Metoda przesiewowa pojedynczych komórek w celu selekcji i odzyskiwania przeciwciał o pożądanej swoistości ze wzbogaconych populacji komórek B ludzkiej pamięci

Protokół ten jest istotny, ponieważ może być wykorzystany do badania repertuaru immunologicznego ludzkich dawców w celu identyfikacji rzadkich, specyficznych dla antygenu limfocytów B. Technika ta pozwala nam uzyskać natywnie sparowane łańcuchy ciężkie i lekkie, które można szybko sklonować, a następnie bezpośrednio przetestować pod kątem interesującego nas antygenu lub antygenów. Procedurę zademonstruje Mike Morton, technik z naszego laboratorium.

Co najmniej godzinę po rozmrożeniu i odzyskaniu zebrać PBMC dawcy przez odwirowanie. I ponownie zawieś komórki w 50 mililitrach lodowatego bufora MES w celu zliczenia. Osadzać komórki przez kolejne wirowanie i izolować limfocyty B CD22-dodatnie przez pozytywną selekcję za pomocą mikrogranulek CD22 zgodnie ze standardowymi protokołami.

Zebrać izolowane komórki CD22-dodatnie przez odwirowanie i ponownie zawiesić komórki w ilości czterech razy od 10 do siódmych komórek na mililitr stężenia buforu Vax. Dodać koktajl przeciwciał IgG CD19 CD27 do komórek zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi rozcieńczania z delikatnym mieszaniem i podwielokrotnić 10 do siódmych komórek do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej w celu kontroli ujemnej. Dodać podwójnie znakowane tetramery biotyny steptawidyny do probówki kontroli ujemnej o końcowym stężeniu 36 nanomolowych każdy, z PE i APC, pomnożonych przez liczbę peptydów w probówce sortującej.

Przynieś końcową objętość do każdej probówki o 2,5 mililitra świeżym buforem Vax i dodaj tetramery peptydowe do sortowania w probówce o nachodach 36 nanomolowych po PE i APC. Po odwirowaniu doprowadzić komórki do stężenia dwa razy od 10 do 6 na 100 mikrolitrów TBS przez 30 do 60 minut inkubacji, w ciemności, w temperaturze czterech stopni Celsjusza, z rotacją. Pod koniec inkubacji przemyć komórki dwa razy w świeżym buforze TBS na przemycie, a następnie przecedzić próbki do oddzielnych pięciomililitrowych probówek z nasadką filtrującą.

Wybarwić próbki końcowym stężeniem DAPI wynoszącym 0,3 mikromola jako markerem integralności błony komórkowej. I uruchom całą kontrolę ujemną w sortowniku komórek, aby ustawić bramki cytometrii przepływowej w celu wyizolowania odpowiednich populacji komórek do sortowania pojedynczych komórek. Wykreśl antygen PE w stosunku do antygenu APC i ustaw bramkę R8 jako antygen PE-dodatni i kwadrant APC-dodatni z małą liczbą zdarzeń w podwójnie dodatniej bramce.

Następnie posortuj pojedyncze CD19-dodatnie, CD27-dodatnie komórki PE-dodatnie, antygenowe APC-dodatnie do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki przygotowanej przez Master Mix. Pod koniec sortowania przykryj płytkę aluminiową taśmą i odwiruj komórki przez jedną minutę w temperaturze 400 razy g, a następnie przechowuj w temperaturze minus 80 stopni. Aby przeprowadzić reakcję odwrotnej transkryptazy, rozmrażaj posortowane limfocyty B na lodzie przez dwie minuty, a następnie obracaj płytkę przez dwie minuty w temperaturze 3300 razy g, aby wyciągnąć zawartość studzienki na dno płytki przed otwarciem.

Po potraktowaniu komórek odpowiednim enzymem Master Mix, dodaj 2,5 mikrolitra uzupełniającego DNA jako matrycę dla każdej reakcji PCR i dodaj startery do końcowego stężenia 1 mikromola do każdej reakcji. Następnie dodaj 2-krotne stężenie 10-krotnego buforu polimerazy do każdej studzienki, aby doprowadzić końcową objętość do 25 mikrolitrów na reakcję. I uruchom reakcje PCR w łańcuchu ciężkim i lekkim przez 50 cykli.

