRI w stosunku 0,6:1 do próbki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie danych SLIC-CAGE; wykresy szerokości międzykwartylowej, prawdziwe i fałszywie dodatnie CTSS w zakresach nanogramowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Walidacja bibliotek SLIC-CAGE. (A) Rozkład szerokości międzykwartylowej klastrów tagów w bibliotekach SLIC-CAGE przygotowanych z 1, 5 lub 10 ng całkowitego RNA S. cerevisiae oraz w bibliotece nAnT-iCAGE przygotowanej z 5 µg całkowitego RNA S. cerevisiae. Wysoka liczba wąskich klastrów tagów w bibliotece SLIC-CAGE 1 ng wskazuje na jej niską złożoność. (B) Krzywe ROC dla identyfikacji CTSS w bibliotekach SLIC-CAGE S. cerevisiae. Wszystkie CTSS nAnT-iCAGE S. cerevisiae zostały użyte jako zbiór prawdziwy. (C) Krzywe ROC dla identyfikacji CTSS w bibliotekach nanoCAGE S. cerevisiae. Wszystkie CTSS nAnT-iCAGE S. cerevisiae zostały użyte jako zbiór prawdziwy. Porównanie krzywych ROC pokazuje, że SLIC-CAGE znacznie przewyższa nanoCAGE w identyfikacji CTSS. Wykorzystano dane z ArrayExpress E-MTAB-6519. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Sekwencja syntetycznego genu nośnika. Miejsca I-SceI są pogrubione, zapisane kursywą i zaznaczone kolorem fioletowym, a miejsca rozpoznawania I-CeuI są zielone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/Table1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >nośnik</td>
			<td colspan="2" >primer rewersyjny 5’-3’</td>
			<td >długość produktu PCR / bp</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >1</td >
			<td colspan="2" >PCR_N6_r1: NNNNNNCTACGTGTCGCAGACGAATT</td >
			<td >1034</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >2</td >
			<td colspan="2" >PCR_N6_r2: NNNNNNTATCCAGATCGTTGAGCTGC</td >
			<td >966</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >3</td >
			<td colspan="2" >PCR_N6_r3: NNNNNNCACTGCGGGATCTCTTTACG</td >
			<td >889</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >4</td >
			<td colspan="2" >PCR_N6_r4: NNNNNNGCCGTCGATAACTTGTTCGT</td >
			<td >821</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >5</td >
			<td colspan="2" >PCR_N6_r5: NNNNNNAGTTGACCGCAGAAGTCTTC</td >
			<td >744</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >6</td >
			<td colspan="2" >PCR_N6_r6: NNNNNNGTGAAGAATTTCTGTTCCCA</td >
			<td >676</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >7</td >
			<td colspan="2" >PCR_N6_r7: NNNNNNCTCGCGGCTCCAGTCATAAC</td >
			<td >599</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >8</td >
			<td colspan="2" >PCR_N6_r8: NNNNNNTATACGCGATGTTGTCGTAC</td >
			<td >531</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >9</td >
			<td colspan="2" >PCR_N6_r9: NNNNNNACCGCCGCGCCTTCCGCAGG</td >
			<td >454</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >10</td >
			<td colspan="2" >PCR_N6_r10: NNNNNNCAGGACGTTTTTGCCCAGCA</td >
			<td >386</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td colspan="2" >* Primer foremowy jest taki sam dla wszystkich matryc nośnika. Podkreślono sekwencję promotora T7. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA</td >
			<td ></td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2: Primery do amplifikacji matrycy nośnikowej. Primer forward jest taki sam dla wszystkich matryc nośnikowych. Podkreślono sekwencję promotora T7. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA. Dzięki zastosowaniu różnych primerów reverse otrzymuje się matryce PCR, a w konsekwencji RNA nośnikowe o różnej długości.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>nośnik</td>
			<td>długość</td>
			<td>bez zakrętki/µg</td>
			<td>zamknięte/µg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>1034</td>
			<td>3.96</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>966</td>
			<td>8.36</td>
			<td>0.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>889</td>
			<td>4.4</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>821</td>
			<td>6.6</td>
			<td>0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>744</td>
			<td>4.4</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>676</td>
