Mapowanie miejsca rozpoczęcia transkrypcji przy użyciu bardzo niskiego wskaźnika wejściowego Carrier-CAGE

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie regulacji genów, ponieważ umożliwia odkrywanie głównych promotorów i wzmacniaczy przy użyciu niewielkich ilości materiału wyjściowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona bezstronne, mapowanie miejsc startowych transkrypcji polimerazy II polimerazy II w całym genomie w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu przy użyciu zaledwie 10 nanogramów całkowitego RNA. CAGE okazuje się nieoceniony w odkrywaniu miejsc rozpoczęcia transkrypcji związanych z chorobą, które można wykorzystać jako markery diagnostyczne.

Projekt SLIC-CAGE rozszerza te odkrycia na próbki skalowane, takie jak biopsje tkanek. SLIC-CAGE idealnie nadaje się do dogłębnej analizy promotorów o wysokiej rozdzielczości typów słabych komórek, w tym wczesnych etapów rozwoju embrionalnego lub tkanki embrionalnej z szerokiej gamy organizmów modelowych. Ponieważ protokół ten składa się z wielu etapów, ważne jest, aby zminimalizować utratę próbki na każdym etapie, dbając o odzyskanie jak największej ilości materiału podczas przenoszenia między probówkami.

Zacznij od przygotowania mieszanki PCR dla każdej matrycy. Połącz bufor, dNTP, unikalny starter do przodu, plazmid matrycowy z syntetycznym genem nośnikowym i polimerazę fuzyjną zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Wymieszać odczynniki przez pipetowanie.

Dodaj 90 mikrolitrów mieszanki PCR do 10 mikrolitrów każdego odwróconego startera i wymieszaj. Zapoznaj się z manuskryptem, aby zapoznać się z warunkami termocyklingu. Wykonaj odwrotną transkrypcję lub RT na interesującym Cię RNA.

Połącz jeden mikrolitr startera odwrotnej transkrypcji, 10 nanogramów RNA i 4 990 nanogramów mieszanki nośników w łącznej objętości 10 mikrolitrów. Mieszać, pipetując w górę i w dół. Podgrzej mieszaninę do 65 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie natychmiast umieść ją na lodzie.

Przygotuj mieszaninę RT zgodnie ze wskazówkami rękopisu i dodaj 28 mikrolitrów mieszanki do 10 mikrolitrów RNA. Wymieszać zawartość probówki, pipetując, aż stanie się jednorodna. Uruchom RT w termocyklerze.

Po zakończeniu odwrotnej transkrypcji oczyść produkt za pomocą kulek magnetycznych SPRI wolnych od DNaz i RNaz. Dodaj kulki do mieszanki RT w stosunku objętościowym 1,8 do jednego i dobrze wymieszaj przez pipetowanie. Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na pięć minut.

Następnie umieść koraliki na stojaku magnetycznym i pozwól im się rozdzielić na pięć minut. Wyrzuć sklaratant i dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego 70% etanolu do kulek. Nie mieszaj kulek ani nie zdejmuj ich ze stojaka magnetycznego i nie usuwaj etanolu natychmiast po dodaniu.

Trzymaj probówkę na stojaku magnetycznym i usuń wszelkie ślady etanolu, wypychając pozostałe kropelki za pomocą pipety P10. Natychmiast dodaj 42 mikrolitry wody i pipetuj w górę iw dół 60 razy, aby wymyć próbkę, uważając, aby nie spowodować pienienia. Inkubuj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut bez pokrywki, a następnie oddziel koraliki na stojaku magnetycznym.

Następnie przenieś supernatant do nowego zestawu probówek, uważając, aby pobrać cały supernatant, ale unikaj przenoszenia kulek. Po potraktowaniu RNazą I wymieszać 45 mikrolitrów próbki ze 105 mikrolitrami przygotowanych kulek streptawidyny i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Podczas inkubacji należy pipetować próbkę co 10 minut w celu wymieszania.

Następnie oddziel koraliki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant. Umyj kulki A, B i C. Zaczynając od buforu A, ponownie zawieś kulki w 150 mikrolitrach buforu. Oddziel na stojaku magnetycznym na dwie do trzech minut, a następnie usuń supernatant.

Rozgrzej B i C do 37 stopni Celsjusza i powtórz kroki prania. Aby usunąć wszystkie niezamknięte RNA, ważne jest, aby dokładnie umyć kulki streptawidyny i ścianki rurki oraz całkowicie usunąć bufor płuczący przed dodaniem następnego. Aby uwolnić cDNA, ponownie zawieś kulki w 35 mikrolitrach buforu 1X RNazy I i inkubuj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Po inkubacji natychmiast umieść koraliki na lodzie na dwie minuty. Oddziel kulki na stojaku magnetycznym i przenieś supernatant do nowego zestawu probówek. Ponownie zawieś kulki w 30 mikrolitrach bufora 1X RNaza I, a następnie oddziel na stojaku magnetycznym.

Połączyć supernatant z wcześniej zebranym supernatantem, aby uzyskać łączną objętość około 65 mikrolitrów. Wykonaj qPCR, aby określić liczbę cykli PCR dla amplifikacji biblioteki docelowej. Przygotuj główne mieszanki qPCR do amplifikacji całych bibliotek DNA z nośnika.

Ustaw warunki termocyklingu zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i amplifikuj przygotowaną próbkę. Protokół SLIC-CAGE umożliwia uzyskanie bibliotek gotowych do sekwencjonowania z nanogramów wyjściowego materiału RNA. Długość fragmentu w końcowej bibliotece waha się od 200 do 2 000 par zasad.

Krótsze fragmenty są artefaktami PCR i mogą powodować problemy z sekwencjonowaniem w przyszłości. Można wykonać dodatkowe rundy wyboru rozmiaru, aby je usunąć. W porównaniu z NanoCAGE, SLIC-CAGE wykazuje znacznie lepszą wydajność w identyfikacji miejsca rozpoczęcia transkrypcji, co jest widoczne na podstawie krzywych charakterystyki operacyjnej odbiornika obu technik wykonywanych na różnych ilościach całkowitego RNA S.cerevisiae.

Podczas wykonywania tego protokołu należy pamiętać, że utrata próbki może prowadzić do bibliotek o niskiej złożoności. Aby temu zapobiec, należy używać słabo wiążących końcówek i probówek do pipet. Bez SLIC-CAGE analiza promotorów różnych typów komórek była do tej pory niedostępna.

Obejmuje to analizę etapów rozwoju embrionalnego lub tkanki embrionalnej z szerokiej gamy organizmów modelowych.