Pod koniec reakcji uruchom próbki na 1% żelu agarozowym, aby uwidocznić pozytywne uderzenia amplifikacji. Wyizoluj zarówno sparowane ciężkie, jak i lekkie reakcje łańcuchowe z tej samej komórki poprzez ekstrakcję żelu. Określ stężenie fragmentów DNA na podstawie gęstości optycznej do 60, aby uzyskać dokładne obliczenia mieszanki ligacyjnej.

Połączyć odzyskane ciężkie i lekkie fragmenty łańcucha z fragmentem łącznika i szkieletem wektora wyrażenia za pomocą reakcji ligacji czterech fragmentów zgodnie z instrukcjami producenta. I przekształć reakcje ligacji w chemicznie kompetentne bakterie zgodnie z instrukcjami producenta. Po posieciu na płytkach z antybiotykami dodaj cztery mililitry pożywki wzrostowej z antybiotykami do pozostałej kultury transformacyjnej do inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 250 obrotach na minutę.

Następnego ranka należy przygotować minipreparat DNA z nocnych kultur mieszanki ligacyjnej zgodnie z instrukcjami producenta i określić wynikowe stężenie plazmidowego DNA. Aby potwierdzić swoistość antygenową wyizolowanych przeciwciał, należy przetransfekować 10 mikrogramów DNA miniprep odczynnikiem na bazie kationowej zasady lipidowej w 10-mililitrowej zawiesinie 293 komórek. Inkubuj kulturę komórkową przez trzy do czterech dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 8% dwutlenku węgla oraz 125 obrotów na minutę.

Pod koniec inkubacji odwirować kulturę przez 10 minut w temperaturze 1000 razy g i odzyskać oczyszczoną pożywkę. Zmierzyć stężenie IgG w supernatancie poprzez powinowactwo do białka A i przetestować każde przeciwciało w supernatancie przy stężeniu 25 mikrogramów na mililitr za pomocą testu ELISA w porównaniu z poszczególnymi peptydami stosowanymi do sortowania zgodnie ze standardowymi protokołami ELISA. Następnie potwierdź dodatnie trafienia przesiewowe za pomocą dodatkowego testu ELISA, używając rozcieńczeń supernatantu IgG w celu wygenerowania krzywej stężenia, zaczynając od 20 mikrolitrów na mililitr i wykreślając w stosunku do gęstości optycznej dla każdego antygenu wykazującego reaktywność w początkowym badaniu przesiewowym ELISA.

Aby wyizolować przeciwciała specyficzne dla antygenu od ludzkich dawców, można opracować serię bramek cytometrycznych w celu wyizolowania docelowych komórek B pamięci. Limfocyty izoluje się na podstawie ich wielkości komórek i ziarnistości, stosując rozpraszanie do przodu i na boki. Po wykluczeniu dubletów i martwych komórek, markery fenotypowe umożliwiają segregację IgG-dodatnich komórek B CD19-dodatnich i komórek B pamięci CD27-dodatniej.

Pierwszy odczyt klonowania pojedynczej komórki jest potwierdzeniem amplifikacji odpowiednich łańcuchów zmiennych ciężkich i lekkich. Tutaj pokazano przykład bardzo wydajnej amplifikacji z 24 pojedynczych komórek z 42% sparowanym odzyskiem po PCR. Po klonowaniu IgG wektor ekspresji IgG jest transpektowany do ludzkich embrionalnych komórek nerki 293.

Odzyskane przeciwciała są badane pod kątem oryginalnego panelu peptydów Tau ocenianych pod kątem reaktywności za pomocą testu ELISA. Dodatkowe potwierdzenie jest następnie przeprowadzane przy użyciu krzywej stężenia tych samych próbek rekombinowanych przeciwciał przeciwko peptydom zidentyfikowanym w początkowym badaniu przesiewowym. Dla każdego dodatniego trafienia pojedynczy klon plazmidu może zostać wyizolowany z przekształconej puli i ponownie potwierdzony tą samą metodą ELISA.

Celem jest amplifikacja sekwencji z pojedynczych komórek, więc najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest to, że wszelkie zanieczyszczenia zostaną amplifikowane podczas części PCR tej procedury. Ta procedura daje nienaruszone ludzkie rekombinowane przeciwciała, co pozwala na oczyszczenie i funkcjonalną charakterystykę takiej ilości przeciwciał, jaką chcesz wygenerować.