			<td>3.08</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>599</td>
			<td>4.4</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>531</td>
			<td>3.96</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>454</td>
			<td>2.64</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>386</td>
			<td>2.2</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Mieszanina nośnika RNA. Łącznie 49 µg mieszaniny nośnika 0,3-1 kbp: niekapszowana = 44 µg, kapszowana = 5 µg.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Całkowita ilość wprowadzonego RNA /ng</td>
			<td>Cykle PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ng</td>
			<td>18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ng</td>
			<td>17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ng</td>
			<td>16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ng</td>
			<td>15-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ng</td>
			<td>14-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ng</td>
			<td>13-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ng</td>
			<td>12-14</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Przewidywana liczba cykli PCR w zależności od całkowitej ilości wprowadzonego RNA z próbki. Przybliżona liczba cykli opiera się na eksperymentach przeprowadzonych z użyciem całkowitego RNA z Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster oraz Mus musculus.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Całkowita ilość wprowadzonego RNA/ng</td>
			<td >% całkowitego mapowania</td>
			<td >% mapowania unikalnego</td>
			<td >% nośnika</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >1 ng</td >
			<td >30</td >
			<td >20-30</td >
			<td >30</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >2 ng</td >
			<td >60</td >
			<td >20-50</td >
			<td >10</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >5 ng</td >
			<td >60-70</td >
			<td >40-60</td >
			<td >5-10</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >10 ng</td >
			<td >60-70</td >
			<td >40-60</td >
			<td >5-10</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >25 ng</td >
			<td >65-80</td >
			<td >40-70</td >
			<td >0-5</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >50 ng</td >
			<td >65-80</td >
			<td >40-70</td >
			<td >0-3</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >100 ng</td >
			<td >70-85</td >
			<td >40-70</td >
			<td >0-2</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 5: Przewidywana wydajność mapowania w zależności od całkowitej ilości wprowadzonego RNA. Przedstawiono wartości przybliżone, oparte na eksperymentach przeprowadzonych z wykorzystaniem całkowitego RNA z Saccharomyces cerevisiae i Mus musculus.
Tabela uzupełniająca 1: Sekwencje starterów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/supptable1.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
Tabela uzupełniająca 2: Hybrydyzacja linkerów 5’ i 3’. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/supptable2.pdf" target="_blank">Aby wyświetlić tę tabelę, kliknij tutaj (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
Tabela uzupełniająca 3: Wyżarzanie linkera 5’. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/supptable3.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
Tabela uzupełniająca 4: Mieszanie linkerów 5’. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/supptable4.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
Tabela uzupełniająca 5: Rozcieńczenie łącznika 5’. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/supptable5.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
Tabela uzupełniająca 6: Wyżarzanie łącznika 3’. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/supptable6.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
Tabela uzupełniająca 7: Rozcieńczenie łącznika 3’. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/supptable7.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>
Tabela uzupełniająca 8: Przygotowanie standardowych rozcieńczeń seryjnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/supptable8.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).</a>

Analiza ekspresji genów (CAGE) to metoda ilościowego mapowania końca 5 mRNA w całym genomie w celu uchwycenia miejsc początkowych transkrypcji polimerazy II RNA w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu. W niniejszej pracy opisano protokół o niskim nakładzie wejściowym (SLIC-CAGE) do generowania wysokiej jakości bibliotek przy użyciu nanogramów całkowitego RNA.

Mapowanie miejsca rozpoczęcia transkrypcji przy użyciu bardzo niskiego wskaźnika wejściowego Carrier-CAGE

Cap analysis of gene expression (CAGE) is a method used for single-nucleotide resolution detection of RNA polymerase II transcription start sites (TSSs). ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie regulacji genów, ponieważ umożliwia odkrywanie głównych promotorów i wzmacniaczy przy użyciu niewielkich ilości materiału wyjściowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona bezstronne, mapowanie miejsc startowych transkrypcji polimerazy II polimerazy II w całym genomie w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu przy użyciu zaledwie 10 nanogramów całkowitego RNA. CAGE okazuje się nieoceniony w odkrywaniu miejsc rozpoczęcia transkrypcji związanych z chorobą, które można wykorzystać jako markery diagnostyczne.Projekt SLIC-CAGE rozszerza te odkrycia na próbki skalowane, takie jak biopsje tkanek. SLIC-CAGE idealnie nadaje się do dogłębnej analizy promotorów o wysokiej rozdzielczości typów słabych komórek, w tym wczesnych etapów rozwoju embrionalnego lub tkanki embrionalnej z szerokiej gamy organizmów modelowych. Ponieważ protokół ten składa się z wielu etapów, ważne jest, aby zminimalizować utratę próbki na każdym etapie, dbając o odzyskanie jak największej ilości materiału podczas przenoszenia między probówkami.Zacznij od przygotowania mieszanki PCR dla każdej matrycy. Połącz bufor, dNTP, unikalny starter do przodu, plazmid matrycowy z syntetycznym genem nośnikowym i polimerazę fuzyjną zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Wymieszać odczynniki przez pipetowanie.Dodaj 90 mikrolitrów mieszanki PCR do 10 mikrolitrów każdego odwróconego startera i wymieszaj. Zapoznaj się z manuskryptem, aby zapoznać się z warunkami termocyklingu. Wykonaj odwrotną transkrypcję lub RT na interesującym Cię RNA.Połącz jeden mikrolitr startera odwrotnej transkrypcji, 10 nanogramów RNA i 4 990 nanogramów mieszanki nośników w łącznej objętości 10 mikrolitrów. Mieszać, pipetując w górę i w dół. Podgrzej mieszaninę do 65 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie natychmiast umieść ją na lodzie.Przygotuj mieszaninę RT zgodnie ze wskazówkami rękopisu i dodaj 28 mikrolitrów mieszanki do 10 mikrolitrów RNA. Wymieszać zawartość probówki, pipetując, aż stanie się jednorodna. Uruchom RT w termocyklerze.Po zakończeniu odwrotnej transkrypcji oczyść produkt za pomocą kulek magnetycznych SPRI wolnych od DNaz i RNaz. Dodaj kulki do mieszanki RT w stosunku objętościowym 1,8 do jednego i dobrze wymieszaj przez pipetowanie. Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na pięć minut.Następnie umieść koraliki na stojaku magnetycznym i pozwól im się rozdzielić na pięć minut. Wyrzuć sklaratant i dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego 70% etanolu do kulek. Nie mieszaj kulek ani nie zdejmuj ich ze stojaka magnetycznego i nie usuwaj etanolu natychmiast po dodaniu.Trzymaj probówkę na stojaku magnetycznym i usuń wszelkie ślady etanolu, wypychając pozostałe kropelki za pomocą pipety P10. Natychmiast dodaj 42 mikrolitry wody i pipetuj w górę iw dół 60 razy, aby wymyć próbkę, uważając, aby nie spowodować pienienia. Inkubuj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut bez pokrywki, a następnie oddziel koraliki na stojaku magnetycznym.Następnie przenieś supernatant do nowego zestawu probówek, uważając, aby pobrać cały supernatant, ale unikaj przenoszenia kulek. Po potraktowaniu RNazą I wymieszać 45 mikrolitrów próbki ze 105 mikrolitrami przygotowanych kulek streptawidyny i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Podczas inkubacji należy pipetować próbkę co 10 minut w celu wymieszania.Następnie oddziel koraliki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant. Umyj kulki A, B i C. Zaczynając od buforu A, ponownie zawieś kulki w 150 mikrolitrach buforu. Oddziel na stojaku magnetycznym na dwie do trzech minut, a następnie usuń supernatant.Rozgrzej B i C do 37 stopni Celsjusza i powtórz kroki prania. Aby usunąć wszystkie niezamknięte RNA, ważne jest, aby dokładnie umyć kulki streptawidyny i ścianki rurki oraz całkowicie usunąć bufor płuczący przed dodaniem następnego. Aby uwolnić cDNA, ponownie zawieś kulki w 35 mikrolitrach buforu 1X RNazy I i inkubuj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.Po inkubacji natychmiast umieść koraliki na lodzie na dwie minuty. Oddziel kulki na stojaku magnetycznym i przenieś supernatant do nowego zestawu probówek. Ponownie zawieś kulki w 30 mikrolitrach bufora 1X RNaza I, a następnie oddziel na stojaku magnetycznym.Połączyć supernatant z wcześniej zebranym supernatantem, aby uzyskać łączną objętość około 65 mikrolitrów. Wykonaj qPCR, aby określić liczbę cykli PCR dla amplifikacji biblioteki docelowej. Przygotuj główne mieszanki qPCR do amplifikacji całych bibliotek DNA z nośnika.Ustaw warunki termocyklingu zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i amplifikuj przygotowaną próbkę. Protokół SLIC-CAGE umożliwia uzyskanie bibliotek gotowych do sekwencjonowania z nanogramów wyjściowego materiału RNA. Długość fragmentu w końcowej bibliotece waha się od 200 do 2 000 par zasad.Krótsze fragmenty są artefaktami PCR i mogą powodować problemy z sekwencjonowaniem w przyszłości. Można wykonać dodatkowe rundy wyboru rozmiaru, aby je usunąć. W porównaniu z NanoCAGE, SLIC-CAGE wykazuje znacznie lepszą wydajność w identyfikacji miejsca rozpoczęcia transkrypcji, co jest widoczne na podstawie krzywych charakterystyki operacyjnej odbiornika obu technik wykonywanych na różnych ilościach całkowitego RNA S.cerevisiae.Podczas wykonywania tego protokołu należy pamiętać, że utrata próbki może prowadzić do bibliotek o niskiej złożoności. Aby temu zapobiec, należy używać słabo wiążących końcówek i probówek do pipet. Bez SLIC-CAGE analiza promotorów różnych typów komórek była do tej pory niedostępna.Obejmuje to analizę etapów rozwoju embrionalnego lub tkanki embrionalnej z szerokiej gamy organizmów modelowych.

transcription-start-site-mapping-using-super-low-input-carrier-cage

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film demonstruje test in vivo na bakteriach w celu zbadania interakcji białek wiążących RNA (RBP) z RNA. Komórki bakteryjne są przekształcane za pomocą dwóch konstruktów plazmidowych - plazmidu miejsca wiązania kodującego mRNA zawierającego fluorescencyjny gen reporterowy za miejscem wiązania RBP - podczas gdy plazmid RBP ulega ekspresji białek RBP pod kontrolą induktora. Po wzroście produkcji RBP za pośrednictwem induktora, RBP wiążą się z mRNA, powodując translacyjną represję reportera...

Test represji genu reporterowego w celu zbadania regulacji translacyjnej genu docelowego

Test chromatyny dostępnej dla transpozy w połączeniu z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ATAC-seq) to metoda odkrywania dostępnej chromatyny obejmująca cały genom. Jest to protokół sekwencyjny ATAC-seq krok po kroku, od analizy molekularnej do końcowej analizy obliczeniowej, zoptymalizowany pod kątem ludzkich limfocytów (Th1/Th2). Protokół ten może zostać przyjęty przez badaczy bez wcześniejszego doświadczenia w metodach sekwencjonowania nowej generacji.

Mapowanie chromatyny dostępnej w całym genomie w pierwotnych ludzkich limfocytach T za pomocą ATAC-Seq

Ten protokół przedstawia kroki potrzebne do wygenerowania modelowego systemu, w którym transkrypcja interesującego nas endogennego genu może być warunkowo kontrolowana u żywych zwierząt lub komórek za pomocą ulepszonych systemów represora lac i/lub aktywatora tet.

Zastosowanie in vivo systemu REMOTE-control do manipulacji endogenną ekspresją genów

Specyficzność sekwencji jest kluczowa dla regulacji genów. Białka regulatorowe, które rozpoznają określone sekwencje, są ważne dla regulacji genów. Zdefiniowanie funkcjonalnych miejsc wiązania dla takich białek jest trudnym problemem biologicznym. Iteracyjne podejście do identyfikacji miejsca wiązania białka wiążącego RNA jest opisane tutaj i ma zastosowanie do wszystkich białek wiążących RNA.

Badanie przestrzeni sekwencji w celu identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących regulatorowe RNA

Tutaj prezentujemy protokół opisujący, jak i) złożyć samoreplikujący się wektor za pomocą modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate, ii) wprowadzić wektor do sinicowego gospodarza przez koniugację, oraz iii) scharakteryzować transgeniczne szczepy sinic za pomocą czytnika płytek lub cytometrii przepływowej.

Modyfikacja genetyczna cyjanobakterii przez koniugację przy użyciu modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate

Opisujemy inżynierię nowatorskiej polimerazy T7 RNA na uwięzi DNA do regulacji reakcji transkrypcji in vitro. Omawiamy etapy syntezy i charakterystyki białek, walidujemy regulację transkrypcji typu proof-of-concept i omawiamy jej zastosowania w obliczeniach molekularnych, diagnostyce i przetwarzaniu informacji molekularnych.

Polimeraza RNA na uwięzi DNA do programowalnej transkrypcji in vitro i obliczeń molekularnych

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół użycia enzymu Cas13D ukierunkowanego na RNA (RfxCas13D) u much.

Wszechobecne i specyficzne tkankowo celowanie RNA u Drosophila melanogaster przy użyciu CRISPR/CasRx

Ten protokół przedstawia nowy system genów reporterowych i eksperymentalne ustawienie do wykrywania transkrypcji przy pęknięciach dwuniciowych DNA z czułością pojedynczej cząsteczki.

Obrazowanie aktywności transkrypcyjnej żywych komórek przy pęknięciach dwuniciowych DNA

Obecny protokół opisuje pojedynczą mutację M213L w Gja1, która zachowuje pełną generację Connexin43, ale uniemożliwia translację mniejszej wewnętrznie translowanej izoformy GJA1-20k.

Usunięcie wewnętrznego translacyjnego miejsca startowego z mRNA przy zachowaniu ekspresji białka o pełnej długości

Systemy CRISPR-Cas i białka anty-CRISPR zostały zintegrowane ze schematem bramek Boole'a u Saccharomyces cerevisiae. Nowe małe obwody logiczne wykazały się dobrą wydajnością i pogłębiły wiedzę zarówno na temat czynników transkrypcyjnych opartych na dCas9/dCas12a, jak i właściwości białek anty-CRISPR.

Genowe obwody cyfrowe oparte na systemach CRISPR-Cas i białkach anty-CRISPR

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Poznaj metodę SLIC-CAGE do mapowania miejsc rozpoczęcia transkrypcji z użyciem zaledwie 10 nanogramów RNA. Technika ta umożliwia analizę promotorów w delikatnych typach komórek i tkankach embrionalnych.

Mapowanie miejsca rozpoczęcia transkrypcji przy użyciu bardzo niskiego wskaźnika wejściowego Carrier-CAGE

Przeglądaj więcej filmów